2. 6. 1 Ektopische Expression humaner pankreatischer Lipase
Die Verwendung rekombinanter Adenoviren als Carrier ermöglicht nach Transfektion des humanen Pankreaslipase-Gens seine ektopische Expression. Bislang gelang dies in-vitro in einer humanen Gallenblasen- Zelllinie, ex-vivo in der ovinen Gallenblase sowie in-vivo im Gallengang von Ratten (MAEDA et al. 1994; KUHEL et al. 2000).
Eine Expression des Lipase-Gens in der Gallenblase (MAEDA et al. 1994) scheint dabei aus mehreren Gründen sinnvoll: Da die Leerung der Gallenblase synchron mit der Leerung des Magens als Antwort auf eine Cholecystokinin-Ausschüttung erfolgt, werden Ingesta und Gallensekret im Duodenum gemischt, d.h. die pankreatische Lipase gelangt zeitgleich mit dem Nahrungsbrei in das Duodenum (ARONCHIK u. BROOKS 1985; KALSER 1985).
Weiterhin findet die Zellerneuerung des Gallenblasenepithels sehr langsam statt, eine Therapie müsste nicht allzu oft durchgeführt werden (MAEDA et al. 1994). Allerdings ist davon auszugehen, dass die oftmals mit Cystischer Fibrose vergesellschafteten anatomischen und physiologischen Veränderungen der Gallenblase sowie auch Veränderungen der Gallensäuresekretion und krankheitstypische Mukus-Ansammlungen, die Effizienz einer Behandlung mittels Gen-Transfer in dieser Lokalisation bei Patienten mit CF mindern können (WEIZMAN et al. 1986; MASCLEE et al. 1989). Auch lag die nach Expression des humanen pankreatischen Lipasegens in der Gallenblase sezernierte Lipasemenge noch weit unter der therapeutischen Dosis (MAEDA et al. 1994).
Das Einbringen transfizierter rekombinanter Adenoviren in das Gallengangepithel (KUHEL et al. 2000) umgeht die Problematik der bei gestörter pankreatischer Sekretion oftmals beeinträchtigten Gallenblasenkontraktilität (DIMAGNO et al. 1977). In der in-vivo-Studie an Ratten wurde das Produkt des mittels Carrier eingebrachten Gens zusammen mit der Gallenflüssigkeit als enzymatisch aktives Protein in das Duodenumlumen sezerniert. Die in der Gallenflüssigkeit ermittelten lipolytischen Aktivitäten waren äquivalent zu jenen im Pankreassaft der Kontrolltiere (KUHEL et al. 2000). Da sich die Mengen der täglichen Ausschüttung von Galle und Pankreassaft beim Menschen annähernd entsprechen (GUYTON 1991), könnte der hepatobiliäre Gentransfer ein effizienter Ansatz zu sein.
Obschon das Einbringen rekombinanter Adenoviren in das humane Gallengangepithel mittels retrograder Cholangiographie technisch möglich wäre, erfordern die mit diesem Vorgehen einhergehenden signifikanten Risiken (O`MAHONY et al. 1995; HALME et al. 1999) zunächst weitere technische Fortschritte, bevor ein Gentransfer in das Gallengangepithel als therapeutischer Ansatz zur Behandlung der humanen EPI Realität werden kann. Zudem konnte die Expression durch die rekombinanten Adenoviren in der Studie nur über 7 Tage aufrechterhalten werden. Die Entwicklung von Vektoren, die eine in-vivo-Langzeitexpression ermöglichen könnten, ist daher erforderlich (KUHEL et al. 2000).
Die in den verschiedenen Studien nachgewiesene signifikante Produktion pankreatischer Lipase zeigt, dass in der Zukunft die Möglichkeit einer ektopischen Expression des humanen Pankreaslipase-Gens auch im humanen hepato-biliären System besteht. Da bei CF-Patienten das Defizit an pankreatischer Lipase mit einem Defizit an Colipase vergesellschaftet ist, könnte ein Vektor von Vorteil sein, der zeitgleich Transfer und Expression von Colipase ermöglicht (MAEDA et al. 1994).
2. 6. 2 Humane gastrale Lipase
Die Applikation biotechnologisch hergestellter, säureresistenter humaner gastraler Lipase könnte in Zukunft ebenfalls einen Therapieansatz zur Behandlung der EPI darstellen (LAYER u. KELLER 1999; LANKISCH 2001).
Humane gastrale Lipase und die bisher in der Therapie eingesetzte porcine pankreatische Lipase zeigen bezüglich der Aminosäuresequenzen ihres genetischen Materials nur einen
Schrifttum
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geringen Grad an Homologie (BODMER et al. 1987). Diese geringe Übereinstimmung spiegelt sich in den unterschiedlichen Eigenschaften der Enzyme wider. Während die säurelabile porcine pankreatische Lipase ihre lipolytische Wirkung vornehmlich im alkalischen Bereich entfaltet und die Lipolyse die Anwesenheit von Colipase erfordert, ist die humane gastrale Lipase im aziden pH-Bereich lipolytisch aktiv und erfordert keine Interaktion mit Colipase (VERGER 1984). Bezüglich der so genannten Ser-152-Region hingegen besteht eine Homologie zwischen beiden Enzymen (BODMER et al. 1987). Dieser konservierten Region („active-site“) wird eine maßgebliche Rolle bei der lipase-katalysierten Hydrolyse von Triglyceriden zugeschrieben (VERGER 1984).
Die Klonierung der genetischen Information humaner gastraler Lipase und eine nachfolgende Expression in Hefen sind möglich; lipolytisch aktives Enzym ist als Ergebnis beider Prozesse nachweisbar (BODMER et al. 1987). Dieses Vorgehen schafft die Voraussetzungen zur Produktion verhältnismäßig großer Mengen humaner gastraler Lipase. Die Sekretion durch Hefen ermöglicht die Gewinnung des Enzyms in löslicher, aktiver, glykolysierter Form (BODMER et al. 1987). Weitere, in der Zukunft erforderliche Studien bezüglich der enzymatischen und strukturellen Eigenschaften humaner gastraler Lipase werden durch die Gewinnung des Enzyms mit dieser Methode erleichtert.
2. 7 Ausblick
Sowohl die Möglichkeit einer ektopischen Expression humaner pankreatischer Lipase als auch der Einsatz humaner gastraler Lipase stellen vielversprechende neue Ansätze für die Behandlung der exokrinen Pankreasinsuffizienz dar. Da allerdings zum gegenwärtigen Zeitpunkt beide Ansätze noch weit von der Praxisreife entfernt sind, stellt momentan die orale Substitutionstherapie mit pankreatischen Enzympräparaten nach wie vor das Mittel der Wahl dar. Die aus den physiologischen Gegebenheiten im Gastrointestinaltrakt an exokriner Pankreasinsuffizienz erkrankter Individuen resultierenden Anforderungen an die eingesetzten Präparate wurden in den vorigen Kapiteln ausführlich dargelegt; sie bedingen folgende Zielsetzungen der aktuellen Forschung auf diesem Gebiet:
• Herstellung von Multienzympräparaten mit frei zu gestaltenden Lipase-Protease-Amylase-Relationen (Steigerung der lipolytischen Aktivität);
• Möglichkeit der Modifikation der einzelnen eingesetzten Enzyme (z. B. Säurestabilität);
• Kombination von Enzymen, die sich nach ihrer Herkunft oder in ihrem präferierten Wirkungsort unterscheiden
Die Überprüfung der Wirksamkeit von neu entwickelten Enzymprodukten und Enzymkombinationen erfordert zunächst zahlreiche In-vitro-Tests und nachfolgend auch eine große Anzahl von In-vivo-Tests der in vitro als wirksam getesteten Produkte. Die Etablierung von Schnelltests, die eine erhebliche Ersparnis an Zeit, Kosten und Material ermöglichen, war und ist daher das Ziel vorangegangener sowie gegenwärtiger Untersuchungen im Rahmen dieses Projektes.
Während die Entwicklung von Screening-Verfahren für Monoenzymprodukte bereits gelang (BECKER 2005; ZANTZ 2006), sollte im Rahmen der hier vorliegenden Studie ein Schnelltest für Multienzymprodukte etabliert werden. Die im vorangegangenen Text ausführlich beschriebenen Wechselwirkungen der verschiedenen Enzymtypen untereinander machen eine Prüfung der in einem Präparat parallel eingesetzten Enzyme notwendig.
Eigene Untersuchungen
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