Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und aus dem
Universitätsklinikum Münster
Medizinische Klinik und Poliklinik C (Kardiologie und Angiologie) __________________________________________________________
Kardiale Phänotypisierung heterozygoter Plakoglobin-defizienter Mäuse mittels Echokardiographie und Telemetrie
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Melanie Zwiener
aus Schloß Holte- Stukenbrock
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder Tierärztliche Hochschule Hannover PD Dr. Paulus Kirchhof
Universitätsklinikum Münster
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder
2. Gutachter: Prof. Dr. Gregor Hauschild
Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2006
Die Dissertation wurde angefertigt im Rahmen des Projektes Ki 099-04 des IZKF Münster mit Unterstützung der zentralen Projektgruppe „Kleintierphänotypisierung“
des IZKF Münster (ZPG 4).
Meinem Mann
und meinen Eltern gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung...9
2. Stand der Forschung...12
2.1 ARVC (Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie)... 12
2.1.1 Naxos-Disease beim Menschen... 17
2.1.2 ARVC bei Tieren ... 19
2.1.2.1 Poll Hereford Kälber ... 19
2.1.2.2 Hund... 19
2.1.2.3 Katze ... 21
2.1.2.4 Maus... 21
2.2 Plakoglobin... 22
2.2.1 Aufbau... 22
2.2.2 Funktion ... 22
2.2.2.1 Intercalated Discs – Plakoglobin vs. β-Catenin ... 24
2.2.2.1.1 Desmosomen... 25
2.2.2.1.2 Adherens Junctions ... 26
2.2.2.2 Wnt-Signalweg ... 26
2.2.2.3 Phosphorylierung... 27
2.2.2.4 Plakoglobin als Transkriptionsfaktor ... 29
2.2.2.5 Apoptose / Tumorentwicklung ... 30
2.3 Plakoglobin-Defizienz... 32
2.4 Elektrokardiographie bei der Maus ... 34
2.5 Echokardiographie bei der Maus ... 36
2.6 Fragestellung... 38
3. Experimenteller Teil...40
3.1 Tiere und Tierhaltung ... 40
3.1.1 Plakoglobin-defiziente Mäuse ... 40
3.1.2 Tierhaltung ... 42
3.2 Elektrophysiologische Untersuchungen ... 43
3.2.1 Erstellung des Oberflächenelektrokardiogramms... 43
3.2.2 Erstellung des telemetrischen Elektrokardiogramms ... 44
3.2.2.1 Aufbau der Anlage... 44
3.2.2.2 Implantation des Transmitters ... 47
3.2.2.3 Erstellung des Ruhe-EKGs... 49
3.2.2.4 Erstellung des Belastungs-EKGs... 49
3.2.3 Auswertung der Elektrokardiogramme ... 50
3.2.4 Telemetrisches EKG mit sympathomimetisch wirksamen Pumpen... 52
3.2.4.1 Implantation der Pumpen ... 52
3.3 Transthorakale Echokardiographie ... 53
3.3.1 Durchführung ... 53
3.3.2 Auswertung ... 58
3.4 Schwimmtraining ... 63
3.4.1 Durchführung ... 63
3.4.2 Auswertung ... 63
3.5 Elektrophysiologische Untersuchung an isolierten Herzen ... 65
3.5.1 Durchführung ... 65
3.5.2 Auswertung ... 69
3.6 Histologische Untersuchung... 71
3.7 Positronen Emissions Tomographie (PET) ... 72
3.8 Versuchsablauf und Tierversuchsgruppen... 73
3.9 Statistik... 78
4. Ergebnisse ...79
4.1 Echokardiographie ... 79
4.1.1 Altersabhängiger Vergleich ... 79
4.1.2 Auswirkung von Ausdauertraining... 88
4.2 Elektrokardiogramm ... 102
4.2.1 Oberflächenelektrokardiogramm ... 102
4.2.2 Telemetrisches Elektrokardiogramm ... 104
4.3 Implantation von sympathomimetisch-wirksamen Pumpen ... 109
4.4 Elektrophysiologische Untersuchung an isolierten Herzen ... 112
4.5 Histologische Untersuchung... 116
5. Diskussion ...117
5.1 Methodik... 117
5.1.1 Mausmodell ... 117
5.1.2 Echokardiographie... 118
5.1.3 EKG-Aufzeichnung ... 120
5.1.4 Gabe von Sympathomimetika ... 122
5.2 Versuchsergebnisse... 125
5.2.1 Zusammenfassung ... 125
5.2.2 Rechtsventrikuläre Dilatation... 126
5.2.3 Funktionsverminderung ... 128
5.2.4 Arrhythmien ... 128
5.2.5 EKG-Morphologie ... 130
5.3 Schlussfolgerungen... 132
6. Zusammenfassung...134
7. Summary ...136
Literaturverzeichnis ...137
Abbildungsverzeichnis...177
Tabellenverzeichnis...181
Abkürzungsverzeichnis ...182
Anhang ...186
Geräte ... 186
Verbrauchsmaterialien ... 187
1. Einleitung
Der plötzliche Herztod ist ein gefürchtetes Ereignis, das in Europa und den USA je ca. 300.000 Todesfälle pro Jahr verursacht (PRIORI et al. 2001). Er ist definiert als ein plötzlich und unerwartet auftretender Todesfall ohne vorausgehende Symptome oder mit einem Symptombeginn von maximal 24 Stunden vorher (KANNEL et al.
1982; ZIPES und WELLENS 1998). Verantwortlich dafür sind zumeist Kammertachykardien und Kammerflimmern. Diese Arrhythmien entstehen häufig in der linken Herzkammer. Allerdings wurden in Italien in 20% der Fälle bei jungen Menschen und Sportlern die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVC) als Ursache beschrieben (CORRADO et al. 2000a). Trotz zunehmender Erkenntnisse zur klinischen Manifestation und zum Krankheitsverlauf sind die pathogenetischen und -physiologischen Ursachen der ARVC und die Pathophysiologie der Arrhythmien bei ARVC noch weitgehend unbekannt.
Verursacht wird der plötzliche arrhythmische Herztod durch Kammerflimmern und ventrikuläre Kammertachykardien, die zu einem Verlust der Pumpfunktion des Herzens und damit zu einem Kreislaufstillstand führen. Für diese Arrhythmien gibt es in einigen Fällen eine genetische Prädisposition. Neben dem langen QT-Syndrom und dem Brugada-Syndrom, die durch mutierte Ionenkanäle und primär elektrophysiologische Veränderungen verursacht werden, findet sich bei der ARVC ebenfalls eine genetisch bedingte Neigung zu Kammertachykardien und arrhythmischem Herztod. Eine Dilatation des rechten Ventrikels sowie Reduktion der rechtsventrikulären Ejektionsfraktion, ein Umbau des Myokards zu Fett- und Bindegewebe und ein Vorkommen von Epsilonwellen bzw. Verbreiterung des QRS- Komplexes im EKG sind Hauptkriterien zur Diagnose von ARVC. Sie weist zwar charakteristische strukturelle Veränderungen des Herzens auf, geht jedoch zumeist primär mit Kammertachykardien und plötzlichem arrhythmischem Herztod einher (WICHTER et al. 2002). Die Arrhythmien treten bei ARVC-Patienten vor allem unter Belastung auf. Zudem scheint ein hoher Anteil von Kammertachykardien bei Sportlern mit inapparenten Formen der ARVC assoziiert zu sein (HEIDBUCHEL et al.
2003). Bei der ARVC gibt es bislang nur wenige Hinweise, dass die Zell-Kontakt-
Proteine verändert sind, wohingegen Gendefekte als Ursache des langen QT- und Brugada-Syndroms schon länger bekannt sind (WICHTER et al. 2002).
Bei Patienten mit Naxos disease, einer Sonderform der ARVC mit zusätzlicher palmo-plantarer Hyperkeratose und gelocktem Haar, finden sich Mutationen im Plakoglobin-Gen, die ein nicht-funktionales Protein codieren (McKOY et al. 2000;
PROTONOTARIOS et al. 2002). In Untersuchungen des Universitätsklinikums Münster konnte nachgewiesen werden, dass bei Patienten mit typischer ARVC der Plakoglobin-Gehalt im Myokard selektiv im rechten Herzen vermindert ist (unveröffentlichte Daten). Diese Befunde legen nahe, dass eine reduzierte Expression von Plakoglobin ursächlich für die ARVC sein könnte. Plakoglobin ist ein zytoskelettäres Protein aus der Familie der Catenine (RUIZ et al. 1996). Es verbindet die Zytoskelettfilamente mit den Zellkontaktproteinen der so genannten Intercalated Discs. Es wird angenommen, dass bei einer Veränderung dieser Verbindung der Zellverband instabil wird (PROTONOTARIOS et al. 2002).
Homozygot Plakoglobin-defiziente Tiere weisen einen embryonal letalen Phänotyp auf (RUIZ et al. 1996), der durch ein Fehlen der Desmosomen im Herzen und Rupturen der Herzwand charakterisiert ist. Dagegen erreichen heterozygote Tiere das Erwachsenenalter.
Um dem postulierten vermehrten Vorkommen von Arrhythmien durch ARVC bei Ausdauersportlern Rechnung zu tragen, sollten in dieser Arbeit an einem transgenen Tiermodell mit verminderter Expression von Plakoglobin die Auswirkungen von akuter körperlicher und mentaler Belastung sowie von körperlichem Ausdauertraining auf kardiale Funktion und Arrhythmien untersucht werden.
Im Einzelnen war es zunächst das Ziel der vorliegenden Studie, den Zusammenhang zwischen veränderter Plakoglobin-Expression und arrhythmogener rechtsventrikulärer Kardiomyopathie durch kardiale Phänotypisierung an heterozygoten Plakoglobin-defizienten Mäusen zu untersuchen. Des Weiteren sollten die pathophysiologischen Ursachen der ARVC anhand des Mausmodells näher charakterisiert werden. Hierzu wurden echokardiographische,
elektrokardiographische und elektrophysiologische In-vivo- und In-vitro- Untersuchungen durchgeführt, um folgende Fragen näher zu beleuchten:
Hat das heterozygote Vorkommen des Plakoglobin-Gens Auswirkungen auf die Elektrophysiologie und die Morphologie des Herzens?
Sind die Folgen einer heterozygoten Plakoglobin-Defizienz vom Alter der Tiere und/oder dem Trainingszustand abhängig?
Treten unter Medikation mit β-Adreno-Rezeptor-Agonisten vermehrt Arrhythmien oder Funktionsstörungen auf?
2. Stand der Forschung
2.1 ARVC (Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie)
Im Jahr 1961 wurde die arrhythmogene rechtsventrikulare Dysplasie von DALLA VOLTA et al. zuerst beschrieben und anschließend von FONTAINE et al. (1977) charakterisiert. Eine familiäre Häufung ist bei 50% der Patienten nachweisbar.
Hierfür werden bereits diagnostizierte ARVC, plötzliche Herztode (SCD) und ventrikuläre Tachykardien (VT) evaluiert. Eine variable Expression und eine unvollständige Penetranz (30%) liegen bei der Vererbung der autosomal dominanten Formen vor (McKENNA et al. 1994). Eine autosomal rezessive Form wurde in Verbindung mit der Naxos disease (PROTONOTARIOS et al. 1986; McKOY et al.
2000) und mit Mutationen im Desmoplakin-Gen beschrieben (ALCALAI et al. 2003).
Es wurden bisher neun verschiedene Genloci entdeckt, die mit der ARVC in Zusammenhang gebracht werden (s. Tab. 2.1.1).
Tabelle 2.1.1: Mutationen, die mit der ARVC assoziiert sind
ARVC= Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie; Aut.-dom.= Autosomal-dominant; Aut.- rez.= Autosomal-rezessiv; in der Chromosomenspalte steht die erste Zahl für die Chromosomennummer, q steht für den langen Arm des Chromosoms und p für den kurzen Arm;
RyR2= kardialer Ryanodinrezeptor2; ?= noch unbekannt
Nach TOME ESTEBAN et al. 2004, McKOY et al. 2000 und ALCALAI et al. 2003 Typ Modus Chromosom Lod-
Score
Mutiertes
Gen Quelle
ARVC1 Aut.-dom. 14q23-q24 5.4 Transf.
Wachstums- faktor-β3
RAMPAZZO et al. 1994 BEFFAGNA et al. 2005 ARVC2 Aut.-dom. 1q42-q43 4.0 RyR2 (?) RAMPAZZO et al. 1995 ARVC3 Aut.-dom. 14q12-q22 4.7 ? SEVERINI et al. 1996 ARVC4 Aut.-dom. 2q32.1-q32.3 3.5 ? RAMPAZZO et al. 1997
ARVC5 Aut.-dom. 3p23 6.9 ? AHMAD et al. 1998
ARVC6 Aut.-dom. 10p12-p14 3.9 ? LI et al. 2000
ARVC7 Aut.-dom. 10q22 3.1 ? MELBERG et al. 1999
ARVC8 Aut.-dom. 6p24 4.3 Desmoplakin RAMPAZZO et al. 2002 NAXOS Aut.-rez. 17q21 3.6 Plakoglobin COONAR et al. 1998 Carvajal
Syndrom Aut.-rez. 6p24 ? Desmoplakin NORGETT et al. 2000
Die ARVC führt vor allem bei jungen, männlichen, zuvor gesunden Patienten zu einem plötzlichen Herztod ohne vorherige Symptome. Der plötzliche Herztod (SCD) führt jährlich zu 300.000 Todesfällen in Europa (PRIORI et al. 2001). Allein in Italien verursachte ARVC 20% aller plötzlichen Herztode in Individuen unter 35 Jahren und 22% der plötzlichen Herztode bei Athleten (ASANO et al. 2004). Etwa 50-75% der plötzlichen arrhythmischen Todesfälle werden durch Kammerflimmern (KANNEL et al. 1982) und ventrikulären Kammertachykardien verursacht. Diese führen zu einem Verlust der Pumpfunktion des Herzens und damit zu einem Kreislaufstillstand. Für diese Arrhythmien gibt es in einigen Fällen eine genetische Prädisposition. Neben dem langen QT-Syndrom und dem Brugada-Syndrom, die durch mutierte Ionenkanäle und primär elektrophysiologische Veränderungen verursacht werden, findet sich bei der Arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVC)
ebenfalls eine genetisch bedingte Neigung zu Kammertachykardien und arrhythmischem Herztod (WICHTER et al. 2002).
Man teilt die ARVC in vier Stadien ein:
1. Die frühe und stille Phase, die meistens asymptomatisch verläuft. Es kann allerdings bereits zu der ersten Manifestation des plötzlichen Herztodes kommen (FURLANELLO et al. 1998).
2. Die instabile Phase, in der symptomatische Arrhythmien dominieren, vor allem in Form von Kammertachykardien mit Linksschenkelblock, also mit rechtsventrikulärem Ursprung.
3. Phase der rechtsventrikulären Fehlfunktion, mit einer noch relativ gut ausgeprägten linksventrikulären Funktion.
4. Finale Phase mit progressiver biventrikulärer Dilatation, oftmals nicht mehr von einer dilatativen Kardiomyopathie zu unterscheiden. Die häufigsten Komplikationen in diesem Stadium sind Thrombembolien und Vorhofflimmern (CORRADO et al. 2000a).
Indirekte Hinweise lassen vermuten, dass Ausdauersport die Manifestation der ARVC begünstigt. In einer Erfassung von Sportlern mit Arrhythmien oder Synkopen hatten mehr als die Hälfte der Patienten rechtsventrikuläre Arrhythmien (HEIDBUCHEL et al. 2003). Bei der ARVC wurde eine Imbalanz der adrenergen Innervation als ein möglicher Faktor in der Genese von Arrhythmien beschrieben. In einer Studie von WICHTER et al. (2000) zeigte sich eine reduzierte β-adrenerge Rezeptorendichte bei ARVC-Patienten. So könnte bei einer verstärkten Katecholaminausschüttung die Neigung zu ventrikulären Arrhythmien vor allem bei sportlicher Belastung ansteigen (WICHTER et al. 2000).
Die ARVC ist eine der häufigsten angeborenen degenerativen Herzmuskelerkrankungen, bei denen es zu einer Verdünnung der rechtsventrikulären Wand, aneurysmaler Dilatation des rechten Ventrikels und/oder dessen Dysfunktion kommen kann. Sie führt wahrscheinlich zu regional induzierter Apoptose (MALLAT et al. 1996) vorwiegend des rechtsventrikulären Myokards mit nachfolgendem Ersatz durch Fett- und/oder Bindegewebe (WICHTER et al. 2002). Hierbei erfolgt der
Umbau vom Subepicardium ausgehend zum Subendocardium (THIENE et al. 1988;
CORRADO et al. 1997; MARCUS et al. 1982). Ebenso wurden in kleineren Bezirken inflammatorische Infiltrate (hauptsächlich Lymphozyten) beschrieben (THIENE et al.
1991).
Aufgrund der Komplexität dieser Erkrankung wurden standardisierte diagnostische Kriterien von der ARVC-Arbeitsgruppe der “Myocardial and Pericardial Disease of the European Society of Cardiology” und von dem „Scientific Council on Cardiomyopathies of the International Society and Federation of Cardiology“ verfasst (McKENNA et al. 1994; s. Tab. 2.1.2).
Tabelle 2.1.2: Diagnostische Kriterien der ARVC
Die Diagnose wird gestellt bei Vorliegen von mindestens zwei Hauptkriterien oder einem Hauptkriterium und zwei Nebenkriterien oder bei vier Nebenkriterien aus verschiedenen Diagnosekategorien (I-VI). EKG: Elektrokardiogramm; LV: linker Ventrikel; RV: rechter Ventrikel; VT:
ventrikuläre Tachykardie
a entdeckt mit Hilfe der Echokardiographie, Angiographie, MRI (magnetic resonance imaging) oder Radionuklid Szintigraphie
I. Familiäre Häufung Hauptkriterium Nebenkriterium
Familiäre Erkrankung bestätigt durch Autopsie oder Chirurgie
Familiäres Vorkommen eines plötzlichen Todes im Alter von unter 35 Jahren und einer vermuteten klinischen Diagnose von ARVC bei Familienmitgliedern
II. EKG Depolarisations Abnormalitäten Hauptkriterium
Nebenkriterium
Epsilonwellen oder Verbreiterung des QRS-Komplexes (≥110ms) in den Ableitungen V1-V3
Späte positive Potentiale III. EKG Repolarisations Abnormalitäten
Nebenkriterium T-Wellen Inversion in den rechts präkordialen Ableitungen (V2-V3) bei Patienten über 12 Jahren ohne Rechtsschenkelblock
IV. Arrhythmien
Nebenkriterium Linksschenkelblock-Morphologie bei anhaltender oder nicht anhaltender VT im EKG, Holter monitoring oder unter Belastung
V. Globale und/oder regionale Dysfunktion und strukturelle Abnormalitätena Hauptkriterium
Nebenkriterium
Deutliche Dilatation und Reduktion der RV Ejektionsfraktion, mit/ohne geringe Einbeziehung des LV
RV Aneurysma (akinetische oder dyskinetische Regionen mit diastolischer Ausweitung)
Deutliche segmentale Dilatation des RV
Moderate globale RV Dilatation und Reduktion der RV Ejektionsfraktion mit normalem LV
Moderate segmentale RV Dilatation Regionale RV Hypokinesie
VI. Gewebecharakterisierung
Hauptkriterium Umbau des Myokards mit Ersatz durch Fett- und/oder Bindegewebe bei einer endomyokardialen Biopsie
Die medikamentöse Behandlung mit Sotalol und Amiodaron in Verbindung mit oder ohne Beta-Blocker hat sich als effektiv bei symptomatischen Arrhythmien bewährt (CORRADO et al. 2000b; DALIENTO et al. 1990). Bei Patienten mit einem erhöhten
Risiko sollte eine Implantation eines Defibrillators in Betracht gezogen werden (WICHTER et al., 2004).
2.1.1 Naxos-Disease beim Menschen
Bei der Naxos-Disease, einer rezessiv vererbten Sonderform der ARVC, handelt es sich um eine 2-Basen-Deletion im Plakoglobin-Gen, die einen Frameshift verursacht, und dadurch zu einem vorzeitiger Kettenabbruch führt. Der Genlocus 17q21 ist die chromosomale Lokation von Plakoglobin und liegt auf dem langen Arm des Chromosoms 17 (COONAR et al., 1998; WICHTER et al., 2002; COWLEY et al., 1997). Die Mutationen im Plagoklobin-Gen codiert ein nicht-funktionales Protein und führt zu einem Abbruch im C-terminalen Ende nach der 56. Aminosäure (McKOY et al., 2000). Das mutierte Protein hat wahrscheinlich trotz der Abwesenheit des C- terminalen Endes noch einige funktionelle Aktivität, da der Phänotyp dieser Patienten bei weitem nicht so gravierend ist, als der von Plakoglobin-/- Mäusen (BIERKAMP et al., 1996; RUIZ et al., 1996).
Bei Patienten mit Naxos-Disease geht die Erkrankung mit einer zusätzlichen palmo- plantaren Hyperkeratose und gelocktem Haar einher (PROTONOTARIOS et al.
2002). Die Expression des Haut- und Haarphänotyps entwickelt sich bereits in der frühen Kindheit, wohingegen die pathologischen Anzeichen am Herzen sich erst im Erwachsenenalter zu einer 100%igen Penetranz manifestieren (PROTONOTARIOS et al. 1997). Eine Synkope ist meist das erste Anzeichen der kardialen Erkrankung.
Mit einem 12-Kanal EKG und einer zweidimensionalen Echokardiographie kann man diese Form der ARVC nach den etablierten Kriterien (siehe Tab. 2.1.2) diagnostizieren (PROTONOTARIOS et al. 2002). Die charakteristische Ausprägung der kardialen Veränderung entspricht denen im ARVC-Kapitel beschriebenen. Es tritt eine rechtsventrikuläre Dilatation ein, die bei fortgeschrittenen Formen auch den linken Ventrikel betreffen kann. Die rechtsventrikuläre freie Wand ist dünner und geht mit fettig-fibrösem Ersatzgewebe im Einfluss- und/oder Ausflusstrakt des rechten Ventrikels sowie im rechtsventrikulären Apex einher. In einem 12-Kanal Ruhe-EKG findet man in 90% der Fälle kleinere, oft unspezifische Abweichungen bei erkrankten Adulten. Am häufigsten kommen T-Wellen-Inversion und QRS-Komplex- Verbreiterungen (>110 ms) in den Ableitungen V1 bis V3 vor (PROTONOTARIOS et
al. 2002). Inkompletter oder kompletter Rechtsschenkelblock liegt bei Naxos disease Patienten im gleichen Verhältnis, wie bei den anderen Formen der ARVC vor (MARCUS et al., 1982). Bei fortgeschrittener Progression mit Einbeziehung des linken Ventrikels zeigen einige Patienten auch einen Linksschenkelblock. Dies ist nicht zu verwechseln mit den linksschenkelblockähnlichen ventrikulären Extrasystolen, die beim Großteil der Patienten auftreten (PROTONOTARIOS et al.
2002).
Andere Familien mit ähnlichen klinischen Manifestationen wurden dokumentiert (HAMMILL et al. 1988; TOSTI et al. 1994; CARVAJAL-HUERTA 1998). Bei einer weiteren Sonderform der ARVC in Ecuador befindet sich eine Mutation im Gen von Desmoplakin, einem weiteren zytoskelettären Protein, das an der Bildung der Desmosomen beteiligt ist. Dies führt zu einer klassischen, autosomal-dominant vererbten Form der ARVC (NORGETT et al. 2000). Interessanterweise liegt diese Mutation im Bereich einer Bindungsstelle am Plakoglobin (RAMPAZZO et al. 2002).
Zusätzlich entdeckten ALCALAI et al. (2003) eine rezessive Mutation des Desmoplakingens, das zu ARVC, Hautveränderung und lockigem Haar führte.
Aufgrund dieser Erkenntnisse wird vermutet, dass Veränderungen in den Zytoskelett- Proteinen, wie beispielsweise Plakoglobin, eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese der ARVC spielen (WICHTER et al. 2002).
2.1.2 ARVC bei Tieren
2.1.2.1 Poll Hereford Kälber
Ein letales, autosomal-rezessives, kardiokutanes Syndrom (CWH: Cardiomyopathy and wooly haircoat syndrome) wurde bei Poll Hereford Kälbern in Australien dokumentiert (WHITTINGTON und COOK 1988; COOK 2003). Betroffene Tiere können bereits bei der Geburt anhand des unverwechselbaren wolligen Haarkleides erkannt werden und leiden an ventrikulären Arrhythmien. In manchen Fällen entwickelt sich eine neonatale Keratitis. In der Elektrokardiographie werden geringe Amplituden, flache T-Wellen, ventrikuläre Extrasystolen und Episoden von nicht- anhaltenden ventrikulären Tachykardien registriert (WHITTINGTON und COOK 1988). Der Tod tritt meist innerhalb der ersten 12 Wochen nach der Geburt ein und kann plötzlich, aufgrund von Kammerflimmern (oft nach physischer Anstrengung), oder als Folge von einer Herzinsuffizienz auftreten. Der klinische Phänotyp der CHW teilt Ähnlichkeiten mit dem humanen kardiokutanen Syndrom der Naxos disease beim Haarphänotyp, bei kardialen Arrhythmien und elektrokardiographischen Abnormalitäten. Bei dem CWH-Syndrom können Schäden in beiden Herzkammern auftreten, die einen multifokalen bis lokalen extensiven Myokardmangel mit fibrösem Ersatzgewebe und gelegentlich kalzifizierte Bereiche beinhalten. Subepikardiale Fibrosen der rechtsventrikulären freien Wand sind meistens die führende Veränderung (COOK 2003). Das Fehlen einer fettigen Infiltration könnte eine schnelle Entwicklung der Krankheit in Kälbern widerspiegeln, die zu einem frühzeitigen Herztod führt. Die ventrikuläre Kalzifikation ist vergleichbar mit dem beschriebenen Phänomen bei einem Menschen mit einer homozygoten Mutation des Plakoglobin-Gens, wobei ebenso eine Kalzifikation der rechtsventrikulären freien Wand auftreten kann (BASSO et al. 2001).
2.1.2.2 Hund
1994 und 1995 wurden bereits Fallbeispiele von rechtsventrikulärer Kardiomyopathie bei Hunden beschrieben (SIMPSON et al. 1994; BRIGHT et al. 1995). Eine Dekade
später wurde von BASSO et al. (2004) eine Studie mit 23 Boxern erstellt, bei denen eine Form der ARVC und/oder ein plötzlicher Herztod eintrat. Die klinischen Profile sind plötzlicher Herztod, Synkopen und ventrikuläre Arrhythmien (vermutlich ausgehend von dem rechten Ventrikel). Die pathologischen Abnormalitäten sind rechtsventrikuläre Dilatation und Aneurysmata, rechtsventrikulärer Myokardschwund und fettiges oder fettig-fibröses Ersatzgewebe, Myokarditis und Apoptose. Die Kombination der klinischen Profile und der pathologischen Abnormalitäten scheint ein deutlicher Beleg für das canine Modell der ARVC zu sein. In der Studie starben 39% der Tiere plötzlich, wobei dies bei 78% während einer leichten oder stärkeren körperlichen Anstrengung passierte. Bei 83% der Tiere zeigten sich ventrikuläre Extrasystolen in einer Linksschenkelblock-Morphologie und in 48% traten ventrikuläre Tachykardien auf. Ein familiärer Zusammenhang konnte in 43% der Fälle dokumentiert werden. Bei allen Tieren wurde Myokard durch entweder fettiges (65%) oder fettig-fibröses (35%) Gewebe ersetzt, das sich vom Epikard zum Endokard ausbreitete. Myokarditis wurde beim größten Teil der Tiere sowohl im rechten als auch im linken Ventrikel und teilweise sogar im rechten oder linken Atrium entdeckt. Zusätzlich konnte eine Apoptose der Myozyten in 39% der Fälle histologisch belegt werden. Myokarditis und fettig-fibröses Ersatzgewebe waren charakteristisch für Boxer mit ARVC, die plötzlich verstorben sind (BASSO et al.
2004). Bei einer Untersuchung von SPIER und MEURS (2004a) wurden bei zehn Boxern, die an ARVC erkrankt waren, Langzeit-EKGs angefertigt. Hierbei zeigten sich Änderungen von ≤ 80% in der Häufigkeit von ventrikulären Arrhythmien, die wahrscheinlich in der spontanen Variabilität bei der caninen Form der ARVC begründet liegen (SPIER und MEURS 2004a). Weiter konnte eine verringerte Herzfrequenzvariabilität bei Boxern mit einer kongestiven Herzinsuffizienz gezeigt werden (SPIER und MEURS 2004b). Bei ARVC betroffenen Hunden mit ausgeprägten Arrhythmien werden momentan zwei Therapieprotokolle empfohlen: 1.
Sotalol (1,5 – 2,0 mg/kg oral, 2x täglich) oder 2. eine Kombination aus Mexiletine (5-8 mg/kg oral, 3x täglich) und Atenolol (12,5 mg pro Hund, oral 3x täglich) (MEURS 2004). Aufgrund jüngster Studien kann bei der ARVC des Boxers eine Veränderung
im kardialen Ryanodinrezeptor vermutet werden (MEURS et al. 2005), wie sie auch in der ARVC 2 vorliegt.
2.1.2.3 Katze
In einer Studie über ARVC bei Katzen, konnten 12 Tiere mit eindeutigen Symptomen beschrieben werden (FOX et al. 2000). Bei allen Tieren lag eine moderate bis erhebliche Rechtsherzvergrößerung mit gleichzeitiger Wandverdünnung und teilweise ein oder mehrere Aneurysmata vor. Ebenso konnten bei allen Tieren mit Hilfe einer histologischen Untersuchung eine rechtsventikuläre Schädigung (aufgrund von myozytärem Tod und Atrophie) sowie das Vorkommen von Ersatzgewebe (fettig oder fettig-fibrös) belegt werden. Diese histologisch erkennbaren Schäden waren bei dem Großteil der Tiere auch im linken Ventrikel und teilweise auch in den Vorhöfen darstellbar. Eine Myokarditis war in zehn Fällen und Apoptose in neun Fällen nachweisbar. Im EKG wurden supraventrikuläre Tachyarrhythmien, ventrikuläre Tachykardien, polymorphe ventrikuläre Arrhythmien und Rechtsschenkelblöcke beschrieben.
2.1.2.4 Maus
ASANO et al. (2004) haben eine Mauslinie mit erblicher rechtsventrikulärer Dysplasie gefunden, verursacht durch eine Mutation des Laminin Rezeptor 1-Gens (Lamr1).
Hierbei traten keine letalen Tachyarrhythmien auf, wie sie häufig bei der humanen ARVC zu finden sind. Im EKG wurden aber elektrische Übergangsleitungs- inhomogenitäten, die zu einer verlängerten QRS-Dauer führten, entdeckt.
Typischerweise wurde auch hier eine Degeneration der rechtsventrikulären Kardiomyozyten festgestellt. Dabei waren besonders die äußeren Kardiomyozyten betroffen. Aufgrund dessen wurde von den Autoren vermutet, dass ein erhöhter mechanischer Streß eine vermehrte Expression von zytoprotektiven Genen hervorruft. Dies würde den Unterschied zwischen links- und rechtsventrikulär sowie zwischen den inneren und äußeren Kardiomyozyten erklären (ASANO et al. 2004).
Weiter wurden ähnliche rechtsventrikuläre Veränderungen bei einem Nerz beschrieben (ISHIKAWA et al. 1977).
2.2 Plakoglobin 2.2.1 Aufbau
Plakoglobin (COWIN et al. 1986), auch bekannt unter der Bezeichnung γ-Catenin (OZAWA et al. 1989), wurde als erstes Mitglied der Armadillo Protein Familie entdeckt (COWIN et al. 1986; FRANKE et al. 1989). Diese ist charakterisiert durch eine zentrale Domäne, die zusammengesetzt ist aus einer variablen Anzahl von arm (Armadillo) repeats. Diese Wiederholungen, die je 42 Aminosäuren beinhalten, wurden identifiziert als ein Genprodukt von Drosophila armadillo, das in die wingless Signalkette involviert ist (PFEIFER und WIESCHAUS 1990; PFEIFER et al. 1994;
PFEIFER 1995). Weitere Mitglieder dieser Familie sind β-Catenin, α-Importin, p120ctn und das APC-(adenomatous polyposis coli) Genprodukt. Sie haben unterschiedlichste Funktionen, wie z.B. Kontrolle in der Embryogenese, Zell-Zell- Kontakte, Tumorprogression, Kernimport und Signaltransduktion (HÜLSKEN et al.
1994; KUSSEL und FRASCH 1995; TÖRÖK et al. 1995; PFEIFER 1996).
Plakoglobin besteht aus drei Subdomänen. Die zentrale Domäne setzt sich aus 12 arm repeats zusammen. Diese Region weist einen hohen Homologitätsgrad (76-83%
identisch) zwischen Plakoglobin und β-Catenin auf (WILLIAMS et al. 2000; BUTZ et al. 1992; FOUQUET et al. 1992). Es ist in einer Superhelix gefaltet, die sich aus 36 kleinen α-Helices (drei je armadillo repeat) zusammensetzt (HUBER et al. 1997). Die Armadillo repeat Domäne wird durch saure terminale Amino- und Carboxyl-Domänen begrenzt. Die Ähnlichkeit der Proteinendungen zwischen β-Catenin und Plakoglobin sind relativ gering: die C-terminale Domäne stimmt in 41-57% und die N-terminale Domäne in 15-29% überein (WILLIAMS et al., 2000; FOUQUET et al., 1992).
2.2.2 Funktion
Plakoglobin dient als Komponente an verschiedenen Zell-Zellverbindungen einschließlich Desmosomen, Zonulae adherentes im Epithel, Belt-Plaques im Endothel und in Verbindungen ohne nachweisbare Filamente, wie im lymphatischen Endothel und Granularzellen der zerebellären Glomeruli (FRANKE et al. 1987;
GARROD 1993; SCHMIDT et al. 1994; ROSE et al. 1995). Es ist das einzige Protein,
das sowohl in Desmosomen als auch in Adherens Junctions vorkommt (MATHUR et al. 1994; SACCO et al. 1995; CHITAEV et al. 1996; WITCHER et al. 1996).
Plakoglobin liegt in freier und in gebundener Form im Zytosol vor.
Abbildung 2.2.2: Die verschiedenen Funktionen von Plakoglobin (ZHURINSKY et al. 2000b) Plakoglobin (Pg) kann an dem zytoplasmatischen Ende des Cadherin Adhäsions- Rezeptors in den Adherens Junctions (AJ) binden. Über α-Catenin (α) gehen Plakoglobin und β-Catenin (β) eine Cadherin-Verbindung mit dem Aktin-Zytoskelett ein. Plakoglobin kann im Gegensatz zum β-Catenin zusätzlich mit den desmosomalen Cadherinen Desmocollin und Desmoglein in den Desmosomen (DES) eine Verbindung eingehen, und über Desmoplakin (Dsp) und Plakophilin (Plp) auch mit intermediären Filamenten (IF).
Wenn die Wnt (wingless bei Drosophila)-Signalkette nicht aktiviert ist, wird freies Plakoglobin in einem Multimolekularem Komplex abgebaut. Dieser beinhaltet den Tumor Supressor APC (adenomatous polyposis coli), Axin und GSK (Glykogen Synthase Kinase), die wiederum Plakoglobin phosphoriliert (PP). Dieser Komplex steht über die Ubiquitin Lygase β-TrCP in Verbindung mit dem Ubiquitin- Proteasomen System, welche (zusammen mit Cul1 und Skp1) die Ubiquitination (Ub) von Plakoglobin vermittelt und somit zu dem Abbau durch Proteasomen führt.
Die Verbindung von Wnt mit dem Frizzled (Frz)-Rezeptor aktiviert die Wnt- Signalkette, und Dishevelled (Dsh) unterdrückt die Plakoglobin Phosphorilierung durch Hemmung der GSK-Aktivität. Dies führt zu einer Akkumulation von Plakoglobin. Die Fähigkeit von Plakoglobin zur Transkription in einem Komplex mit TCF (T-Zell Faktor) wird noch kontrovers diskutiert.
2.2.2.1 Intercalated Discs – Plakoglobin vs. β-Catenin
Plakoglobin ist ein zytoskelettäres Protein aus der Familie der Catenine (RUIZ et al.
1996). Es verbindet die Zytoskelettfilamente mit den Zellkontaktproteinen der Intercalated Discs (RUIZ et al. 1996) und spielt somit eine entscheidende Rolle in den Desmosomen und Adherens Junctions. Es dient als Stützpfeiler in der Architektur der Intercalated Discs und ist damit auch für die Stabilität des Herzgewebes verantwortlich (RUIZ et al. 1996). Bei einer Veränderung in diesen Verbindungen wird eine darauf folgende Instabilität des Zellverbandes vermutet (PROTONOTARIOS et al. 2002).
Sowohl in kardialen als auch epidermalen Zell-Zell-Kontakten formt Plakoglobin zusammen mit Cateninen, klassischen und desmosomalen Cadherinen und Mitgliedern der Plakinfamilie die Kernstruktur für Adhäsion und interzelluläre Signalleitung (RUIZ et al. 1996).
Plakoglobin kommt sowohl in den Desmosomen, als auch in den Adherens Junctions vor (COWIN et al. 1986; s. Abb. 2.2.2) und hat hier eine vergleichbare Funktion wie β-Catenin (COWIN und BURKE 1996; SCHMIDT et al. 1994). Ein Wettbewerb zwischen den klassischen und den desmosomalen Cadherinen um eine Plakoglobinbindung ist Bedingung für eine Regulation des Aufbaus dieser Zell-Zell- Verbindungen (BEN-ZE’EV und GEIGER 1998; COWIN und BURKE 1996; LEWIS et al. 1997).
Obwohl Plakoglobin die klassischen Cadherine über α-Catenin mit Aktin in den Adherens Junctions verankern kann, verliert es diese Fähigkeit, wenn es in den Desmosomen eingebunden ist (CHITAEV et al. 1998).
Im Gegensatz zu den Arm-Domänen von β-Catenin und Plakoglobin sind die N- und C-terminalen Domänen nur in wenigen Bereichen ähnlich (COWIN und BURKE 1996). Weitere Studien belegen, dass die terminalen Domänen auch verantwortlich sind für die Interaktionen der Arm-Domäne mit anderen Proteinen (CHITAEV et al.
1996; PALKA und GREEN 1997; ZHURINSKY et al. 2000a). Zum Beispiel wird durch Deletion der C-terminalen Domäne die Bindung von Cateninen zu Cadherinen mit dem Arm repeats positiv beeinflusst (CHITAEV et al. 1996). Solch eine Deletion kann
ebenso den Aufbau von Plakoglobin-beinhaltenden Desmosomen stimulieren (PALKA und GREEN 1997).
SCHNITTLER et al. (1997) haben eine verringerte Zelladhäsion bei Inhibition der Plakoglobinexpression in endothelialen Zellen entdeckt, die einer Flüssigkeitsscherspannung ausgesetzt waren. Diese Entdeckung lässt die Vermutung zu, dass Plakoglobin für die endothelialen interzellulären Verbindungen benötigt wird, um dem mechanischen Stress standzuhalten. Plakoglobin scheint somit eine entscheidende Rolle in der endothelialen Zell-Zell-Adhäsion und Barrierefunktion inne zu haben (VENKITESWARAN et al. 2002).
2.2.2.1.1 Desmosomen
Desmosomen kommen gehäuft in Herzmuskelzellen und in Keratinozyten vor. Hier formen sie symmetrische Plaques, die mehrere Mikrometer im Durchmesser und ca.
100 nm dick sind. Jede Hälfte der Desmosomen ist abgeleitet von einer benachbarten Zelle, in welcher intermediäre Filamente einen Anker durch die zytoplasmatische Peripherie zu bilden scheinen (KELLY 1966).
Plakoglobin bindet in den Desmosomen die desmosomalen Cadherine (Desmocollin und Desmoglein (TROYANOVSKY et al. 1994a,b)) an Desmoplakin, Plakophilin (KOWALCZYK et al. 1997) und epidermales Keratin (SMITH und FUCHS 1998).
Plakoglobin stellt über Desmoplakin, Plakophilin und Keratin eine Verbindung zu dem intermediären Filamenten des Zytoskeletts her (SCHMIDT et al. 1994; s. Abb. 2.2.2).
Besonders dokumentiert wurde die Verbindung zwischen Plakoglobin und Desmoglein, die stärker zu sein scheint als zwischen Plakoglobin und Desmocollin (MATHUR et al. 1994; TROYANOVSKY et al. 1994b; TROYANOVSKY et al. 1996;
CHITAEV et al. 1996; WAHL et al. 1996; WITCHER et al. 1996; KOWALCZYK et al.
1997).
Das Fehlen von Plakoglobin führt zu drastischen Veränderungen in der Architektur der Intercalated Discs: Typische Desmosomen fehlen in den Intercalated Discs von Plakoglobin-/- Mäusen (RUIZ et al. 1996). In epithelialen Zellen findet man stattdessen bei Plakoglobin Knockout-Mäusen β-Catenin in den sonst β-Catenin- freien Desmosomen. Trotzdem kann β-Catenin nicht alle desmosomalen Proteine mit
all ihren molekularen Interaktionen korrekt verbinden; dies erscheint besonders auffällig, wenn Zellen normalem mechanischen Stress ausgesetzt sind (BIERKAMP et al. 1999; RUIZ et al. 1996). SMITH und FUCHS (1998) haben auch in einer In vitro-Analyse eine Plakoglobin-unabhängige Verbindung zwischen desmosomalen Cadherinen und Desmoplakin darstellen können.
Aufgrund von mutiertem Plakoglobin herrschte in einer anderen In-vitro-Studie eine Desmosomen-Dysfunktion, die wiederum zu einem progressiven Myozytensterben bei mechanischem Stress führte (RUIZ et al. 1996).
2.2.2.1.2 Adherens Junctions
Adherens Junctions sind ebenso wie die Desmosomen für die Zell-Zell-Adhäsion verantwortlich. Sie setzen sich aus den klassischen Cadherinen (E-, N-, P- und VE- Cadherin), Plakoglobin, β-Catenin und α-Catenin zusammen. In dieser Architektur bindet Plakoglobin zum einen an die distale Region des zytoplasmatischen Endes der Cadherine (catenin binding domain) (VINCENT et al. 2004) und zum anderen an α-Catenin und bildet über dieses Protein einen Anker zu dem Aktin-Zytoskelett für die Adherens Junctions (KNUDSEN et al. 1995; s. Abb. 2.2.2).
Aufgrund des hohen Homologitätsgrades liegt ein Wettbewerb um dieselben Bindungsstellen zwischen β-Catenin und Plakoglobin nahe. So kann ein hoher Level an exogenem Plakoglobin dazu führen, dass endogenes β-Catenin von den Adherens Junctions verdrängt wird und zu dessen proteasomaler Degradation führt (SALOMON et al. 1997).
2.2.2.2 Wnt-Signalweg
Die Wnt-Protein Familie spielt eine entscheidende Rolle als Wachstums- und Differenzierungsfaktor in der Spezifizierung der Zellen während der embryonalen Entwicklung. Wenn das abgesonderte wingless-Glycoprotein (Wnt) an einen Zelloberflächenrezeptor frizzled/ frizzled-2-type bindet (BHANOT et al. 1996; BHAT 1998; KENNERDELL und CARTHEW 1998; MULLER et al. 1999b), aktiviert es das zytoplasmatische Protein dishevelled (Dvl) (YANAGAWA et al. 1995), das wiederum
zu einer Inaktivierung der Glykogenkinase-3β (Gsk3b) führt (YOST et al. 1997).
Gsk3b ist für die Phosphorylierung von β-Catenin und Plakoglobin verantwortlich (siehe Phosphorylierung).
Die Beteiligung von Plakoglobin in der Wnt-Signalkaskade wird immer noch debattiert (KARNOVSKY und KLYMKOWSKY 1995; KOFRON et al. 1997; MILLER und MOON 1997; SIMCHA et al. 1998). In manchen Studien teilt man Plakoglobin eine einzigartige Rolle, die unterschiedlich zu der Funktion des β-Catenin ist, in diesem Signalweg zu (CHARPENTIER et al. 2000; SIMCHA et al. 1996;
ZHURINSKY et al. 2000a).
Auch wenn in verschiedenen Zelltypen eine Überexpression von Wnt zu einer Akkumulation von Plakoglobin führt (BRADLEY et al. 1993; PAPKOFF et al. 1996), ist die Beteiligung von Plakoglobin in dem Wnt-Signalweg in vivo immer noch umstritten, da Plakoglobin die Abwesenheit von β-Catenin bei Knockout-Mäusen nicht ausgleichen kann (BIERKAMP et al. 1996; HAEGEL et al. 1995; HÜLSKEN et al. 2000; RUIZ et al. 1996).
Interessanterweise wurde in einer neueren Studie erkannt, dass eine Expression von Plakoglobin in der Haut von transgenen Mäusen (CHARPENTIER et al. 2000) zu einem anderen Phänotyp führt (verringerte epitheliale Proliferation und verringertes Haarwachstum) als bei einer β-Catenin Expression (de novo Haarfollikel Morphogenese und Tumorentwicklung) (GAT et al. 1998). Ein ähnlicher Phänotyp tritt auch auf, wenn spätere Komponenten im Wnt-Signalweg (WNT-3 oder DVL-2, eine Isoform von Dishevelled) in der Haut überexpremiert werden (MILLAR et al.
1999). Dies könnte ein Hinweis auf eine Beteiligung von Plakoglobin in dem Wnt- Signalweg in einer Reaktion, die nach WNT-3 und DVL-2 auftritt, sein (MILLAR et al.
1999).
2.2.2.3 Phosphorylierung
Bei den Cateninen wird Serin/Threonin und Tyrosin phosphoryliert, um die Reaktionen mit anderen Proteinen zur regulieren (YOST et al. 1996; HAMAGUCHI et al. 1993; MATSUYOSHI et al. 1992).
Plakoglobin ist Ziel des proteasomalen Abbaus mit Hilfe des Axin-APC-Komplexes (KODAMA et al. 1999; SADOT et al. 2000; s. Abb. 2.2.2). Plakoglobin kann einen Komplex mit APC (adenomatous polyposis Coli) (RUBINFELD et al. 1993; SHIBATA et al. 1994), Axin (BEHRENS et al. 1998; IKEDA et al. 1998; KODAMA et al. 1999) und Gsk3b (ABERLE et al. 1997) formen. Die N-terminale Domäne von Plakoglobin wird von Gsk3b (Glykogenkinase-3β) am Serin-Rest phosphoryliert (ABERLE et al.
1997; YOST et al. 1996; KODAMA et al. 1999). Die Gsk3b-vermittelte Phosphorylierung führt zum proteasomalen Abbau über eine Ubiquitination von Plakoglobin (ABERLE et al. 1997; SADOT et al. 2000).
Solange Plakoglobin in den Desmosomen oder Adherens Junctions gebunden ist, ist es unzugänglich für die Degradationsmaschinerie (SADOT et al. 2000).
Punktmutationen oder Deletion der N-terminalen Phosphorylierungsstelle haben keinen Effekt auf die Halbwertszeit von Plakoglobin (WILLIAMS et al. 2000).
Trotzdem ist die N-terminale Gsk3b Phosphorilierungstelle wichtig für die Plakoglobinstabilität, da eine Überexpression von Axin, das die Gsk3b-abhängige Phosphorilierung fördert, zu einem Plakoglobinabbau führt (KODAMA et al. 1999).
Plakoglobin kann ebenso am Tyrosin über eine Rezeptor-vermittelte und eine nicht Rezeptor-vermittelte Tyrosin-Kinase phosphoryliert werden (HAMAGUCHI et al.
1993; MATSUYOSHI et al. 1992). Der EGF-Rezeptor (epidermal growth factor) reagiert direkt mit Plakoglobin (HOSCHUETZKY et al. 1994; MATSUYOSHI et al.
1992) und phosphoriliert dabei Tyrosin, so dass eine Verbindung mit Desmoplakin, nicht aber mit Desmoglein verhindert wird (GAUDRY et al. 2001). Zusätzlich wurde entdeckt, dass Peroxyvanadat die Tyr(P)-Phophatase inhibiert. Dies führt zu einer verringerten Zell-Zell-Adhäsion, da die Verbindungen zwischen Plakoglobin mit α- Catenin und E-Cadherin abnehmen. Dieser Effekt kann mit Hilfe der Tyr(P)- Phosphatase wieder rückgängig gemacht werden (HU et al. 2001). Auch wenn β- Catenin und Plakoglobin hochgradig verwandt sind, so phosphorilieren dieselben Kinasen doch unterschiedliche Stellen in den beiden Proteinen (SOLANAS et al.
2004). Darüber hinaus hat die Phosphorylierung an den entsprechenden gleichen Stellen verschiedene Effekte auf die Reaktionen von β-Catenin und Plakoglobin mit deren Zellpartnern (MIRAVET et al. 2003).
2.2.2.4 Plakoglobin als Transkriptionsfaktor
Plakoglobin kann an LEF/TCF (lymphocyte enhancer binding factor-1/ T-Zell Faktor) binden (HECHT et al. 1999; HUBER et al. 1996; SIMCHA et al. 1998; ZHURINSKY et al. 2000a) und hat einen Transaktivierungsbereich an der C-terminalen Domäne (HECHT et al. 1999; SIMCHA et al. 1998).
Da β-Catenin vor allem mit seiner Arm-repeat-Domäne an die Transkriptionsfaktoren bindet, und diese mit der von Plakoglobin nahezu homolog ist (COWIN und BURKE 1996), liegt es nahe, dass Plakoglobin auch mit denselben Kernmolekülen interagiert. Plakoglobin kann einen Komplex mit LEF-1 eingehen, wenn eine Cotransfektion beider Moleküle in der Zelle durchgeführt wird (HUBER et al. 1996;
SIMCHA et al. 1998). Catenine haben keine klassischen Kern- Lokalisationssignalsequenzen (NLSs) und sammeln sich über zwei verschiedene Mechanismen im Kern an. Zum einen konnte gezeigt werden, dass β-Catenin über einen Importin-unabhängigen Weg in einem semipermeablen Zellmodell für Kernimport in den Zellkern gelangt (FAGOTTO et al. 1998; YOKOYA et al. 1999).
Dies könnte in einer Verbindung von β-Catenin und dem Nukleoporin Nup1 begründet liegen (FAGOTTO et al. 1998). Zum anderen führt eine Überexpression von LEF/TCF zu einer Akkumulation von β-Catenin in dem Zellkern (BEHRENS et al.
1996; MOLENAAR et al. 1996; SIMCHA et al. 1998). Es wird vermutet, dass der Kernimport von dem β-Catenin/LEF-, bzw. Plakoglobin/LEF-Komplex über die klassischen NLS der LEF/TCF-Proteine möglich ist. Nachdem ein Anstieg der intranukleären Plakoglobinkonzentration bei einem geringen Vorkommen von LEF/TCF festgestellt wird (SIMCHA et al. 1996, 1998), sind in vivo wahrscheinlich auch LEF/TCF-unabhängige Transportmechanismen von großer Bedeutung.
Auch wenn Plakoglobin an LEF-1 genauso stark bindet wie β-Catenin, so ist doch die Verbindung von Plakoglobin-LEF-1 und DNA sehr schwach (ZHURINSKY et al.
2000a). Dies hängt wahrscheinlich mit der Struktur der terminalen Domänen von Plakoglobin zusammen, da ein Konstrukt, das nur die Arm-Domäne von Plakoglobin enthält, sehr wohl eine effektive Bindung des Dreifachkomplexes mit LEF-1 und DNA eingehen kann (ZHURINSKY et al. 2000a). Eine Bindung von Transkriptionsfaktoren (z.B. CBP, TBP) an die terminalen Domänen eines Catenins könnte eine erhöhte
Affinität des LEF-Catenin-Komplexes zur DNA hervorrufen (ZHURINSKY et al.
2000a). Es wird unter anderem vermutet, dass der positive Effekt von Plakoglobin auf TCF-vermittelte Transkription darin begründet liegt, dass ein verstärkter Transport von β-Catenin in den Zellkern stattfindet (ZHURINSKY et al. 2000b). Es wurde beobachtet, dass β-Catenin und Plakoglobin an verschiedenen Stellen von TCF-4 binden (MIRAVET et al. 2002): β-Catenin bindet an die Aminosäurensequenzen 1-51 und Plakoglobin an die Aminosäurensequenzen 51- 110 (SOLANAS et al. 2004). Die N- und C-Terminalen Domänen sind verantwortlich für die Spezifität von Plakoglobin, indem sie potenzielle Bindungstellen in den armadillo repeats verdecken (SOLANAS et al. 2004). Das führt dazu, dass Bindungspartner aus den Intercalated Discs und den Transkriptionellen Cofaktoren, auch wenn sie jeweils an den entsprechenden Stellen der arm repeats von β-Catenin und Plakoglobin binden könnten, über die unterschiedlichen terminalen Domänen reguliert werden (SOLANAS et al. 2004).
2.2.2.5 Apoptose / Tumorentwicklung
In Tumorzellen ist häufig die Menge an Plakoglobin verringert (ABERLE et al. 1995;
NAVARRO et al. 1993; SOMMERS et al. 1994). Eine Wiederherstellung der Plakoglobinexpression in hochgradig kanzerogenen Zellen konnte die Tumorgenese verringern (BEN-ZE’EV 1997; SIMCHA et al. 1996). Andererseits kann Plakoglobin auch die Apoptose inhibieren. Es wurden drei verschiedene Plakoglobinmutationen in chemisch induzierten murinen Blasentumoren beschrieben (SHIINA et al. 2001).
Weiter konnte in einem Fall eine Plakoglobinmutation in einem Magentumor erkannt werden (CACA et al. 1999) und es wurde eine transformierende Aktivität von Plakoglobin beobachtet, indem es die Effizienz von einer MYC-Induktion erhöhte (KOLLIGS et al. 2000). Eine erhöhte Plakoglobinexpression verursachte zudem eine erhöhte Expression des anti-apoptotischen Proteins BCL-2 in SCC9-Zellen und führte somit zu unkontrolliertem Wachstum (HAKIMELAHI et al. 2000).
Während des apoptotischen Zelltodes werden die Desmosomen mit Hilfe von Caspasen und Metalloproteinasen proteolisiert (WEISKE et al. 2001), wobei
Plakoglobin von Caspase-3 gespalten wird (BRANCOLINI et al. 1998; SCHMEISER et al. 1998).
Die folgende Tabelle führt zusammenfassend alle bisher identifizierten Proteinpartner von Plakoglobin auf:
Tabelle 2.2: Proteinpartner von Plakoglobin (nach ZHURINSKY et al. 2000b) ND = noch nicht ermittelt
Proteinpartner Bindungsstelle an Plakoglobin
Funktion
der Verbindung Quelle Klassische
Cadherine Arm repeats Adhäsion KEMLER 1993 Desmocollin Arm repeats Adhäsion TROYANOVSKY et al.
1994b
Desmoglein Arm repeats Adhäsion TROYANOVSKY et al.
1994a
Desmoplakin Arm repeats Adhäsion KOWALCZYK et al. 1997 Keratin 5 ND Adhäsion SMITH und FUCHS 1998 Protein-tyrosine
phosphatase LAR ND Adhäsion MULLER et al. 1999a α -Catenin
N Terminus und der erste arm
repeat
Adhäsion ABERLE et al. 1996 APC Arm repeats Degradation RUBINFELD et al. 1993;
SHIBATA et al., 1994 Axin/conductin Arm repeats Degradation
BEHRENS et al. 1998;
IKEDA et al. 1998;
KODAMA et al. 1999 β -TrCP N terminus Degradation
HART et al. 1999;
SADOT et al. 2000;
WINSTON et al. 1999 Caveolin-1 ND Membran
Lokalisation (?) GALBIATI et al. 2000 LEF-1 Arm repeats Transaktivierung BEHRENS et al. 1996;
HUBER et al. 1996 TBP C Terminus Transaktivierung HECHT et al. 1999 TCF-4 (an den
Aminosäuren 51- 80)
Arm repeats Transaktivierung MIRAVET et al. 2002
2.3 Plakoglobin-Defizienz
Eine homozygote Deletion des Plakoglobin-Gens führt bei Mäusen zu einem Versterben der Tiere in der Embryogenese. Charakteristisch bei diesen Tieren sind rupturierte Ventrikel und ein Fehlen von Desmosomen (RUIZ et al. 1996). Häufig reißen die Hauptkammern des Herzens, und das Perikard füllt sich mit Blut, so dass die meisten Tiere am 12.-16. Tag der Embryogenese sterben. Die Plakoglobin-/- Tiere waren am 12. Tag der Entwicklung im Wachstum zurückgeblieben, und die Blutzufuhr, vor allem in der Leber und der Plazenta war verringert (RUIZ et al. 1996).
Die Gewebeinstabilität hängt mit dem Fehlen von Desmosomen im Herzen zusammen. Die epithelialen Organe (Haut und Darmtrakt) scheinen davon unberührt zu sein. Stattdessen finden sich verbreiterte Adherens Junctions (bis zu 4,5 µm) im Herzen, die desmosomale Proteine, wie z.B. Desmoplakin beinhalten (RUIZ et al.
1996).
Überlebten die transgenen Mäuse bis zur Geburt, zeigte sich ein zusätzlicher Hautphänotyp, mit Blasenbildung und einer subcornealen Akantholyse (BIERKAMP et al. 1999). Hierbei ersetzte β-Catenin Plakoglobin in den epithelialen Desmosomen.
Dies geschieht jedoch unzureichend in Bezug auf die Struktur und in einer verringerten Anzahl der Desmosomen (BIERKAMP et al., 1999). Der unterschiedliche Effekt von einem Plakoglobinmangel in den kardialen und epithelialen Desmosomen liegt wahrscheinlich in deren unterschiedlicher Zusammensetzung begründet. In den kardialen Desmosomen sind nur einige Proteine der Desmosomen ausgebildet: Desmoglein-2, Desmocollin-2 und Plakophilin-2. In den epithelialen Geweben sind 3 Desmogleine (1-3), 3 Desmocolline (1-3) und Plakophilin-1 ausgebildet (GARROD 1993; KOCH und FRANKE 1994; SCHMIDT et al. 1994; MERTENS et al. 1996).
Ähnliche pathologische Veränderungen, auch in einem vergleichbaren Zeitfenster (10,5 – 12. Entwicklungstag), findet man bei Plakophilin-2 defizienten Tieren.
Allerdings ist kein Desmoplakin bei dieser Mutation mit den Intercalated Discs assoziiert (GROSSMANN et al. 2004). Bei der Genentfernung des Zytoskelett-
verbindenden Desmoplakin (GALLICANO et al. 1998) oder des desmosomalen Cadherins Desmoglein-2 (ESHKIND et al. 2002) wird die Embryogenese schon früher unterbrochen.
In einer In-vitro-Studie zeigte sich eine verringerte passive Compliance bei embryotischen Herzfasern von Plakoglobin-defizienten Mäusen gegenüber Wildtypen. Bei der Untersuchung des passiven Kraft-Dehnungsverhaltens dieser Fasern war die Dehnbarkeit vor allem bei einem geringen Extensionsgrad deutlich verringert. Da die Kontraktilitätsparameter keine Veränderungen aufwiesen, wurde postuliert, dass Plakoglobin nicht notwendig sei, um den myofibrillären Apparat über die Adherens Junctions zu befestigen, aber unabdingbar für die kardiale Compliance (ISAC et al. 1999).
Heterozygote Tiere unterschieden sich nicht von den Wildtypen in der Morphologie während der Embryogenese und erreichen das Erwachsenenalter (RUIZ et al. 1996).
Trotzdem konnte ein verringerter Plakoglobingehalt in murinen Herzfasern gegenüber Wildtypen festgestellt werden (ISAC et al. 1999).
2.4 Elektrokardiographie bei der Maus
1929 wurde das erste murine Elektrokardiogramm (EKG) von AGDUHR und STENSTRÖM aufgezeichnet und darüber berichtet, dass keine deutliche T-Welle erkennbar war. Über 20 Jahre später wurde dann das EKG kleiner Säugetiere eingehender beschrieben (LOMBARD 1952; RICHARDS et al. 1953). Hierbei wurde wiederum berichtet, dass keine deutlichen T-Wellen entdeckt wurden, mit Ausnahme vom Meerschweinchen. Allerdings wurde in manchen Fällen eine Einkerbung am Ende des QRS-Komplexes als mutmaßliche T-Welle bezeichnet. Hierbei trat dann kein isoelektrisches ST-Segment auf. Des Weiteren zeigten sich verkürzte P-R und QRS-Intervalle und eine bis zu zehnfach schnellere Herzfrequenz im Vergleich zum Menschen. Diese Erkenntnisse belegten bereits die deutlichen Unterschiede in den Charakteristika der EKGs zwischen Mensch und Maus. Aufgrund des Phänomens, dass kein deutliches ST-Segment vorliegt, definierten GUSSAK et al. (1995) den J- Punkt als Repolarisationsbeginn der Ventrikel und das Ende der T-Welle als Repolarisationsende. Der abrupte Übergang vom QRS-Komplex zum ST-Segment stellt den J-Punkt dar. Von einer J-Welle spricht man, wenn der J-Punkt nicht auf der isoelektrischen Linie liegt. Diese Definition wurde anschließend auch bei der Maus angewandt, bei der physiologischerweise kein isoelektrisches ST-Segment vorliegt (GUSSAK et al. 2000). Dieses Charakteristikum liegt darin begründet, dass bei der Maus die Repolarisation bereits beginnt, während in anderen Bereichen des Herzen noch die Depolarisation stattfindet. Erklärbar ist dies durch das Fehlen einer Plateauphase der Aktionspotentiale in erwachsenen Mäusen (LONDON 2001). Die Aktionspotentiale zeigen für eine kurze Zeit nach der Geburt eine Plateauphase, die dann aber mit zunehmenden Alter kürzer wird (GUSSAK et al. 2000). Hierbei resultiert eine altersabhängige Zunahme eines 4-AP-sensitiven Kaliumauswärtsstromes (ITO) in eine sehr schnelle Repolarisation. Bei ITO
unterscheidet man ITO,f -Ströme (schnelle Öffnung, schnelle Inaktivierung) und ITO,s- Ströme (schnelle Öffnung, langsame Inaktivierung). In den Mausventrikelzellen adulter Tiere liegt eine hohe Dichte von ITO vor und diese korreliert direkt mit der verkürzten Plateauphase der Aktionspotentiale und der J-Welle im EKG (GUSSAK et
al. 2000). Interessanterweise ist ITO bei verschiedenen Herzerkrankungen bei Mensch und Hund reduziert (GUSSAK et al. 2000). Für die langsamere Repolarisationsphase und die Rückkehr der Zelle zum Ruhemembranpotential sind zwei weitere Kalium-Auswärtsströme (IK,s und Iss) verantwortlich (GUSSAK et al.
2000).
In Abbildung 2.4 sind die verschieden aussehenden EKG-Kurven von Mensch und Maus dargestellt, die aus den beschriebenen elektrophysiologischen Besonderheiten resultieren.
Abbildung 2.4: Schematische Darstellung der unterschiedlichen EKG-Kurven bei Mensch und Maus
Im oberen Teil der Abbildung ist ein typisches Maus EKG, im unteren Teil das eines Menschen dargestellt.
2.5 Echokardiographie bei der Maus
MANNING et al. beschrieben 1994 den hochfrequenten kardialen Ultraschall bei Mäusen zur Errechnung der linksventrikulären Masse. HOIT et al. (1995) wandte die transthorakale Echokardiographie bei Mäusen an, um Unterschiede in der linksventrikulären Funktion zwischen Wildtypen und transgenen Mäusen darzustellen. Die transthorakale Echokardiographie ist eine nicht invasive Untersuchungsmethode, die eine morphologische und funktionale Charakterisierung des kardialen Phänotyps ermöglicht (TANAKA et al. 1996). Veränderungen des linken Ventrikels wie Kammergröße, Wanddicken, Masse und Funktion konnten durch diese Methode bereits in der Vergangenheit zuverlässig ermittelt werden.
Neuere Untersuchungen bestätigen, dass die 2D Echokardiographie die Möglichkeit einer kostengünstigen, akkuraten und nicht invasiven Methode zur Beurteilung der kardiovasculären, strukturellen und funktionellen Veränderungen in den verschiedenen Mausmodellen bietet (COLLINS et al. 2003). 1998 zeigten STEUDEL et al. und SCHERRER-CROSBIE et al. zuerst eine transösophagiale Echokardiographiemethode zur Darstellung von Größe und Funktion des rechten Ventrikels bei Mäusen. Hierbei wurde ein intravasculärer Ultraschallkatheter in den Ösophagus eingeführt und es wurden vier bis sechs Querschnitte des rechten Ventrikels erstellt. In diesen verschiedenen Ebenen wurden sowohl die endo- als auch die epikardialen Wände umfahren und darüber die Fläche der freien rechtsventrikulären Wand und nach der Simpson-Methode auch das gesamte Volumen der rechtsventrikulären Wand sowie das rechtsventrikuläre Volumen an sich errechnet. Mit Hilfe des diastolischen und systolischen Volumens wurde ebenso das Schlagvolumen und die rechtsventrikuläre Ejektionsfraktion ermittelt.
Anschließend wurde der Durchmesser der freien Wand unterhalb der Trikuspidalklappe direkt gemessen. Diese echokardiographische Methode erlaubte zum ersten Mal eine zuverlässige Visualisierung und Quantifizierung der rechtsventrikulären Struktur und Funktion bei Mäusen (SCHERRER-CROSBIE et al.
1998). Beim adulten Menschen wurde eine zuverlässige Vermessung des rechten
Ventrikels mit Hilfe der transthorakalen Echokardiographie bereits 1986 von FOALE et al. beschrieben. Hierbei wurden sieben verschiedene Einstellungen gewählt:
1. die parasternale lange Achse,
2. die parasternale lange Achse zur Darstellung der Trikuspidalklappe,
3. die parasternale kurze Achse in verschiedenen Ebenen (um auch eine Darstellung des rechtsventrikulären Ausflusstraktes zu ermöglichen),
4. den apikalen Vierkammerblick, 5. den apikalen Zweikammerblick, 6. die subcostale lange Achse,
7. die subcostale kurze Achse des rechtsventrikulären Ausfluss- und Einflusstraktes.
Mit Hilfe dieser Schnitte konnte die Breite des rechtsventrikulären Ausfluss- und Einflusstraktes, sowie die Breite und Länge des rechten Ventrikels bestimmt werden (FOALE et al. 1986). Die Messung des Trikuspidal- und Pulmonalflusses mit Hilfe eines gepulsten Dopplers wurde auch mehrfach in der Humanmedizin beschrieben (DINI et al. 2004; JAUSSI et al. 1989; SHIMIZU et al. 2003). In einer Studie von ZHOU et al. (2003) wurden gepulste Dopplermessungen des Trikuspidalflusses bei neugeborenen und juvenilen Mäusen durchgeführt.
2.6 Fragestellung
Die molekularen Funktionen von Plakoglobin wurden bereits in verschiedenen Arbeiten beschrieben. Ebenso wurde ein Tiermodell von homozygoten Plakoglobin- defizienten Mäusen bereits näher charakterisiert. Weitere Mausmodelle arbeiteten mit Tieren, bei denen eine Defizienz im Plakophilin-2-, Desmoplakin- und Desmoglein-2-Gen vorlag, die ebenso für die Zell-Zell-Adhäsion verantwortlich ist.
Hier wurden hauptsächlich die homozygoten Tiere, die bereits in der Embryogenese verstarben, ausführlich beschrieben. Systematische Untersuchungen der heterozygoten Tiere zur Elektrophysiologie, Einfluss von Belastungen oder zur Morphologie im Rahmen von echokardiographischen Untersuchungen adulter Mäuse wurden bisher nicht durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Herzen der transgenen Mäuse in vivo phänotypisiert. Dies ermöglichte auch die Darstellung eines alters- und trainingsabhängigen Verlaufs eventuell auftretender Veränderungen.
Die humane, autosomal-rezessive Plakoglobindefizienz-Erkrankung (Naxos Disease) zählt zu den arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathien (ARVC). Die phänotypische Ausprägung der ARVC findet man in juvenilen sowie adulten Menschen, und sie kann vermutlich durch Ausdauersport verstärkt werden. Hier tritt die letale Phase weitaus später als in den homozygoten Tiermodellen auf. Um die pathophysiologischen Ursachen der ARVC näher zu charakterisieren, sollen bei diesem Mausmodell echokardiographische, elektrokardiographische und elektrophysiologische Untersuchungen in vivo durchgeführt werden.
Es sollen folgende Fragen untersucht werden:
Hat das heterozygote Vorkommen des Plakoglobin-Gens Auswirkungen auf die Elektrophysiologie und die Morphologie des Herzens?
Sind die Folgen einer heterozygoten Plakoglobin-Defizienz vom Alter der Tiere oder dem Trainingszustand abhängig?
Treten unter Medikation mit β-Adreno-Rezeptor-Agonisten vermehrt Arrhythmien oder Funktionsstörungen auf?
3. Experimenteller Teil
3.1 Tiere und Tierhaltung
Sowohl der Entwurf als auch die Durchführung der Studie erfolgte nach den allgemeinen und lokalen Richtlinien des Tierschutzes (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publication No. 85- 23, revised 1996)).
3.1.1 Plakoglobin-defiziente Mäuse
Die Plakoglobin+/-Mäuse wurden im Max-Delbrück-Center für Molekularmedizin in Berlin für diese Studie gezüchtet und genotypisiert. Aufgrund dessen soll hier nur kurz auf die Verfahrensweise eingegangen werden.
Ein Plakoglobin-Klon wurde aus einer 129/SV Maus Genom Bibliothek (Stratagene, La Jolla, CA, U.S.A.) ausgewählt, und es wurde ein Vektor aus einem 11-kb Genom- Fragment zusammengestellt. In diesem Vektor (Großteil des Exons 3) wurden die folgenden intrinsischen Sequenzen und die 5`Region des Exons 4 (verschlüsselt die Aminosäuren 70-160) durch eine Neomycin Gen Kassette (Neo) in derselben transkriptionellen Ausrichtung ersetzt. Eine Herpes-Simplex-Virus-Thymidine-Kinase- Gen-Kassette (HSV-TK) wurde an dem 3´Ende des Konstruktes eingefügt (MANSOUR et al. 1988; s. Abb. 3.1.1). Der linearisierte Vektor wurde mit Hilfe der Elektroporation in E14.1 murine embryonale Stammzellen (ES) transferiert.
Die Integration und Rekombination dieser Konstruktion wurde durch Southern Blot verifiziert. Die Zellen wurden in Lysepuffer bei 55°C und mit 0,1 mg/ml Proteinase K verbracht und die genomische DNA wurde ausgefällt. Nach dem Aufschluss mit XhoI und XbaI wurden die Fragmente per Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel separiert und auf Hybond-N+-Membranen (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) übertragen.
Mit 32P-gekennzeichnete Proben wurden aus genomischen Plakoglobin-Sequenzen hergestellt, die für die Konstruktion des Zielvektors benutzt wurden. Nach Aufschluss mit BspEI und XabI (1.1 kb 3`externer Abschnitt) und mit BstEII und NdeI (1.3 kb interner Abschnitt) wurden Fragmente isoliert und mit Hilfe des multiprime labeling
system (Amersham) gekennzeichnet. Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C über Nacht in einem Hybridisationspuffer, und die Blots wurden für 24 h einem Röntgenfilm exponiert. ES-Zell Klone, die die gewünschte Integration beinhalteten, wurden in eine C57Bl/6-Empfänger-Blastocyste injiziert und diese in scheinschwangere NMRI Weibchen übertragen, um Mäusechimäre zu erzeugen (MANSOUR et al. 1988). Männliche Nachkommen mit deutlichem Fellfarben- Chimärismus wurden mit C57Bl/6 Weibchen gekreuzt. Um die Genotypen zu identifizieren, wurde isolierte DNA aus den Schwanzspitzen zuerst mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) und dann mit Southern Blot analysiert.
Für die PCR Genotypisierung wurden die Proben mit 0,1mg/ml Proteinase K aufgeschlossen und die DNA präzipitiert. Es wurden drei verschiedene Primer benutzt. Die Reaktionsprodukte wurden mit einer Ethidium-Bromid-Färbung auf 1,2%
Agarosegel sichtbar gemacht.
Abbildung 3.1.1: Eine Restriktionsübersichtstafel
von dem genomischen Plakoglobin Klon, der für die Vektorkonstruktion genutzt wurde (oben), der Zielvektor für die Genentfernung (Mitte) und der Zielort (unten).
Exon3 und 4 sind als graue Rechtecke dargestellt (ex3 und ex4). Die 1,1-kb lange externe Probe, die für die Southern Blot Analyse genutzt wird, ist als schwarzer Balken dargestellt (probe). Pfeile kennzeichnen die Restriktionsstelle für Xbal und Xhol. (RUIZ et al.1996)
3.1.2 Tierhaltung
Alle Tiere wurden in Makrolonkäfigen Typ II auf staubfreiem Weichholzgranulat gehalten. Zusätzlich wurden die Käfige mit zwei Papiertüchern als Nestmaterial ausgestattet, um den Tieren eine Rückzugsmöglichkeit zu bieten. Tiere, die nur für elektro- oder echokardiographische Untersuchungen oder für das Schwimmtraining verwendet wurden, wurden in Gruppen mit bis zu vier Tieren aufgestallt. Während der Telemetriephase wurden die Tiere einzeln gehalten.
Für alle Tiergruppen lag die Raumtemperatur bei 22 +/- 2°C, die relative Luftfeuchtigkeit bei 55 +/- 5% und die Belichtung fand von 07.00 bis 19.00 Uhr MEZ statt.
Pelletiertes, autoklaviertes Haltungsfutter für Ratten/Mäuse der Firma Altromin GmbH (Lage, D) (Inhaltsstoffe: Rohprotein 19,0%, Rohfett 4,0%, Rohfaser 6,0%, Rohasche 7,0%, Calcium 0,9% und Phosphor 0,7%; Zusatzstoffe je kg: Vit. A 15.000 IE, Vit. D3 600 IE, Vit. E 75 mg, Kupfer 5 mg) wurde ad libidum gefüttert, zusätzlich wurde Leitungswasser aus Tränkeflaschen ad libidum bereitgestellt.
Genehmigung
Das Versuchsvorhaben wurde von der Bezirksregierung Münster unter der Nummer G 59/2003 genehmigt.
3.2 Elektrophysiologische Untersuchungen
3.2.1 Erstellung des Oberflächenelektrokardiogramms
Es wurden ein digitales 6 Kanal EKG (EMKA Technologies ECG Auto user manual) und ein manuelles 6 Kanal EKG (Siemens Megacart, 1993 Siemens Erlangen) für mindestens zehn Sekunden erstellt (KORTE et al. 2002). Es wurden die bipolaren Standardableitungen I, II und III nach Einthoven, sowie die unipolaren Standardableitungen aVR, aVL, aVF nach Goldberger abgeleitet. Manuell wurden zusätzlich Brustwandableitungen geschrieben. Das manuelle EKG wurde bei einer Laufgeschwindigkeit von 20 mm/s und Amplitudenhöhe von 10 mm/mV auf handelsüblichem EKG-Papier ausgedruckt. Es wurde ein Tremorfilter 35Hz und ein Schwächungsfilter 100Hz verwendet.
Vor jeder Aufzeichnung wurden die Mäuse mit dem jeweils entsprechenden Narkotikum für die darauf folgende Untersuchung narkotisiert bzw. sediert. Bei einer anstehenden echokardiographischen Untersuchung wurden die Tiere mit Diazepam (17,5 mg pro kg Körpergewicht) sediert, vor der Langendorff-Untersuchung mit Urethan (2 g pro kg Körpergewicht) und vor einer Transmitter-OP mit einem Xylazin- Ketamin-Gemisch (50 mg Ketamin pro kg Körpergewicht und 10 mg Xylazin pro kg Körpergewicht) narkotisiert, jeweils über eine intraperitoneale Verabreichung. Im späteren Verlauf wurde die Transmitter-OP mit einer Isofluran-Inhalationsnarkose (2% Isofluran, 98% Sauerstoff) durchgeführt und unter dieser Medikation ein Oberflächen-EKG aufgezeichnet. Um die Qualität der Signalübertragung der Brustwandableitungen zu verbessern, wurde den Mäusen die Brust rasiert.
Zur Aufzeichnung der Oberflächen-EKGs wurden die Mäuse zunächst in Rückenlage auf eine Wärmeplatte (40°C) gelegt. Die Gliedmaßen der Mäuse wurden mit Elektrodengel benetzt und Schlaufenelektroden aus weichem, geflochtenem, nichtoxidierbarem Stahldraht wurden sanft darüber gezogen.
Die EKG-Schlaufenelektroden waren mit einem herkömmlichen EKG-Schreiber (Siemens Megacart, 1993 Siemens Erlangen) für die manuelle Aufzeichnung und gleichzeitig mit einem ITF 16 EKG Verstärker (EMKA Technologies, Paris, F)
verbunden, so dass zusätzlich ein digitales EKG mit IOX-Software auf dem Computer aufgezeichnet werden konnte.
3.2.2 Erstellung des telemetrischen Elektrokardiogramms
Die drahtlose Radiotelemetrie, die Messwerte mit Hilfe von Funkwellen überträgt, wurde zur telemetrischen Datenerfassung genutzt.
3.2.2.1 Aufbau der Anlage
Abbildung 3.2.2.1: Schematische Darstellung des Aufbaus der Telemetrieanlage
Radiotelemetrie, die zur Erfassung von Daten lebender Tiere dient, wird als Biotelemetrie bezeichnet (KRAMER et al. 2000). In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Biotelemetrie Elektrokardiogramme von Mäusen aufgezeichnet, die sich frei bewegen konnten.
