2. Stand der Forschung
2.2 Plakoglobin
2.2.2 Funktion
Plakoglobin dient als Komponente an verschiedenen Zell-Zellverbindungen einschließlich Desmosomen, Zonulae adherentes im Epithel, Belt-Plaques im Endothel und in Verbindungen ohne nachweisbare Filamente, wie im lymphatischen Endothel und Granularzellen der zerebellären Glomeruli (FRANKE et al. 1987;
GARROD 1993; SCHMIDT et al. 1994; ROSE et al. 1995). Es ist das einzige Protein,
das sowohl in Desmosomen als auch in Adherens Junctions vorkommt (MATHUR et al. 1994; SACCO et al. 1995; CHITAEV et al. 1996; WITCHER et al. 1996).
Plakoglobin liegt in freier und in gebundener Form im Zytosol vor.
Abbildung 2.2.2: Die verschiedenen Funktionen von Plakoglobin (ZHURINSKY et al. 2000b) Plakoglobin (Pg) kann an dem zytoplasmatischen Ende des Cadherin Adhäsions-Rezeptors in den Adherens Junctions (AJ) binden. Über α-Catenin (α) gehen Plakoglobin und β-Catenin (β) eine Cadherin-Verbindung mit dem Aktin-Zytoskelett ein. Plakoglobin kann im Gegensatz zum β-Catenin zusätzlich mit den desmosomalen Cadherinen Desmocollin und Desmoglein in den Desmosomen (DES) eine Verbindung eingehen, und über Desmoplakin (Dsp) und Plakophilin (Plp) auch mit intermediären Filamenten (IF).
Wenn die Wnt (wingless bei Drosophila)-Signalkette nicht aktiviert ist, wird freies Plakoglobin in einem Multimolekularem Komplex abgebaut. Dieser beinhaltet den Tumor Supressor APC (adenomatous polyposis coli), Axin und GSK (Glykogen Synthase Kinase), die wiederum Plakoglobin phosphoriliert (PP). Dieser Komplex steht über die Ubiquitin Lygase β-TrCP in Verbindung mit dem Ubiquitin-Proteasomen System, welche (zusammen mit Cul1 und Skp1) die Ubiquitination (Ub) von Plakoglobin vermittelt und somit zu dem Abbau durch Proteasomen führt.
Die Verbindung von Wnt mit dem Frizzled (Frz)-Rezeptor aktiviert die Wnt-Signalkette, und Dishevelled (Dsh) unterdrückt die Plakoglobin Phosphorilierung durch Hemmung der GSK-Aktivität. Dies führt zu einer Akkumulation von Plakoglobin. Die Fähigkeit von Plakoglobin zur Transkription in einem Komplex mit TCF (T-Zell Faktor) wird noch kontrovers diskutiert.
2.2.2.1 Intercalated Discs – Plakoglobin vs. β-Catenin
Plakoglobin ist ein zytoskelettäres Protein aus der Familie der Catenine (RUIZ et al.
1996). Es verbindet die Zytoskelettfilamente mit den Zellkontaktproteinen der Intercalated Discs (RUIZ et al. 1996) und spielt somit eine entscheidende Rolle in den Desmosomen und Adherens Junctions. Es dient als Stützpfeiler in der Architektur der Intercalated Discs und ist damit auch für die Stabilität des Herzgewebes verantwortlich (RUIZ et al. 1996). Bei einer Veränderung in diesen Verbindungen wird eine darauf folgende Instabilität des Zellverbandes vermutet (PROTONOTARIOS et al. 2002).
Sowohl in kardialen als auch epidermalen Zell-Zell-Kontakten formt Plakoglobin zusammen mit Cateninen, klassischen und desmosomalen Cadherinen und Mitgliedern der Plakinfamilie die Kernstruktur für Adhäsion und interzelluläre Signalleitung (RUIZ et al. 1996).
Plakoglobin kommt sowohl in den Desmosomen, als auch in den Adherens Junctions vor (COWIN et al. 1986; s. Abb. 2.2.2) und hat hier eine vergleichbare Funktion wie β-Catenin (COWIN und BURKE 1996; SCHMIDT et al. 1994). Ein Wettbewerb zwischen den klassischen und den desmosomalen Cadherinen um eine Plakoglobinbindung ist Bedingung für eine Regulation des Aufbaus dieser Zell-Zell-Verbindungen (BEN-ZE’EV und GEIGER 1998; COWIN und BURKE 1996; LEWIS et al. 1997).
Obwohl Plakoglobin die klassischen Cadherine über α-Catenin mit Aktin in den Adherens Junctions verankern kann, verliert es diese Fähigkeit, wenn es in den Desmosomen eingebunden ist (CHITAEV et al. 1998).
Im Gegensatz zu den Arm-Domänen von β-Catenin und Plakoglobin sind die N- und C-terminalen Domänen nur in wenigen Bereichen ähnlich (COWIN und BURKE 1996). Weitere Studien belegen, dass die terminalen Domänen auch verantwortlich sind für die Interaktionen der Arm-Domäne mit anderen Proteinen (CHITAEV et al.
1996; PALKA und GREEN 1997; ZHURINSKY et al. 2000a). Zum Beispiel wird durch Deletion der C-terminalen Domäne die Bindung von Cateninen zu Cadherinen mit dem Arm repeats positiv beeinflusst (CHITAEV et al. 1996). Solch eine Deletion kann
ebenso den Aufbau von Plakoglobin-beinhaltenden Desmosomen stimulieren (PALKA und GREEN 1997).
SCHNITTLER et al. (1997) haben eine verringerte Zelladhäsion bei Inhibition der Plakoglobinexpression in endothelialen Zellen entdeckt, die einer Flüssigkeitsscherspannung ausgesetzt waren. Diese Entdeckung lässt die Vermutung zu, dass Plakoglobin für die endothelialen interzellulären Verbindungen benötigt wird, um dem mechanischen Stress standzuhalten. Plakoglobin scheint somit eine entscheidende Rolle in der endothelialen Zell-Zell-Adhäsion und Barrierefunktion inne zu haben (VENKITESWARAN et al. 2002).
2.2.2.1.1 Desmosomen
Desmosomen kommen gehäuft in Herzmuskelzellen und in Keratinozyten vor. Hier formen sie symmetrische Plaques, die mehrere Mikrometer im Durchmesser und ca.
100 nm dick sind. Jede Hälfte der Desmosomen ist abgeleitet von einer benachbarten Zelle, in welcher intermediäre Filamente einen Anker durch die zytoplasmatische Peripherie zu bilden scheinen (KELLY 1966).
Plakoglobin bindet in den Desmosomen die desmosomalen Cadherine (Desmocollin und Desmoglein (TROYANOVSKY et al. 1994a,b)) an Desmoplakin, Plakophilin (KOWALCZYK et al. 1997) und epidermales Keratin (SMITH und FUCHS 1998).
Plakoglobin stellt über Desmoplakin, Plakophilin und Keratin eine Verbindung zu dem intermediären Filamenten des Zytoskeletts her (SCHMIDT et al. 1994; s. Abb. 2.2.2).
Besonders dokumentiert wurde die Verbindung zwischen Plakoglobin und Desmoglein, die stärker zu sein scheint als zwischen Plakoglobin und Desmocollin (MATHUR et al. 1994; TROYANOVSKY et al. 1994b; TROYANOVSKY et al. 1996;
CHITAEV et al. 1996; WAHL et al. 1996; WITCHER et al. 1996; KOWALCZYK et al.
1997).
Das Fehlen von Plakoglobin führt zu drastischen Veränderungen in der Architektur der Intercalated Discs: Typische Desmosomen fehlen in den Intercalated Discs von Plakoglobin-/- Mäusen (RUIZ et al. 1996). In epithelialen Zellen findet man stattdessen bei Plakoglobin Knockout-Mäusen β-Catenin in den sonst β-Catenin-freien Desmosomen. Trotzdem kann β-Catenin nicht alle desmosomalen Proteine mit
all ihren molekularen Interaktionen korrekt verbinden; dies erscheint besonders auffällig, wenn Zellen normalem mechanischen Stress ausgesetzt sind (BIERKAMP et al. 1999; RUIZ et al. 1996). SMITH und FUCHS (1998) haben auch in einer In vitro-Analyse eine Plakoglobin-unabhängige Verbindung zwischen desmosomalen Cadherinen und Desmoplakin darstellen können.
Aufgrund von mutiertem Plakoglobin herrschte in einer anderen In-vitro-Studie eine Desmosomen-Dysfunktion, die wiederum zu einem progressiven Myozytensterben bei mechanischem Stress führte (RUIZ et al. 1996).
2.2.2.1.2 Adherens Junctions
Adherens Junctions sind ebenso wie die Desmosomen für die Zell-Zell-Adhäsion verantwortlich. Sie setzen sich aus den klassischen Cadherinen (E-, N-, P- und VE-Cadherin), Plakoglobin, β-Catenin und α-Catenin zusammen. In dieser Architektur bindet Plakoglobin zum einen an die distale Region des zytoplasmatischen Endes der Cadherine (catenin binding domain) (VINCENT et al. 2004) und zum anderen an α-Catenin und bildet über dieses Protein einen Anker zu dem Aktin-Zytoskelett für die Adherens Junctions (KNUDSEN et al. 1995; s. Abb. 2.2.2).
Aufgrund des hohen Homologitätsgrades liegt ein Wettbewerb um dieselben Bindungsstellen zwischen β-Catenin und Plakoglobin nahe. So kann ein hoher Level an exogenem Plakoglobin dazu führen, dass endogenes β-Catenin von den Adherens Junctions verdrängt wird und zu dessen proteasomaler Degradation führt (SALOMON et al. 1997).
2.2.2.2 Wnt-Signalweg
Die Wnt-Protein Familie spielt eine entscheidende Rolle als Wachstums- und Differenzierungsfaktor in der Spezifizierung der Zellen während der embryonalen Entwicklung. Wenn das abgesonderte wingless-Glycoprotein (Wnt) an einen Zelloberflächenrezeptor frizzled/ frizzled-2-type bindet (BHANOT et al. 1996; BHAT 1998; KENNERDELL und CARTHEW 1998; MULLER et al. 1999b), aktiviert es das zytoplasmatische Protein dishevelled (Dvl) (YANAGAWA et al. 1995), das wiederum
zu einer Inaktivierung der Glykogenkinase-3β (Gsk3b) führt (YOST et al. 1997).
Gsk3b ist für die Phosphorylierung von β-Catenin und Plakoglobin verantwortlich (siehe Phosphorylierung).
Die Beteiligung von Plakoglobin in der Wnt-Signalkaskade wird immer noch debattiert (KARNOVSKY und KLYMKOWSKY 1995; KOFRON et al. 1997; MILLER und MOON 1997; SIMCHA et al. 1998). In manchen Studien teilt man Plakoglobin eine einzigartige Rolle, die unterschiedlich zu der Funktion des β-Catenin ist, in diesem Signalweg zu (CHARPENTIER et al. 2000; SIMCHA et al. 1996;
ZHURINSKY et al. 2000a).
Auch wenn in verschiedenen Zelltypen eine Überexpression von Wnt zu einer Akkumulation von Plakoglobin führt (BRADLEY et al. 1993; PAPKOFF et al. 1996), ist die Beteiligung von Plakoglobin in dem Wnt-Signalweg in vivo immer noch umstritten, da Plakoglobin die Abwesenheit von β-Catenin bei Knockout-Mäusen nicht ausgleichen kann (BIERKAMP et al. 1996; HAEGEL et al. 1995; HÜLSKEN et al. 2000; RUIZ et al. 1996).
Interessanterweise wurde in einer neueren Studie erkannt, dass eine Expression von Plakoglobin in der Haut von transgenen Mäusen (CHARPENTIER et al. 2000) zu einem anderen Phänotyp führt (verringerte epitheliale Proliferation und verringertes Haarwachstum) als bei einer β-Catenin Expression (de novo Haarfollikel Morphogenese und Tumorentwicklung) (GAT et al. 1998). Ein ähnlicher Phänotyp tritt auch auf, wenn spätere Komponenten im Wnt-Signalweg (WNT-3 oder DVL-2, eine Isoform von Dishevelled) in der Haut überexpremiert werden (MILLAR et al.
1999). Dies könnte ein Hinweis auf eine Beteiligung von Plakoglobin in dem Wnt-Signalweg in einer Reaktion, die nach WNT-3 und DVL-2 auftritt, sein (MILLAR et al.
1999).
2.2.2.3 Phosphorylierung
Bei den Cateninen wird Serin/Threonin und Tyrosin phosphoryliert, um die Reaktionen mit anderen Proteinen zur regulieren (YOST et al. 1996; HAMAGUCHI et al. 1993; MATSUYOSHI et al. 1992).
Plakoglobin ist Ziel des proteasomalen Abbaus mit Hilfe des Axin-APC-Komplexes (KODAMA et al. 1999; SADOT et al. 2000; s. Abb. 2.2.2). Plakoglobin kann einen Komplex mit APC (adenomatous polyposis Coli) (RUBINFELD et al. 1993; SHIBATA et al. 1994), Axin (BEHRENS et al. 1998; IKEDA et al. 1998; KODAMA et al. 1999) und Gsk3b (ABERLE et al. 1997) formen. Die N-terminale Domäne von Plakoglobin wird von Gsk3b (Glykogenkinase-3β) am Serin-Rest phosphoryliert (ABERLE et al.
1997; YOST et al. 1996; KODAMA et al. 1999). Die Gsk3b-vermittelte Phosphorylierung führt zum proteasomalen Abbau über eine Ubiquitination von Plakoglobin (ABERLE et al. 1997; SADOT et al. 2000).
Solange Plakoglobin in den Desmosomen oder Adherens Junctions gebunden ist, ist es unzugänglich für die Degradationsmaschinerie (SADOT et al. 2000).
Punktmutationen oder Deletion der N-terminalen Phosphorylierungsstelle haben keinen Effekt auf die Halbwertszeit von Plakoglobin (WILLIAMS et al. 2000).
Trotzdem ist die N-terminale Gsk3b Phosphorilierungstelle wichtig für die Plakoglobinstabilität, da eine Überexpression von Axin, das die Gsk3b-abhängige Phosphorilierung fördert, zu einem Plakoglobinabbau führt (KODAMA et al. 1999).
Plakoglobin kann ebenso am Tyrosin über eine Rezeptor-vermittelte und eine nicht Rezeptor-vermittelte Tyrosin-Kinase phosphoryliert werden (HAMAGUCHI et al.
1993; MATSUYOSHI et al. 1992). Der EGF-Rezeptor (epidermal growth factor) reagiert direkt mit Plakoglobin (HOSCHUETZKY et al. 1994; MATSUYOSHI et al.
1992) und phosphoriliert dabei Tyrosin, so dass eine Verbindung mit Desmoplakin, nicht aber mit Desmoglein verhindert wird (GAUDRY et al. 2001). Zusätzlich wurde entdeckt, dass Peroxyvanadat die Tyr(P)-Phophatase inhibiert. Dies führt zu einer verringerten Zell-Zell-Adhäsion, da die Verbindungen zwischen Plakoglobin mit α-Catenin und E-Cadherin abnehmen. Dieser Effekt kann mit Hilfe der Tyr(P)-Phosphatase wieder rückgängig gemacht werden (HU et al. 2001). Auch wenn β-Catenin und Plakoglobin hochgradig verwandt sind, so phosphorilieren dieselben Kinasen doch unterschiedliche Stellen in den beiden Proteinen (SOLANAS et al.
2004). Darüber hinaus hat die Phosphorylierung an den entsprechenden gleichen Stellen verschiedene Effekte auf die Reaktionen von β-Catenin und Plakoglobin mit deren Zellpartnern (MIRAVET et al. 2003).
2.2.2.4 Plakoglobin als Transkriptionsfaktor
Plakoglobin kann an LEF/TCF (lymphocyte enhancer binding factor-1/ T-Zell Faktor) binden (HECHT et al. 1999; HUBER et al. 1996; SIMCHA et al. 1998; ZHURINSKY et al. 2000a) und hat einen Transaktivierungsbereich an der C-terminalen Domäne (HECHT et al. 1999; SIMCHA et al. 1998).
Da β-Catenin vor allem mit seiner Arm-repeat-Domäne an die Transkriptionsfaktoren bindet, und diese mit der von Plakoglobin nahezu homolog ist (COWIN und BURKE 1996), liegt es nahe, dass Plakoglobin auch mit denselben Kernmolekülen interagiert. Plakoglobin kann einen Komplex mit LEF-1 eingehen, wenn eine Cotransfektion beider Moleküle in der Zelle durchgeführt wird (HUBER et al. 1996;
SIMCHA et al. 1998). Catenine haben keine klassischen Kern-Lokalisationssignalsequenzen (NLSs) und sammeln sich über zwei verschiedene Mechanismen im Kern an. Zum einen konnte gezeigt werden, dass β-Catenin über einen Importin-unabhängigen Weg in einem semipermeablen Zellmodell für Kernimport in den Zellkern gelangt (FAGOTTO et al. 1998; YOKOYA et al. 1999).
Dies könnte in einer Verbindung von β-Catenin und dem Nukleoporin Nup1 begründet liegen (FAGOTTO et al. 1998). Zum anderen führt eine Überexpression von LEF/TCF zu einer Akkumulation von β-Catenin in dem Zellkern (BEHRENS et al.
1996; MOLENAAR et al. 1996; SIMCHA et al. 1998). Es wird vermutet, dass der Kernimport von dem β-Catenin/LEF-, bzw. Plakoglobin/LEF-Komplex über die klassischen NLS der LEF/TCF-Proteine möglich ist. Nachdem ein Anstieg der intranukleären Plakoglobinkonzentration bei einem geringen Vorkommen von LEF/TCF festgestellt wird (SIMCHA et al. 1996, 1998), sind in vivo wahrscheinlich auch LEF/TCF-unabhängige Transportmechanismen von großer Bedeutung.
Auch wenn Plakoglobin an LEF-1 genauso stark bindet wie β-Catenin, so ist doch die Verbindung von Plakoglobin-LEF-1 und DNA sehr schwach (ZHURINSKY et al.
2000a). Dies hängt wahrscheinlich mit der Struktur der terminalen Domänen von Plakoglobin zusammen, da ein Konstrukt, das nur die Arm-Domäne von Plakoglobin enthält, sehr wohl eine effektive Bindung des Dreifachkomplexes mit LEF-1 und DNA eingehen kann (ZHURINSKY et al. 2000a). Eine Bindung von Transkriptionsfaktoren (z.B. CBP, TBP) an die terminalen Domänen eines Catenins könnte eine erhöhte
Affinität des LEF-Catenin-Komplexes zur DNA hervorrufen (ZHURINSKY et al.
2000a). Es wird unter anderem vermutet, dass der positive Effekt von Plakoglobin auf TCF-vermittelte Transkription darin begründet liegt, dass ein verstärkter Transport von β-Catenin in den Zellkern stattfindet (ZHURINSKY et al. 2000b). Es wurde beobachtet, dass β-Catenin und Plakoglobin an verschiedenen Stellen von TCF-4 binden (MIRAVET et al. 2002): β-Catenin bindet an die Aminosäurensequenzen 1-51 und Plakoglobin an die Aminosäurensequenzen 51-110 (SOLANAS et al. 2004). Die N- und C-Terminalen Domänen sind verantwortlich für die Spezifität von Plakoglobin, indem sie potenzielle Bindungstellen in den armadillo repeats verdecken (SOLANAS et al. 2004). Das führt dazu, dass Bindungspartner aus den Intercalated Discs und den Transkriptionellen Cofaktoren, auch wenn sie jeweils an den entsprechenden Stellen der arm repeats von β-Catenin und Plakoglobin binden könnten, über die unterschiedlichen terminalen Domänen reguliert werden (SOLANAS et al. 2004).
2.2.2.5 Apoptose / Tumorentwicklung
In Tumorzellen ist häufig die Menge an Plakoglobin verringert (ABERLE et al. 1995;
NAVARRO et al. 1993; SOMMERS et al. 1994). Eine Wiederherstellung der Plakoglobinexpression in hochgradig kanzerogenen Zellen konnte die Tumorgenese verringern (BEN-ZE’EV 1997; SIMCHA et al. 1996). Andererseits kann Plakoglobin auch die Apoptose inhibieren. Es wurden drei verschiedene Plakoglobinmutationen in chemisch induzierten murinen Blasentumoren beschrieben (SHIINA et al. 2001).
Weiter konnte in einem Fall eine Plakoglobinmutation in einem Magentumor erkannt werden (CACA et al. 1999) und es wurde eine transformierende Aktivität von Plakoglobin beobachtet, indem es die Effizienz von einer MYC-Induktion erhöhte (KOLLIGS et al. 2000). Eine erhöhte Plakoglobinexpression verursachte zudem eine erhöhte Expression des anti-apoptotischen Proteins BCL-2 in SCC9-Zellen und führte somit zu unkontrolliertem Wachstum (HAKIMELAHI et al. 2000).
Während des apoptotischen Zelltodes werden die Desmosomen mit Hilfe von Caspasen und Metalloproteinasen proteolisiert (WEISKE et al. 2001), wobei
Plakoglobin von Caspase-3 gespalten wird (BRANCOLINI et al. 1998; SCHMEISER et al. 1998).
Die folgende Tabelle führt zusammenfassend alle bisher identifizierten Proteinpartner von Plakoglobin auf:
Tabelle 2.2: Proteinpartner von Plakoglobin (nach ZHURINSKY et al. 2000b) ND = noch nicht ermittelt
Proteinpartner Bindungsstelle an Plakoglobin
Funktion
der Verbindung Quelle Klassische
Cadherine Arm repeats Adhäsion KEMLER 1993 Desmocollin Arm repeats Adhäsion TROYANOVSKY et al.
1994b
Desmoglein Arm repeats Adhäsion TROYANOVSKY et al.
1994a
Desmoplakin Arm repeats Adhäsion KOWALCZYK et al. 1997 Keratin 5 ND Adhäsion SMITH und FUCHS 1998 Protein-tyrosine
phosphatase LAR ND Adhäsion MULLER et al. 1999a α -Catenin
N Terminus und der erste arm
repeat
Adhäsion ABERLE et al. 1996 APC Arm repeats Degradation RUBINFELD et al. 1993;
SHIBATA et al., 1994 Axin/conductin Arm repeats Degradation
BEHRENS et al. 1998;
IKEDA et al. 1998;
KODAMA et al. 1999 β -TrCP N terminus Degradation
HART et al. 1999;
SADOT et al. 2000;
WINSTON et al. 1999 Caveolin-1 ND Membran
Lokalisation (?) GALBIATI et al. 2000 LEF-1 Arm repeats Transaktivierung BEHRENS et al. 1996;
HUBER et al. 1996 TBP C Terminus Transaktivierung HECHT et al. 1999 TCF-4 (an den
Aminosäuren 51-80)
Arm repeats Transaktivierung MIRAVET et al. 2002