Analyse der veränderten Genexpression unter Berücksichtigung der chronisch

Zur Detektion von Signal- und Stoffwechselwegen mit einer starken funktionellen Assoziation zur chronischen Demyelinisierung wurde eine auf maschinellem Lernen beruhende Analyse mit einem „random forest“ Algorithmus verwendet (EICHLER et al., 2007). Bei diesem Verfahren wurden ganze Gruppen funktionell miteinander verknüpfter Gene auf ihre Verbindung zum quantitativen Ausmaß der chronischen Demyelinisierung hin überprüft (EICHLER et al., 2007; PANG et al., 2006). Als Maß für die Demyelinisierung wurde hierbei die MBP-positive Rückenmarksfläche verwendet. Die Zuordnung der Gene zu funktionellen Gruppen erfolgte anhand der Kategorie „biological process“ der „Gene Ontology“ Datenbank (ASHBURNER et al., 2000). Hierbei zeigte sich, dass eine Herabregulierung der Lipid-, Sterol- und Cholesterolbiosynthese, eine Aufregulierung von

„Toll-like receptor 4“ (TLR4)-induzierten Signalwegen und eine unterschiedliche Genexpression der Morphogenese von Neuriten besonders eng mit der Demyelinisierung assoziiert sind.

Es wird vermutet, dass die Herabregulierung der Cholesterolsynthese in einem direkten Zusammenhang mit der chronischen Demyelinisierung steht, da Myelin eine besonders lipid- und cholesterolreiche Struktur darstellt (BAUMANN und PHAM-DINH, 2001). Die herabregulierten Gene „cytochrome P450, family 51“ (CYP51), 7-Dehydrocholesterol-Reduktase (DHCR7), 24-Dehydrocholesterol-7-Dehydrocholesterol-Reduktase (DHCR24), Squalen-Synthetase (Farnesylpyrophosphat Farnesyltransferase, FDFT1), Farnesyldiphosphat-Synthetase (FDPS),

„isopentenyl-diphosphate delta isomerase“ (IDI1), „NAD(P) dependent steroid dehydrogenase-like“ (NSDHL) und Squalen-Epoxidase (SQLE) sind Mitglieder des Mevalonatweges der Cholesterolsynthese hinter der 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzym A (HMG-CoA)-Reduktase und stellen mögliche therapeutische Ziele von Cholesterol-senkenden Arzneimitteln dar (AMIN et al., 1996). Bemerkenswerterweise zeigten die Gene mit den höchsten Bewertungen in der LeFE Analyse (DHCR7, FDPS, NSDHL) im Vergleich der Expression zwischen den Gruppen q-Werte über dem Grenzwert von 0.01, was zeigt, dass beide Verfahren auf voneinander unabhängigen Kriterien beruhen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der vorliegenden Untersuchung zeigte eine Mikroarray-Analyse bei MS eine Herabregulierung multipler Gene der Lipid- und Cholesterolbiosynthese, sowie spezifischer

Myelinproteine (LOCK et al., 2002). Eine weitere Mikroarray-Studie bei progressiver MS zeigte eine Herabregulierung der DHCR7 sowohl in den Läsionen als auch in der normal erscheinenden weißen Substanz von MS Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen, was ein Hinweis auf eine der Demyelinisierung vorangehende Herabregulation der Cholesterolbiosynthese sein könnte (LINDBERG et al., 2004). Wie im ersten Teil der vorliegenden Untersuchungsreihen (Kapitel 4) eingehend dargestellt wurde, kommt es bei der TME vermutlich in Folge einer ungenügenden Differenzierung von OPCs zu einer unvollständigen Remyelinisierung und somit zur chronischen Demyelinisierung. Ein möglicher Pathomechanismus hierbei wäre eine Inhibition der oligodendroglialen Differenzierung in Folge einer ungenügenden Cholesterolbiosynthese, da diese einen limitierenden Faktor für die Myelinisierung darstellt (SAHER et al., 2005). Mäuse mit einer unterbrochenen oligodendroglialen Cholesterolsynthese auf Grund einer konditionellen FDFT1-Mutation in Oligodendrozyten zeigen eine starke Verzögerung der Myelinisierung, jedoch ohne dass es zu ultrastrukturellen oder deutlichen biochemischen Veränderungen des gebildeten Myelins kommt (SAHER et al., 2005). Im Gegensatz hierzu zeigen Mäuse mit einer generellen Unterbrechung der Cholesterolbiosynthese in allen Zellen des Körpers wie z.B. bei DHCR7-Mutanten, schwere Mißbildungen des ZNS und die Tiere sterben kurz nach der Geburt (WAAGE-BAUDET et al., 2005). In Übereinstimmung mit der Hypothese, dass eine Herabregulierung der Cholesterolbiosynthese mit der chronischen Demyeliniserung assoziiert ist, zeigte die Mikroarray-Analyse auch eine progressive Herabregulierung der MBP mRNS. Diese Herabregulierung der MBP mRNS wurde ebenfalls im ersten Teil dieser Arbeit mittels RT-qPCR beobachtet, sowie in einer früheren Studie bei der TME mittels in situ Hybridisierung (YAMADA et al., 1990b). Genau wie bei der vorgelegten Studie wurde auch bei den Mäusen mit der konditionellen FDFT1-Mutation in Oligodendrozyten eine Koregulation der Cholesterolbiosynthese und der MBP mRNS-Expression beobachtet (SAHER et al., 2005). Auf den ersten Blick widersprechen unsere Ergebnisse einer Studie zum Einsatz von HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren im EAE-Modell, wobei geringere klinische Veränderungen, reduzierte Demyelinisierung, weniger Entzündung und eine erhöhte Anzahl OPCs beobachtet wurden (PAINTLIA et al., 2004). Bei näherer Betrachtung fällt aber auf, dass der Wirkmechanismus der HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren vor allem auf einer starken Entzündungshemmung beruht, die vermutlich durch die Beeinflussung zahlreicher Immunzellfunktionen, einschließlich Antigenpräsentation, Aktivierung und Differenzierung autoreaktiver T-Zellen und der Rekrutierung von Leukozyten in das ZNS, zustande kommt (WEBER et al., 2007). Eine kurzzeitige Kultivierung von Ratten-OPCs und humanen

Oligodendrozyten mit HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren verstärkt die Ausbildung langer zellulärer Fortsätze und die Differenzierung der Zellen. Bemerkenswerterweise kommt es aber bei einer längeren Kultivierung mit HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren zu einer Retraktion der Prozesse und dem Absterben der Zellen (MIRON et al., 2007). Der kurzfristige, positive Effekt auf die oligodendroglialen Zellen wird vermutlich durch die Inhibition der RhoA GTPase vermittelt, wohingegen der negative langfristige Effekt zumindest teilweise durch die Substitution von Cholesterol oder Isoprenoid aufhebbar ist. Ob diese in vitro Ergebnisse auch auf die in vivo Situation übertragbar sind bleibt weiteren Studien vorbehalten. Alternativ kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Reduktion der Cholesterolbiosynthese nur eine sekundäre Folge des oligodendroglialen Verlustes darstellt.

Weitere Studien zur Rolle der Cholesterolbiosynthese bei chronisch demyelinisierenden Erkrankungen wie TME und MS werden vor allem für die Risikobewertung des Einsatzes Cholesterol-senkender Medikamente bei der MS benötigt, die zur Zeit in ersten klinischen Studien getestet werden (WEBER et al., 2007).

Die vorliegende Studie zeigte weiterhin, dass es eine Assoziation zwischen der Demyelinisierung und multiplen funktionellen Kategorien gibt, deren Gemeinsamkeit eine Aufregulierung der Expression ist. Im normalen humanen ZNS ist die TLR4-Expression auf Mikroglia beschränkt, wohingegen sie in MS Läsionen sowohl in Mikroglia / Makrophagen als auch Astrozyten nachweisbar ist (BSIBSI et al., 2002). Im Gegensatz hierzu wird im normalen Rattenhirn eine TLR4-Expression in den Meningen, Plexus chorioideus und den Zirkumventrikulärorganen beobachtet. Nach Stimulation mittels Lipopolysaccharid kann auch in Mikroglia von Ratten eine TLR4-Expression beobachtet werden (LAFLAMME und RIVEST, 2001). Das TMEV und andere Picornaviren können über multiple zytoplasmatische Rezeptoren für doppelsträngige RNS wie „melanoma differentiation-associated gene-5“ (GITLIN et al., 2006), Proteinkinase R (CARPENTIER et al., 2007), und TLR3 (SO et al., 2006) eine Induktion angeborener Immunmechanismen bewirken. Im Gegensatz dazu geschieht die Aktivierung von TLR4 bei der TME vermutlich vor allem durch endogene Alarmine aus nekrotischen Zellen und zerstörter Extrazellulärmatix (TERMEER et al., 2002). Eine TLR4-Aktivierung in Makrophagen löst die vermehrte Synthese von TNFα aus (TSAN et al., 2001). Bemerkenswerterweise wurden in der vorliegende Studie auch zwei Gruppen von funktionell verwandten Genen mit veränderter Expression detektiert, die mit einer Aktivierung der Synthese von TNF assoziiert sind. Eine Aufregulierung von TNFα wiederum stellt einen bereits bekannte Weg dar, der bei der TME

zu einer Herabregulierung der Myelinsynthese führt (AKASSOGLOU et al., 1998;

GERHAUSER et al., 2007b; INOUE et al., 1996). Eine TLR4-vermittelte Mikroglia-Aktivierung in vitro führt zu vermehrten oligodendroglialen und neuronalen Degenerationen (LEHNARDT et al., 2003). Im Gegensatz hierzu kann eine TLR4-Aktivierung in vivo aber auch positiv für die Integrität des ZNS sein (FELTS et al., 2005; GLEZER et al., 2006;

KERFOOT et al., 2004; KIGERL et al., 2007; LEHNARDT et al., 2003; MARTA et al., 2008). Interessanterweise induzieren TLR4-aktivierte Mikroglia die Proliferation von OPCs in vivo (GLEZER et al., 2006).

Die mittels Oligonukleotid-Mikroarrays beobachtete Assoziation der Demyelinisierung mit einer unterschiedlich veränderten Genexpression mit funktionellem Bezug zur Morphogenese von Neuriten in in Übereinstimmung mit der in Kapitel 3 dieser Studie formulierten Hypothese, dass frühe axonale Schäden eine vermutlich TME-spezifische Rolle in der Pathogenese der Demyelinisierung spielen (TSUNODA et al., 2003; TSUNODA et al., 2007). Alternativ könnten diese Veränderungen auch die Folge einer sekundären Degeneration der demyelinisierten Axone oder eines gestörten Cholesterolstoffwechsels darstellen (CHANG et al., 2000; RAINE und CROSS, 1989). Interessanterweise können axonale Schhäden auch in Folge von Störungen des Cholesterolmetabolismus entstehen (WAAGE-BAUDET et al., 2005). Die wichtigsten Gene in der Kategorie „neurite morphogenesis“ beinhalteten das Signalmolekül Netrin-1 (NTNG1), welches an der Pathogenese der ZNS Mißbildungen bei den oben erwähnten DHCR7 „knock-out“-Mäusen beteiligt ist (WAAGE-BAUDET et al., 2005). Zur genauen Abschätzung, in welchem Ausmaß axonale Schäden zur ungenügenden Remyelinisierung beitragen sind weitere quantitative Studien der frühen und sekundären axonalen Schäden bei der TME erforderlich.