2.10 Die Expressionsst ¨arke beeinflusst die subzellul ¨are
detek-tiert. Die Partikeldichte nahm jedoch im Stamm mittlerercdc3G-mRNA-Menge zur Filament-spitze hin ab, w¨ahrend sie bei starker Expression zunahm. Es ist davon auszugehen, dass die gleichm¨aßige Partikel-Verteilung unter endogenen Expressionsbedingungen der tats¨achlichen Verteilung der cdc3-mRNA am n¨achsten kommt. In diesem Zusammenhang muss in zuk¨unf-tigen Experimenten gepr¨uft werden, wie sich die heterologegfp-mRNA unter entsprechenden Expressionsbedingungen verh¨alt.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Menge ancdc3G-Transkript einen qualita-tiven Einfluss auf dessen subzellul¨are Lokalisation besaß. Die unter endogenen Expressions-bedingungen beobachtete gleichm¨aßige Verteilung entspricht dabei wahrscheinlich der nat¨urli-chen Situation und ist m¨oglicherweise das Resultat Rrm4 vermittelter Transportprozesse.
2.11 Die Lokalisation des Cdc3-Proteins ist abh ¨angig von Rrm4
Proteine mit subzellul¨ar lokalisierten Transkripten zeigen in der Regel selbst eine polare Vertei-lung innerhalb der Zelle. Deshalb sollte die Lokalisation des Cdc3-Proteins untersucht werden.
Daf¨ur wurde der bereits beschriebene Stamm AB33cdc3G verwendet, der am aminoterminalen Ende mit Gfp fusioniertes Cdc3 vom nativen Locus exprimiert (siehe Kapitel 2.10). In fluo-reszenzmikroskopischen Aufnahmen erschien das als Cdc3G bezeichnete Fusionsprotein mit der Zellperipherie assoziiert, wobei im Bereich der Hyphenspitze ein verst¨arktes Signal auftrat (Abb. 10). Zudem wurde gelegentlich eine Lokalisation am distalen Filamentende beobachtet, welche vermutlich entstehenden oder neu gebildeten Septen entsprach. Neben diesen statischen Signalen waren durch Cdc3G markierte partikul¨are Strukturen erkennbar, die sich bidirektio-nal im Filament bewegten. Um diese Partikel besser beobachten zu k¨onnen, wurde der Stamm AB33Potefcdc3G verwendet, in dem Cdc3G unter Kontrolle des starken Promotors Potef expri-miert wurde (siehe Kapitel 2.9). Auch in diesem Stamm konnte Cdc3G verst¨arkt in der Spitze des Filaments und in beweglichen Partikeln beobachtet werden (Abb. 11A). Partikel und Spitze zeigten wie erwartet eine h¨ohere Signalintensit¨at als in AB33cdc3G. Die Zellen zeigten jedoch auch ein st¨arkeres zytoplasmatisches Signal, wodurch die Assoziation von Cdc3G mit der Zell-peripherie schlechter erkennbar war.
Abbildung 10: Die subzellul¨are Lokalisation des Cdc3G-Proteins. Mikroskopische Durchlicht- (DIC) und Gfp-Fluoreszenz- (Gfp) Aufnahmen eines Filamentes des Stammes AB33cdc3G. In den DIC-Aufnahmen befinden sich in der linken Bildh¨alfte am distalen Filament-ende zwei leere Abschnitte, die Filamentspitze zeigt nach rechts. Der Gr¨oßenmaßstab (weißer Balken) entspricht 10µm. In den Gfp-Bildern kann ein Signal mit der Zellperipherie assoziiert sowie verst¨arkt in der Filamentspitze (Pfeil) beobachtet werden. Der durch das weiße Rechteck markierte Bereich ist unter dem Gfp-Bild in einer Zeitreihe von f¨unf Bildern (0 s - 2 s) vergr¨oßert dargestellt. Die Pfeilspitzen markieren zwei sich anterograd (ungef¨ullt) bzw. retrograd (gef¨ullt) bewegende Partikel. Darunter ist eine ¨Uberlagerung der Bilder zu den Zeitpunkten 0 s (gr¨un) und 0,5 s (rot) gezeigt. Unbewegliche Strukturen erscheinen dabei gelb. Sich bewegende Objekte bilden sich als nebeneinander liegende gr¨une und rote Signale ab. Die beiden Partikel der Zeitreihe sind durch entsprechende gr¨une und rote Pfeilspitzen markiert.
Nachdem eine Rrm4 vermittelte, posttranskriptionelle Regulation der cdc3-mRNA als wahr-scheinlich angenommen wurde, sollte gepr¨uft werden, ob die Abwesenheit von Rrm4 einen Einfluss auf die subzellul¨are Lokalisation des Cdc3-Proteins besitzt. Dazu wurde die Verteilung von Cdc3G im Stamm AB33Potefcdc3G/rrm4∆ mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikroskopie stu-diert. Dabei konnten keine beweglichen Partikel beobachtet werden und die Spitzenlokalisation von Cdc3G war stark reduziert (Abb. 11B). Diese Beobachtungen belegten den weitreichenden Einfluss von Rrm4 auf die subzellul¨are Verteilung von Cdc3.
Abbildung 11: Die Cdc3G-Lokalisation ist abh¨angig von Rrm4. (A) Mikroskopische Durchlicht- (DIC) und Gfp-Fluoreszenz- (Gfp) Aufnahmen eines Filamentes des Stammes AB33Potefcdc3G. Der Gr¨oßenmaßstab (weißer Balken) entspricht 10µm. Im Gfp-Bild wird ein in der Filamentspitze verst¨arktes Signal beobachtet. Die durch die weißen Rechtecke markierten Bereiche sind unter dem Gfp-Bild in zwei Zeitreihen von je f¨unf Bildern (0 s - 2 s) vergr¨oßert dar-gestellt. Die Pfeilspitzen markieren sich anterograd (ungef¨ullt) bzw. retrograd (gef¨ullt) bewegende Partikel. Darunter ist eine ¨Uberlagerung der Bilder zu den Zeitpunkten 0 s (gr¨un) und 0,5 s (rot) gezeigt (siehe Abb. 10).(B)Mikroskopische Aufnahmen des Stammes AB33Potefcdc3G/rrm4∆.
DIC- und Gfp-Aufnahmen, sowie ¨Uberlagerung wie in (A). Es kann eine Lokalisation von Cdc3G weder an den Filamentspitzen noch in den beweglichen Partikeln beobachtet werden.
Somit konnte Cdc3 in Fusion mit Gfp an den Filamentspitzen sowie in sich bewegenden Parti-keln nachgewiesen werden. In Abwesenheit von Rrm4 waren die Bildung beweglicher Partikel aufgehoben und die Spitzenlokalisation stark beeintr¨achtigt. Diese Ergebnisse waren ein star-ker Hinweis auf die Beteiligung von Rrm4 an der posttranskriptionellen Regulation voncdc3.
Im Speziellen korrelierte der Verlust der subzellul¨aren Lokalisation des Cdc3-Proteins mit der ebenfalls Rrm4 abh¨angigen Rekrutierung dercdc3-mRNA in Partikel (siehe Kapitel 2.9).
Da die Deletion von rrm4 einen deutlichen Einfluss auf die cdc3-mRNA- und Proteinlokali-sation zeigte, sollte gepr¨uft werden, ob Cdc3 eine Rolle beim filament¨osen Auswachsen ¨uber-nimmt. Als erster Schritt wurde daher die Filament-Entwicklung des cdc3-Deletionsstammes AB33cdc3∆studiert. Initiale Experimente deuteten darauf hin, dass die Wachstumsgeschwin-digkeit dieser Filamente nicht beeintr¨achtigt war. Interessanterweise schien jedoch die An-zahl bipolar wachsender Zellen erh¨oht. Dieser Polarit¨atsdefekt, der auch Teil des rrm4-Deletionsph¨anotyps ist, k¨onnte als Hinweis gedeutet werden, dass die Fehlverteilung von Cdc3 in Abwesenheit von Rrm4 an der St¨orung des filament¨osen Wachstums beteiligt ist. Wenn-gleich eine Quantifizierung der Rate bipolaren Filamentwachstums dercdc3-Deletionsst¨amme noch aussteht, legten diese Beobachtungen nahe, dasscdc3-Transkripte ein entscheidendes Ziel Rrm4 vermittelter, posttranskriptioneller Regulation darstellen.
3 Diskussion
Eine Grundvoraussetzung f¨ur filament¨oses Wachstum ist die Etablierung und Aufrechter-haltung einer definierten Polarit¨atsachse. Aktive Transportprozesse entlang des Mikrotubuli-Zytoskeletts spielen dabei eine fundamentale Rolle. InU. maydisist das putativ RNA bindende Protein Rrm4 Teil von Partikeln, die sich bidirektional entlang von Mikrotubuli durch das Fila-ment bewegen. Dieser Prozess ist Voraussetzung f¨ur korrektes Ausbilden der Polarit¨atsachse sowie f¨ur volle Pathogenit¨at des Pilzes. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Rrm4 in vivo bestimmte Transkripte bindet und so deren Verteilung im Filament beeinflusst. Entspre-chend schien Rrm4 vermittelter mRNA-Transport Auswirkungen auf die Lokalisation der in den Transkripten kodierten Proteine zu haben. Weiterhin konnten erste Hinweise gesammelt werden, dass die daraus resultierende Fehllokalisation bestimmter Proteine im Zusammenhang mit dem inrrm4-Deletionsst¨ammen beobachteten Polarit¨atsverlust steht.
3.1 Rrm4 bindet in vivo mRNA
Das Protein Rrm4 enth¨alt zwei funktionell wichtige RRM-Dom¨anen und k¨onnte somitin vivoan RNA binden (Becht, 2005; Bechtet al., 2006). Um von Rrm4 gebundene Transkripte zu identi-fizieren, wurden in der Vergangenheit SELEX-Experimente (systematic evolution of ligands by exponential enrichment; Tuerk und Gold, 1990) und Durchforstungsstudien mit dem Hefe-Drei-Hybrid-System angewendet (SenGuptaet al., 1996). Obwohl mit beiden Ans¨atzen Rrm4 bin-dende RNA-Aptamere identifiziert wurden, konnten diese nicht mit Transkripten in Verbindung gebracht werden, diein vivomit Rrm4 interagieren (J. K¨onig und M. Feldbr¨ugge, unver¨offent-licht; K¨onig et al., 2007). Deshalb sollten in dieser Arbeit Rrm4-RNA-Komplexe direkt aus lebenden Zellen gereinigt werden. Zu diesem Zweck wurde die CLIP-Methode ausgew¨ahlt, die RNA-Immunopr¨azipitation durch UV-Strahlung induzierte, kovalente Kreuzvernetzung der Protein-RNA-Komplexe erg¨anzt (Ule et al., 2003; Denman, 2006). Dadurch wird verhindert, dass sich unter den in vitro-Bedingungen der Aufreinigung artifizielle RNP-Komplexe bilden, die bei herk¨ommlicher Aufreinigung beobachtet wurden (Mili und Steitz, 2004; Darnell et al., 2005). Mit dem Einsatz dieser Methode konnte zun¨achst gezeigt werden, dass Rrm4 in vivoRNA bindet. Entscheidende Ergebnisse hierf¨ur waren, dass das mit Rrm4 aufgenommene Signal abh¨angig von UV-Bestrahlung sowie sensitiv gegen¨uber RNase-Spaltung war und dass Kreuzvernetzung nur im Bereich der RRM-Dom¨anen detektiert werden konnte. Zudem konnten nach Kreuzvernetzung 55 durch Rrm4 gebundene Transkripte identifiziert werden, hingegen keine in den unbestrahlten Kontrollen. Diese Ergebnisse sind in ¨Ubereinstimmung mit
CLIP-Experimenten mit dem alternativen Spleißfaktor Nova. Dabei konnte CLIP zum ersten und vor-erst einzigen Mal erfolgreich eingesetzt werden, um diein vivo-Bindestellen dieses Regulators in der mRNA-Population von Mausgehirnen zu kartieren (Uleet al., 2003; Jambhekar und De-Risi, 2007).
Die Analyse unterschiedlicher Rrm4-Varianten mit Punktmutationen in den konservierten RNA-Kontaktregionen von RRM1 bzw. RRM3 zeigte, dass beide Dom¨anen mit RNA in Kon-takt stehen. Dabei war ¨uberraschend, dass der st¨arkste Kreuzvernetzungsverlust bei Mutation von RRM3 zu beobachten war, obgleich diese auf zellul¨arer Ebene die Funktion des Proteins nicht beeintr¨achtigten. Eine Quantifizierung der RNA-Bindung von Rrm4 nach UV induzier-ter kovaleninduzier-ter Verkn¨upfung ist jedoch schwierig, da bei Punktmutationen einzelner Dom¨anen nicht zwischen tats¨achlichem Bindungsverlust und reduzierter Kreuzvernetzung unterschieden werden kann. Dies ist vorallem wichtig, da die drei RRM-Dom¨anen von Rrm4 wahrschein-lich unterschiedwahrschein-liche Kreuzvernetzungskompetenz besitzen. Voraussetzung f¨ur Kreuzvernet-zung sind Aminos¨auren wie Cys, Lys, Phe, Trp und Tyr, die sich in direkter Umgebung der RNA befinden m¨ussen (Shetlar et al., 1984; Hockensmith et al., 1986; Brimacombe et al., 1988).
Daf¨ur stehen innerhalb der konservierten RNA-Kontaktregionen RNP1 und RNP2 vier konser-vierte Positionen zur Verf¨ugung, deren Aminos¨aurereste der Bindungsoberfl¨ache zugewendet sind (Maris et al., 2005). In RRM3 von Rrm4 sind drei dieser Reste kreuzvernetzungskom-petent, w¨ahrend RRM1 und RRM2 jeweils nur einen solchen Aminos¨aurerest besitzen. Somit k¨onnte Kreuzvernetzung verst¨arkt in RRM3 stattfinden, obwohl alle drei RRM-Dom¨anen an der RNA-Bindung beteiligt sind. RRM1 und RRM2 k¨onnten dabei gemeinschaftlich die Spezifit¨at der RNA-Erkennung steuern, da sie funktionell wichtig sind, w¨ahrend RRM3 durch unspezifi-sche Bindung den Protein-RNA-Komplex stabilisiert. Bei Mutation von RRM3 k¨onnte dieser in vivoweiter bestehen, die Kreuzvernetzung w¨are jedoch wie im Experiment beobachtet stark reduziert. Funktionelle Unterschiede zwischen den beiden Tandem-RRM-Dom¨anen und RRM3 konnten auch bei einer Kombination der Ergebnisse aus den SELEX-Experimenten mit dem Hefe-Drei-Hybrid-System beobachtet werden. Es zeigte sich dabei, dass alle dabei identifizier-ten RNA-Aptamere von RRM3 gebunden wurden, jedoch keine von RRM1 und RRM2 (K¨onig et al., 2007).
Beobachtungen dieser Art sind in ¨Ubereinstimmung mit Ergebnissen, die beim Studium ande-rer ELAV-¨ahnlicher Proteine erzielt wurden. In HuC, HuD und HuR aus S¨augern stabilisiert die dritte RRM-Dom¨ane durch Bindung an den Poly(A)-Schwanz die spezifische Erkennung be-stimmter mRNAs durch die beiden ersten RRM-Dom¨anen (Abeet al., 1996; Maet al., 1997).
Auch im menschlichen U2AF65 ¨ubernimmt die dritte RRM-Dom¨ane eine von den beiden ersten
unterschiedliche Funktion. Sie wird nicht f¨ur RNA-Bindung und Spleißaktivit¨at des Proteinsin vitroben¨otigt, ist jedochin vivowichtig f¨ur die Funktion des Proteins (Banerjeeet al., 2004).
In dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Bindung von Rrm4 w¨ahrend des filament¨osen Wachstums zunimmt. Dies korrelierte mit verst¨arkter Partikelbildung (Becht et al., 2006) und unterst¨utzte die Hypothese, dass Rrm4 eine spezifische Rolle w¨ahrend des fila-ment¨osen Wachstums einnimmt. M¨ogliche molekulare Ursachen f¨ur die Bindungszunahme w¨aren die verst¨arkte Anwesenheit von Rrm4-Ziel-mRNAs, eine posttranskriptionelle Modifika-tion von Rrm4, die dessen Bindeeigenschaften moduliert, oder das Auftreten von InterakModifika-tions- Interaktions-partnern, die f¨ur RNA-Bindung wichtig sind. Die erste M¨oglichkeit erscheint unwahrschein-lich, da bei Transkriptom weitenMicroarray-Studien w¨ahrend des ¨Ubergangs zur filament¨osen Form keine der 55 identifizierten Ziel-mRNAs von Rrm4 als differentiell reguliert gefunden wurde (M. Scherer und J. K¨amper, pers¨onliche Mitteilung). Auch posttranskriptionelle Modifi-kationen konnten bei einem Vergleich von Rrm4 aus Sporidien und Filamenten mit Hilfe von Massenspektrometrie nicht detektiert werden (F. Kaffarnik und J. K¨onig, Daten nicht gezeigt).
Als wahrscheinlich wird darum die Wechselwirkung von Rrm4 mit anderen Interaktionspart-nern angenommen. Diese Hypothese wird durch die Beobachtung gest¨utzt, dass Mutationen in der Protein-Protein-Interaktionsdom¨ane PABC von Rrm4 zu reduzierter RNA-Bindung f¨uhrten.
Die Notwendigkeit entsprechender Interaktionspartner f¨ur die RNA-Erkennung k¨onnte zudem die Probleme bei der Anwendung der SELEX-Technologie und des Hefe-Drei-Hybrid-Systems erkl¨aren, da diesein vitrobzw. inS. cerevisiaeabwesend sein sollten.
Grunds¨atzlich werden in anderen Systemen alle drei M¨oglichkeiten beobachtet. In D. melanogaster lokalisieren bestimmte in den Embryo injizierte RNAs, obwohl sie zu diesem Zeitpunkt eigentlich nicht vorliegen (Bullock und Ish-Horowicz, 2001). In S¨auger-Zellkultur konnte gezeigt werden, dass die RNA bindenden Eigenschaften von ZBP1 durch Phosphorylie-rung negativ beeinflusst werden, was zu AktiviePhosphorylie-rung der Translation von β-aktin-mRNA f¨uhrt (H¨uttelmaieret al., 2005). Eine stabile Bindung der menschlichen RNA-Helikase eIF4AIII an Exon-Grenzen wird durch eine Interaktion mit den anderen Komponenten des EJC-Komplexes, Barentsz, Mago, und Y14, erreicht (Bonoet al., 2006).