Quantitativer Nachweis von freier Gesamt- und leukämiespezifischer Plasma DNA bei Kindern mit Akuter Lymphoblastischer Leukämie

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Abteilung IV Kinderheilkunde

- Pädiatrische Hämatologie und Onkologie - Direktor: Prof. Dr. med. Karl Welte Medizinische Hochschule Hannover

Quantitativer Nachweis von freier Gesamt-

und leukämiespezifischer Plasma DNA bei Kindern mit Akuter Lymphoblastischer Leukämie

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Arne Kristian Schwarz

aus Hamburg

Hannover 2006

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Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule am 19.01.2007

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer: Prof. Dr. Karl Welte

Referent: Prof. Dr. Matthias Eder

Korreferent: Privatdozent Dr. Ulrich Lehmann

Tag der mündlichen Prüfung: 19.01.2007

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Michael Manns Prof. Dr. Arnold Ganser

Frau Prof.´in Dr. Marion Haubitz

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Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

1. Einleitung

1.1 Freie DNA in Plasma und Serum ...

1.2 Akute Lymphatische Leukämie (ALL)

1.2.1 Definition, Ätiologie und Epidemiologie ...

1.2.2 Klinik ...

1.2.3 Klassifikation der ALL ...

1.2.4 ALL-BFM Studie ...

1.3 Klonales Rearrangement der Immunglobulin und T-Zell-Rezeptor Gene ...

1.4 Minimale Resterkrankung (minimal residual disease, MRD) ...

1.5 Fragestellung ...

2. Material und Methoden

Übersichtsgraphik: Verarbeitung des peripheren Blutes (EDTA-PB) ...

Übersichtsgraphik: Prozessieren der DNA ...

Arbeitstechniken ...

2.1 Aufbereitung des peripheren Blutes (PB)/des Knochenmarkes (KM) 2.1.1 Auftrennung des peripheren Blutes bzw. des Knochenmarkes

in Plasma und zelluläre Bestandteile ...

2.1.2 Isolierung der Lymphozyten mittels Ficoll-Paque Plus

(Amersham Biosciences) ...

2.1.3 DNA-Aufarbeitung aus Lymphozyten bzw. KM-Zellen

mittels QIAamp Blood Midi Kit (Qiagen) ...

2.1.4 Isolierung der Plasma DNA mittels QIAamp UltraSens

Virus Kit (Qiagen) ...

1

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2.2 PCR

2.2.1 Allgemeine Einführung ...

2.2.2 Nested PCR und ASO-PCR...

2.2.3 Real-time quantitative PCR (LightCycler System) ...….

2.3 Weiterverarbeitung der DNA

2.3.1 -Actin real-time quantitative PCR zur Testung der Amplifizierbarkeit sowie der Quantifizierung der freien Plasma DNA ...

2.3.1.1. Reaktionsansatz ...

2.3.1.2. Reaktionsprotokoll ...

2.3.2 Real-time quantitative PCR zur Testung der patientenspezifischen

Marker an Tag 0 Material (KM) ...

2.3.2.1. Reaktionsansatz ...

2.3.2.2. Reaktionsprotokoll ...

2.3.3. Nested PCR zur Detektion von MRD in Leukozyten DNA aus PB

2.3.3.1 „First round PCR“ ...…..

2.3.3.1.1 Reaktionsansatz ...

2.3.3.1.2 Reaktionsprotokoll ...

2.3.3.2 Agarose-Gel ...

2.3.3.3 „Second round“ real-time quantitative PCR ...……

2.3.3.3.1 Reaktionsansatz ...

2.3.3.3.2 Reaktionsprotokoll ...

2.3.4. Real-time quantitative PCR zur Detektion von MRD in Plasma DNA ...

2.3.4.1 Reaktionsansatz ...

2.3.4.2 Reaktionsprotokoll ...

2.3.5 Messung der DNA-Konzentration mittels Photometer ...

2.4. Verwendetes Material und Geräte ...

19 20 22

23 24 25

25 27 27

27 28 28 28 29 30 30 30 32 32 32 33

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3. Ergebnisse

3.1 Studiendesign und Patientenkollektiv ...

3.2 Quantifizierung der freien Plasma DNA ...

3.3 Verlauf der DNA-Konzentration im Plasma von Kindern mit ALL unter Therapie 3.3.1 Verlauf der DNA-Konzentration ...

3.3.2 Verlauf von DNA-Konzentration und Leukozytenzahl ...

3.4 MRD Messung in Plasma und Leukozyten von Kindern mit ALL

3.4.1 Verlauf von MRD in freier Plasma DNA ...

3.4.2 Verlauf von MRD in freier Plasma DNA und Leukozyten DNA ...

4. Diskussion

4.1 Diskussion der Methodik ...

4.2 Diskussion der Ergebnisse

4.2.1 Nachweis von freier DNA im Plasma ...

4.2.2 Verlauf der DNA-Konzentration im Plasma bei ALL unter Therapie ...

4.2.3 MRD Messung in Plasma und Leukozyten von Kindern mit ALL ...

5. Zusammenfassung ...

Literaturverzeichnis ...

Anhang ...

37 38

41 43

46 48

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51 52 57

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Abkürzungsverzeichnis

Abb.

ABL ALL AML ASO BFM bc BCR bp CD DEXA DNA dsDNA dNTP EDTA FAB H HR(G) Ig Kde KM KMP KMT LC MDS min.

ml MR MRD mRNA MTX ng NHL PB PBS PCR pg rpm RQ-PCR sec.

SR(G) SZT Taq TBE TE TZR µg µl

Abbildung

Abelson (Onkogen)

Akute Lymphoblastische Leukämie Akute Myeloische Leukämie allel-spezifische Oligonukleotide Berlin–Frankfurt-Münster

Buffy coat (DNA aus Leukozyten von Gesundspendern) Breakpoint cluster region

Basenpaare

Cluster of Differentiation Dexamethason

Desoxyribonukleinsäure (acid)

doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonukleosid-5´-triphosphat

Ethylendiamintetraessigsäure (ethylene diamine tetraacetic acid) French-American-British Cooperative Group

Stunde(n)

Hochrisiko(gruppe) Immunglobulin

immunoglobulin kappa deleting element Knochenmark

Knochenmarkpunktion Knochenmarktransplantation Light Cycler

Myelodysplastisches Syndrom Minute

Milliliter mittleres Risiko

Minimal residual disease (minimale Resterkrankung) Boten (messenger) Ribonukleinsäure

Methotrexat Nanogramm

Non-Hodgkin-Lymphom peripheres Blut

Phosphatpuffer (phosphate buffered saline)

Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction) Pikogramm

Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) real-time quantitative PCR

Sekunde

Standardrisiko(gruppe) Stammzelltransplantation Thermus aquaticus

Tris-Borat-EDTA (Puffer) Tris-EDTA (Puffer) T-Zell Rezeptor Mikrogramm Mikroliter

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Abbildungen Seite

Tabellen Abb. 1 Abb. 2

Abb. 3 Abb. 4

Abb. 5 Abb. 6 Abb. 7 Abb. 8 Abb. 9

Abb. 10

Abb. 11 Abb. 12 Abb. 13

Abb. 14

Abb. 15

Abb. 16

Abb. 17

Abb. 18

Abb. 19 Abb. 20 Abb. 21 Abb. 22 Abb. 23

Protokoll der multizentrischen Therapiestudie ALL-BFM 2000

Schematische Darstellung von Immunglobulinen und T-Zell-Rezeptoren an der Oberflächenmembran von B- bzw. T-Lymphozyten

Genetische Meilensteine der IgH-Ketten Synthese

Nachweis von Leukämiezellen in PB und KM bei Patienten mit ALL während und nach Chemotherapie und während Rezidiventwicklung

Übersichtsgraphik: Verarbeitung des peripheren Blutes (EDTA-PB) Übersichtsgraphik: Prozessieren der DNA

Schematische Darstellung des Funktionsprinzips der PCR Schematische Darstellung des Funktionsprinzips der ASO-PCR A: Amplifikationsprofil der β-Actin RQ-PCR

B: Schmelzkurvenanalyse der β-Actin RQ-PCR

A: Amplifikationsprofil einer RQ-PCR zur Definition eines geeigneten Markers B: Schmelzkurvenanalyse zu Abb. 10 A

Darstellung der PCR-Produkte der „first round“ PCR Amplifikationsprofil der „second round“ RQ-PCR

A: Amplifikationsprofil einer RQ-PCR zur Detektion von MRD in Plasma DNA B: Schmelzkurvenanalyse zu Abb. 13 A

Darstellung der medianen DNA-Konzentrationen freier Plasma DNA aller untersuchten Patienten

Logarithmische Darstellung des Verlaufs der DNA-Konzentration im Plasma von Kindern mit ALL unter Therapie

Verlauf der medianen DNA-Konzentration im Plasma von Kindern mit ALL unter Therapie

Logarithmische Darstellung des Verlaufs der Leukozytenzahl von Kindern mit ALL unter Therapie

Verlauf von Plasma DNA-Konzentration und Leukozytenzahl von Kindern mit ALL unter Therapie

Korrelation zwischen Plasma DNA und Leukozytenzahl MRD-Messung anhand von freier Plasma DNA

Zusammenfassung der im Plasma gemessenen MRD-Last im Verlauf MRD-Messung anhand von freier Plasma DNA und Leukozyten DNA A: Vergleich von MRD im Plasma vs. MRD in KM

B: Vergleich von MRD im Plasma vs. MRD in Leukozyten

Tab. 1 Tab. 2

Tab. 3

Tab. 4

Verwendete Primer

Konzentration freier Plasma DNA und Leukozytenzahl von 21 an ALL erkrankten Kindern

Konzentration freier Plasma DNA und Leukozytenzahl von 13 onkologisch erkrankten Kindern

Konzentration freier Plasma DNA von 12 Kindern einer pädiatrischen Kontrollgruppe

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1. Einleitung

1.1 Freie DNA in Plasma und Serum

Die erfolgreiche Therapie der meisten malignen Erkrankungen hängt maßgeblich von ihrer frühzeitigen Diagnose ab. Neben den invasiven Verfahren wie zum Beispiel der Entnahme von Biopsien oder der Endoskopie, die v.a. in der Pädiatrie mit Kurznarkosen verbunden sind, wird dabei auch immer wieder nach weniger belastenden Tests Ausschau gehalten, die im günstigsten Fall zusätzlich Aussagen über die Tumorlast, die Prognose und das Ansprechen auf die Therapie zulassen.

Bereits 1948 konnten Mandel und Métais Nukleinsäuren durch Ausfällung mit Perchlorsäure im Blutplasma von Gesunden und Patienten mit verschiedenen Krankheiten nachweisen ¹. Diese Entdeckung geriet weitgehend in Vergessenheit bis 18 Jahre später DNA im Serum von Patienten mit Systemischen Lupus Erythematosus (SLE) gefunden wurde ². Es folgten weitere Arbeiten, die u.a. DNA im Serum und Plasma von Patienten mit rheumatoider Arthritis, Glomerulonephritis, Pankreatitis, Cholelithiasis, chronisch entzündlichen Darm- erkrankungen, peptischem Ulkus, Hepatitis, Ösophagitis sowie von Gesunden nach- wiesen ^3,4. Leon et al. konnten 1977 mit Hilfe eines von ihnen etablierten Radioimmunoassays

5 zeigen, dass die DNA-Konzentration im Serum von Krebspatienten deutlich höher ist als bei Gesunden ⁶. Diese Ergebnisse wurden durch Carpentier (1981) und Shapiro (1983) bestätigt ^7,

8. Allerdings wurden in diesen Studien nur indirekte Techniken (radio-immunologischer bzw.

Actinomycin D Test) angewandt. Die DNA im Plasma/Serum liegt hauptsächlich in Form eines Nukleoproteinkomplexes vor, so dass sich für die o.g. Verfahren zwei Probleme ergaben: 1. konnte die DNA den anti-DNA Antikörpern bzw. dem Actinomycin D entgehen.

2. konnte die DNA durch die fehlende Aufreinigung nicht weiter charakterisiert werden. Da die DNA Level zwischen Krebspatienten und den Kontrollgruppen überlappten, bestand die Notwendigkeit zu qualitativen Testverfahren ⁹. Indem sie eine zuvor etablierte Technik zur Gewinnung von DNA aus von Lymphozyten abgegebenen Nukleoproteinkomplexen ¹⁰ modifizierten, konnten Stroun et al. 1987 erstmalig DNA aus Plasma von Krebspatienten isolieren, aufreinigen und charakterisieren ¹¹. So zeigten sie in einer späteren Arbeit, dass die Plasma DNA von Krebspatienten - genau wie die DNA der Tumorzellen - eine geringere Strangstabilität aufweist ¹².

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Durch die Einführung von PCR-basierten Techniken in den späten 1980ern wurden schließlich der Nachweis und die Quantifizierung kleinster DNA-Mengen und die Identifikation zahlreicher Gensegmente, die eventuell als nützliche Tumormarker eingesetzt werden können, ermöglicht ¹³. Die ersten Mutationsanalysen, die mittels PCR-Technik durchgeführt wurden, konzentrierten sich auf die K-ras und N-ras Onkogene und wiesen im Jahre 1994 Mutationen dieser Gene bei Patienten mit Kolorektalem Karzinom, MDS und AML nach ¹⁴. Mittlerweile konnten noch eine ganze Reihe weiterer tumorspezifischer Veränderungen in Plasma DNA detektiert werden:

Mikrosatellitenveränderungen (einfache DNA-Wiederholungssequenzen, die in Tumorzellen Veränderungen durchlaufen wie z. B. den Verlust der Heterozygotie [loss of heterozygocity, LOH]) bei Patienten mit kleinzelligem ¹⁵ und nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom ¹⁶, Malignomen im Bereich des Kopfes und Halses ¹⁷, klarzelligem Nierenkarzinom ¹⁸, Blasenkarzinom ¹⁹, Brustkrebs ²⁰, Kolorektalem Karzinom ²¹, Ovarialkarzinom ²² und Melanom ²³.

Aberrierende Hypermethylierung des Promoters, die zur Inaktivierung des Gens führt, bei Patienten mit nichtkleinzelligem Bronchialkarzinom ²⁴, Malignomen der Leber ²⁵, Brustkrebs ²⁶ und Malignomen im Bereich des Kopfes und Halses ²⁷.

Tumorspezifische virale (EBV-)DNA bei Patienten mit Nasopharyngealem Karzinom

28.

Mutationen mitochondrialer DNA ²⁹.

Rearrangierte DNA der schweren Ketten von Ig ³⁰.

In der zuletzt aufgeführten Studie von Frickhofen et al., die den Anstoß zu dieser Doktorarbeit gab, wurde das Serum oder Plasma von 110 Patienten mit B-Zell Neoplasien (B-NHL und B- Vorläufer-ALL) und 37 Kontrollpersonen mittels PCR-Technik untersucht. Wurden die Patienten vor Therapiebeginn untersucht, so wiesen 86% von ihnen klonspezifische DNA im Serum oder Plasma auf. Im Follow-up zeigte sich eine enge Korrelation zwischen der Persistenz tumorspezifischer DNA in Plasma/Serum und Therapieresistenz oder frühem Rezidiv.

Neben dem molekularen Nachweis von freier Plasma DNA im peripheren Blut gelang auch die Detektion zellfreier, tumorspezifischer DNA aus anderem Probenmaterial, so zum Beispiel im Sputum von Patienten mit Bronchialkarzinom ^31,32, im Stuhl von Patienten mit Kolorektalem Karzinom ³³, im Pankreassaft von Patienten mit Pankreaskarzinom ³⁴ und im Urin von Patienten mit Blasenkarzinom ^{33, 35, 36}.

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Über die Herkunft der freien Plasma DNA gibt es verschiedene Hypothesen, die in Kapitel 4 (Diskussion) näher beleuchtet werden.

1.2 Akute Lymphoblastische Leukämie (ALL)

1.2.1 Definition, Ätiologie und Epidemiologie

Die Akute Lymphoblastische Leukämie (ALL) wird als die autonome Proliferation unreifer lymphatischer Zellen (Blasten) definiert. Diese verdrängen die normale Hämatopoese im Knochenmark und führen so zu Anämie, Thrombozytopenie und Granulozytopenie, dreier typischer Symptome der Erkrankung.

Die Ätiologie der ALL ist bislang weitgehend unbekannt.

Diskutiert werden:

1. Keimbahnmutationen: So wurde für Leukämien eine familiäre Häufung ³⁷ und eine erhöhte Konkordanz bei eineiigen Zwillingen im Vergleich zu normalen Geschwister- kindern ³⁸ nachgewiesen. Ebenfalls bekannt ist seit längerem eine erhöhte Inzidenz der ALL bei Patienten mit numerischen Chromosomenaberrationen (z. B. Trisomie 21) ³⁹. 2. Erworbene Genmutationen: Es konnten einige Umweltfaktoren identifiziert werden,

die zu einer solchen Mutation führen können. Zu ihnen zählen u.a.: radioaktive Strahlung ^{40, 41}, chronische Exposition mit kanzerogenen Chemikalien (Benzene) ^{42, 43} und virale Infektionen z.B. mit dem Epstein-Barr-Virus ⁴⁴.

3. Wirtsspezifische Faktoren: Hierunter fällt die unterschiedliche Expression und Aktivität von Enzymen, die die körpereigenen Zellen vor schädigenden Umwelt- einflüssen schützen. Ein Beispiel dafür ist die Glutathion-S-Transferase ^{45, 46}.

Mit einer Inzidenz von 3,3 Erkrankungen/100.000 Einwohner < 15 Jahre und einem Anteil von ca. 30% ist die ALL die häufigste Krebserkrankung im Kindesalter. Es kann ein Häufigkeitsgipfel zwischen dem zweiten und fünften Lebensjahr beobachtet werden, wobei das Erkrankungsalter im Median bei 4,7 Jahren liegt. Das Verhältnis von Jungen zu Mädchen beträgt bei der ALL 1,2 : 1 ⁴⁷.

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1.2.2 Klinik

Beispiele für die klinische Manifestation sind ^{48, 49}: Anämie (Hb ≤ 8 g/dl): ca. 58 %

Leukozytose (Leukozyten > 10.000/mm³): ca. 50 % Lymphadenopathie: ca. 41 %

signifikante Hepato- und/oder Splenomegalie: ca. 33 % Thrombopenie (Thrombozyten < 20.000/mm³): ca. 22 % ZNS-Befall: ca. 2,5 %.

1.2.3 Klassifikation der ALL

Die Klassifikation der ALL basiert auf:

der Zytologie (Giemsa-Wright gefärbte Blut-, Knochenmark- und Liquorausstriche;

Einteilung nach FAB-Klassifikation: L1, L2 und L3) ⁵⁰.

der Zytochemie (hat nach Einführung der immunologischen Nachweismethoden an Bedeutung verloren; wird heutzutage noch zur Abgrenzung von der AML genutzt) ⁵¹. der Immunphänotypisierung: Leukozyten exprimieren unterschiedliche Oberflächen-

moleküle (Cluster of Differentiation, CD) anhand derer man Aussagen über Differenzierungs-, Reifungs-, und Aktivierungsformen treffen kann. Diese können nach der spezifischen Reaktion mit entsprechend markierten monoklonalen Antikörpern per Fluoreszenzmikroskop oder Durchflusszytometer nachgewiesen werden ^52,53. Ca. 88 % aller lymphoblastischen Leukämien leiten sich aus B- Vorläufer-Zellen (B-Vorläuferzell-ALL: Prä-prä-B-ALL (pro-B-ALL), Common ALL, Prä-B-ALL) oder aus reifen B-Zellen (B-ALL) ab. In etwa 12 % handelt es sich um eine T-ALL (frühe T-ALL (pro- und prä-T), intermediäre (kortikale T-ALL), reife T-ALL) ^{54, 55}.

der Immungenotypisierung: Hierbei kommt zum einen die Zytogenetik und zum anderen die Molekulargenetik zum Einsatz.

Die zytogenetische Untersuchung von Leukämiezellen dient dem Nachweis struktureller und numerischer Chromosomenaberrationen und spielt sowohl für die Prognose als auch für die Therapie eine wichtige Rolle ^56-58. Es konnten molekulargenetisch bereits zahlreiche präzise

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Gen-Rearrangements beschrieben werden, die zu neuen Fusionsgenen mit unterschiedlichen transformierenden Funktionen führen ^{59, 60}.

Als Beispiele für strukturelle Aberrationen seien die Philadelphia-Chromosom-positive ALL (Ph⁺-ALL) mit der Translokation t(9;22) und dem Fusionsgen BCR-ABL und die Translokation t(4;11) mit dem Fusionsgen MLL-AF4 genannt. Beide Translokationen führen derzeit aufgrund ihrer ungünstigen Prognose zur Einordnung in die Hochrisikogruppe (s.

1.1.4) ⁶¹. Als prognostisch günstig erwiesen hat sich die Translokation t(12;21) mit dem Fusionsgen TEL-AML1, die bei etwa 25% der B-Vorläuferzell-ALL vorkommt ^62-64. Bei den numerischen Aberrationen sei die Hyperdiploidie (> 50 Chromosomen; bei ca. 25% der Patienten) mit in der Regel günstiger Prognose angeführt ^{65, 66}.

1.2.4 ALL-BFM-Studie

Die ALL-BFM-Studiengruppe gründet sich auf den Zusammenschluss der drei Universitäts- kliniken Berlin, Frankfurt und Münster in den 70er Jahren, nachdem in Berlin ein erfolgreiches Pilotprojekt für kindliche ALL unter der Leitung von Prof. Riehm durchgeführt worden war ⁶⁷. Seit 1976 besteht ein ständig wachsender Verbund von teilnehmenden Kliniken, in denen die erkrankten Kinder nach einem einheitlichen Studienprotokoll behandelt werden.

Die Verbesserung des Therapieergebnisses der ALL im Kindesalter zählt zu den großen Erfolgsgeschichten der klinischen Onkologie: so konnte innerhalb der letzten 30 Jahre die Langzeitüberlebensrate dieser unbehandelt obligat tödlich verlaufenden Erkrankung von nahezu 0% auf fast 80% gesteigert werden ^{68, 69}. Bis in die 50er und frühen 60er Jahre wurde die ALL mit einer Monotherapie behandelt. Erst später wendete man mehrere Therapeutika an, die anfänglich nacheinander und später dann kombiniert eingesetzt und von einer Supportivtherapie begleitet wurden ⁷⁰. Im Laufe der Studien wurde festgestellt, dass die Patienten unterschiedlich auf die Chemotherapie ansprechen und die Anwendung der intensiven und potentiell lebensbedrohlichen Chemotherapeutika die Gefahr von Akut- und Spätkomplikationen nach sich zieht ^{49, 71-73}. Daraufhin wurde die optimale Anpassung der Therapiezusammensetzung und –intensität an das individuelle Rezidivrisiko ein zentrales Anliegen aller Therapieprotokolle ^74-76. So wurden in der ALL-BFM-Studie 81 erstmals drei Risikogruppen definiert: Standardrisiko (SR), mittleres Risiko (MR) und Hochrisiko (HR) ⁴⁸. Während die Rezidivrisikoabschätzung anfangs anhand von Parametern wie zum Beispiel Alter, initialer Leukozytenzahl und Immunphänotyp durchgeführt wurde ^{77, 78}, ist bei der

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ALL-BFM-Studie 2000 das Ansprechen auf die initiale Therapie für die Einteilung in die Risikogruppen maßgeblich. Hierzu wird an Protokolltag 8 peripheres Blut der Patienten untersucht. Lassen sich ≥ 1.000 Blasten/µl nachweisen, so gelangt der Patient in den HR- Zweig. Des Weiteren wird an Protokolltag 33 (R1) das Knochenmark zytomorphologisch untersucht (bei ≥ 5% Blasten im Knochenmark erfolgt die Stratifizierung in die HR-Gruppe) und die minimale Resterkrankung (minimal residual disease, MRD) im Knochenmark an Protokolltag 33 (R1) und vor Protokoll M (R2) bestimmt. Darüber hinaus werden Patienten mit den Translokationen t(9;22) und t(4;11) unabhängig vom Ansprechen auf die Therapie der HR-Gruppe zugeordnet ⁷⁹.

Das hämato-onkologische Labor der Kinderklinik der Medizinischen Hochschule Hannover war bis 07/05 im Rahmen der Studie primär für die komplette Materialverarbeitung und die referenz-morphologische Befundung der eingesandten Knochenmarksproben verantwortlich (danach Umzug der Studienzentrale nach Kiel). Des Weiteren werden MRD Messungen von HR-Patienten durchgeführt.

Abb. 1: Protokoll der multizentrischen Therapiestudie ALL-BFM 2000 ⁷⁹.

Neben den obligaten Entnahmezeitpunkten von Knochenmark an Tag 0, Protokolltag 33 (= MRD-Zeitpunkt 1, R1) und Protokolltag 1 von Protokoll M bzw. vor dem 1. HR-Block

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(= MRD-Zeitpunkt 2, R2) sollen im Rahmen der von der Ethikkommission genehmigten MRD-Begleitstudie fakultative Knochenmarkspunktionen an Protokolltag 15 und 52, Tag 1 von Protokoll II/III, Woche 52 und 104 durchgeführt werden. Für HR-Patienten werden Punktionen zu folgenden Zeitpunkten empfohlen: vor jedem HR-Block, vor jedem Protokoll III und vor Protokoll II, vor der Knochenmarkstransplantation (KMT), Tag 30, 60 und 100 nach KMT sowie 6 Monate und 1 Jahr nach KMT (s. Abb. 1). Durch diese zusätzlichen Untersuchungen soll geprüft werden, ob eine weitere Optimierung der Risikostratifizierungen möglich ist ⁷⁹.

Die Therapie der ALL lässt sich - nach einer 7-tägigen Vorphase mit Glukokortikoiden - in drei Phasen einteilen (s. Abb. 1):

1. Induktionstherapie (Protokoll I) 2. Konsolidierungstherapie (Protokoll M) 3. Reinduktionstherapie (Protokoll II/III)

Ziel der ersten Phase ist die Verringerung der Blastenzahl und das Verhindern der Nachproduktion von Blasten. Dieses Ziel wird bei ca. 95 – 98% der Patienten erreicht; man spricht von Remission 68, 80, 81 . Um einen erneuten Ausbruch der Krankheit durch nicht nachweisbare Tumorzellen zu verhindern, schließen sich zwei intensive Chemotherapieblöcke an. Abschließend erhalten die Patienten eine medikamentöse Dauertherapie, so dass sich die Therapie insgesamt auf etwa zwei Jahre beläuft.

1.3 Klonales Rearrangement der Immunglobulin und T-Zell-Rezeptor Gene

Reife Lymphozyten bilden das Antigen-spezifische Immunsystem: B-Lymphozyten, die als ausdifferenzierte Plasmazellen Immunglobuline (Ig) ins Blut sezernieren (humorale Abwehr) und T-Lymphozyten, die membranständige Rezeptoren (T-Zell-Rezeptoren, TZR) exprimieren und die zelluläre Abwehr vermitteln.

Die Abbildung 2 zeigt schematisch den Aufbau von Immunglobulinen (Ig) und T-Zell- Rezeptoren (TZR): Ig setzen sich ebenso wie TZR aus zwei verschiedenen Kettentypen zusammen. Bei den Ig werden schwere (heavy, H) Ketten mit leichten (light, L) Ketten des κ oder λ Typs kombiniert, während TZR entweder aus α- und β-Ketten oder aus γ- und δ- Ketten bestehen. Die einzelnen Proteinketten werden durch Disulfidbrücken verbunden. Der für die Effektorfunktion verantwortliche konstante (C) Abschnitt wird aminoterminal durch

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den variablen (V) Bereich ergänzt. Dieser dient der Erkennung und macht die Spezifität der jeweiligen Ig- oder TZR-Kette aus ⁸².

Abb. 2: Schematische Darstellung von Immunglobulinen und T-Zell-Rezeptoren an der Oberflächen- membran von B- bzw. T-Lymphozyten (Abb. übernommen von van Dongen et al. ⁸³).

Hierbei wird nicht jedes Ig bzw. jeder TZR von einem gesonderten Gen kodiert. Die variablen Kettenanteile werden durch zahlreiche Gensegmente kodiert, die auf 4 Chromosomen verteilt sind. Erst die Verknüpfung durch DNA-Rekombination führt zu funktionstüchtigen Einheiten.

Für dieses sogenannte somatische Rearrangement stehen drei Typen von DNA-Segmenten zur Verfügung:

V-Elemente (variablity): kodieren die aminoterminalen Abschnitte, J-Elemente (joining): als Bindeglieder zu den konstanten (C) Bereichen, D-Elemente (diversity): erhöhen die Vielfalt der variablen (V) Region.

Die Zahl der V-, D- und J-Segmente sowie ihre Anordnung innerhalb eines Genlocus variieren erheblich zwischen den einzelnen Ig- und TZR-Ketten.

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Abb. 3: Genetische Meilensteine der Ig H-Ketten Synthese. Im Schema sind nur wenige der zahlreichen V-, D- bzw. J-Segmente wiedergegeben. Die konstante Region (C) ist vereinfachend durch ein Segment repräsentiert (Abb. übernommen von Kulozik et al. ⁸⁴).

Zunächst kommt es, durch eine sogenannte V (D) J Rekombinase gesteuert und durch die beiden Proteine RAG1 (Rekombination aktivierendes Gen) und RAG2 eingeleitet, zu Rearrangements auf DNA-Ebene. Dieses rearrangierte Ig H-Allel wird anschließend in RNA transkribiert, durch Spleißvorgänge zu einer reifen mRNA weiterverarbeitet und nachfolgend in ein Protein translatiert (s. Abb. 3).

Zusammenfassend liegen der Vielfalt der Ig und TZR Moleküle folgende Ursachen zugrunde ⁸²:

Kombination verschiedener Kettentypen (Ig H/L, TCR α/β, TCR γ/δ) Keimbahnrepertoire von V-, D- und J-Elementen

Rekombinationen zwischen V-, D- und J-Elementen

Variabilität der exakten Rekombinationsstelle zweier Elemente Verlust von Nukleotiden der Rekombinationsregion

Insertion von Nukleotiden (N/P-Elemente) während der Rekombination Somatische Mutationen in rekombinierten Genen.

Die Rearrangements der Ig und TZR Gene führen zu junktionalen Regionen, die als klonspezifischer genetischer „Fingerabdruck“ angesehen werden können ⁸⁵. Dies bildet die

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Basis für die sogenannte Immunogenotypisierung und die Verfahren zum Nachweis einer minimalen Resterkrankung (MRD, s. 1.4).

1.4 Minimale Resterkrankung (minimal residual disease, MRD)

Obwohl sich nach klinischen und morphologischen Kriterien bei 95-98% der Kinder eine komplette Remission erreichen lässt 68, 80, 81

, kommt es bei 25-30% der Patienten durch resistente und nicht von der Therapie erfasste Leukämiezellen zu einem Rezidiv ⁸⁶. Es wäre demnach wünschenswert, die erneute Proliferation der Blasten noch vor der klinischen Manifestation zu detektieren, um die Patienten einem effizienteren Therapieprotokoll zuführen zu können.

Auf der anderen Seite muss davon ausgegangen werden, dass ein Teil der Patienten eine Übertherapie erhält, die im Hinblick auf akute und langfristige Nebenwirkungen sowie dem Auftreten von Zweitmalignomen (s. 1.2.4) nicht gewünscht ist. Es ist also sehr wichtig, das Ansprechen eines Patienten auf die Therapie sehr sensitiv zu überwachen und Anpassungen an die individuellen Bedürfnisse vorzunehmen.

Abb. 4: Nachweis von Leukämiezellen in PB und KM bei Patienten mit ALL während und nach Chemotherapie und während Rezidiventwicklung. Die Nachweisgrenzen der morphologischen sowie der durchflusszytometrischen Immunphänotypisierung und PCR-basierten Techniken sind aufgeführt. I:

Induktionstherapie, C: Konsolidierungstherapie, II: Reinduktionstherapie. (entnommen und modifiziert aus Szczepanski et al. ⁸⁷).

Follow-up in Jahren I C II Erhaltungstherapie

Häufigkeit leukämischer Zellen

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Wie aus Abb. 4 ersichtlich ist, erkennen klassische Nachweisverfahren wie die Zyto- morphologie nur 1-5 Leukämiezellen unter 100 Normalzellen. So wurden in den letzten Jahren zahlreiche Methoden zum Nachweis von MRD entwickelt und im Rahmen von Studien evaluiert. Zu diesen Verfahren zählen u.a. die Zytogenetik, Zellkultursysteme, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), Southern Blotting, Immunphänotypisierung sowie PCR-basierte Techniken. Die meisten dieser Techniken haben sich aufgrund verschiedener Ursachen für die klinische MRD-Messung als nicht praktikabel erwiesen, da es ihnen an Sensitivität, Spezifität oder praktischer Durchführbarkeit mangelt. Heutzutage basiert die MRD-Messung auf drei grundlegenden Techniken ^87-89:

1. Durchflusszytometrie (Messung tumor-assoziierter anomaler Immunphänotypen) 2. PCR mit tumorspezifischen DNA targets (Detektion von Ig/TZR Gen-

Rearrangements)

3. Reverse Transkriptase (RT-)PCR mit tumorspezifischen RNA targets (Detektion von Fusionsgenen).

Die Sensitivität aller drei Methoden ist ähnlich (10^-3 bis 10^-5), tendenziell aber für den klonspezifischen MRD-Nachweis aus DNA von Leukämiezellen am höchsten. Diese Methode ist auch am wenigsten anfällig gegenüber eingeschränkter Qualität des Untersuchungs- materials ⁹⁰.

Eine Initiative innerhalb der internationalen BFM-Studiengruppe zeigte nach der Evaluation der von 1990 bis 1995 durchgeführten Studien, dass sich klonspezifische Rearragements der TZR- bzw. Ig-Gene mit einer Sensitivität von 10^-4 bis 10^-5 (teilweise sogar bis 10^-6) nachweisen lassen. So ließ sich nicht nur minimale Resterkrankung per se demonstrieren, sondern nach semi-quantitativer Abstufung sogar ein unterschiedliches Rezidivrisiko erkennen. Eine differenzierte Beschreibung des Rezidivrisikos eines Patienten kann am besten durch die Bestimmung der minimalen Resterkrankung zu den beiden Zeitpunkten Tag 33 von Protokoll I (R1) und vor Protokoll M (R2) erfolgen ⁸⁶.

Durch fortlaufende und sekundäre Rearrangements auf der Ebene der Ig und TZR Gene kann es zu einer Veränderung der junktionalen Regionen kommen ^91-94. Aus diesem Grund ist es wichtig, Patienten mit mindestens zwei verschiedenen Ig/TZR Rearrangements zu überwachen, um falsch negative Ergebnisse im Rahmen des follow-up zu verhindern ^{93, 95}. Diese Vorgabe wird bei ca. 80% der Patienten erfüllt.

So konnte gezeigt werden, dass MRD ein prognostischer Faktor ist, der unabhängig von Alter, Geschlecht, Immunphänotyp, Leukozytenzahl und Behandlungsgruppe messbar ist ⁸⁶.

(19)

1.5 Fragestellung

Es liegen bisher keine Studien zur Quantifizierung von freier Plasma DNA bei Kindern vor.

Des weiteren ist unbekannt, ob sich anhand von freier Plasma DNA MRD bestimmen und MRD-Kinetiken nachweisen lassen.

Somit werden in der vorliegenden Studie folgende Fragen bearbeitet:

1. Lässt sich freie Plasma DNA bei onkologisch erkrankten Kindern und bei einer pädiatrischen Kontrollgruppe messen ?

2. Wie stellt sich bei Kindern mit ALL der Verlauf der Gesamtkonzentration an freier Plasma DNA in sequentiellen Messungen unter Therapie dar ?

3. Stellt die sequentielle Messung von MRD-Kinetiken in freier Plasma DNA eine Möglichkeit zur Beschreibung des Verlaufs der Tumorzellreduktion dar ?

(20)

2. Material und Methoden

Abb. 5: Übersichtsgraphik: Verarbeitung des peripheren Blutes (EDTA-PB)

= Kapitelnummern 1. Zentrifugation

Überstand Pellet

EDTA-PB

2. Zentrifugation

Plasma

QIAGEN UltraSens Virus Kit

Zellen

Freie Plasma DNA

Ficoll und QIAGEN Blood Midi

Kit

Leukozyten DNA

2.1.2 2.1.3 2.1.1

2.1.4

(21)

Abb. 6: Übersichtsgraphik: Prozessieren der DNA:

MRD Plasma MRD Leukozyten

= Kapitelnummern Standardverdünnungsreihe

(KM, Tag 0);

150 pg/µl – 150 fg/µl

β-Actin LC zurKontrolle

Testen der Marker an der Verdünnungsreihe mittels nested PCR (LC)

Definition eines Markers

Bestimmung der Konzen- tration anfreier Plasma DNA (Verlaufsproben) mittels β-Actin LC

Einsetzen der Plasma DNA (Verlaufsproben) in die Standardverdünnungsreihe

Standardverdünnungsreihe (KM, Tag 0);

50 ng/µl– 5 pg/µl (V1 – V5)

Messen der Leukozyten DNA-Konzentration (Verlaufsproben)mittels Photometer und Einstellen auf 50 ng/µl

PCR (Verlaufsproben) mit anschließendem Gel

Verdünnen des PCR- Produktes (1:100)

Nested PCR (LC)

2.3.1 .

2.3.1 . 2.3.2

.

2.3.3.1 .

2.3.3.2 . 2.3.4

.

2.3.5 .

(22)

Arbeitstechniken:

Aufgrund der großen Anzahl von amplifizierten Reaktionsprodukten ist bei einer PCR das Risiko einer Kontamination besonders hoch. Folgende Vorsichtsmaßnahmen wurden getroffen, um dieses Risiko so gering wie möglich zu halten:

Räumlich getrennte DNA-Aufbereitung und Herstellung des PCR-Ansatzes

Strikte Trennung von PCR-Produkten, PCR-Reagenzien (Primer, Nukleotide, Puffer etc.) sowie DNA-Proben

Durchführung einer Negativkontolle (aqua dest.) zum Ausschluss einer Kontamination Verwendung von autoklavierten Pipettenspitzen mit eingebauten Filtern

Tragen und häufiges Wechseln von puderfreien Latexhandschuhen

2.1 Aufbereitung des peripheren Blutes bzw. des Knochenmarkes

2.1.1 Auftrennung des peripheren Blutes (PB) bzw. des Knochenmarkes (KM) in Plasma und zelluläre Bestandteile

EDTA-PB bzw. Heparin-KM aus dem Entnahmeröhrchen in 15 ml Röhrchen überführen

Zentrifugieren bei 3000 x g für 10 Minuten

vorsichtiges Pipettieren des Überstandes in ein neues 15 ml Röhrchen Zentrifugieren bei 3000 x g für 10 Minuten

vorsichtiges Überführen des Überstandes in 1,6 ml Reaktionsgefäße weitere Aufarbeitung des Pellets mittels Ficoll-Paque Plus (s. 2.1.2.) Lagerung des Plasmas bei – 20° C sofern keine direkte Weiterverarbeitung erfolgt.

2.1.2 Isolierung der Lymphozyten mittels Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences) (unter Verwendung der mitgelieferten Pufferlösungen)

Bei diesem Protokoll werden alle Pipettierschritte unter der Hood durchgeführt.

Schritt 1: Überschichten

Gabe von 15 ml Ficoll^TM in ein 50 ml Röhrchen

(23)

Überführen des Pellets (s. 2.1.1) in ein neues 50 ml Röhrchen und Auswaschen des 15 ml Röhrchens aus 2.2.1 mit PBS-Puffer (ph 7,2) bis zu einem Gesamtvolumen von 35 ml.

Überschichten des Ficoll^TM mit dem Blut/KM-PBS-Gemisch (Gesamtvo-

lumen: 50 ml) Zentrifugieren bei 1000 x g für 20 Minuten

Schritt 2: Waschen

Abnehmen und Verwerfen von etwa 10 ml Überstand

Aufsaugen des sichtbaren „Zellringes“ (mononukleäre Zellen) mit einer 10 ml Pipette und Überführen in ein 15 ml Röhrchen

Zentrifugieren bei 450 x g für 10 Minuten vorsichtiges Abgießen des Überstandes

Aufnehmen des Pellets in 10 ml PBS-Puffer mit anschließendem mindestens dreimaligen Auf- und Abpipettieren zur Durchmischung Zentrifugieren bei 450 x g für 5 Minuten

Schritt 3: Lysieren

Aufnehmen des Pellets in 2 ml PBS-Puffer und 2,4 ml AL-Puffer (aus QIAamp^®Blood Midi Kit)

Vortexen

Einfrieren des 15 ml Röhrchens bei – 20° C bzw. sofortige Weiter- verarbeitung (über QIAamp^®Blood Midi Kit, s. 2.1.3)

2.1.3 DNA-Aufarbeitung aus Lymphozyten bzw. KM-Zellen mittels QIAamp^®Blood Midi Kit (Qiagen) - unter Verwendung der mitgelieferten Pufferlösungen

Auftauen des Lysats (aus 2.1.2) Zugeben von 200 µl Proteinase

Inkubieren im Wasserbad bei 68 – 70° C für mindestens 60 Minuten mit zwischenzeitlichem Schwenken der Proben

Zugeben von 2 ml Ethanol absolut ausgiebiges Vortexen

Überführen der Hälfte des Lysats auf die Säule Zentrifugieren bei 1850 x g für 3 Minuten

(24)

Verwerfen des Eluats und Überführen der anderen Hälfte des Lysats auf die Säule

erneutes Zentrifugieren bei 1850 x g für 3 Minuten

Verwerfen des Eluats und anschließende Gabe von 2 ml AW1-Puffer auf die Säule

Zentrifugieren bei 4500 x g für 1 Minute Gabe von 2 ml AW2-Puffer auf die Säule Zentrifugieren bei 4500 x g für 15 Minuten

vorsichtiges Überführen der Säule in ein neues Röhrchen

Zugeben von AE-Puffer auf die Säule nach dem folgenden Schema:

≤ 3 x 10⁶mononukleäre Zellen: 100 µl

≤ 6 x 10⁶mononukleäre Zellen: 200 µl

> 6 x 10⁶mononukleäre Zellen: 300 µl Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten Zentrifugieren bei 4500 x g für 5 Minuten Gabe des Eluats auf die selbe Säule

Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten Zentrifugieren bei 4500 x g für 5 Minuten

Überführen des Eluats in 1,6 ml Reaktionsgefäße und Lagerung bei – 20° C.

2.1.4 Isolierung der Plasma DNA mittels QIAamp^®UltraSens Virus Kit (Qiagen) - unter Verwendung der mitgelieferten Pufferlösungen

Auftauen und anschließendes Vortexen der Probe Zentrifugieren bei 3000 x g für 10 Minuten

Überführen von 1 ml Plasma in ein 2 ml Reaktionsgefäß

Lyse und Präzipitation

Zugeben von 800 µl ml AC-Puffer

Zugeben von 5,6 µl carrier RNA-Lösung (gelagert bei – 20° C) in den Deckel des Reaktionsgefäßes

dreimaliges Schwenken des Reaktionsgefäßes Vortexen für 10 Sekunden

Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten

(25)

Zentrifugieren bei 1200 x g für 3 Minuten Verwerfen des Überstandes

Pellet im Reaktionsgefäß belassen und durch Vortexen lösen

Resuspendierung und Proteinase-K-Verdau

Zugeben von 300 µl AR-Puffer (auf 60° C erwärmt)

Zugeben von 20 µl Proteinase K (gelagert bei 4° C; auf 60° C erwärmt) ausgiebiges Vortexen (Pellet muss vollständig resuspendiert sein)

Inkubieren im Wasserbad bei 40° C für 10 Minuten, nach 5 Minuten und 10 Minuten jeweils Vortexen für 5 Sekunden

kurzes Anzentrifugieren, um keine Flüssigkeit aus dem Deckel zu verlieren

Binden an die Membran

Zugeben von 300 µl AB-Puffer ausgiebiges Vortexen

kurzes Anzentrifugieren, um keine Flüssigkeit aus dem Deckel zu verlieren 3-4-maliges Resuspendieren mittels Pipette

Überführen des Lysats auf die QIAamp Säule Zentrifugieren bei 3000 x g für 1 Minute Säule in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß stellen

Waschen der Säule

Zugeben von 500 µl AW1-Puffer Zentrifugieren bei 6000 x g für 1 Minute Säule in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß stellen Zugeben von 500 µl AW2-Puffer

Zentrifugieren bei 16100 x g für 3 Minuten Säule in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß stellen

Eluieren der DNA

Zugeben von 30 µl AVE-Puffer auf die Säule Zentrifugieren bei 6000 x g für 1 Minute

wiederholtes Zugeben von 30 µl AVE-Puffer auf die Säule Zentrifugieren bei 6000 x g für 1 Minute

komplettes Eluat erneut auf die Säule geben Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 Minuten

(26)

Zentrifugieren bei 6000 x g für 1 Minute

Überführen des Endeluats (etwa 52–56 µl) in ein 1,6 ml Reaktionsgefäß und Lagerung bei - 20° C.

2.2 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

2.2.1 Allgemeine Einführung

Diese von Saiki und Mitarbeitern ^{96, 97} entwickelte Methode zur in vitro-Amplifizierung von Nukleinsäure-Fragmenten ist inzwischen zu einer der am meisten verwendeten Standard- methoden der Molekularbiologie geworden. Sie eignet sich prinzipiell zum Nachweis jeglicher DNA-Sequenz, deren Basensequenz zumindest in wichtigen Teilbereichen bekannt ist. Hierzu verwendet man zwei Oligonukleotide (Primer), die zu den jeweiligen DNA- Strängen der Hin- und Rückrichtung (sense und antisense) komplementär sind und den zu amplifizierenden Bereich kennzeichnen.

Im Einzelnen läuft eine PCR in drei Schritten ab, die in gleicher Form mehrfach wiederholt werden:

1. Denaturierung

2. Anheften der Oligonukleotide (Annealing) 3. Extension zu neuen Doppelsträngen (Elongation)

Durch das Erhitzen auf über 90 °C wird die doppelsträngig vorliegende DNA denaturiert und somit in zwei Einzelstränge getrennt. Im Laufe des nachfolgenden Absinkens der Temperatur auf etwa 50 °C erfolgt die Bindung der Primer an die komplementären Sequenzen der zu vervielfältigenden DNA (Template). Anschließend wird durch die Erhöhung der Temperatur auf 72 °C, dem Temperaturoptimum der Taq-Polymerase, die Synthese des neuen DNA- Stranges durch die Taq-Polymerase eingeleitet (s. Abb. 7).

Die zyklische Wiederholung dieser Reaktionsschritte ermöglicht eine exponentielle Vermehrung der spezifischen DNA-Sequenz in Form neu synthetisierter DNA-Doppel- Stränge, die der ursprünglichen exakt gleichen.

(27)

Abb. 7 : Schematische Darstellung des Funktionsprinzips der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Abb.

übernommen von Kulozik et al. ⁹⁸).

Durch eine anschließende Gelelektrophorese und Anfärbung mit Ethidiumbromid kann das PCR-Produkt getrennt, sichtbar gemacht und anhand seiner Größe identifiziert werden.

2.2.2 Nested PCR und ASO-PCR

Im Rahmen einer konventionellen PCR nimmt die Zahl der Fehlhybridisierungen mit steigender Zyklenzahl immer stärker zu, so dass es zu einem sogenannten Schmier an Produkten kommt und geringste Template-Mengen nicht mehr nachgewiesen werden können.

Aus diesem Grund wurde die „nested PCR“ entwickelt: man führt eine erste PCR („first round PCR“) durch und verwendet das generierte Produkt als Template für eine zweite Amplifikation („second round PCR“). Das Primerpaar der „second round PCR“ liegt innerhalb der in der „first round PCR“ amplifizierten Sequenz, so dass Produkte der ersten Runde nicht weiter amplifiziert werden. Auf diese Weise wird sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität gesteigert ⁹⁹.

(28)

Bei der MRD Messung kommt die sogenannte ASO-PCR zum Einsatz (s. Abb. 8). Hierzu müssen bei Diagnosestellung zunächst die patientenspezifischen Ig/TZR Rearrangements identifiziert werden. Dies geschieht durch die Amplifizierung der Gen-Rearrangements ¹⁰⁰. Zur Unterscheidung zwischen leukämiespezifischen und polyklonalen PCR-Produkten wird eine Heteroduplex-Analyse oder aber fluoreszierendes Gen-Scanning durchgeführt ^{101, 102}. Monoklonale PCR-Produkte können dann sequenziert werden und dienen so als Vorlage für das Design von für die junktionalen Regionen spezifischen Oligonukleotiden, den sogenannten allelspezifischen Oligonukleotiden (ASO) ⁸⁹. Der zuletzt beschriebene Schritt wird im Rahmen der ALL-BFM-Studie im Humangenetischen Institut, Prof. Dr. C. R.

Bartram, Universität Heidelberg ausgeführt.

Abb. 8: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips der ASO-PCR. (Abb. übernommen von Nakao et al. ¹⁰³).

In der im oberen Teil der Abbildung 8 dargestellten PCR wurden für die Ig H Rearrangements in der „first round PCR“ Konsensus Primer der VH- und der JH-Familie eingesetzt, die auf den Keimbahnabschnitten der betroffenen Gensegmente lokalisiert sind. Für die „second round PCR“ wurden ein „innerer Keimbahn-Primer“ (für das zugehörige VH Gen spezifisch) und ein ASO Primer verwendet.

Für die TZR Rearrangements im unteren Teil der Abbildung wurde die „first round PCR“ mit einer Primerkombination für den entsprechenden Keimbahnabschnitt durchgeführt. Bei der

„second round PCR“ wurde ein ASO entweder als forward („Possibility 2“) oder als reverse („Possibility 1“) Primer zusammen mit einem Keimbahn-Primer eingesetzt.

(29)

2.2.3 Real-Time quantitative PCR (RQ-PCR, LightCycler System)

Mit dem Light Cycler System lässt sich sowohl eine quantitative als auch eine qualitative real-time PCR durchführen. Das dem Light Cycler Verfahren zugrunde liegende Prinzip ist die kontinuierliche Messung eines Fluoreszenzsignals, z.B. SYBR Green I, das nur bei Bindung an doppelsträngige DNA (dsDNA) Signale sendet. Die gesendete Signalstärke steigt während der PCR proportional mit der Menge des Ampilifikationsproduktes an ^{104, 105}. Der Beginn der exponentiellen Produktzunahme (lineare Log-Phase der PCR) wird aufgrund der Fluoreszenzzunahme bestimmt und entspricht dem sogenannten crossing point. Dieser korreliert mit der Anfangskonzentration der zu amplifizierenden DNA-Sequenz und kann deshalb zur Quantifizierung der Transkripte herangezogen werden.

Bei der Verwendung von SYBR Green I fehlt allerdings die Spezifität hinsichtlich des zu untersuchenden Templates, da auch Primer-Dimere oder Nebenprodukte, die sich während der Reaktion bilden, einen Fluoreszenzanstieg verursachen. Dieser ist zunächst einmal nicht von dem des spezifischen Produktes zu unterscheiden. Eine Differenzierung zwischen spezifischem Produkt und Primer-Dimeren oder Nebenprodukten wird erst durch die sich an die letzte Elongationsphase der PCR anschließende Schmerzkurvenanalyse ermöglicht. Bei dieser werden die PCR-Produkte kontinuierlich über einen bestimmten Temperaturbereich aufgeheizt bis sie ihrem Schmelzpunkt entsprechend nur noch als Einzelstrang vorliegen. Die damit verbundene Fluoreszenzabnahme wird aufgezeichnet. Jedes PCR-Produkt besitzt eine charakteristische Schmelztemperatur (Tm), die sowohl von der Länge des PCR-Produktes als auch von seinem GC-Gehalt abhängig ist. Kleinere Fragmente wie z.B. Primer-Dimere weisen einen niedrigeren Schmelzpunkt auf als die spezifischen PCR-Produkte ¹⁰⁶.

Sowohl die Steuerung des LightCyclers, als auch die logarithmische Auswertung der Reaktionsergebnisse wird mittels einer speziellen Software (Roche Molecular Biochemicals LightCycler Software Version 3.5) durch einen Personalcomputer durchgeführt.

(30)

2.3. Weiterverarbeitung der DNA

2.3.1 -Actin real-time quantitative PCR (RQ-PCR) zur Testung der Amplifizierbarkeit sowie der Quantifizierung der freien Plasma DNA

Zur Bestimmung der Konzentration an freier Plasma DNA wurde eine RQ-PCR (LightCycler) mit den Primern -Actin (F) und -Actin (R) etabliert.

-Actin ist ein „housekeeping gene“, das als Bestandteil des Zytoskeletts und Vermittler von intrazellulärer Motilität ubiquitär in allen eukaryotischen Zellen zu finden ist. Ein 1.2-kb Fragment der -Actin 5´ Region ist für eine effiziente Transkription ausreichend ¹⁰⁷.

Als Ausgangspunkt für die verwendete Verdünnungsreihe diente ein mit dem Photometer auf eine Konzentration von 50 ng/µl eingestellter buffy coat (bc), der zunächst mit AE-Puffer auf 15 ng/µl eingestellt und sukzessiv mit AE-Puffer um jeweils eine Zehnerpotenz bis auf 1,5 pg/µl verdünnt wurde. Eine Standard-DNA (aus LightCycler™ Control Kit DNA; auf 150 pg/µl eingestellt) lief zur externen Kontrolle bei jedem der Versuche mit (Abb. 9 A-B).

1 2 3 4 5 H₂O H2O

Standard

DNA Patientenproben

Abb. 9 A: Amplifikationsprofil der βββ-Actin real-time quantitative PCR. β

1-5: Verdünnungsreihe mit bc (15 ng/µl – 1,5 pg/µl), H2O: Negativkontrolle. Standard DNA: aus LightCycler™

Control Kit DNA als externe Kontrolle. Patientenproben: 6 zu quantifizierende Patientenproben.

(Slope: -3,91; r=-1,00)

(31)

Die Reproduzierbarkeit wurde in einem parallelen Assay mit mehreren Plasmaproben eines Gesundspenders getestet. Diese wurden zum selben Zeitpunkt entnommen und die DNA in der selben DNA-Präparation isoliert (Daten hier nicht aufgeführt).

Zur Klärung der Frage, ob die Lagerungszeit der EDTA-PB Proben einen Einfluss auf die gemessene DNA-Konzentration der Proben hat, wurden Experimente im Sinne einer Zeit- kinetik (6, 12, 24, 36 und 48 h) durchgeführt (Daten hier nicht aufgeführt). Da erst nach 24 Stunden deutlich erhöhte DNA-Konzentrationen bei konstanter Leukozytenzahl nachgewiesen werden konnten, wurden in der Regel alle Proben innerhalb von maximal 24 Stunden aufgearbeitet.

Die hier beschriebene Quantifizierung der freien Plasma DNA erfolgte in der Etablierungs- phase als Doppelansatz. Aufgrund der Materialknappheit wurde sie später nur als Einfachansatz durchgeführt.

2.3.1.1 Reaktionsansatz

Reaktionskomponenten Volumen [µl]

LightCycler™ FastStart DNA Master SYBR Green I 2,0

MgCl2, 25 mM 2,4

Primer -Actin (F) 1,0

Primer -Actin (R) 1,0

Volumen Mastermix 6,4

Volumen Verdünnungsreihe bzw. Aqua dest.

(Negativkontrolle) bzw. DNA-Probe 13,6

Gesamtvolumen (Reaktionsansatz, einfach) 20,0 Abb. 9 B: Schmelzkurvenanalyse der ββββ-Actin real-time quantitative PCR.

H2O

spezifische PCR-Produkte

(32)

2.3.1.2 Reaktionsprotokoll

1 Zyklus: 95°C, 10 min. (Denaturierung)

50 Zyklen: 95°C, 1 sec.; 68°C - 60°C, 10 sec.; 72°C, 10 sec. (PCR) 1 Zyklus: 95°C, 1 sec.; 64°C, 10 sec.; 95°C, 1 sec. (Melting) 1 Zyklus: 40°C, 15 sec.

2.3.2 Real-time quantitative PCR (RQ-PCR) zur Testung der patientenspezifischen Marker an Tag 0 Material (KM)

Wie unter 1.3 beschrieben, lassen sich in der Regel pro Patient mehrere spezifische Marker nachweisen, die für die MRD Messung verwendet werden. Um die Kinder nicht unnötig zu belasten, wurden nur wenige ml Blut entnommen. Die daraus gewonnene Plasma-Menge reichte in der Regel nur zur Messung eines Markers aus.

Das Tag 0 Knochenmark wurde mit AE Puffer auf 150 pg/µl eingestellt (= V 0) und in 3 weiteren Verdünnungsschritten (jeweils im Verhältnis 1:10) mit buffy coat (ebenfalls auf 150 pg/µl eingestellt) bis zur Stufe V 3 (= 1:10³) verdünnt.

Anschließend wurden alle aufgelisteten Marker (im Rahmen der ALL-BFM-Studie im Humangenetischen Institut, Prof. Dr. C. R. Bartram, Universität Heidelberg sequenziert) anhand dieser Verdünnungsreihe getestet. Dabei wurde das Reaktionsprotokoll den jeweiligen Annealing-Temperaturen der verwendeten Primer angepasst.

Destilliertes Wasser diente als Negativkontrolle und drei Doppelansätze buffy coat (150 pg/µl) zur Definition der unspezifischen Hintergrundsignale.

Damit ein Marker für die Experimente mit der Plasma und der Leukozyten DNA ausgewählt werden konnte, wurden Kriterien aufgestellt, um zwischen einem „informativen“ und einem

„nicht-informativen“ Marker unterscheiden zu können. Hierbei war die Schmelzkurvenanalyse ausschlaggebend: Marker, bei denen eine eindeutige Trennung zwischen buffy coat und H2O (als Negativprobe) auf der einen und patientenspezifischer DNA (KM, Tag 0) auf der anderen Seite sichtbar war, wurden als „informativ“ gewertet.

Marker, bei denen dies nicht der Fall war, wurden als „nicht-informativ“ eingeordnet und kamen für die weiteren Experimente nicht in Frage.

Abb. 10 A-B soll diesen Sachverhalt veranschaulichen: Schon im Amplifikationsprofil ist eine klare Auftrennung zwischen patientenspezifischer DNA und den anderen Proben erkennbar, welche durch die Schmelzkurvenanalyse eindeutig bestätigt wird (Peaks bei zwei verschiedenen Temperaturen). Die Bedeutung der Schmelzkurvenanalyse wird deutlich, wenn

(33)

man die Verdünnungsstufe V3 näher betrachtet: In Abb. 10 A wird V3 noch vor V2 amplifiziert. Bei Betrachtung der Abb. 10 B stellt sich jedoch heraus, dass es sich bei V3 nicht um ein patientenspezifisches PCR-Produkt handelt, die Sensitivität dieses Markers demnach mit V2 (bis 1,5 pg/µl) angegeben werden muss.

V0 V1 V3 V2 H₂O bc

Abb. 10 A: Amplifikationsprofil einer real-time quantitative PCR zur Definition eines geeigneten Markers. V0-V3: Verdünnungsreihe mit Tag 0 Knochenmark, H2O: Negativkontrolle. bc: buffy coat zur Definition der unspezifischen Hintergrundsignale. (Slope: -2,47; r=-0,98)

Abb. 10 B: Schmelzkurvenanalyse zu Abb. 10 A. V0, V1 und V2 mit spezifischem Schmelzpunkt bei 88° C.

V0, V1, V2 V3

bc

H₂O

(34)

MgCl2, 25 mM 1,6

Primer 1 0,5

Primer 2 0,5

Gesamtvolumen (Reaktionsansatz, einfach) 20,0 2.3.2.2 Reaktionsprotokoll

60 Zyklen: 95°C, 1 sec.; 70°C - 64°C, 10 sec.; 72°C, 10 sec. (PCR);

Annealing-Temperatur an jeweilige Primer angepasst 1 Zyklus: 95°C, 1 sec.; 64°C, 10 sec.; 95°C, 1 sec. (Melting) 1 Zyklus: 40°C, 15 sec.

2.3.3 Nested PCR zur Detektion von MRD in Leukozyten DNA aus PB

Das im Rahmen der ALL-BFM-Studie etablierte Standard-Protokoll zur Detektion von MRD in Knochenmark wurde modifiziert, um es auf Leukozyten DNA anzuwenden: Die mittels QIAamp^® Blood Midi Kit isolierte Leukozyten DNA wurde zunächst mit dem Photometer gemessen und ggf. mit AE Puffer auf 50 ng/µl verdünnt.

2.3.3.1 „First round PCR“ (Thermocycler)

Eine Verdünnungsreihe mit Tag 0 Knochenmark wurde angelegt (Knochenmark und buffy coat jeweils auf eine Konzentration von 50 ng/µl eingestellt; Verdünnungsfaktor jeweils 1:10;

V 1 - V 5). In die PCR wurden die Verdünnungsreihe, 1 Negativprobe (dest. Wasser), 3 Positivproben (buffy coat) und die Patientenproben eingesetzt. Wie in 2.2.2 beschrieben, wurden bei diesem ersten Schritt forward und reverse Primer eingesetzt, die im Keimbahnbereich des betroffenen Gensegmentes amplifizieren. Dabei wurde das Reaktionsprotokoll den jeweiligen Annealing-Temperaturen der verwendeten Primer angepasst.

(35)

2.3.3.1.1 Reaktionsansatz

PCR Nucleotide Mix 10 mM each dNTP 1,2

10x PCR-Puffer 5,0

MgCl2, 25 mM 2,0

Primer 1 0,8

Primer 2 0,8

HotStarTaq^®DNA Polymerase 5 units/µl 0,25

Aqua ad iniectabilia 30

Gesamtvolumen (Reaktionsansatz, einfach) 50,0 2.3.3.1.2 Reaktionsprotokoll

Vorheizen des Verschlusses auf 110°C 1 Zyklus: 94°C, 15 min.

28 Zyklen: 94°C, 30 sec.; 66° C, 45 sec.; 72°C, 45 sec.

12 Zyklen: 94°C, 30 sec.; 52° C, 45 sec.; 72°C, 45 sec.

1 Zyklus: 72°C, 10 min.

Abkühlen auf 8°C

2.3.3.2 Agarose-Gel

Nach 50 Zyklen wurde ein Agarose-Gel mit den PCR-Produkten geladen, um durch die Beurteilung der Banden feststellen zu können, ob:

1. ausreichend DNA für die folgende nested PCR vorhanden ist, 2. kontaminationsfrei gearbeitet wurde,

3. die Qualität der Primer ausreichend ist.

Zum Gießen eines 2%igen Agarose-Gels benötigt man 2 g Agarose Pulver und 100 ml 1 M TBE-Puffer. Nach kurzem Aufkochen in der Mikrowelle werden 4 µl Ethidiumbromid hinzugefügt und das flüssige Gel in die vorbereitete Gießkammer gefüllt. Etwa 30 Minuten später können die Gele entnommen und in die Gelkammern (gefüllt mit 1 M TBE-Puffer) gelegt werden. Zum Beladen des Gels werden 10 µl des PCR-Produktes mit 1,5 µl loading buffer auf einer Assayplatte vermischt und in die Geltaschen pipettiert.

Marker V (DNA Molecular Weight Marker V 8 – 587 bp) läuft als Standard mit, um bei der Auswertung des Gels die Anzahl der Basenpaare abschätzen zu können.

(36)

Bei einer Feldstärke von 50mV wurden Proben und Größenmarker mittels ihrer Eigenladung im elektrischen Feld nach der Größe aufgetrennt und anschließend durch Ethidiumbromid im UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert (s. Abb. 11).

2.3.3.3 „Second round“ real-time quantitative PCR (RQ-PCR, LightCycler)

Nach der Auswertung des Gels wurden die PCR-Produkte mit 0,5 M TE-Puffer im Verhältnis 1:100 verdünnt. Die so verdünnten PCR-Produkte dienen als Template für den zweiten Schritt der nested PCR: Die RQ-PCR mit einer Kombination aus einem patientenspezifischen ASO- Primer und einem „inneren Keimbahn-Primer“ (s. Abb. 12 A). Dabei wurde das Reaktions- protokoll den jeweiligen Annealing-Temperaturen der verwendeten Primer angepasst.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Abb. 11: Darstellung der PCR-Produkte der „first round PCR“ nach Elektrophorese (unter UV-Licht).

M: Größenmarker V, 1-5: Verdünnungsreihe V1-V5, 6: H2O als Negativ- kontrolle, 7-9: buffy coat (Positivkontrolle), 10-16: Patientenproben.

Abb. 12: Amplifikationsprofil der „second round“ real-time quantitative PCR.

1-4: Verdünnungsreihe mit Tag 0 Knochenmark (V1-V4), bc: buffy coat zur Definition der unspezifischen Hintergrundsignale, Patientenproben. Alle eingesetzten Proben stammen aus der 1. PCR und wurden 1:100 verdünnt. (Slope: -3,18; r=-1,00)

1 2 3 4

bc

d 0 d 15 d 8 d 52 d 6 d 22 R1 R2

(37)

2.3.3.3.1 Reaktionsansatz

MgCl2, 25 mM 0,8

Primer 1 0,25

Primer 2 0,25

Aqua ad iniectabilia 7,2

Volumen verdünntes PCR-Produkt aus 2.3.3.1 1,0 Gesamtvolumen (Reaktionsansatz, einfach) 10,0

2.3.3.3.2 Reaktionsprotokoll

2.3.4 Real-time quantitative PCR (RQ-PCR) zur Detektion von MRD in Plasma DNA:

Es wurde eine RQ-PCR zur Detektion von MRD in Plasma DNA etabliert: Die mittels QIAamp^® UltraSens Virus Kit isolierte und im Rahmen der -Actin RQ-PCR (s. 2.3.1) bereits quantifizierte Plasma DNA wurde nun mit dem für den jeweiligen Patienten zuvor definierten Marker untersucht (s. 2.3.2).

Das Tag 0 Knochenmark wurde mit AE Puffer auf 150 pg/µl eingestellt (= V 0) und in drei weiteren Verdünnungsschritten (jeweils 1:10) mit buffy coat (150 pg/µl) bis zur Stufe V 3 verdünnt. Anschließend wurden die Verdünnungsreihe, eine Negativprobe (dest. Wasser), drei Proben (buffy coat) zur Definition der unspezifischen Hintergrundsignale und die Patientenproben in die PCR eingesetzt. Dabei wurde das Reaktionsprotokoll den jeweiligen Annealing-Temperaturen der verwendeten Primer angepasst.

Unter 2.3.2 wurde bereits beschrieben, dass sich für jeden Versuch eine patientenspezifische Sensitivität bestimmen lässt. Die in Abb. 13 A-B gezeigte PCR weist eine Sensitivität von V2 auf, d.h., dass mit ihr potentiell bis zu einer DNA-Konzentration von 1,5 pg/µl MRD im Plasma detektiert werden kann. Bei einem analysierten Reaktionsvolumen von 15,4 µl bedeutet dies, dass eine Sensitivität bis zu einer Gesamtmenge leukämiespezifischer DNA von 23,1 pg vorlag – dies entspricht der theoretischen Menge von 3 Zellen. Falsch-negative

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Ergebnisse können ausgeschlossen werden, da die Gesamtkonzentration an Plasma DNA vorab per -Actin RQ-PCR quantifiziert wurde und in allen Fällen über der Sensitivitätsgrenze lag. Als positiv wurde eine Plasmaprobe bewertet wenn sie bei der Schmelzkurvenanalyse in unmittelbarer Nähe des Tag 0 Materials lag und ein eindeutiger Abstand zu den unspezifischen PCR-Produkten sichtbar war.

V0 V1 V2 V3

Abb. 13 A: Amplifikationsprofil einer real-time quantitative PCR zur Detektion von MRD in Plasma DNA.

V0-V3: Verdünnungsreihe mit Tag 0 Knochenmark, H2O: Negativkontrolle. bc: buffy coat zur Definition der unspezifischen Hintergrundsignale, Patientenproben zu den Zeitpunkten Tag 2, 4, 5 und 2. MTX Block (Protokoll M). (Slope: -1,35; r=-0,87)

bc H₂O

d 2 d 4 d 5 2.MTX

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MgCl2, 25 mM 1,6

Primer 1 0,5

Primer 2 0,5

Gesamtvolumen (Reaktionsansatz, einfach) 20,0

2.3.4.2 Reaktionsprotokoll

2.3.5 Messung der DNA-Konzentration mittels Photometer (eppendorf Bio Photometer)

Zur Konzentrationsmessung wurden 4 µl DNA mit 76 µl aqua dest. 1:20 verdünnt. Die Messung erfolgte spektralphotometrisch durch die Extinktionsmessung bei einer Wellenlänge von 260 nm.

V3, H2O, bc

2. MTX

V0, V1, V2

d 2, d 4, d 5

Abb. 13 B: Schmelzkurvenanalyse zu Abb. 13 A. Mit spezifischer Schmelzkurve für V0, V1, V2 sowie d2, d4, d5 bzw. charakteristischer Schmelzkurve der unspezifischen Produkte (V3, H2O, bc, 2. MTX).