4.1.1 Medien, L ¨osungen, Enzyme und Kits Chemikalien:
Alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien waren p.a. Qualit¨at und wurden von den Fir-men Ambion, Sigma-Aldrich, Merck, Fluka, Riedel-de Hahn, Gerbu, Seakem, Duchefa, Difco, Serva, BioRad, Amersham, Pharmacia, Invitrogen und Carl Roth bezogen.
Puffer und L¨osungen:
Standard-Puffer und L¨osungen wurden nach Ausubelet al.(1987) und Sambrooket al.(1989) hergestellt. Spezielle Puffer und L¨osungen sind unter den jeweiligen Methoden aufgef¨uhrt sein.
Medien:
F¨ur die Kultivierung von E. coliwurden dYT-Fl¨ussigmedium und YT-Festmedium verwendet (Ausubel et al., 1987; Sambrook et al., 1989), welche 5 min bei 121◦C autoklaviert wurden.
Ampicillin wurde in einer Konzentration von 100µg/ml eingesetzt (YT-Amp).
F¨ur die Kultivierung vonU. maydiswurden folgende Medien verwendet, die wenn nicht anders angegeben, 5 min bei 121◦C autoklaviert wurden.
CM-Glk Vollmedium
(Holliday, 1974; Banuett und Herskowitz, 1989):
1,5 g NH4NO3
2,5 g Casamino Acids 0,5 g DNA
1 g Yeast Extract
10 ml Vitamin-L¨osung (siehe unten) 62,5 ml Salz-L¨osung (siehe unten) 1 ml Spurenelement-L¨osung (siehe unten) 20 g Bacto Agar (f¨ur Platten)
mit H2O auf 980 ml aufgef¨ullt,
pH-Wert auf 7,0 mit NaOH eingestell und auto-klaviert.
nach dem Autoklavieren:
20 ml 50% (w/v) Glukose-L¨osung
NM-Glk Medium (Holliday, 1974):
3 g KNO3
62,5 ml Salz-L¨osung
mit H2O auf 980 ml aufgef¨ullt,
pH-Wert auf 7,0 mit KOH eingestell und autokla-viert.
nach dem Autoklavieren:
20 ml 50% (w/v) Glukose-L¨osung
YEPSL-Medium, modifiziert nach (Tsukuda et al., 1988):
10 g Yeast Extract 10 g Pepton 10 g Saccharose
mit H2O auf 1 l aufgef¨ullt.
Salz-L¨osung(Holliday, 1974):
16 g KH2PO4: 4 g Na2SO4
8 g KCl
4 g MgSO4x 7 H2O 1,32 g CaCl2x 2 H2O 8 ml Spurenelement-L¨osung
mit H2O auf 1 l aufgef¨ullt und sterilfiltriert.
Spurenelement-L¨osung(Holliday, 1974):
60 mg H3BO3
140 mg MnCl2x 4 H2O 400 mg ZnCl2
40 mg NaMoO4x 2 H2O 100 mg FeCl3x 6 H2O 40 mg CuSO4x 5 H2O
Mit H2O auf 1 l aufgef¨ullt und sterilfiltriert.
Vitamin-L¨osung(Holliday, 1974):
100 mg Thiamin 50 mg Riboflavin 50 mg Pyridoxin
200 mg Calciumpantothenat 500 mg p-Aminobenzoes¨aure 200 mg Nikotins¨aure
200 mg Cholinchlorid 1000 mg myo-Inositol
Mit H2O auf 1 l aufgef¨ullt und sterilfiltriert.
Regenerationsagar(Schulzet al., 1990):
(a) Top-Agar:
1,5% (w/v) Bacto-Agar 1 M Sorbitol
in YEPS-Medium (siehe oben) (b) Bottom-Agar:
wie (a), zus¨atzlich 400 g/ml Hygromyzin oder 4 µg/ml Carboxin
oder 150 g/ml Nourseotricin (ClonNat)
NSY-Glycerin(Einfriermedium):
8 g Nutrient Broth 1 g Yeast Extract 5 g Saccharose
800 ml 87% (v/v) Glycerin mit H2O auf 1 l aufgef¨ullt.
Verwendete Kits und Enzyme:
JETquick Plasmid Miniprep Kit (Genomed) zur Pr¨aparation hochreiner Plasmid-DNA, JET-quick General DNA Clean-Up Kit (Genomed) zur Aufreinigung von Plasmiden vor der Sequen-zierung, TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) zur Klonierung von PCR-Produkten. Restriktions-enzyme wurden von NEB Biolabs bezogen. Die PhusionTMHigh-Fidelity DNA Polymerase war von NEB und die Taq DNA-Polymerase eine Laborpr¨aparation. Weiteres verwendetes Material ist unter den jeweiligen Methoden beschrieben.
4.1.2 Oligonukleotide
Die Oligonukleotide wurden von der Firma metabion GmbH und Purimex synthetisiert. Die Nukleotidsequenz ist jeweils vom 50-Ende in Richtung 30-Ende angegeben.
Verwendete Oligonukleotide:
DNA-Oligonukleotide
oMF969-ClapT5 AGTTGATGTTTTTCTGATGC
oMF970-ClapT3 AGCTCCCAGGCTCAGATC
oMF973-ClapT5aussen GCAGTTGATGTTTTTCTGAT
oMF974-ClapT3A AGCTCCCAGGCTCAGATCA
oMF975-ClapT3T AGCTCCCAGGCTCAGATCT
oMF976-ClapT3C AGCTCCCAGGCTCAGATCC
Gfp-Sonden #1-4 siehe Abb. 6A RNA-Oligonukleotide
oR043801 GCAGUUGAUGUUUUUCUGAUGC
oR043802 GAUCUGAGCCUGGGAGCU mit 30-FI
4.1.3 St ¨amme U. maydis-St¨amme:
Die St¨amme in Tabelle 2 dienten in dieser Arbeit als Ausgangs- und/oder Testst¨amme, die in Tabelle 3 aufgef¨uhrten St¨amme wurden in dieser Arbeit hergestellt. In allen hergestellten St¨ammen wurden die homologen Rekombinationsereignisse durch Southern-Analyse best¨atigt.
Tabelle 2: Die verwendeten Ausgangs- bzw. Testst¨amme
Stamm Genotyp UMa Referenz
AB33 a2 PnarbW2 bE1 133 Brachmannet al., 2001
AB33rrm4∆ a2 PnarbW2 bE1 273 Bechtet al., 2006
Tabelle 3: Die in dieser Arbeit hergestellten St¨amme
Stamm Genotyp UMa Integriertes Plasmid Lokus Ausgangsstamm Referenz
AB33PotefgfpNLS a2 PnarbW2 bE1 404 pPotefgfpNLS-CbxR ip AB33 S. Baumann,
ipr[PotefgfpN LS]ips unver¨offentlicht
AB33rrm4GT a2 PnarbW2 bE1 rrm4GT 303 pRrm4GT-NatR rrm4 AB33rrm4∆ Bechtet al., 2006 AB33rrm4GTmR1 a2 PnarbW2 bE1 341 pRrm4GTmR1-NatR rrm4 AB33rrm4∆ Bechtet al., 2006
rrm4GTmR1
AB33rrm4GTmR3 a2 PnarbW2 bE1 343 pRrm4GTmR3-NatR rrm4 AB33rrm4∆ Bechtet al., 2006 rrm4GTmR3
AB33rrm4GTmP a2 PnarbW2 bE1 359 pRrm4GTmP-NatR rrm4 AB33rrm4∆ Bechtet al., 2006 rrm4GTmP
AB33cdc3∆ a2 PnarbW2 bE1 cdc3∆ 442 pCdc3∆-HygR cdc3 AB33 diese Arbeit
AB33cdc3G a2 PnarbW2 bE1 cdc3G 449 pCdc3G-NatR cdc3 AB33cdc3∆ diese Arbeit AB33Potefcdc3G a2 PnarbW2 bE1 421 pPotefcdc3G-CbxR ip AB33 diese Arbeit
ipr[Potefcdc3G]ips
AB33Potefcdc3G/rrm4∆ a2 PnarbW2 bE1 rrm4∆ 434 pPotefcdc3G-CbxR ip AB33rrm4∆ diese Arbeit ipr[Potefcdc3G]ips
AB33mPotefcdc3G a2 PnarbW2 bE1 443 pPotefcdc3G-CbxR ip AB33 diese Arbeit ipr[Potefcdc3G](m)ips
E. coli-St¨amme:
F¨ur s¨amtliche Klonierungen wurde der Stamm TOP10 (Invitrogen) benutzt, ein E. coli K12-Derivat mit dem Genotyp: F−, mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZ∆M15, ∆lacX74, deoR,recA1,araD139,∆(ara-leu)7697,galU,galK,rpsL(StrR),endA1,nupG.
4.1.4 Plasmide und Plasmidkonstruktionen
Alle verwendeten Plasmide tragen eine Ampicillin-Resistenzkassette zur Selektion in E. coli.
Alle Klonierungsschritte wurden durch Restriktionsanalyse ¨uberpr¨uft, alle eingebrachten PCR-Amplifikate sequenziert.
Ausgangsplasmide und Klonierungsvektoren:
pCR2.1R-TOPO(Invitrogen)
Vektor zum Klonieren von PCR-Produkten mittels Topoisomerase-Aktivit¨at. Blau/Weiß-Selektion auf Anwesenheit eines insertierten Fragments ist m¨oglich.
p123(pUMa43; Aichinger, 2000)
Plasmid f¨ur die Integration in denip-Locus. Tr¨agt außer der daf¨ur n¨otigen Carboxin-Resistenz den Promotor Potef(896 bp langesKpnINcoI-Fragment), der die Expression vonegfp(als 763 bp großesNcoINotI-Fragment; Spelliget al., 1996) kontrolliert. Transkriptionsstopp erfolgt durch den Terminator Tnos(Bevanet al., 1983).
pMF1-n(pUMa262; Brachmannet al., 2004)
Der Vektor enth¨alt eineSfiI-Kassette mit Nourseothrizin-Resistenz, die vorwiegend f¨ur die Her-stellung von Deletionsmutanten verwendet wird.
pMF5-3n(pUMa737; Bechtet al., 2006)
Der Vektor enth¨alt eine SfiI-Kassette analog zu Brachmann et al. (2004). Die Kasette enh¨alt egfp(Spelliget al., 1996), gefolgt von einem Kodon optimiertentap tag-Epitop (Rigautet al., 1999) und dem Terminator Tnos(Bevanet al., 1983), sowie einer Nourseothrizin-Resistenz.
pBS-hhn(pUMa194; K¨amper, 2004)
Der Vektor enth¨alt eine 1,8 kbp großeSfiISfiI-Kasette die ein Hygromyzin-Resistenzgen, beste-hend aus hsp70-Promotor,hph-Gen und Terminator Tnosenth¨alt. Kassette wird f¨ur die Herstel-lung von Deletionsmutanten verwendet.
pRrm4G-NatR(pUMa496; Bechtet al., 2006)
Plasmid f¨ur die Expression einer carboxyterminalen Fusion von Rrm4 mit Gfp unter dem na-tiven Promotor. Es enth¨alt eine 3,2 kbp große stromaufw¨arts liegende Flanke inklusive des 2,3 kbp großen offenen Leserahmen von rrm4, sowie eine 1.9 kbp lange stromabw¨arts liegen-de Flanke f¨ur die homologe Rekombination am rrm4-Locus. Dazwischen wurde eine 2.4 kb großes SfiI/SfiI-Fragment aus pMF5-1n (pUMa389) eingef¨ugt. Es enth¨alt egfp (Spellig et al., 1996) und den Terminator Tnos(Bevanet al., 1983), sowie eine Nourseothrizin-Resistenz. Das Plasmid wurde f¨ur die Integration in den endogenenrrm4-Locus verwendet.
pRrm4GmR1-NatR(pUMa634; Bechtet al., 2006)
Wie pRrm4G-NatR, tr¨agt jedoch Mutationen inrrm4, die in RRM1 zur Substitution der folgen-den Aminos¨auren f¨uhren: T116A, V117A, E118A, F119A.
pRrm4GmR3-NatR(pUMa637; Bechtet al., 2006)
Wie pRrm4G-NatR, tr¨agt jedoch Mutationen inrrm4, die in RRM3 zur Substitution der folgen-den Aminos¨auren f¨uhren: F365A, V366A, S367A und F368A.
pRrm4GmP-NatR(pUMa607; Bechtet al., 2006)
Wie pRrm4G-NatR, tr¨agt jedoch Mutationen inrrm4, die in der PABC-Dom¨ane zur Substitution der folgenden Aminos¨auren f¨uhren: F740A, I743A, A751G, K753A.
In dieser Arbeit hergestellte Plasmide:
pPotefgfpNLS-CbxR(pUMa932; S. Baumann, unver¨offentlicht)
Enth¨alt ein am carboxyterminalen Ende mit Kernlokalisationsequenz markiertes egfp-Gen (Spelliget al., 1996) als 763 bp großesNcoINotI-Fragment. Die Expression steht unter Kontrol-le des Promotors Potef, einem 896 bp langenKpnINcoI-Fragment. Die Transkription wird durch den Terminator Tnos (306 bp NotIEcoRV-Fragment; Bevanet al., 1983) gestoppt. Plasmid zur Integration in denip-Locus.
pRrm4GT-NatR(pUMa603; Bechtet al., 2006)
Plasmid f¨ur die Expression einer carboxyterminalen Fusion von Rrm4 mit Gfp und dem Tap tag-Epitop unter dem nativen Promotor. Es enth¨alt eine 3,2 kbp große stromaufw¨arts liegende Flanke inkulsive des 2,3 kbp großen offenen Leserahmens vonrrm4, sowie eine 1,9 kbp lange stromabw¨arts liegende Flanke f¨ur die homologe Rekombination am rrm4-Locus. Dazwischen wurde eine 3 kb großesSfiI/SfiI-Fragment aus pMF5-3n (pUMa737) eingef¨ugt. Es enth¨altegfp (Spelliget al., 1996), gefolgt von dem Kodon optimiertentap tag-Epitop (Rigautet al., 1999) und dem Terminator Tnos(Bevanet al., 1983), sowie einer Nourseothrizin-Resistenz. Das Plas-mid wurde f¨ur die Integration in den endogenenrrm4-Locus verwendet.
pRrm4GTmR1-NatR(pUMa698; Bechtet al., 2006)
Wie pRrm4GT, tr¨agt jedoch Mutationen in rrm4, die in RRM1 zur Substitution der folgenden Aminos¨auren f¨uhren: T116A, V117A, E118A, F119A. Hergestellt durch Ligation der SfiISfiI-Fragmente aus pRrm4GmR1-NatR (8198 bp; pUMa634) und pRrm4GT (2987 bp; pUMa603).
Das Plasmid wurde f¨ur die Integration in den endogenenrrm4-Locus verwendet.
pRrm4GTmR3-NatR(pUMa700; Bechtet al., 2006)
Wie pRrm4GT, tr¨agt jedoch Mutation in rrm4, die in RRM3 zur Substitution der folgen-den Aminos¨auren f¨uhren: F365A, V366A, S367A und F368A. Hergestellt durch Ligation der
SfiISfiI-Fragmente aus pRrm4GmR3-NatR (8198 bp; pUMa637) und pRrm4GT (2987 bp; pU-Ma603). Das Plasmid wurde f¨ur die Integration in den endogenenrrm4-Locus verwendet.
pRrm4GTmP-NatR(pUMa724; Bechtet al., 2006)
Wie pRrm4GT, tr¨agt jedoch Mutation in rrm4, die in der PABC-Dom¨ane zur Substitution der folgenden Aminos¨auren f¨uhren: F740A, I743A, A751G, K753A. Hergestellt durch Ligation der SfiISfiI-Fragmente aus pRrm4GmP-NatR (8198 bp; pUMa657) und pRrm4GT (2987 bp;
pUMa603). Das Plasmid wurde f¨ur die Integration in den endogenenrrm4-Locus verwendet.
pCdc3∆-HygR(pUMa1004)
Plasmid f¨ur die Herstellung von Deletionsmutanten des cdc3-Gens. Es enth¨alt eine 1,7 kbp große stromaufw¨arts des offenen Leserahmens von cdc3liegende Flanke, sowie eine 1,1 kbp lange stromabw¨arts liegende Flanke. Dazwischen wurde ein 1,8 kb großes SfiI/SfiI-Fragment aus pBS-hhn (pUMa194) eingef¨ugt. Es enth¨alt eine Hygromyzin-Resistenz. Das Plasmid wurde f¨ur die Integration in den endogenencdc3-Locus verwendet.
pCdc3G-NatR(pUMa1028)
Plasmid f¨ur die Expression einer aminoterminalen Fusion von Cdc3 mit Gfp unter dem nati-ven Promotor. Es enth¨alt eine 1,7 kbp große stromaufw¨arts des offenen Leserahmens voncdc3 liegende Flanke, sowie eine 1,1 kbp lange stromabw¨arts liegende Flanke. An die linke Flanke anschließend findet sichegfpals 719 bp großesXbaIBsrgI-Fragment, gefolgt von dem offenen Leserahmen des cdc3-Gens mit 0,6 kbp 30-UTR (2154 bp langes BsrgISfiI-Fragment). Daran schließt sich die Nourseothrizin-Resistenz als 1437 bp großeSfiISfiI-Kassette aus pMF1-n (pU-Ma 262) an. Das Plasmid wurde f¨ur die Integration in den endogenencdc3-Locus verwendet.
pPotefcdc3G-CbxR(pUMa987)
Enth¨alt den am aminoterminalen Ende mit egfp (XmaIBsrgI-Fragment, 733 bp; Spellig et al., 1996) markierten offenen Leserahmen voncdc3mit 0,6 kbp 30-UTR unter Kontrolle des Promo-tors Potef, einem 896 bp langenKpnINcoI-Fragment. Plasmid zur Integration in denip-Locus.