Die Identifikation von Ziel-Transkripten des RNA bindenden Proteins Rrm4 aus Ustilago maydis

des RNA bindenden Proteins Rrm4

aus Ustilago maydis

Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universit¨at Marburg

vorgelegt von

Julian K¨onig aus M¨unchen

Marburg/Lahn M¨arz 2008

angenommen am:

Erstgutachter: Herr PD Dr. Michael Feldbr¨ugge Zweitgutachterin: Frau Prof. Dr. Renate Renkawitz-Pohl

Ich versichere, dass ich meine Dissertation mit dem Titel

”Die Identifikation von Ziel-Transkripten des RNA bindenden Proteins Rrm4 aus Ustilago maydis“ selbstst¨andig, ohne un-erlaubte Hilfe angefertigt und mich dabei keiner anderen als der von mir ausdr¨ucklich bezeich-neten Quellen und Hilfen bedient habe.

Die Dissertation wurde in ihrer jetzigen oder einer ¨ahnlichen Form noch bei keiner anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Pr¨ufungszwecken gedient.

(Ort, Datum) (Julian K¨onig)

Teile dieser Arbeit wurden ver¨offentlicht in:

BECHT, P., K ¨ONIG, J.,UND FELDBRUGGE¨ , M. (2006). The RNA-binding protein Rrm4 is essential for polarity in Ustilago maydis and shuttles along microtubules. J Cell Sci 119, 4964-4973.

Weitere wissenschaftliche Beitr¨age:

K ¨ONIG, J., JULIUS, C., BAUMANN, S., HOMANN, M., G ¨ORINGER, H.U., UND FELDBRUGGE¨ , M. (2007). Combining SELEX and the yeast three-hybrid system for in vivo selection and classification of RNA aptamers. RNA 13, 614-622.

Zusammenfassung

Die Etablierung einer zellul¨aren Polarit¨atsachse ist Voraussetzung f¨ur filament¨oses Wachstum in Pilzen. Aufbau und Aufrechterhaltung zugrunde liegender molekularer Gradienten werden h¨aufig durch aktiven subzellul¨aren Transport entlang des Zytoskeletts gew¨ahrleistet, wobei als Fracht Proteine, Vesikel sowie mRNA bef¨ordert werden. In Ustilago maydis ist das putativ RNA bindende Protein Rrm4 Teil von Partikeln, die sich bidirektional entlang von Mikrotubuli im Filament bewegen. Der Transportprozess sowie die im Protein enthaltenen RNA-Erkennungs-Motive (RRM) sind wichtig f¨ur die akkurate Bildung der Polarit¨atsachse und die Pathogenit¨at des Pilzes.

Ziel dieser Arbeit war es, Transkripte zu identifizieren, die von Rrm4 im Filament gebunden werden. Mit Hilfe der CLIP-Technologie (ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation) konnte zun¨achst gezeigt werden, dass Rrm4 in vivo mit RNA interagierte. Diese Bindung erfolgte ¨uber die RRM-Dom¨anen des Proteins. Nach Aufreinigung wurden 55 durch Rrm4 gebundene Transkripte identifiziert. Eine bioinformatische Analyse der erhaltenen Sequenzen ergab CA reiche Elemente als m¨ogliches sequenzspezifisches Bindemotiv. Interessanterweise kodierte ein Teil der Ziel-Transkripte f¨ur Proteine, deren Homologe in anderen Organismen an polaren Wachstumsprozessen beteiligt sind. F¨ur die Analyse der subzellul¨aren Lokalisation der Transkripte wurde die FISH-Technologie (fluorescence in situ hybridisation) in U. maydis-Filamenten etabliert. Die Quantifizierung der Signalverteilung erfolgte mit dem daf¨ur imple-mentierten Programm PIA (peak-identifying algorithm). Am Beispiel der mRNA des Sep-tins Cdc3 konnte demonstriert werden, dass diese in Partikeln akkumulierte, deren Bil-dung von Rrm4 abh¨angig war. Die durch den Transport dieser Partikel erreichte Verteilung der mRNA k¨onnte wichtig sein, um auch vom Kern entferntere Bereiche des Filaments zu versorgen. Entsprechend korrelierte der nahezu vollst¨andige Verlust der mRNA-Partikel in rrm4-Deletionsst¨ammen mit einer stark reduzierten Akkumulation des Cdc3-Proteins in den Filamentspitzen. Diese Ergebnisse deuteten an, dass der Rrm4 abh¨angige Transport der cdc3-mRNA entscheidend f¨ur die korrekte Verteilung des entsprechenden Proteins in der Hyphe sein k¨onnte. Durch die Lokalisierung dieses und m¨oglicher weiterer Polarit¨atsfaktoren k¨onn-te die Rrm4 vermitk¨onn-telk¨onn-te posttranskriptionelle Regulation einen sk¨onn-teuernden Einfluss auf polare Wachstumsprozesse nehmen.

Abk ¨urzungen und Fachbegriffe

bp Basenpaar(e)

Cbp Calmodulin bindendes Peptid cDNA complementary DNA

CLIP ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation DNA Desoxyribonukleins¨aure

DIC differential interference contrast EJC exon junction complex

EST expressed sequence tag

FISH fluorescence in situ hybridisation Gfp (enhanced) green fluorescent protein H2Obid. zweifach destilliertes Wasser

kbp Kilobasenpaar(e)

kD Kilodalton

MIPS Munich Information Center for Protein Sequences

mM millimolar

mRNP Boten-Ribonukleoprotein MUMDB MIPS Ustilago maydis DataBase

nt Nukleotid

ORF open reading frame PCR polymerase chain reaction

P Phosphat

p.a. pro analysi, Klassifikation der Reinheitsstufe

PA Protein A

PIA peak-identifying algorithm RNA Ribonukleins¨aure

RNP Ribonukleoprotein RRM RNA recognition motif U unit, Enzymeinheit

¨

UN ¨uber Nacht

Upm Umdrehungen pro Minute UTR untranslatierte Region UV ultraviolettes Licht

Inhaltsverzeichnis

ZUSAMMENFASSUNG I

ABKURZUNGEN UND¨ FACHBEGRIFFE II

INHALTSVERZEICHNIS III

1 Einleitung 1

1.1 Der Modellorganismus Ustilago maydis . . . 1

1.2 Polares Wachstum in filament¨osen Pilzen . . . 3

1.3 mRNA-Transport und lokale Translation . . . 4

1.4 CLIP und FISH : Methoden zur Analyse von RNP-Komplexen . . . 6

1.5 Die Beteiligung von Rrm4 an der Entwicklung zum Filament . . . 7

1.6 Zielsetzung dieser Arbeit . . . 9

2 Ergebnisse 10 2.1 Rrm4 bindet in vivo RNA . . . 10

2.2 Die RNA-Bindung erfolgt ¨uber die RRM-Dom¨anen . . . 11

2.3 Die RNA-Bindung von Rrm4 ist entwicklungsspezifisch reguliert . . . 13

2.4 Die durch Rrm4 gebundenen Sequenzen entsprechen mRNAs . . . 14

2.5 Innerhalb der Ziel-Gene sind bestimmte funktionelle Klassen angereichert . . . 19

2.6 CA-Reichtum ist ein m¨ogliches Rrm4-Bindemotiv . . . 21

2.7 Die FISH-Technologie erm¨oglicht die Darstellung von gfp-mRNA in situ . . . 21

2.8 Das Programm PIA erlaubt eine objektive Quantifizierung des FISH-Signals . . 24

2.9 Die Bildung der cdc3-mRNA-Partikel ist von Rrm4 abh¨angig . . . 25

2.10 Die Expressionsst¨arke beeinflusst die subzellul¨are Lokalisation der cdc3-mRNA 28 2.11 Die Lokalisation des Cdc3-Proteins ist abh¨angig von Rrm4 . . . 29

3 Diskussion 33 3.1 Rrm4 bindet in vivo mRNA . . . 33

3.2 Das CA-Motiv als m¨ogliche Rrm4-Bindestelle . . . 35

3.3 Die Funktion der Rrm4-Ziel-mRNAs . . . 36

3.4 Die subzellul¨are Lokalisation der cdc3-mRNA . . . 39

3.5 Die Rolle von Cdc3 w¨ahrend des filament¨osen Wachstums . . . 40

3.6 Das Modell des Rrm4 vermittelten mRNA-Transports . . . 41

4 Material und Methoden 46

4.1 Material und Bezugsquellen . . . 46

4.1.1 Medien, L¨osungen, Enzyme und Kits . . . 46

4.1.2 Oligonukleotide . . . 47

4.1.3 St¨amme . . . 48

4.1.4 Plasmide und Plasmidkonstruktionen . . . 49

4.2 Mikrobiologische, zellbiologische und genetische Methoden . . . 51

4.2.1 Arbeiten mit E. coli . . . 51

4.2.2 Arbeiten mit U. maydis . . . 53

4.3 Molekularbiologische Standard-Methoden . . . 54

4.3.1 Die Bestimmung der Konzentration von Nukleins¨auren . . . 54

4.3.2 Die Isolierung von Nukleins¨auren . . . 55

4.3.3 Auftrennung und Nachweis von Nukleins¨auren . . . 56

4.3.4 Sequenz- und Strukturanalyse . . . 57

4.3.5 PCR-Techniken . . . 58

4.3.6 Nachweis von immobilisierten Proteinen (Western-Analyse) . . . 58

4.4 CLIP-Analysen . . . 59

4.4.1 Wachstumsbedingungen und UV-Kreuzvernetzung . . . 59

4.4.2 Zellaufschluss und Proteinreinigung . . . 60

4.4.3 Enzymatische Modifikationen der gereinigten RNA . . . 60

4.4.4 Analyse und weitere Reinigung der Protein-RNA-Komplexe . . . 61

4.4.5 Reverse Transkription und Amplifikation der RNA . . . 62

4.5 Nachweis von RNA in situ (FISH-Analysen) . . . 63

4.5.1 Fixierung und Vorbereitung der Filamente . . . 63

4.5.2 in situ-Hybridisierung . . . 64

4.6 Maximaquantifizierung mit PIA . . . 65

5 Literaturverzeichnis 66 6 Anhang 77 6.1 Das Programm PIA . . . 77

1 Einleitung

1.1 Der Modellorganismus Ustilago maydis

Die Forschung an dem pathogenen Basidiomyzeten Ustilago maydis, dem Erreger des Mais-beulenbrandes, liefert seit Jahrzehnten Beitr¨age zum Verst¨andnis fundamentaler biologischer Prozesse. Einen Schwerpunkt hierbei bilden Studien der Interaktion des Pilzes mit seiner Wirts-pflanze Mais. Die pathogene Entwicklung zeigt sich eng mit einem morphologischen Differen-zierungsprozess von U. maydis verkn¨upft, dessen molekulare Grundlagen ebenfalls im Fokus intensiver Forschung stehen (B¨olker, 2001; Feldbr¨ugge et al., 2004; Kahmann und K¨amper, 2004).

W¨ahrend seiner saprophytischen Lebensphase außerhalb der Pflanze liegt der Pilz als Einzel-zelle vor und reproduziert sich durch Knospung (Abb. 1). Die haploiden Sporidien k¨onnen sich paaren, was die pathogene und morphologische Entwicklung einleitet. Dieser Vorgang wird durch die beiden Paarungstyploci a und b kontrolliert (B¨olker, 2001; Feldbr¨ugge et al., 2006). Der biallelische a-Locus kodiert f¨ur ein Pheromon und einen Pheromonrezeptor, welcher nur durch das Pheromon des jeweils anderen a-Allels stimuliert werden kann (B¨olker et al., 1992). Dies erlaubt es Sporidien unterschiedlichen a-Allels, sich gegenseitig wahrzunehmen. Das f¨uhrt zur Ausbildung von Konjugationshyphen, die durch das Pheromon der jeweiligen Partnerzelle gelenkt aufeinander zu wachsen und schließlich verschmelzen (Spellig et al., 1994; Snetse-laar et al., 1996). Unterscheiden sich die beiden Partner auch in den Allelen des b-Locus for-miert sich ein dikaryotisches Filament (Snetselaar, 1993). Der multiallelische b-Locus kodiert f¨ur die zwei Homeodom¨anenproteine bEast (bE) und bWest (bW). Nach dem Verschmelzen zweier Sporidien bildet bE des einen Partners mit bW des anderen einen heterodimeren Kom-plex, der als aktiver Transkriptionsfaktor die Entwicklung des Filaments einleitet und aufrecht erh¨alt (Gillisen et al., 1992; K¨amper et al., 1995). Das entstehende Dikaryon zeichnet sich durch schnelles unipolares Spitzenwachstum aus. Die dabei am distalen Ende akkumulierenden basalen Vakuolen werden durch Einziehen eines Septums von der Zelle abgetrennt, wodurch abgestorbene leere Abschnitte entstehen (Steinberg et al., 1998). Finden Paarung und Dikaryo-nentwicklung auf der Pflanzenoberfl¨ache statt, dringt das Filament unter Ausbildung appres-sorien¨ahnlicher Strukturen in die Pflanze ein. Dort w¨achst der Pilz vorwiegend intrazellul¨ar in Form eines dikaryotischen Myzels. Pflanzengallen entstehen, in denen das Myzel prolife-riert und schließlich in diploide Teliosporen differenziert (Snetselaar und Mims, 1992, 1993; Doehlemann et al., 2008). Aufgrund der Melanin-Einlagerung erscheinen diese Sporen rußge-schw¨arzt, woraus sich der Name Maisbeulenbrand ableitet. Die reifen Sporen werden durch

Aufbrechen der Pflanzengallen freigesetzt und keimen unter geeigneten Bedingungen zu Pro-basidien aus. Nach Durchlaufen der meiotischen Teilungen knospen erneut haploide Sporidien ab, womit sich der Lebenszyklus von U. maydis schließt (Christensen, 1963).

Abbildung 1: Der Lebenszyklus von U. maydis. Außerhalb der Pflanze vermehren sich die haploiden Sporidien durch Knospung. Unter entsprechenden Bedingungen bilden kompatible Zellen Konjugationshyphen und paaren sich. Dies f¨uhrt zur Etablierung des b-abh¨angigen di-karyotischen Filaments. Auf der Pflanzenoberfl¨ache entwickelt der Pilz Appressorien, mit deren Hilfe das Filament in die Pflanze eindringt. Nach der Infektion proliferiert das Myzel und Tumore (Pflanzengallen) entstehen. Dort bilden sich Sporen, die durch Aufplatzen des Pflanzengewebes freigesetzt werden. Diese keimen unter geeigneten Bedingungen aus und schn¨uren nach den meio-tischen Teilungen erneut haploide Sporidien ab (Abbildung modifiziert nach K¨amper et al., 2006). In der rechten Bildh¨alfte befindet sich ein durch U. maydis infizierter Maiskolben mit den durch Sporenmaterial schwarzgef¨arbten Tumoren (aus einem Maisfeld bei Seeshaupt, August 2003). Die Etablierung mikrobiologischer, genetischer, zellbiologischer, biochemischer und bioinfor-matischer Methoden f¨ur U. maydis erlaubt ein Studium des Pilzes auf molekularer Ebene. Alle Lebensabschnitte außerhalb der Pflanze k¨onnen unter Laborbedingungen nachvollzogen werden, einschließlich der Paarung und der Ausbildung des dikaryotischen Filaments. Myzel-proliferation und Teliosporenbildung werden nach k¨unstlicher Infektion in der Maispflanze be-obachtet (B¨olker, 2001). Um die biotrophe Phase von U. maydis effektiver studieren zu k¨onnen, wurden sogenannte solopathogene St¨amme entwickelt, die ohne vorherige Paarung infizieren k¨onnen (B¨olker et al., 1995). Analog dazu wurden auch St¨amme entworfen, welche die Ent-wicklung von knospender Sporidie zu filament¨oser Zelle synchronisiert in Fl¨ussigkultur durch-laufen k¨onnen (Brachmann et al., 2001). Voraussetzung f¨ur die Konstruktion solcher St¨amme ist die M¨oglichkeit, das Genom von U. maydis gezielt zu manipulieren. Dies wird durch effiziente Transformations-Protokolle und hohe Raten homologer Rekombination erm¨oglicht. Als Werk-zeuge stehen dabei eine Reihe von Resistenzmarkern und Promotoren zur Verf¨ugung (Brach-mann et al., 2004; K¨amper, 2004). Die vollst¨andige Sequenzierung und manuelle Annotation des Genoms von U. maydis bietet die M¨oglichkeit bioinformatische Methoden einzusetzen. Die

dabei erhaltenen Ergebnisse k¨onnen leicht unter Anwendung revers genetischer Ans¨atze expe-rimentell untersucht werden (MUMDB, http://mips.gsf.de/genre/proj/ustilago; K¨amper et al., 2006). Desweiteren erm¨oglichte die Genomsequenz das Etablieren der Microarray-Technologie f¨ur U. maydis, welche genomweite Expressionsstudien erlaubt (Scherer et al., 2006; Eichhorn et al., 2006). Diese und viele weitere Technologien erlauben ein intensives Studium von U. maydis und bilden ein Fundament, auf dem weitere Techniken etabliert und ausgebaut werden k¨onnen.

1.2 Polares Wachstum in filament ¨

osen Pilzen

Filament¨ose Pilze werden ¨uber ihre F¨ahigkeit definiert, hochgradig polarisierte Hyphen zu bilden. Mit Ausnahme von Pollenschl¨auchen und Neuronen zeigt keine anderen Zellart ein derart ausgepr¨agtes polarisiertes Wachstum (Harris, 2006). Am apikalen Pol expandiert das Filament unter Beteiligung des Spitzenk¨orpers, w¨ahrend am distalen Ende Septen eingezogen werden, die f¨ur Kompartimentalisierung und Differenzierung wichtig sind. Der Spitzenk¨orper dient als Nachschubplattform f¨ur Vesikel, die f¨ur gerichtete Sekretion w¨ahrend des Spitzen-wachstums notwendig ist. Dabei wird angenommen, dass der Spitzenk¨orper auch als Koor-dinationszentrum des Aktin-Zytoskeletts dient, das exozytotische Vesikel zur Zelloberfl¨ache dirigiert. F¨ur die Anlieferung dieser Vesikel zum Apex wird Mikrotubuli abh¨angiger Trans-port verantwortlich gemacht. Neben exozytotischen Vesikeln sind auch Endosomen an pola-rem Wachstum beteiligt, wobei ihnen eine Rolle bei endozytotischer Wiederaufbereitung zu-geschrieben wird (Harris et al., 2005; Harris, 2006; Fischer, 2007; Steinberg, 2007b). Zudem m¨ussen auch Signal- und Landmarken-Proteine an die Hyphenspitze transportiert werden, die selbst an der Aufrechterhaltung der Polarit¨atsachse beteiligt sind (Sudbery und Court, 2007; Harris, 2006; Steinberg, 2007a). Darunter befinden sich z.B. Komponenten des Polarisoms, einem Multiprotein-Komplex, der mit dem Spitzenk¨orper kolokalisiert und an der Regulation des Aktin-Zytoskeletts beteilig ist (Sharpless und Harris, 2002). Daneben wird der Familie der Septine eine wichtige Rolle zugeschrieben. Diese bilden membranassoziierte heteropolymere Filamente und lokalisieren als Kappe an der Hyphenspitze. Es wird davon ausgegangen, dass sie dort Membrandom¨anen definieren, in die bestimmte Polarit¨atsfaktoren wie Formine als Teil des Polarisoms rekrutiert werden (Gladfelter, 2006). Mit diesem Bild ¨ubereinstimmend konnte in U. maydis die Beteiligung des Zytoskeletts und assoziierter molekularer Motoren, der Endo-zytose, sowie von Signalproteinen und Septinen an polarem Wachstum nachgewiesen werden (Fuchs et al., 2005; Schuchardt et al., 2005; Wedlich-S¨oldner et al., 2000; Mahlert et al., 2006; Boyce et al., 2005). So ergaben z.B. Inhibitorstudien, dass die Integrit¨at des Aktin- und des Mikrotubuli-Zytoskeletts entscheidend f¨ur die Filamententwicklung ist (Fuchs et al., 2005).

1.3 mRNA-Transport und lokale Translation

Wie bereits f¨ur das Wachstum filament¨oser Pilze angedeutet, ist Zellpolarit¨at Voraussetzung f¨ur Differenzierungs- und Entwicklungsprozesse. Zellen weisen ihre Bestandteile dazu einer Vielzahl von Organellen, zytoplasmatischen Kompartimenten und Membranabschnitten zu, die spezialisierte biologische und regulatorische Funktionen ¨ubernehmen (Nelson, 2003). Seit der Entdeckung des Signal-Peptides 1975 (Blobel und Dobberstein, 1975a, b) wurde davon aus-gegangen, dass Proteine ihre Ziele innerhalb der Zelle w¨ahrend oder nach der Translation fin-den, wobei die Information ¨uber ihre subzellul¨are Lokalisation allein in der Proteinsequenz verankert sein sollte. Sp¨ater konnte jedoch gezeigt werden, dass die Verteilung eines Proteins ¨uber die Lokalisierung des entsprechenden Transkriptes vor der Translation gesteuert werden kann (Czaplinski und Singer, 2006; St Johnston, 2005). mRNA-Lokalisation ist an vielen unter-schiedlichen biologischen Prozessen beteiligt. Darin eingeschlossen sind die Etablierung von Morphogen-Gradienten bei der Embryonenentwicklung in Insekten und Vertebraten sowie die Verteilung von Zell-Schicksals-Determinanten, z.B. in Saccharomyces cerevisiae. Weitere Bei-spiele sind die Zuweisung von Proteinen zu Organellen wie Mitochondrien oder ihre Rekru-tierung in bestimmte zytoplasmatische Abschnitte, z.B. neuronale Dendriten. Dar¨uber hinaus wird diskutiert, dass lokale Translation eine Voraussetzung f¨ur den korrekten kotranslationellen Zusammenbau makromolekularer Komplexe darstellt (Shav-Tal und Singer, 2005; Gonsalvez et al., 2005; Moore, 2005).

So vielf¨altig wie ihre biologischen Funktionen sind auch die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der mRNA-Lokalisation (St Johnston, 2005). Es findet sich z.B. Diffusion mit anschließender Verankerung (Wang et al., 1994; Ephrussi und Lehmann, 1992) oder lokaler Schutz vor mRNA-Abbau (Ding et al., 1993; Bashirullah et al., 1999). Am h¨aufigsten wurde jedoch aktiver Transport entlang des Aktin- oder des Mikrotubuli-Zytoskeletts beobachtet (St Johnston, 2005). Die Informationen f¨ur den Transport finden sich in cis-aktiven Elementen der mRNA. Diese werden von bestimmten RNA-bindenden Proteinen erkannt und gebunden (Jamb-hekar und DeRisi, 2007). Der daraus resultierende Boten-Ribonukleoprotein-Komplex (mRNP-Komplex) wird entweder direkt oder indirekt mit molekularen Motoren verkn¨upft. Diese trans-portieren den mRNP-Komplex zu seinem Ziel innerhalb der Zelle. H¨aufig ist dieser Prozess mit Mechanismen verkn¨upft, die verhindern, dass die mRNA vor Erreichen ihres Zieles translatiert wird. Wie durch die Verkn¨upfung von Lokalisierung und Translation angedeutet, stehen die ein-zelnen Prozesse im Lebenszyklus einer mRNA nicht unabh¨angig voneinander, sondern sind eng miteinander verkn¨upft. Schon w¨ahrend der Transkription im Kern komplexiert die naszierende mRNA mit Proteinen, die sie, beeinflusst durch die Kombination ihrer cis-aktiven Elemente, in

wechselnder Zusammensetzung bis zu ihrem letztendlichen Abbau begleiten. Die Zusammen-setzung dieser mRNP-Komplexe entscheidet dar¨uber, in welchem Zusammenspiel Aspekte wie Spleißen, Kernexport, Lokalisierung, Translation oder Abbau ablaufen (Moore, 2005). So wird z.B. beim Spleißen durch Markierung der mRNA mit dem Exonverbindungs-Komplex (exon junction complex, EJC) die Voraussetzung f¨ur die sp¨atere Lokalisierung bestimmter Transkripte geschaffen (Tange et al., 2004).

Ein Paradebeispiel f¨ur aktiven Aktin abh¨angigen mRNA-Transport ist die asymmetrische Zell-teilung in S. cerevisiae (Gonsalvez et al., 2005). ASH1-mRNA lokalisiert dabei haupts¨achlich in der Tochterzelle (Long et al., 1997). Lokale Translation f¨uhrt dann zu einer Akkumulation des Transkriptionsfaktors Ash1p im Tochterkern (Chartrand et al., 2002; Paquin et al., 2007), was den Paarungstypwechsel dieser Zelle unterdr¨uckt (Bobola et al., 1996). Notwendige und hinreichende Bedingung f¨ur die Lokalisierung der ASH1-mRNA sind vier ¨uber das Transkript verteilte cis-Elemente (Gonzalez et al., 1999). Diese werden durch das RNA bindende Protein She2p gebunden und ¨uber das Adapterprotein She3p mit dem Myosin-Motor Myo4p verkn¨upft (Long et al., 2000; B¨ohl et al., 2000). Dieser als She-Maschinerie bezeichnete Komplex be-wegt sich entlang von Aktinfilamenten in die Tochterzelle, an deren Spitze er verankert und translatiert wird (Irie et al., 2002).

Ein gut untersuchtes Beispiel Mikrotubuli abh¨angigen RNA-Transports stellt die Lokalisie-rung der gurken-mRNA w¨ahrend der Oozytenentwicklung bei Drosophila melanogaster dar. Durch ihre definierte Verteilung und die damit verbundene lokale Translation wird die Sekreti-on des kodierten PeptidhormSekreti-ons auf bestimmte angrenzende Follikelzellen begrenzt. Dies f¨uhrt letztendlich zur Etablierung der Achsen des bilateralen Embryos (Tekotte und Davis, 2002). Fluoreszenzmarkierte gurken-mRNA, die in die Oozyte injiziert wurde, bildet Partikel, die sich zun¨achst zum anterioren und dann weiter zum anterior-dorsalen Pol bewegen, wo sie verankert werden (MacDougall et al., 2003). Sie folgt dabei zwei distinkten Gruppen von Mikrotubuli zu ihren jeweiligen Minusenden. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Transport durch das minus-endgerichte Mikrotubuli-Motorprotein Dynein vermittelt wird (Januschke et al., 2002; Duncan et al., 2002). Diese Beispiele verdeutlichen die wichtige Rolle aktiven RNA-Transports bei zellul¨aren Differenzierungs- und Entwicklungsprozessen. Die tats¨achliche Komplexit¨at dieser Abl¨aufe kann jedoch nur angedeutet werden und stellt weiterhin einen aktiven Forschungs-schwerpunkt dar.

1.4 CLIP und FISH : Methoden zur Analyse von RNP-Komplexen

Das Verst¨andnis der Funktion von Ribonukleoprotein-Partikeln (RNPs) auf molekularer Ebene setzt die Kenntnis ihrer einzelnen Protein- und RNA-Komponenten, sowie ihrer subzellul¨aren Verteilung und Dynamiken voraus. Zur Kl¨arung dieser Aspekte wurde eine Vielzahl bioche-mischer, genetischer und zellbiologischer Methoden entwickelt (Denman, 2006; Dirks et al., 2001; Pederson, 2001).

F¨ur die Analyse von RNA-Bindung im nativen Kontext bietet sich die CLIP-Technologie an (CLIP, ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation; Ule et al., 2003; Denman, 2006). Dazu werden in lebenden Zellen mit ultravioletter (UV) Strahlung Proteine und RNA, die in direktem Kontakt stehen, kovalent kreuzvernetzt. Dadurch wird die in vivo-Situation f¨ur sp¨atere bioche-mische Aufreinigungsschritte eingefroren, wobei strikte Bedingungen die Isolation hochgradig reiner, kreuzvernetzter Protein-RNA-Komplexe erlauben. Darin eingeschlossen sind das strin-gente Waschen der Immunopr¨azipitate, das Kochen in SDS sowie die Reinigung durch Protein-Gelelektrophorese mit anschließendem Transfer auf eine Nitrozellulose-Membran. Diese h¨alt die Protein-RNA-Komplexe, jedoch keine freie RNA zur¨uck. Die Kreuzvernetzung erlaubt es zudem, die RNA partiell zu spalten, wodurch nach Klonierung und Sequenzierung der kova-lent gebundenen RNA-Fragmente die Bindestelle des Proteins auf diese Bereiche eingegrenzt werden kann (Ule et al., 2003, 2005).

F¨ur das Studium von RNP-Komplexen im Kontext der Zelle wird die FISH-Technologie (fluorescence in situ hybridisation) in einer Vielzahl von Studien angewendet (Levsky und Singer, 2003). Sie erlaubt den Nachweis bestimmter RNA-Spezies in situ sowie die Darstel-lung ihrer subzellul¨aren VerteiDarstel-lung. Dazu werden die Zellen fixiert und unter geeigneten Be-dingungen mit Nukleins¨aure-Sonden hybridisiert, deren Basensequenz komplement¨ar zu der entsprechenden RNA ist. Als Sonden-Material werden z.B. DNA-Oligonukleotide verwendet, die an mehreren Positionen mit Fluorophoren markiert wurden. Dadurch kann die Verteilung der Sonde innerhalb der Zelle mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikroskopie bestimmt werden. Dieses Signal spiegelt die subzellul¨are Verteilung der RNA wider. Unter Einsatz dieser Methode konnte z.B. die polare Akkumulation der ASH1-mRNA in Tochterzellen von S. cerevisiae visualisiert werden. Zudem wurde der Beitrag der She-Maschinerie zu dieser Lokalisierung durch Kombi-nation von FISH-Analyse mit entsprechenden Deletionsmutanten gekl¨art (Long et al., 1997).

1.5 Die Beteiligung von Rrm4 an der Entwicklung zum Filament

Das Studium potentiell RNA bindender Proteine in U. maydis deutet auf eine Verbindung von posttranskriptioneller Regulation und Zellpolarit¨at in diesem Organismus hin. In einem re-vers genetischen Ansatz konnte gezeigt werden, dass das RNA-Erkennungs-Motiv (RRM, RNA recognition motif) enthaltende Protein Rrm4 an der Entwicklung des dikaryotischen Filaments beteiligt ist. Entsprechend beeintr¨achtigt die Abwesenheit von rrm4 die Filamentbildung und verringert die Pathogenit¨at des Pilzes (Becht et al., 2005).

Auf zellul¨arer Ebene sind Defekte in der Ausbildung der Polarit¨atsachse zu beobachten. Um die Filamententwicklung unabh¨angig von der Paarung haploider Sporidien untersuchen zu k¨onnen, wurde bei diesen Studien der Stamm AB33 eingesetzt, der ein aktives bE/bW-Heterodimer unter Kontrolle des Nitrat induzierbaren Promotors Pnar exprimiert. Dies erlaubt die

Steue-rung der Filamententwicklung ¨uber die im Medium enthaltene Stickstoffquelle (Brachmann et al., 2001). Im Gegensatz zum nat¨urlichen dikaryotischen Filament sind die resultierenden Strukturen haploid, spiegeln aber in mehreren Punkten die nat¨urliche Form wider. Sie zeigen z.B. unipolares Spitzenwachstum und entwickeln am distalen Zellende leere Abschnitte (Brach-mann et al., 2001; Schuchardt et al., 2005). Deletion von rrm4 in diesem Stamm verhindert das Einf¨ugen von Septen am distalen Ende des Filaments, was zu einem Verlust der leeren Ab-schnitte f¨uhrt. Zudem ist die Anzahl der bipolar auswachsenden Zellen signifikant erh¨oht und das Spitzenwachstum verlangsamt. Bei hefeartig wachsenden Zellen konnten hingegen keine Auswirkungen der Abwesenheit von Rrm4 beobachtet werden, was eine spezifische Funktion des Proteins w¨ahrend Entwicklung und Wachstum der filament¨osen Form andeutet (Becht et al., 2005, 2006).

Auf molekularer Ebene scheint Rrm4 an subzellul¨aren Transportprozessen beteiligt zu sein. Fusioniert mit dem gr¨un fluoreszierenden Protein (Gfp) konnte das Protein in Partikeln beob-achtet werden, die sich bidirektional entlang von Mikrotubuli zu beiden Polen des Filaments bewegten. Entsprechend beeintr¨achtigten Mutationen in den Motorproteinen Kin1 und Dynein diesen Transport (Becht et al., 2006; Marc Jungbluth und Michael Feldbr¨ugge, pers¨onliche Mitteilung). Mit einer Funktion w¨ahrend des filament¨osen Wachstums korrelierend nahmen Partikeldichte und Partikelintensit¨at von der hefeartigen zur filament¨osen Form zu (Becht et al., 2006). Es wird davon ausgegangen, dass Rrm4 selbst keine Fracht darstellt, da außerhalb der Partikel keine Akkumulation des Proteins beobachtet werden konnte. Die gest¨orte Entwicklung der rrm4-Deletionsmutanten legt jedoch nahe, dass Rrm4 am Transport wichtiger Polarit¨ats-determinanten beteiligt ist.

Bioinformatische Analysen von Rrm4 deuteten darauf hin, dass das Protein RNA binden k¨onnte und dabei eine neuartige Dom¨anenstruktur aufweist. Im aminoterminalen Bereich des Proteins befinden sich drei RRM-Dom¨anen in der f¨ur ELAV-Proteine typischen Anordnung. Zus¨atzlich befindet sich am carboxyterminalen Ende von Rrm4 eine PABC-Dom¨ane (Becht et al., 2005). Die RRM-Dom¨ane ist die am weitesten verbreitete RNA bindende Dom¨ane. Sie enth¨alt zwei konservierte Bereiche, mit RNP1 und RNP2 bezeichnet, die in direktem Kontakt mit der ge-bunden RNA stehen (Maris et al., 2005). Die PABC-Dom¨ane ist charakteristisches Merkmal des eukaryotischen Poly(A) bindenden Proteins. F¨ur die menschliche PABC-Dom¨ane konnte gezeigt werden, dass diese eine Peptid-Bindetasche ausbildet und so f¨ur die Wechselwirkung mit anderen Proteinen verantwortlich ist (Kozlov et al., 2004).

Genetische Studien mit Rrm4 zeigten, dass das erste und zweite RRM-Modul (RRM1 bzw. RRM2) sowie die PABC-Dom¨ane unterschiedliche Funktionen des Proteins ¨ubernehmen. Dabei war der Beitrag der einzelnen Bereiche zur Funktion von Rrm4 mit Hilfe gezielter Punktmu-tationen untersucht worden. In den RRM-Dom¨anen waren jeweils die letzten vier Aminos¨au-ren im Oktamer der konservierten RNP1-Region gegen Alanin ausgetauscht worden (Becht, 2005; Becht et al., 2006). Entsprechende Mutationen hatten bereits die RNA-Bindung der RRM-Dom¨anen des Poly(A) bindenden Proteins Pab1p aus S. cerevisiae verhindern k¨onnen (Deardorff und Sachs, 1997). Diese Mutationen eingef¨uhrt in RRM1 und RRM2 von Rrm4 verursachten einen mit dem Deletionsstamm vergleichbaren Ph¨anotyp. Die mutierten Rrm4-Varianten wurden jedoch weiterhin in bewegliche Partikel rekrutiert, die in ihrer Dichte und Intensit¨at mit wildtypischen Partikeln vergleichbar waren. Es wurde angenommen, dass die beiden RRM-Dom¨anen RNA binden und diese in die Partikel rekrutieren (Becht et al., 2006). RRM1 und RRM2 k¨onnten dabei eine gemeinsame Funktion ¨ubernehmen, da sie als Tandem-RRM-Dom¨ane wahrscheinlich kooperieren (Deo et al., 1999; Handa et al., 1999; Wang und Tanaka Hall, 2001) und ihre Mutation zudem einen vergleichbaren Ph¨anotyp hervorruft. F¨ur Studien der PABC-Dom¨ane waren Punktmutationen an vier konservierten Aminos¨auren eingef¨uhrt worden, die in einem strukturell untersuchten menschlichen ¨Aquivalent wichtige Positionen in dessen Peptidbindetasche einnehmen (Kozlov et al., 2001, 2004). Die Charak-terisierung entsprechend mutierter Rrm4-Varianten legte nahe, dass die PABC-Dom¨ane wahr-scheinlich maßgeblich an der Partikelbildung von Rrm4 beteiligt ist, da diese Mutationen zum rrm4-Deletionsph¨anotyp f¨uhrten, zus¨atzlich jedoch Partikelbildung und -bewegung stark redu-ziert waren (Becht et al., 2006).

Zusammengenommen deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass Rrm4 an intrazellul¨aren Transportprozessen beteiligt ist. Dieser Transport scheint notwendige Voraussetzung f¨ur die

korrekte Etablierung und Aufrechterhaltung der zellul¨aren Polarit¨atsachse. Als m¨ogliche Fracht kommt dabei RNA in Frage. Es blieb in diesem Zusammenhang jedoch zun¨achst offen, ob Rrm4 tats¨achlich in der Lage ist, RNA zu binden. Weiter m¨usste gekl¨art werden, welcher Natur diese RNA w¨are und welchen Einfluss Rrm4 auf Aspekte wie deren Lokalisation aus¨uben k¨onnte. Die Kl¨arung dieser Fragen k¨onnte einen Beitrag liefern, den molekularen Zusammenhang zwischen Rrm4, den beobachteten Transportprozessen und Zellpolarit¨at zu verstehen.

1.6 Zielsetzung dieser Arbeit

Das putative RNA bindende Protein Rrm4 wurde als Regulator posttranskriptioneller Prozesse diskutiert, die f¨ur die Etablierung der zellul¨aren Polarit¨atsachse wichtig erscheinen. Im Zentrum dieser Arbeit standen die Charakterisierung der RNA bindenden Eigenschaften von Rrm4 sowie die Identifizierung von durch Rrm4 in vivo gebundenen Transkripten. Zu diesem Zweck sollte die CLIP-Technologie an U. maydis angepasst und durchgef¨uhrt werden. In einer anschließen-den Analyse der zellbiologischen Konsequenz dieser Interaktion sollte der Einfluss von Rrm4 auf die subzellul¨are Verteilung der so identifizierten Ziel-RNAs gepr¨uft werden. Daf¨ur wur-de die FISH-Methowur-de gew¨ahlt, die f¨ur die Darstellung bestimmter Transkripte in U. maydis-Filamenten etabliert werden sollte. Dar¨uber hinaus sollte die Lokalisation und Funktion der in den Ziel-RNAs kodierten Proteine studiert werden, um die Verbindung von Rrm4 und pola-rem Filamentwachstum zu konkretisieren. Diese Studien k¨onnten einen Beitrag dazu leisten, das molekulare Verst¨andnis der posttranskriptionellen Regulation im Rahmen polarer Wachs-tumsprozesse zu vertiefen.

2 Ergebnisse

2.1 Rrm4 bindet in vivo RNA

Um zu pr¨ufen, ob das RRM-Dom¨anen enthaltende Protein Rrm4 in vivo RNA bindet, w¨ahlte ich eine modifizierte Variante der CLIP-Methode (Ule et al., 2003). Durch UV-Bestrahlung werden dabei kovalente Bindungen zwischen Protein und RNA eingef¨uhrt und so deren in vivo-Interaktion f¨ur anschließende biochemische Arbeitsschritte konserviert. F¨ur die spezifische Rei-nigung von Rrm4 wurde der Stamm AB33rrm4GT hergestellt, der das Protein mit carboxyter-minal fusioniertem Gfp und Tap tag-Epitop (Rrm4GT, Abb. 2A; Rigaut et al., 1999) am en-dogenen Locus exprimierte. F¨ur dessen korrekte Funktion im zellul¨aren Kontext sprach, dass AB33rrm4GT wie AB33 einen wildtypischen Ph¨anotyp aufwies. Um RNA-Bindung w¨ahrend des filament¨osen Wachstums zu studieren, wurde AB33rrm4GT nach sechs Stunden Inkuba-tion unter Filament induzierenden Bedingungen mit UV-Strahlung behandelt. Daraufhin wur-den die Zellen aufgeschlossen und Rrm4GT mit Hilfe des Tap tag-Epitops durch zweistufige Affinit¨ats-Chromatographie gereinigt. Koimmunopr¨azipitierte Nukleins¨auren wurden mit Hilfe von Polynukleotid-Kinase am 50-Ende mit radioaktivem Phosphat markiert. Dieser Komplex wurde durch Polyakrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt und auf eine Nitrozellulose-Membran ¨ubertragen. So konnten zum einen die Nukleins¨auren im Autoradiogramm, zum anderen das gereinigte Protein Rrm4GT durch Western-Analyse darge-stellt werden.

Im Autoradiogramm war ein Signal zu beobachten, das von der Laufh¨ohe von Rrm4GT (117 kD) in den Bereich gr¨oßeren Molekulargewichts schmierte (Abb. 2B, Spur 2). Gemein-sam mit der Beobachtung, dass dieses Signal abh¨angig von der UV-Bestrahlung war (Abb. 2B, Spur 1), deutete dies darauf hin, dass die Radioaktivit¨at kovalent mit Rrm4GT verkn¨upft worden war. Um zu ¨uberpr¨ufen, ob dieses Signal auf RNA zur¨uckzuf¨uhren war, wurde der aufgereinigte Komplex mit spezifisch RNA degradierenden Enzymen behandelt. RNaseT1-Spaltung vor der radioaktiven Markierung f¨uhrte zu einer Fokusierung des radioaktiven Signals (Abb. 2B, Spur 3 und 4). Das deutete darauf hin, dass die kovalent gebundene RNA enzymatisch gespalten und k¨urzer geworden war. Dadurch n¨aherte sich das Laufverhalten des Protein-RNA-Komplexes im Gel dem von Rrm4GT an. RNaseA-Spaltung nach der radioaktiven Markierung f¨uhrte zu einer starken Verringerung des Signals im Autoradiogramm (Abb. 3B, Spur 5-8). Es kann davon ausgegangen werden, dass dabei Teile der RNA zusammen mit dem am 50-Ende befindlichen radioaktiven Phosphat vom Protein-RNA-Komplex abgespalten wurden. Zusammengenommen war es unter in vivo-Bedingungen m¨oglich, durch UV-Bestrahlung Rrm4 und RNA kovalent zu

vernetzen. Folglich bindet Rrm4 in vivo RNA und ist somit Teil von RNP-Komplexen.

Abbildung 2: Rrm4 bindet in vivo RNA. (A) Schematische Darstellung von Rrm4GT mit kova-lent kreuzvernetzter RNA. Rrm4GT ist ein Fusionsprotein aus Rrm4, Gfp und dem Tap tag-Epitop. Letzteres setzt sich zusammen aus dem Calmodulin bindenden Peptid (Cbp), der Schnittstelle der TEV-Protease (TEV) und Protein A (PA). Die RNA ist am 50-Ende durch radioaktives Phosphat (P) markiert. (B) CLIP-Analyse von 6 h induzierten AB33rrm4GT-Filamenten. Kovalent gebunde-ne radioaktiv markierte RNA wird als Protein-RNA-Komplex detektiert, dessen Molekulargewicht das von Rrm4GT ¨ubersteigt (117 kD; Gr¨oßenstandard in kD am linken Bildrand). Kreuzvernet-zung ist abh¨angig von UV-Bestrahlung (Spur 1 und 2). Steigende RNaseT1-Konzentrationen vor der radioaktiven Markierung reduzieren das Molekulargewicht der Protein-RNA-Komplexe (Spur 3 und 4; ++ bedeutet 100-fache Zunahme). RNaseA-Behandlung nach der radioaktiven Markie-rung reduziert das detektierte Signal (Spur 5 - 8). Als Ladekontrolle diente eine Western-Analyse mit αGfp-Antik¨orpern (unterer Bildbereich). Der Stern markiert eine unspezifisches Signal.

2.2 Die RNA-Bindung erfolgt ¨

uber die RRM-Dom ¨anen

Die beschriebenen CLIP-Experimente konnten zeigen, dass Rrm4 ein RNA bindendes Protein ist. Es blieb jedoch zun¨achst offen, ob die Bindung durch die RRM-Dom¨anen erfolgte. Um dies zu pr¨ufen, sollte die Position der kovalenten Bindung zwischen Protein und RNA kar-tiert werden. F¨allt diese in den Bereich einer bestimmten Dom¨ane, kann davon ausgegangen werden, dass diese an der Bindung beteiligt ist. Da alle drei RRM-Dom¨anen von Rrm4 im aminoterminalen Bereich des Proteins liegen, w¨urde ihre Beteiligung an RNA-Bindung eine Kreuzvernetzung in diesem Bereich des Proteins voraussetzen. Einen ersten Hinweis darauf er-gaben CLIP-Experimente, die in Abwesenheit des Proteaseinhibitors PMSF durchgef¨uhrt wur-den. Dies f¨uhrte zu einer partiellen Spaltung von Rrm4GT vor dessen Aufreinigung. Da die Affinit¨atsreinigung von Rrm4GT ¨uber das carboxyterminale Ende erfolgte, enthielten alle auf der Membran detektierten Proteinfragmente kleiner 74 kD keine RRM-Dom¨anen, w¨ahrend alle Fragmente gr¨oßer 74 kD mindestens eine RRM-Dom¨ane enthielten (Abb. 3A). Damit ¨uberein-stimmend konnte im Autoradiogramm ein radioaktives Signal nur mit dem kompletten Rrm4GT

(117 kD) und dessen gr¨oßtem Abbauprodukt (ca. 80 kD) beobachtet werden. Alle kleineren Ab-bauprodukte (< 64 kD) wiesen kein radioaktives Signal auf (Abb. 3B). Daraus folgte, dass die Wechselwirkung von RNA und Protein im aminoterminalen Bereich von Rrm4 erfolgte. Das deutete auf eine aktive Rolle der RRM-Dom¨anen bei der RNA-Bindung hin. Da keine kovalen-te Bindung am hekovalen-terologen carboxykovalen-terminalen Ende des Fusionsprokovalen-teins Rrm4GT beobachkovalen-tet werden konnte, wurde zudem die Spezifit¨at der durch die UV-Strahlung induzierten Kreuzver-netzungen unterstrichen.

Abbildung 3: Die RRM-Dom¨anen von Rrm4 vermitteln RNA-Bindung. (A) Schematische Darstellung des Rrm4GT-Fragments nach TEV-Protease-Spaltung (117 kD). Im aminotermina-len Bereich des Proteins liegen die drei RRM-Dom¨anen. Im carboxyterminaaminotermina-len Abschnitt des Proteins findet sich die PABC-Dom¨ane, Gfp und das Calmodulin bindende Peptid (Cbp). Letz-teres verbleibt nach Spaltung des Tap tag-Epitops w¨ahrend der Affinit¨ats-Chromatographie im Fusionsprotein. Alle mit Hilfe des Cbp gereinigten Abbauprodukte kleiner 74 kD enthalten kei-ne RRM-Dom¨akei-nen. (B) CLIP-Experiment in Abwesenheit von Proteaseinhibitoren. Rrm4GT und Abbauprodukte wurden durch Western-Analyse mit αGfp-Antik¨orpern nachgewiesen (Gr¨oßen-standard in kD im linken Bildbereich). Radioaktive Signale (RNA) konnten nur mit Rrm4GT und Abbauprodukten gr¨oßer 74 kD detektiert werden (gef¨ullte Pfeile). Alle Proteinfragmente kleiner 74 kD wiesen kein Signal auf (ungef¨ullte Pfeile). (C) CLIP-Experimente vor (0 h) und 6 h nach Wechsel zu Filament induzierenden Bedingungen mit Rrm4GT sowie den mutierten Varianten Rrm4GTmP(mP), Rrm4GTmR1(mR1) und Rrm4GTmR3 (mR3). Die Quantifizierung der Signal-intensit¨at relativ zu dem mit Rrm4GT nach 6 h erhaltenen Signal findet sich unter den jeweili-gen Spuren. Der Stern markiert ein unspezifisches Signal. Als Ladekontrolle diente eine Western-Analyse mit αGfp-Antik¨orpern. Gr¨oßenstandard in kD am linken Bildrand. (D) Western-Western-Analyse der Rrm4GT-Proteinmenge vor (0 h) und 6 h nach Filament-Induktion unter Verwendung eines αGfp-Antik¨orpers. Als Ladekontrolle diente der Nachweis von αTubulin mit αTub-Antik¨orpern (Gr¨oßenstandard in kD).

Nachdem die RNA bindenden Eigenschaften von Rrm4 auf den Bereich der drei RRM-Dom¨anen eingegrenzt werden konnte, sollte nun gepr¨uft werden, ob diese RRM-Dom¨anen aktiv an der Bindung beteiligt sind. Daf¨ur wurde das CLIP-Experiment mit einer genetischen Mutations-analyse kombiniert. Zu diesem Zweck wurden Punktmutationen in die RRM-Dom¨anen eins und drei von Rrm4GT eingef¨uhrt, die bereits bei der funktionellen Kartierung des Proteins einge-setzt worden waren (siehe Kapitel 1.5; Becht et al., 2006). Dazu wurden jeweils die letzten vier Aminos¨auren der RNA-Kontaktregion RNP1 mit Alanin ausgetauscht, wodurch spezifisch die RNA bindenden Eigenschaften der entsprechenden Dom¨ane aufgehoben werden sollten. Die so erzeugten Proteinvarianten wurden mit Rrm4GTmR1 _{bzw. Rrm4GT}mR3 _{bezeichnet. Die}

entsprechenden Gene wurden in den nativen Locus des Stammes AB33rrm4∆ eingef¨ugt, um die St¨amme AB33rrm4GTmR1 bzw. AB33rrm4GTmR3 zu erzeugen. In einer Western-Analyse konnte best¨atigt werden, dass die eingef¨uhrten Mutationen keinen Einfluss auf das Expressions-niveau von Rrm4GTmR1 und Rrm4GTmR3 besaßen (nicht gezeigt). Dies deutete an, dass die Stabilit¨at der Proteinvarianten unver¨andert war und alle Dom¨anen wahrscheinlich korrekt gefal-tet blieben. Die RNA-Bindungsst¨arke von Rrm4GTmR1 _{und Rrm4GT}mR3 _{wurde anschließend}

im CLIP-Experiment mit Rrm4GT verglichen. Dabei zeigten beide Proteinvarianten eine auf 57% bzw. 34% reduzierte Bindung (Abb. 3C). Die Unversehrtheit der RNA-Kontaktregion in den beiden RRM-Dom¨anen war also wichtig f¨ur RNA-Bindung. Im Folgenden wurde somit davon ausgegangen, dass das Protein Rrm4 mit Hilfe seiner RRM-Dom¨anen an RNA bindet.

2.3 Die RNA-Bindung von Rrm4 ist entwicklungsspezifisch

reguliert

Da f¨ur rrm4-Deletionsmutanten bisher ph¨anotypische Ver¨anderungen nur w¨ahrend des fila-ment¨osen Wachstums beobachtet wurden, sollte ¨uberpr¨uft werden, ob die RNA bindenden Ei-genschaften von Rrm4 damit korrelierend reguliert sind. Zu diesem Zweck wurde die RNA-Bindung von Rrm4 in knospenden Zellen mit der in Filamenten verglichen. Mittels Western-Analyse konnte zun¨achst gezeigt werden, dass die Menge des Proteins Rrm4GT vor und nach sechs Stunden unter Filament induzierenden Bedingungen unver¨andert blieb (Abb. 3D). Dar-aufhin wurde das CLIP-Experiment als Vergleich dieser Entwicklungsstadien wiederholt. Im Autoradiogramm konnte eine starke Zunahme des Signals von Proben aus uninduzierten zu in-duzierten Zellen beobachtet werden. Dies sprach daf¨ur, dass Rrm4 w¨ahrend des filament¨osen Wachstums verst¨arkt an RNA bindet.

vom knospenden zum filament¨osen Wachstum (siehe Kapitel 1.5; Becht et al., 2006). Um zu ¨uberpr¨ufen, ob die Rekrutierung von Rrm4 in die Partikel einen Einfluss auf die RNA-Bindung haben k¨onnte, wurde eine weitere mutierte Variante von Rrm4GT verwendet. Rrm4GTmP

ent-hielt Punktmutationen an vier konservierten Aminos¨auren der PABC-Dom¨ane von Rrm4, die zu reduzierter Partikelbildung und zu Funktionsverlust von Rrm4 in U. maydis f¨uhren (siehe Ka-pitel 1.5; Becht et al., 2006). Das entsprechende Gen wurde in den nativen Locus des Stammes AB33rrm4∆ eingef¨ugt, der mit AB33rrm4GTmPbezeichnet wurde. Im CLIP-Experiment zeig-te Rrm4GTmPim Vergleich zu Rrm4GT ein auf 57% reduziertes radioaktives Signal (Abb. 3C). Die durch die Mutationen verursachte reduzierte Partikelbildung korrelierte also mit verringer-ter RNA-Bindung von Rrm4. Diese Ergebnisse unverringer-terstrichen, dass die Funktion von Rrm4 eng mit der Filamententwicklung in U. maydis verkn¨upft ist.

2.4 Die durch Rrm4 gebundenen Sequenzen entsprechen mRNAs

In den oben beschriebenen Experimenten konnte die CLIP-Technologie dazu verwendet werden, die RNA bindenden Eigenschaften von Rrm4 nachzuweisen und zu beschreiben. F¨ur detaillierte Analysen des Rrm4-Partikels war es jedoch notwendig, Informationen ¨uber die Iden-tit¨at der enthaltenen RNAs zu erhalten. Deshalb sollte gekl¨art werden, welche spezifischen RNA-Molek¨ule von Rrm4 w¨ahrend des filament¨osen Wachstums gebunden werden. Dazu wur-de erneut die CLIP-Technologie angewenwur-det und um die daf¨ur n¨otigen Arbeitsschritte erg¨anzt (Ule et al., 2003, 2005). W¨ahrend des zweiten Teilschritts der Affinit¨atsreinigung wurde die aufgereinigte RNA enzymatisch auf eine durchschnittliche L¨ange von ca. 100 nt reduziert. So konnte sp¨ater die Bindestelle von Rrm4 auf diesen Bereich eingegrenzt werden. Anschließend wurde ein RNA-Oligonukleotid bekannter Sequenz an die 30-Enden dieser Fragmente ligiert. Der Protein-RNA-Komplex wurde wie oben durch Polyakrylamid-Gelelektrophorese aufge-trennt und auf eine Membran ¨ubertragen. Aus dieser Membran wurden St¨ucke ausgeschnitten, an die der Protein-RNA-Komplex gebunden hatte. Als Negativ-Kontrolle wurden entsprechen-de Membranst¨ucke von Proben verwenentsprechen-det, die keiner UV-Strahlung ausgesetzt worentsprechen-den waren (Abb. 4A). Durch proteolytische Spaltung wurde die RNA vom Protein und somit der Membran gel¨ost. An ihre 50-Enden wurde ein zweites RNA-Oligonukleotid ligiert. Durch reverse Tran-skription entstand eine zu der unbekannten RNA komplement¨are cDNA, die von zwei Abschnit-ten bekannter Nukleotidsequenz flankiert war. Die so erhalAbschnit-tene cDNA wurde anschließend mit Hilfe von DNA-Oligonukleotiden, die komplement¨ar zu den flankierenden Bereichen bekann-ter Sequenz waren, durch Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) am-plifiziert. Die erzeugten Amplifikate wurden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt, um

sie von den Oligonukleotiden und deren Dimeren zu trennen (Abb. 4B, Spur 1 und 2). Dazu wurde aus den Gelen der Gr¨oßenbereich von 100 - 300 bp ausgeschnitten. Die gereinigten Amplifikate wurden erneut als Matrize f¨ur eine zweite PCR mit einger¨uckten Oligonukleotiden eingesetzt. Nach erneuter Agarose-Gelelektrophorese waren DNA-Amplifikate im Gel zu beob-achten (Abb. 4B, Spur 3 und 4), die zur weiteren Analyse kloniert und anschließend sequenziert wurden.

Abbildung 4: Identifizierung der durch Rrm4 gebundenen RNA. (A) CLIP-Experiment mit AB33rrm4GT f¨ur die Identifizierung der kreuzvernetzten RNA-Molek¨ule. Als Kontrollen dienten Proben ohne UV-Bestrahlung und mit RNaseT1-Behandlung (Spur 1 und 3). F¨ur die Weiterbe-handlung wurden die markierten Bereiche aus der entsprechenden Nitrozellulose-Membran ausge-schnitten. Der Gr¨oßenstandard am linken Bildrand ist in kD, der Stern markiert ein unspezifisches Signal. Als Ladekontrolle diente eine Western-Analyse mit αGfp-Antik¨orpern. (B) Nach proteo-lytischer Spaltung, Oligonukleotid-Ligation und reverser Transkription wurden die in (A) gewon-nenen Proben durch PCR amplifiziert und mit Agarose-Gelelektrophorese von Oligonukleotid-Dimeren getrennt (Spur 1 und 2). F¨ur die weitere Amplifikation wurden Bereiche des Gels ausge-schnitten, die Fragmente von 100 bis 300 bp enthalten sollten. Die daraus gewonnene DNA wurde als Matrize f¨ur eine zweite PCR eingesetzt, deren Produkte nach erneuter Gelreinigung kloniert und sequenziert wurden (Spur 3 und 4; Gr¨oßenstandard in bp am linken Bildrand).

In zwei unabh¨angigen Experimenten konnten 78 unterschiedliche Sequenzfragmente identifiziert werden, die mit Hilfe des BLAST-Algorithmus (Altschul et al., 1990, 1997) 61 genomischen Bereichen von U. maydis zugeordnet werden konnten (MUMDB, http://mips.gsf.de/genre/proj/ustilago). Zu sechs dieser Bereiche waren zwei oder mehr un-terschiedliche, jedoch ¨uberlappende Sequenzfragmente komplement¨ar. In f¨unf F¨allen stamm-ten die Sequenzfragmente dabei aus unabh¨angigen Experimenstamm-ten. Auch in den Proben, die nicht UV-Bestrahlung ausgesetzt worden waren, konnten im Gel DNA-Amplifikate beobachtet werden. Klonierung und Sequenzierung dieser Amplifikate zeigte jedoch, dass es sich hier-bei gr¨oßtenteils um Dimere der eingesetzten DNA-Oligonukleotide sowie um zu ribosomaler RNA komplement¨are Fragmente handelte. Aufgrund der großen Menge dieser RNA-Spezies innerhalb der Zelle wurden diese Sequenzen als Kontamination eingestuft und von der

weite-ren Analyse ausgenommen. Zusammengenommen deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass Sequenzen identifiziert werden konnten, die Teil der durch Rrm4 gebundenen RNA waren. Der

¨

Uberlapp der Sequenzen aus den beiden unabh¨angigen Experimenten best¨atigte diese Annah-me.

Die von Rrm4 gebundenen Fragmente sollten nun bestimmten RNA-Molek¨ulen zugeordnet werden. Dazu wurden die entsprechenden genomischen Bereiche mit Hilfe der MUMDB-Datenbank analysiert (MUMDB, http://mips.gsf.de/genre/proj/ustilago). Diese vereint Se-quenzinformationen aller Genmodelle von U. maydis sowie der exprimierten Sequenzfragmente (expressed sequence tags, ESTs). Diese Auswertung ergab, dass 55 der 61 genomischen Berei-che f¨ur Teile vorhergesagter mRNA-Molek¨ulen kodierten (Tab. 1). Dabei stimmte die Orientie-rung der klonierten Sequenzen mit den entsprechenden mRNAs ¨uberein. Daraus konnte abge-leitet werden, dass Rrm4 in vivo an diese im Folgenden mit Ziel-mRNA bezeichneten Molek¨ule bindet. Die Bindestelle von Rrm4 konnte dabei auf die identifizierten Sequenzbereiche in der entsprechenden Ziel-mRNA eingegrenzt werden. Es zeigte sich, dass 22 Bindestellen in offenen Leserahmen lagen. Dar¨uber hinaus befanden sich 31 in der 30 und eine in der 50 untranslatier-ten Region (UTR). Soweit keine ESTs zur Verf¨ugung standen, die das jeweilige Transkripuntranslatier-tende bzw. dessen Anfang markierten, wurden diese Regionen als 300 bp stromabw¨arts des Stoppko-dons bzw. stromaufw¨arts des StartkoStoppko-dons definiert. In keinem Fall wurden Bindestellen inner-halb von Intron-Bereichen gefunden. Hingegen konnte in zwei F¨allen eine Exon-Exon-Grenze ¨uberspannende Bindestelle identifiziert werden. Zusammengenommen unterstrichen diese Be-obachtungen, dass mit Rrm4GT ¨uberwiegend mRNA-Molek¨ule aufgereinigt wurden. Der hohe Anteil an Bindestellen innerhalb der 30UTRs bekr¨aftigte eine Rolle von Rrm4 bei der zytoplas-matischen posttranskriptionellen Regulation der identifizierten Ziel-mRNAs.

Tabelle 1: Die Ziel-Gene von Rrm4

Annotation n¨achstes SIMAP-Homolog2 _klonierte

Gen (aus MUMDB1_{) S. cerevisiae H. sapiens Fragmente}3

um00160 Sec17 - probable SEC17 - transport vesicle fusion protein

SEC17 (34,2%) NAPA (34,5%) #35

um00379 related to eukaryotic initiation factor 3e subunit

- EIF3E (32,0%) #60

um00714 Npl4 - probable NPL4 - nuclear protein localization factor and ER translocation component

NPL4 (34,5%) NPLOC4 (30,2%)

#33

um00786 conserved hypothetical protein - - #41

um00851 related to BFR1 - Nuclear segregation protein

BFR1 (23,9%) - #45

um00897 conserved hypothetical protein - - #49

um00961 conserved hypothetical protein - - #50

um00986 Ras1 - small G-protein Ras1 RAS1 (43,1%) NRAS (53,1%) #51

um01146 conserved hypothetical protein - - #52

um01167 hypothetical protein - - #53

um01189 Efb1 - probable EFB1 - translation elongation factor eEF1beta

EFB1 (54,2%) EEF1B2 (54,2%) #54

um01434 Fer3 - siderophore peptide synthetase involved in ferrichromeA biosynthesis

- - #55

um02440 Ubi1 - probable RPL40A - Ubiquitin RPL40B (94,5%) UBA52 (89,8%) #62 - 74

um03033 conserved hypothetical protein - SMAP-1 (25,0%) #3

um03306 Prs4 - probable PRS4 - ribose-phosphate pyrophosphokinase 3

PRS1 (41,8%) PRPS1 (41,7%) #5

um03598 Ent1 - related to ENT2 - clathrin binding protein, required for endocytosis

ENT2 (35,1%) EPN2 (21,8%) #8

um03854 Pda1 - probable PDA1 - pyruvate dehydrogenase (lipoamide) alpha chain precursor

PDA1 (52,4%) PDHA1 (44,3%) #17

um03959 probable t-complex-type molecular chaperone, epsilon subunit

CCT5 (60,8%) CCT5 (64,9%) #19

um03965.2 conserved hypothetical protein FAD1 (20,9%) FLAD1 (29,4%) #18

um04070 Rho3 - GTP binding protein RHO3 (47,2%) RHOC (46,5%) #22

um04136 related to serine/threonine protein kinase

NPR1 (25,5%) - #23

um04270 Dps1 probable DPS1

-aspartyl-tRNA synthetase, cytosolic

DPS1 (58,7%) DARS (47,0%) #24

um04628 conserved hypothetical protein - - #26

um04632 probable ribosomal protein P2 RPP2B (62,2%) RPP2 (64,3%) #27 um04855 probable 60S ribosomal protein L26A RPL26A (52,0%) RPL26 (54,5%) #29 um05031 probable ribosomal protein L10a.e,

cytosolic

RPL1A (68,2%) RPL10a (62,7%) #30

um05104 putative protein - - #32

um05644 related to alcohol dehydrogenase XYL2 (28,7%) ADH7 (27,1%) #37 um05818 probable chimeric spermidine

synthase/saccharopine reductase

LYS9 (32,5%) SRM (22,5%) #38

um06078 conserved hypothetical protein - - #39

um06139 related to zinc transporter - MSC2 (22,8%) #40

um06323 probable translation initiation factor eIF3

NIP1 (32,0%) EIF3CN (35,3%) #42

Fortsetzung n¨achste Seite

1 _{http://mips.gsf.de/genre/proj/ustilago.}

2 _{Aus der Similarity Matrix of Proteins-Analyse (SIMAP) der MUMDB. Aufgelistet sind}

Gennamen und Identity*Overlap/Length-Werte der n¨achsten Homologe (Identity*Overlap/Length > 20%).

Tabelle 1 (Fortsetzung): Die Ziel-Gene von Rrm4

Annotation n¨achstes SIMAP-Homolog2 _klonierte

Gen (aus MUMDB1_{) S. cerevisiae H. sapiens Fragmente}3

um06509 related to Phenylalanine ammonia-lyase

- - #44

um10095 probable RNA helicase dbp2 (DEAD box protein)

DBP2 (60,0%) DDX17 (50,4%) #57

um10339 related to fatty acid synthase, beta and alpha chains

FAS2 (22,3%) - #1

um10360 probable 40S Ribosomal protein S14 RPS14B (72,5%) RPS14 (81,5%) #2 um10433 Rpo26 - probable Rpo26 - 18kD

subunit of DNA-directed RNA polymerases I, II, III

RPO 26 (56,2%) POLR2F (54,3%) #25

um10503 probable cell division control protein CDC3

CDC3 (41,7%) SEPT7 (50,4%) #9

um10625 probable ribosomal protein L24.e.A, cytosolic

RPL24B (60,6%) RPL24 (49,0%) #47, 48

um10733 putative protein - - #36

um10926 Tfp1 - probable TFP1p - H+-ATPase V1 domain 69 KD catalytic subunit, vacuolar

TFP1 (65,2%) ATP6V1A

(69,3%)

#20

um11047 conserved hypothetical protein - - #11

um11097 related to QCR10 - ubiquinol-cytochrome-c reductase 8.5 kDa subunit

QCR10 (27,5%) - #6

um11103 Rpl3 - probable RPL3 - 60s ribosomal protein l3

RPL3 (72,4%) RPL3 (65,7%) #15

um11168 Tim8 - probable TIM8 - Translocase of the mitochondrial inner Membrane

TIM8 (43,7%) TIMM8B

(41,0%)

#34

um11238 conserved hypothetical protein yhr087w (27,7%) - #43

um11261 Rps17b probable RPS17B -ribosomal protein S17.e.B

RPS17A (64,1%) RPS17 (58,6%) #46

um11326 conserved hypothetical protein - BAA83717

(20,9%)

#56

um11499 Rps29b probable RPS29B -ribosomal protein S29.e.B

RPS29B (67,9%) RPS29 (64,3%) #77, 78

um11536 Rpl5 - probable RPL5 - 60S large subunit ribosomal protein L5.e

RPL5 (59,4%) RPL5 (50,7%) #28

um11731 Nuo1 - related to nadh-ubiquinone oxidoreductase 9.5 kDa subunit

- NDUFA3

(22,6%)

#7

um11948 related to ubiquitin-like protein Hub1 HUB1 (54,8%) UBL5 (5,7%) #4

um12159 conserved hypothetical protein - - #31

um12241 related to COX19 - Cytochrome c oxidase assembly protein

COX19 (22,2%) hCOX19 (22,1%) #10, 11

um15090 conserved hypothetical protein - - #61

1 _{http://mips.gsf.de/genre/proj/ustilago.}

2 _{Aus der Similarity Matrix of Proteins-Analyse (SIMAP) der MUMDB. Aufgelistet sind}

Gennamen und Identity*Overlap/Length-Werte der n¨achsten Homologe (Identity*Overlap/Length > 20%).

2.5 Innerhalb der Ziel-Gene sind bestimmte funktionelle Klassen

angereichert

RNA bindende Proteine interagieren h¨aufig mit Gruppen von mRNAs, die an bestimm-ten zellul¨aren Funktionen beteiligt sind. Dies erm¨oglicht eine konzertierte Regulation der Expression der entsprechenden Proteine. Um zu ¨uberpr¨ufen, ob auch die Ziel-Gene von Rrm4 gemeinsame Aufgaben ¨ubernehmen, wurden diese mit dem Programm FunCat analy-siert (http://mips.gsf.de/projects/funcat/; Ruepp et al., 2004). Dabei werden die Genmodelle bestimmten Klassen zugeordnet, die gemeinsame Funktionen oder Eigenschaften zusammen-fassen. Der relative Anteil einer solchen Klasse an der Anzahl der analysierten Genmodelle kann dann mit dem relativen Anteil dieser Klasse an der Gesamtheit aller Genmodelle von U. maydis verglichen werden. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass innerhalb der Ziel-Gene die Klassen Protein synthesis, Protein fate, Protein with binding function or cofactor requirement, Cell fate, Development und Cell type differentiation signifikant angereichert waren (Abb. 5A, Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05; Ruepp et al., 2004). Die drei zuletzt genannten Titel be-schreiben Klassen, deren Funktion im Zusammenhang mit dem Differenzierungsprozess der von U. maydis gebildeten Filamente steht.

Somit korrelierte die Funktion von Rrm4 w¨ahrend des filament¨osen Wachstums mit einer An-reicherung von an diesem Prozess beteiligten Transkripten in den Ziel-mRNAs von Rrm4. Bei-spiele hieraus stellen das Septin Cdc3 (um10503; Boyce et al., 2005) und die kleine GTPase Rho3 (um04070; Weinzierl et al., 2002) dar, f¨ur deren Orthologe in Hefe eine Funktion bei polarem Wachstum diskutiert wird (Robinson et al., 1999). Weiter findet sich ein Ortholog der in S. cerevisiae an Endozytose und Zytoskelett-Organisation beteiligten Epsine (Aguilar et al., 2006), das mit Ent1 (um03598) bezeichnet wurde. Dar¨uber hinaus umfassen die Ziel-mRNAs von Rrm4 jedoch auch solche, f¨ur die eine Verbindung zu polarem Wachstum nicht offensicht-lich erscheint. Dazu z¨ahlen z.B. Nuo1 (um11731), das wahrscheinoffensicht-lich eine Untereinheit des mitochondriellen Komplexes I darstellt (Heinrich et al., 1992), und Ubi1 (um02440), welches dem Fusionsprotein aus Ubiquitin und der ribosomalen Untereinheit L40 in anderen Organis-men entspricht (Finley et al., 1989).

Abbildung 5: Auswertung der Ziel-mRNAs von Rrm4. (A) Graphische Darstellung der in den Rrm4-Ziel-Genen angereicherten funktionellen Klassen. Gezeigt ist der Anteil der jeweiligen funktionellen Klasse an den Ziel-Genen von Rrm4 bzw. an allen Genmodellen von U. maydis. Gew¨ahlt wurden alle Klassen, bei denen der Anteil der Rrm4-Ziel-Gene den Anteil an allen Genmodellen signifikant ¨uberstieg (Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05; Ruepp et al., 2004; http://mips.gsf.de/projects/funcat/). (B) Visualisierung des CA-Motivs. Die H¨ohe jeder Spalte ist ein Maß der Konservierung der entsprechenden Position im Motiv (2 bits entsprechen maximaler Konservierung). Die relative H¨ohe der einzelnen Buchstaben spiegelt deren H¨aufigkeit an der je-weiligen Stelle wider (http://weblogo.berkeley.edu/; Crooks et al., 2004).

2.6 CA-Reichtum ist ein m ¨

ogliches Rrm4-Bindemotiv

Im vorherigen Kapitel konnte gezeigt werden, dass die Ziel-mRNAs von Rrm4 funktionelle Ge-meinsamkeiten aufwiesen. Da RNA bindende Proteine h¨aufig bevorzugt bestimmte Sequenz-motive erkennen, sollte nun analysiert werden, ob die Bindestellen von Rrm4 ebenfalls ge-meinsame Motive enthielten. Dazu wurde eine nicht-redundante Liste aller klonierten Sequenz-fragmente erstellt, wobei im Fall der ¨uberlappenden Sequenzen nur das jeweils l¨angste Frag-ment aufgenommen wurde. Diese Liste wurde mit dem Programm MEME (Bailey et al., 2006; http://meme.sdsc.edu/meme/intro.html) analysiert, das f¨ur die Suche nach kurzen Sequenzmo-tiven entwickelt wurde. Damit konnte das in Abb. 5B dargestellte Konsensus-Motiv identifiziert werden. Es war reich an Cytidin- und Adenin-Basen und wurde deshalb im Folgenden als CA-Motiv bezeichnet. Es konnte in 22 der 61 analysierten Sequenzfragmente gefunden werden (siehe Anhang 6.2, Tab. 4). In 31 der 61 Sequenzfragmente waren zudem insgesamt 59 Kopi-en des CACA-Tetranukleotids zu beobachtKopi-en. Ein Beispiel hoher Signifikanz ist das mRNA-Molek¨ul des Gens ubi1, welches 17 direkte Wiederholungen von CA-Dinukleotiden in der klo-nierten Rrm4-Bindestelle trug. Auch in der rho3-mRNA befanden sich 14 CA-Wiederholungen, die allerdings nicht in der Bindestelle, sondern unmittelbar daran anschließend in der 30 UTR gefunden wurden. CA reiche Sequenzbereiche k¨onnten somit ein m¨ogliches Bindemotiv von Rrm4 darstellen.

2.7 Die FISH-Technologie erm ¨

oglicht die Darstellung von

gfp-mRNA in situ

Die CLIP-Experimente konnten zeigen, dass Rrm4 Teil von mRNP-Komplexen ist und dabei mit einer bestimmten Gruppe von Ziel-mRNAs interagiert. Gleichzeitig wird das Protein bi-direktional entlang des Mikrotubuli-Zytoskeletts transportiert (siehe Kapitel 1.5; Becht et al., 2006). Diese Beobachtungen deuten eine Beteiligung des Proteins an subzellul¨arem mRNA-Transport an. Rrm4 k¨onnte dabei die Verteilung der Ziel-mRNAs innerhalb des Filaments be-einflussen. Um dies zu pr¨ufen, wurde die FISH-Technologie f¨ur U. maydis etabliert, mit der die Lokalisation bestimmter Transkripte innerhalb einer Zelle bestimmt werden kann. F¨ur die Etablierungsarbeiten wurde gfp-mRNA gew¨ahlt, da diese sp¨ater als heterologe Kontrolle die-nen konnte. Außerdem wurde gfp-mRNA mit endogedie-nen Transkripten fusioniert, um deren Lo-kalisation unter den zuvor optimierten Bedingungen zu analysieren. Es wurden vier zu gfp-mRNA komplement¨are DNA-Oligonukleotide entworfen, die jeweils an vier Positionen mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Cy3 markiert waren (Abb. 6A). Diese im Weiteren als gfp-Sonden bezeichneten Oligonukleotide sollten unter geeigneten Bedingungen mit gfp-mRNA innerhalb

von fixierten U. maydis-Filamenten hybridisieren. Freie Sonden wurden anschließend durch Waschen entfernt. Die Verteilung der gfp-Sonden innerhalb des Filaments konnte mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikroskopie festgehalten werden. Das dabei detektierte Signal wird im Folgenden als RNA-Signal bezeichnet.

Um die Bedingungen von Fixierung, Hybridisierung und Waschen f¨ur die gfp-Sonden zu opti-mieren, wurden zun¨achst Filamente mit und ohne gfp-mRNA im FISH-Experiment verglichen. Dazu wurden die beiden St¨amme AB33PotefgfpNLSund AB33 verwendet. AB33PotefgfpNLSist

ein Derivat des Stammes AB33, das Gfp mit Kernlokalisationssignal unter Kontrolle des Pro-motors Potef exprimiert. Dieser Stamm enth¨alt im Gegensatz zu AB33 zytoplasmatische

gfp-mRNA und kann mit Hilfe des kernlokalisierten Gfp-Proteins von AB33 unterschieden werden. In Mischexperimenten dieser beiden St¨amme wurden die experimentellen Bedingungen so ein-gestellt, dass sich ein m¨oglichst hoher Signalunterschied bei der Analyse des RNA-Signals er-gab (Abb. 6B). Bei der vergleichenden Betrachtung der Signal-Verteilungen der beiden St¨amme fiel auf, dass das RNA-Signal in AB33PotefgfpNLSpartikelf¨ormig vorlag, w¨ahrend die

Autofluo-reszenz von AB33 keine derartigen Strukturen aufwies. Somit konnte die FISH-Technologie f¨ur den Nachweis von gfp-mRNA in U. maydis etabliert werden.

Abbildung 6 (n¨achste Seite): Etablierung der FISH-Technologie f ¨ur den Nachweis von gfp-mRNA in U. maydis. (A) Schematische Darstellung des kodierenden Bereiches innerhalb der mRNA sowie der Hybridisierungs-Positionen der vier mit Cy3 (roter Kreis) markierten gfp-Sonden (Pfeile). Start- (AUG) und Stoppkodon (UAA) markieren das 50- bzw. 30-Ende. Eine Maß-stabseinheit entspricht 50 nt. Darunter finden sich die vier Oligonukleotid-Sonden in tabellari-scher Auflistung. Die jeweils mit Cy3 markierten Basen sind fett gedruckt. Neben dem GC-Gehalt ist die mit dem Programm Mfold berechnete freie Enthalpie m¨oglicher Sekund¨arstrukturen an-gegeben (Mfold: http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi; Zuker, 2003) (B) Mikroskopische Aufnahmen von in situ mit gfp-Sonden hybridisierten Filamenten. Gezeigt sind Durchlicht- (DIC) , Gfp-Fluoreszenz- (Gfp) und Cy3-Fluoreszenz- (RNA) Aufnahmen der St¨amme AB33PotefgfpNLSund AB33. W¨ahrend in AB33 (rechte Bildh¨alfte) f¨ur Gfp- und

RNA-Signal nur Autofluoreszenz detektiert wird, zeigt sich das Gfp-RNA-Signal in AB33PotefgfpNLS wie

erwartet kernlokalisiert. Das RNA-Signal wird in Form von Partikeln im Zytoplasma wahrgenom-men. Drei Beispielpartikel sind durch Pfeilspitzen markiert (1-3). (C) Intensit¨atsdiagramm des RNA-Signals entlang der Filamente aus (B). Dabei erscheinen die Partikel im Filament des Stam-mes AB33PotefgfpNLS in Form von spitzen Maxima (linkes Diagramm). Die den drei Partikeln

aus (B) entsprechenden Maxima sind durch Pfeilspitzen markiert (1-3). Bei Filamenten von AB33 (rechtes Diagramm) kann die Autofluoreszenz der Zelle beobachtet werden.

2.8 Das Programm PIA erlaubt eine objektive Quantifizierung des

FISH-Signals

Voraussetzung f¨ur den Vergleich von mRNA-Verteilungen unterschiedlicher Transkripte ist eine Quantifizierung der jeweiligen FISH-Signale. Um dies zu erm¨oglichen, wurde zun¨achst das RNA-Signal entlang des Filaments mit Hilfe des Programms Metamorph in einen Graphen ¨ubersetzt, welcher die Signalintensit¨at in Relation zur deren Position im Filament setzt (Abb. 6C). Dabei erschienen die partikelf¨ormigen Signale der gfp-mRNA in Form von spitzen Ma-xima, die dem Autofluoreszenz-Signal des Filaments aufgesetzt waren. Eine M¨oglichkeit, die gfp-mRNA-Verteilung innerhalb des Filaments unabh¨angig von der starken Autofluoreszenz zu quantifizieren, w¨are folglich, die Verteilung der Maxima entlang des Graphen zu bestim-men. Um diese Verteilung m¨oglichst objektiv und automatisiert zu erstellen, wurde in Zusam-menarbeit mit Dr. K. Zarnack das Hilfsprogramm PIA (peak-identifying algorithm) entwickelt, welches die automatische Erkennung der Maxima erm¨oglicht. Der daf¨ur gew¨ahlte Algorithmus wurde in der Programmiersprache Python implementiert (siehe Anhang 6.1). Gewertet wurden solche Maxima, die eine minimale H¨ohe h und eine maximale Breite b besitzen (Abb. 7A). Das Programm PIA erkennt diesen Parametern gen¨ugende Maxima und gibt deren Position aus. Um Filamente unterschiedlicher L¨ange zu vergleichen, werden die Maxima einem von n gleich großen Abschnitten zugeordnet, in die jedes Filament unterteilt wird. Abschließend wird die Anzahl der Maxima in jedem Abschnitt ausgegeben. F¨ur mehrere Filamente kann zus¨atzlich die durchschnittliche Maximazahl pro Abschnitt ermittelt werden. In Abb. 7B ist eine solche Auswertung der in Abb. 6B gezeigten Zellen dargestellt. Die Parameter waren dabei so gew¨ahlt, dass im Stamm AB33 keine Zacken erkannt wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass das Programm PIA in der Lage war, Maxima mit definierten Parametern zu erkennen und bestimmten Bereichen eines Filaments zuzuordnen. Das Programm konnte so im Folgenden dazu verwendet werden, aus mehreren Filamenten durchschnittliche Maxima-Verteilungen zu berechnen.

Abbildung 7: Das Programm PIA erkennt Maxima mit definierten Parametern. (A) Sche-matische Darstellung der Ausdehnungs-Parameter eines von PIA gewerteten Maximums. Beispie-le f¨ur gewertete (gef¨ullte Pfeilspitzen) und nicht gewertete Maxima (ungef¨ullte Pfeilspitzen) sind gezeigt: (1) die minimale H¨ohe h wird unterschritten, (2) die minimale H¨ohe h wird einseitig unterschritten, und (3) die maximale Breite b wird ¨uberschritten. (B) Auswertung der Intensit¨ats-diagramme aus Abb. 6C mit PIA (h = 80; b = 14). Durch das Programm gewertete Maxima sind mit einer gef¨ullten Pfeilspitze markiert. Anschließend wurden die gewerteten Maxima einem von zehn gleich großen Zellabschnitten zugeordnet, in die jedes Filament unterteilt wurde. Die auf diese Weise erhaltene Verteilung findet sich unter den Diagrammen.

2.9 Die Bildung der cdc3-mRNA-Partikel ist von Rrm4 abh ¨angig

Nachdem FISH-Technologie und anschließende Bildauswertung f¨ur gfp-mRNA in U. maydis etabliert waren, sollte mit dieser Methode die subzellul¨are Lokalisation der Ziel-mRNAs von Rrm4 untersucht werden. Daf¨ur wurde cdc3 ausgew¨ahlt, dessen Orthologe in anderen Organis-men an polarem Wachstum beteiligt sind (Gladfelter, 2006). Die entsprechende mRNA stellte somit ein vielversprechendes Ziel f¨ur Rrm4 vermittelte, posttranskriptionelle Regulation dar. Um die cdc3-mRNA mit Hilfe der vier gfp-Sonden detektieren zu k¨onnen, wurde der Stamm AB33Potefcdc3G hergestellt. Dieser exprimierte das Cdc3-Protein unter Kontrolle des

Promo-tors Potef, das an seinem aminoterminalen Ende mit Gfp fusioniert wurde. Die cdc3-mRNA

war also mit gfp-mRNA markiert, um einen Nachweis der Fusions-mRNA (cdc3G-mRNA) im FISH-Experiment zu erm¨oglichen. Die Verwendung des starken Promotors Potef sollte dabei

ein intensives, mit dem Stamm AB33PotefgfpNLSvergleichbares Signal gew¨ahrleisten. Zun¨achst

sollte gepr¨uft werden, ob cdc3G-mRNA eine von gfp-mRNA unterscheidbare subzellul¨are Lo-kalisation aufwies. Da es sich bei gfp-mRNA um ein heterologes Transkript handelte, sollte ihre

subzellul¨are Verteilung nicht von Rrm4 beeinflusst werden. Somit wurde das FISH-Experiment als Vergleich der St¨amme AB33Potefcdc3G und AB33PotefgfpNLSdurchgef¨uhrt. Dabei konnten

in beiden St¨ammen partikelf¨ormige RNA-Signale detektiert werden, die ¨uber die gesamte Fi-lamentl¨ange verteilt waren (Abb. 8A). Um ihre Anordnungen zu vergleichen, wurden mit dem Programm PIA aus jeweils 20 Filamenten die durchschnittlichen Partikel-Verteilungen berech-net. Dabei zeigte AB33Potefcdc3G im Vergleich zu AB33PotefgfpNLSeine geringf¨ugig, jedoch

reproduzierbar erh¨ohte Partikeldichte im Bereich der Hyphenspitze, w¨ahrend sie in der Mutter-zelle verringert war (Abb. 8B).

Um zu pr¨ufen, ob die spezifische Bindung von Rrm4 die cdc3-mRNA-Lokalisation beeinflusst, wurde durch Deletion von rrm4 in AB33Potefcdc3G der Stamm AB33Potefcdc3G/rrm4∆

her-gestellt und mit der FISH-Methode untersucht. Dabei war zu beobachten, dass die Abwesenheit von Rrm4 zu einer drastischen Verringerung der mRNA-Partikel f¨uhrte (Abb. 8A). Die vermin-derte Partikelzahl spiegelte sich auch in der mit PIA berechneten durchschnittlichen Partikel-Verteilung wider (Abb. 8C). Dies deutete an, dass die Partikelbildung aufgrund der Abwesen-heit von Rrm4 gest¨ort war. Um auszuschließen, dass dieser Effekt auf einen generellen Ver-lust der cdc3G-mRNA zur¨uckzuf¨uhren war, wurden die Transkriptmengen in AB33Potefcdc3G

und AB33Potefcdc3G/rrm4∆ mit Hilfe einer Northern-Analyse verglichen. Dabei konnte kein

Unterschied in der Expressionsst¨arke festgestellt werden (K. Zarnack und M. Feldbr¨ugge, un-ver¨offentlicht). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Rrm4 daf¨ur verantwortlich ist, cdc3-mRNA in partikul¨are Strukturen zu rekrutieren. Ob Rrm4 auch an der Partikel-Bildung der heterologen gfp-mRNA beteiligt war, bleibt zum jetzigen Zeitpunkt offen.

Zusammenfassend war es m¨oglich, mit gfp markierte cdc3-mRNA in den Filamenten nachzu-weisen. Diese akkumulierte in Partikeln, deren Bildung von Rrm4 abh¨angig war. Dabei zeigte sich eine reproduzierbare Anreicherung der Partikel im Bereich der Hyphenspitze, deren phy-siologische Relevanz allerdings bisher nicht gezeigt werden konnte. Offen blieb, ob die geringe Auspr¨agung dieses Effekts auf die ¨Uberexpression der cdc3G-mRNA zur¨uckzuf¨uhren war.

Abbildung 8 (n¨achste Seite): Die Verteilung der cdc3G-mRNA-Partikel. (A) Mi-kroskopische Aufnahmen von in situ mit gfp-Sonden hybridisierten Filamenten der St¨amme AB33PotefgfpNLS, AB33Potefcdc3G und AB33Potefcdc3G/rrm4∆. Gezeigt sind

Cy3-Fluoreszenz-Aufnahmen, wobei das RNA-Signal der ersten beiden St¨amme in Form von Partikeln detektiert wird. In AB33Potefcdc3G/rrm4∆ ist die Partikelbildung gest¨ort. (B) Vergleich der mit

PIA bestimmten Maxima-Verteilungen der St¨amme AB33PotefgfpNLSund AB33Potefcdc3G. Die

durchschnittliche Partikelzahl pro Zellabschnitt (Partikeldichte) wurde aus jeweils 20 Filamen-ten berechnet. Die Partikeldichte von AB33Potefcdc3G ¨ubersteigt die von AB33PotefgfpNLS in

den Zellabschnitten 7-9 und unterschreitet sie in den Abschnitten 1-3. (C) Vergleich der St¨amme AB33Potefcdc3G und AB33Potefcdc3G/rrm4∆. Berechnung und Darstellung wie in (B). Die

Par-tikeldichte von AB33Potefcdc3G/rrm4∆ zeigt sich in allen zehn Zellabschnitten drastisch