Auswirkungen der postnatalen Fütterung auf den peripheren Insulin-Response von Kälbern

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Klinik für Rinder

Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Tierernährung

Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Braunschweig

Auswirkungen der postnatalen Fütterung auf den peripheren Insulin-Response von Kälbern

T H E S E

zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY (PhD)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Inga Klosinsky

aus Flensburg

Hannover 2008

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Supervisor: Prof. Dr. Martin Kaske

Betreuungsgruppe: Prof. Dr. Martin Kaske PD Dr. Korinna Huber

Univ. Prof. Dr. agr. Gerhard Flachowsky

1. Gutachten: Prof. Dr. Martin Kaske

(Lehrstuhl für Physiologie, Wissenschaftszentrum Weihenstephan, Technische Universität München)

PD Dr. Korinna Huber

(Institut für Physiologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)

Prof. Dr. Gerhard Flachowsky

(Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsanstalt für Tiergesundheit Braunschweig, Institut für Tierernährung)

2. Gutachten: Prof. Dr. Heinrich H. D. Meyer (Lehrstuhl für Physiologie, Wissenschaftszentrum Weihenstephan, Technische Universität München)

Datum der mündlichen Prüfung: 23.05.2008

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Diese These wurde dankenswerter Weise durch ein Promotionsstipendium des Evangelischen Studienwerks e.V. Villigst gefördert.

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Ergebnisse dieser These wurden auf folgender Tagung veröffentlicht:

61. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie (06. – 08. März 2007 in Göttingen)

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Für meine Familie

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Inhaltsverzeichnis Seite i

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Schrifttum 3

2.1 Glucosestoffwechsel der Wiederkäuer 3

2.1.1. Abbau der Futterkohlenhydrate und Gluconeogenese 3

2.1.2. Glucosetransport in die Zellen 3

2.1.3. Glucosetransport in quergestreifter Muskulatur und Fettgewebe 4 2.2 Hormonelle Regulation der Glucosehomöostase bei Monogastriern und

Wiederkäuern 8

2.2.1. Insulin 8

2.3 Insulinresistenz 16

2.3.1. Insulinresistenz der Wiederkäuer 18

2.4 Metabolische Programmierung 26

2.4.1 Definition 26

2.4.2 Geschichtlicher Hintergrund 26

2.4.3 Epidemiologische Studien zur metabolischen Programmierung 28 2.4.4 Experimentelle Studien zur metabolischen Programmierung 29 2.4.4.4 Metabolische Programmierung bei Rindern 36 2.4.5 Zusammenfassung der metabolischen Programmierung 37 2.4.6 Methoden zur Bestimmung der Insulinwirksamkeit in vivo 38

3 Material und Methode 41

3.1 Versuchsvorhaben 41

3.2 Versuchstiere 42

3.2.1 Selektionskriterien 43

3.3 Haltung und Fütterung der Versuchstiere 43

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Seite ii Inhaltsverzeichnis

3.3.2 Fütterung 45

3.3.3 Auffälligkeiten in Versuchsperioden 1 und 2 50

3.3.4 Abtränken der Kälber 52

3.3.5 Fütterung in Versuchsperiode 3 52

3.3.6 Tägliche Gesundheitskontrolle 53

3.3.7 Krankheiten der Kälber im Versuchszeitraum 54

3.4 Experimentelles Design 60

3.4.1 Wöchentliche Blutproben 60

3.4.2 Gewichtsentwicklung 60

3.4.3 Hyperinsulinämische euglycämische Clamps 61

3.4.4 Bioptatentnahme 69

3.4.5 Durchführung des Western Blot 71

3.5 Analysen 78

3.5.1 Glucose 78

3.5.2 Insulin 79

3.5.3 Nicht-veresterte Fettsäuren 80

3.5.4 Beta-Hydroxybutyrat 81

3.5.5 Kalium 81

3.5.6 Weitere Parameter 81

3.6 Berechnungen 83

3.6.1 Basale Konzentrationen von Glucose, Insulin und nicht-veresterten

Fettsäuren 83

3.6.2 Steady-state Glucose-Infusionsraten 83

3.6.3 Steady-state Insulinkonzentration 83

3.6.4 Steady-state NEFA-Konzentrationen 83

3.6.5 Insulineliminationsrate 84

3.6.6 Insulin-Sensitivitäts-Index 84

3.6.7 Homeostasis model assessment 84

3.7 Statistik 85

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Inhaltsverzeichnis Seite iii

4 Ergebnisse 87

4.1 Experiment I – konventioneller Milchaustauscher 87 4.1.1 Gewichtsentwicklung und Blutparameter im Versuchszeitraum 87 4.1.2 Hyperinsulinämische euglycämische Clamps 91 4.2 Experiment II – Milchaustauscher mit vermindertem Lactoseanteil 98 4.2.1 Gewichtsentwicklung und Blutparameter im Versuchszeitraum 98 4.2.2 Hyperinsulinämische euglycämische Clamps 102

5 Diskussion 111

5.1 Diskussion der Methode 111

5.1.1 Versuchstiere 111

5.1.2 Hyperinsulinämische euglycämische Clamps 116

5.1.3 GLUT-4 Bestimmung mittels Western Blot 120

5.1.4 Zusammenfassung 122

5.2 Diskussion der Ergebnisse 123

5.2.1 Basalwerte 123

5.2.2 Ergebnisse der hyperinsulinämischen euglycämischen Clamps 129

5.2.3 Schlussfolgerungen 142

5.3 Ausblick 144

6 Zusammenfassung 145

7 Summary 149

8 Schrifttumsverzeichnis 151

Tabellenanhang 171

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Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

ATP Adenosintriphosphat

Aqua bidest. zweifach destilliertes Wasser

BCS body condition score

BHB Beta-Hydroxybuttersäure

BMI body mass index

cAMP cyclisches Adenosin-Mono-Phosphat

CoA Coenzym A

d Tag(e)

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGP endogene Glucoseproduktion

FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft

GE Gesamteiweiß

GIR Glucose-Infusionsrate

GLUT Glucosetransporter

h Stunde(n)

HGC Hyperglycämischer Clamp

HIEC Hyperinsulinämischer euglycämischer Clamp

HOMA Homeostatic model assessment

HST Harnstoff

HT Hungertag

IE Internationale Einheiten

IGF-1 Insulin-like-growth-Faktor 1 IGF-2 Insulin-like-growth-Faktor 2

i.m. intramuskulär

ITT Insulin-Toleranztest

IVGTT Intravenöser Glucosetoleranztest

K Kontrolle (Gruppe in dieser Studie)

kDa Kilo Dalton

KGW Körpergewicht

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km Michaelis-Menten-Konstante; Insulinkonzentration bei der der halbmaximale Effekt von Insulin erreicht wird

LL Low Lactose (Gruppe in dieser Studie)

LT Lebenstag

M Musculus

Mm. Musculi

mA Milliampere

MAT Milchaustauscher

MCRG Metabolische Clearance Rate von Glucose

mU Milliunits

µg Mikrogramm

µmol Mikromol

µU Mikrounit

mmol Millimol

mRNA Messenger Ribonucleinsäure

MSH -Melanocyte Stimulating Hormone

N Anzahl

NEB Negative Energiebilanz

NEFA nicht-veresterte Fettsäuren

NfE Stickstoff-freie Extraktstoffe

NIDDM Non Insulin Dependent Diabetes Mellitus

OGTT oraler Glucosetoleranztest

PI-3-Kinase Phosphatidylinositol-3-Kinase

PKC Proteinkinase C

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

POMC Proopiomelanocortin

Ra Rohasche

R-COOH Carbonsäure bzw. Fettsäure

Rfe Rohfett

RIA Radioimmunoassay

Rp Rohprotein

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s. c. subcutan

SD Standardabweichung

SDS Natriumdodecylsulfat

SSGIR Steady-state Glucose-Infusionsrate SSIK Steady-state Insulinkonzentration

TBST Tris-Glycin-Tween 20 Puffer

TEMED N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin

TMR Totale Mischration

TS Trockensubstanz

U Units

V. Vena

VK Variationskoeffizient

VLDL Very Low Density Lipoprotein

Vmax Maximale Reaktionsgeschwindigkeit in der Enzymkinetik;

Sättigung der Umsatzgeschwindigkeit der Substrat- umwandlung

VMH Ventromedialer Nucleus des Hypothalamus

Vv. Venae

w/v Gewicht pro Volumen

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1 Einleitung Seite 1

1 Einleitung

Epidemiologische Untersuchungen aus der Humanmedizin zeigen ebenso wie experimentelle Studien mit Labornagern, dass der periphere Insulin-Response durch die intrauterine nutritive Situation des Feten sowie das postnatale Fütterungsregime lebenslang determiniert werden („metabolic programming“). Diese metabolische Programmierung ist definiert als eine lebenslange Beeinflussung der metabolischen Konstellation des Organismus durch einen kurzfristigen intrauterinen und/oder postnatalen nutritiven Stimulus (LUCAS 1991).

Eine mögliche metabolische Programmierung durch die postnatale Fütterung ist beim Rind von besonderer Relevanz: bei keiner anderen Haustierspezies erscheint der Insulinstatus bzw. die Insulinresistenz für die Stoffwechselstabilität insbesondere während der ersten Wochen der Laktation so wichtig wie bei der Milchkuh, zumal eine periphere Insulinresistenz in der Pathogenese der Ketose offenbar eine wesentliche Rolle spielt (KRÄFT 2004). Eine mögliche Beeinflussung der Stoffwechselstabilität resultierend in einer verminderten Inzidenz verlustreicher Stoffwechselerkrankungen hätte wesentliche Implikationen im Hinblick auf den Tierschutz wie auch für die Ökonomie der Milchproduktion.

Es war das Ziel des Projekts zu prüfen, ob bzw. in welchem Umfang eine metabolische Programmierung durch die postnatale Fütterung bei Kälbern möglich ist. Gegebenenfalls wäre es so möglich, die Inzidenz von Stoffwechselentgleisungen bei Milchkühen durch das Tränkeregime des Kalbes zu vermindern.

Dazu wurde der Einfluss der Tränkemenge und -zusammensetzung auf den peripheren Insulin-Response von Kälbern mittels hyperinsulinämischer euglycämischer Clamps in drei Altersabschnitten quantifiziert. Zusätzlich wurde die Expression der Insulin-abhängigen Glucosetransporter (GLUT-4) in der Muskulatur (M. semimembranosus) mittels Western Blots untersucht.

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Seite 2 1 Einleitung

Ziel dieser Arbeit war die Bearbeitung der folgenden Fragestellungen:

Ist eine metabolische Programmierung von Kälbern durch die postnatale Fütterung induzierbar?

Wird der periphere Insulin-Response durch die Zusammensetzung und die Menge der Milchtränke zunächst kurzfristig beeinflusst?

Bleibt eine Beeinflussung des peripheren Insulin-Response durch die postnatale Ernährung auch nachweisbar, wenn die Kälber anschließend eine einheitliche Kontrolltränke erhalten?

Sind eventuelle Unterschiede im metabolischen Status bedingt durch die postnatale Fütterung auch nach Umstellung der Kälber auf eine wieder- käuergerechte, strukturreiche Ration noch nachweisbar?

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2 Schrifttum Seite 3

2 Schrifttum

2.1 Glucosestoffwechsel der Wiederkäuer

2.1.1. Abbau der Futterkohlenhydrate und Gluconeogenese

Wiederkäuer resorbieren in der Regel nur geringe Mengen an Glucose aus dem Dünndarm, da die mit dem Futter aufgenommenen Kohlenhydrate im Pansen mikrobiell überwiegend zu kurzkettigen Fettsäuren umgesetzt werden. Die Konzentration der Glucose im Blut ist mit etwa 3 mmol/l deutlich niedriger als bei Monogastriern. Die hepatische Gluconeogenese spielt eine zentrale Rolle für die Aufrechterhaltung der basalen Glucosekonzentration. Als Substrate dienen hierfür in erster Linie Propionat aus der Pansenfermentation (40–60 %), Laktat (15 %, aus Pansen, Leber und Muskulatur), Glycerin (5 % aus dem Fettabbau) und bis zu 25 % glucoplastische Aminosäuren aus der Muskulatur (PIATKOWSKI et al. 1990, WEEKES 1991, HERDT 2000). Die Aktivität der Gluconeogenese ist eng mit der Substratverfügbarkeit korreliert (BROCKMANN 1993), der aktuelle Bedarf dagegen hat einen geringeren Einfluss auf die Glucosesynthese (Literaturübersicht bei WEEKES 1991). Im Gegensatz zum Monogastrier ist die Aktivität der Gluconeogenese nicht im Hungerstoffwechsel, sondern postprandial durch die erhöhte Substratverfügbarkeit forciert (VAN SOEST 1996).

2.1.2. Glucosetransport in die Zellen

Glucose wird mit Hilfe von Transportern in die Zellen ein- und ausgeschleust (GOULD u. HOLMAN 1993). Diese Transporter sind strukturell miteinander verwandt. Da sie energieunabhängig ihr Substrat nur entlang eines Konzentrationsgradienten transportieren können, werden sie auch als passive Transporter bezeichnet (MUECKLER 1994). Bisher werden folgende für den Transport von Monosacchariden exprimierte Isotypen unterschieden:

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Seite 4 2 Schrifttum

GLUT-1 wird in fast allen Geweben exprimiert, insbesondere in quergestreifter Muskulatur, Fettgewebe, Perineuralscheiden, Erythrozyten und Endothelzellen von Hirngefäßen. Der basale Glucosetransport in diese Gewebe und Zellen erfolgt bei einem Km von 20 mmol/l.

GLUT-2 (Km = 40 mmol/l) haben nur eine geringe Affinität zu Glucose; sie werden von Hepatozyten, B-Zellen des endokrinen Pancreas, Enterozyten und renalen Tubuluszellen exprimiert.

GLUT-3 (Km = 10 mmol/l) werden vorwiegend in Neuronen exprimiert und sind zusammen mit GLUT-1 dafür verantwortlich, dass Glucose die Blut-Hirn- Schranke überwinden und in Neuronen aufgenommen werden kann.

GLUT-4 ist der einzige insulinabhängige Glucosetransporter und ausschließlich in quergestreifter Muskulatur und im Fettgewebe zu finden (MUECKLER 1990).

Beim Wiederkäuer scheint die Dichte der GLUT-4 Transporter in der Muskulatur niedriger zu sein als bei monogastrischen Spezies (HOCQUETTE et al. 1996).

Während einer experimentell erzeugten euglycämischen Hyperinsulinämie wurden GLUT-4 beim Wiederkäuer nicht verstärkt exprimiert (GELARDI et al.

1999).

GLUT-5 wurden vor allem im Darm und Spermatozoen nachgewiesen und transportieren Fructose.

GLUT-7 sind in den Mikrosomen der Leber vorhanden.

GLUT-8 sind beteiligt an der Entwicklung von Blastozysten.

GLUT-9 befinden sich im Gehirn und in Leukozyten (GOULD u. HOLMAN 1993, MUECKLER 1994, ZIERATH 1995, WATSON u. PESSIN 2001).

2.1.3. Glucosetransport in quergestreifter Muskulatur und Fettgewebe Fettgewebe und quergestreifte Muskulatur reagieren auf eine Insulinstimulation mit einem Anstieg der Glucoseaufnahme. Diese wird durch die Translokation von spezifischen Transportern aus einem Pool intrazellulärer Vesikel in die Plasmamembran vermittelt. Dieser Mechanismus wurde erstmals 1980 von CUSHMAN und WARDZALA beschrieben, die Adipozyten von Ratten untersuchten.

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GLUT-4, ein Glykoprotein mit 45–50 kDa (MUECKLER 1994), ist der einzige Transporter für Glucose, dessen kontinuierliche Rezirkulation durch Insulin stimulierbar ist, was eine verstärkte Translokation von einem intrazellulären Pool in die Plasmamembran zur Folge hat (CUSHMAN u. WARDZALA 1980, JAMES et al.

1988, GUMÁ et al. 1995, ZIERATH 1995, CZECH u. CORVERA 1999, PESSIN et al.

1999, BRAIMAN et al. 2001, FURTADO et al. 2003). So befinden sich in einer Muskelzellkultur basal nur 10 % der GLUT-4 in der Plasmamembran und 90 % in intrazellulären Kompartimenten. Nach einer Insulinstimulation über 20 min werden bereits 30 % der GLUT-4 auf der Zellmembran exprimiert und nur noch 70 % befinden sich intrazellulär (RUDICH u. KLIP 2003). GLUT-4 unterscheiden sich kaum zwischen den Säugerspezies, deshalb ist die Darstellung des humanen GLUT-4 (Abb. 1) auf die in dieser Studie untersuchte Spezies übertragbar. Der als Bindungsstelle dienende C-Terminus von 38 Aminosäuren weist nur einen Unterschied in der Primärstruktur zwischen verschiedenen Spezies auf: das Histidin bei Menschen, Ratten, Schweinen, Schafen und Ziegen an der Aminosäuren-Stelle 508 des Proteins ist bei Kühen ersetzt durch Asparagin (ABE et al. 1998).

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DÜHLMEIER et al. (2007) postulierten, dass GLUT-1 bei Wiederkäuern der dominante Glucosetransporter in glycolytischer Muskulatur ist und wahrscheinlich eine größere Bedeutung in der Glucoseutilisation im Vergleich zum Monogastrier besitzt. ABE et al. (2001) zeigten, dass GLUT-1 im Unterschied zum GLUT-4 nicht von der Ernährung beeinflusst wird: bei Kälbern sank der Gehalt an GLUT-4 in der Skelettmuskulatur im Alter von zwölf Monaten um 60 % gegenüber dem Geburtszeitpunkt, während der GLUT-1-Gehalt konstant blieb.

SASAKI (1990) und HOCQUETTE et al. (1995) postulierten, dass der niedrigere Insulin-Response der Wiederkäuer im Vergleich zu dem von Monogastriern auf dem geringen Gehalt an GLUT-4 in oxidativen Muskeln beruhte. Weiterhin beschrieben HOCQUETTE et al. (1997), dass das Absetzen der Kälber von der Milchtränke mit Umstellung des Metabolismus auf wiederkäuergerechte Ration keine Auswirkungen Abb. 1: Struktur des humanen GLUT-4. A - extrazelluläre Substrat-

bindungsstelle; B – zytoplasmatische Bindungsstelle; C - N- Terminus; D - Dileucin-Motiv am COOH-Terminus; Stern - Stelle der Phosphorylierung (modifiziert nach CZECH 1995)

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auf den GLUT-4 Gehalt von Muskeln hatte (Ausnahme: GLUT-4 Gehalt des M.

Masseter; dieser war höher bei wiederkauenden Tieren - wahrscheinlich aufgrund der höheren Aktivität des Muskels bei diesen Tieren). Bei Ratten und Schweinen wurde eine vermehre Expression des GLUT-4 in Muskel- und Fettzellen nach dem Absetzen nachgewiesen (POSTIC et al. 1994, HOCQUETTE et al. 1997).

Demgegenüber war der GLUT-4-Gehalt in Muskelzellen von adulten Ziegen signifikant niedriger als bei juvenilen Ziegen (DÜHLMEINER et al. 2005). Die Autoren schlossen daraus, dass die verminderte Insulin-Sensitivität der adulten Wiederkäuer auf einer verminderten GLUT-4 Expression beruht.

DÜHLMEIER et al. (2007) untersuchten weiterhin die GLUT-4 und GLUT-1 in verschiedenen Muskelgruppen bei unterschiedlichen Tierspezies. In der Studie waren die GLUT-4 Konzentrationen im M. masseter 3,4-fach höher bei Kühen und 6,3-fach höher bei jungen Ziegen als im M. semitendinosus. Ferner schlossen die Autoren aus ihren Ergebnissen, dass der GLUT-1 die verminderte Insulin-stimulierte GLUT-4 Insertion bei Kühen im Vergleich zu Monogastriern kompensiert (DÜHLMEIER et al. 2005, 2007).

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2.2 Hormonelle Regulation der Glucosehomöostase bei Monogastriern und Wiederkäuern

2.2.1. Insulin

2.2.1.1. Aufbau des Moleküls

Insulin nimmt in der Verteilung und Verwertung der Nährstoffe eine zentrale regulatorische Rolle ein (WEEKES 1991, MCGUIRE et al. 1995, LEMOSQUET 1997). Insulin gehört zu den Proteohormonen und besteht aus zwei Peptidketten. Die A-Kette ist aus 21 Aminosäuren aufgebaut, die B-Kette besteht aus 30 Aminosäuren.

Die Ketten sind durch zwei Disulfidbrücken miteinander verbunden, eine weitere Disulfidbrücke stabilisiert die Raumstruktur der A-Kette und liegt zwischen der sechsten und elften Aminosäure (LÖFFLER u. PETRIDES 2003). Zwischen den Spezies bestehen nur wenige Unterschiede hinsichtlich des Moleküls, z. B.

unterscheidet sich bovines Insulin nur durch drei Aminosäuren von humanem Insulin (TRENKLE 1972).

2.2.1.2 Insulinbiosynthese

Die Insulinbiosynthese erfolgt in den B-Zellen des endocrinen Pancreas, die sich zu Langerhans-Inseln formieren. Zunächst liegt es nach der Transkription als Präproinsulin vor. Von diesem wird eine Präsequenz im endoplasmatischen Retikulum entfernt, so dass das Proinsulin als eine einzige Kette entsteht. Dies besteht aus 81–86 Aminosäuren mit einer A- und einer B-Kette, die über das Connecting-Peptide (C-Peptid) miteinander verbunden sind (RUCKEBUSCH et al.

1991). Im Golgi-Apparat wird das C-Peptid mittels der Prohormon-Convertase abgetrennt (KANEKO 1989). Nach der Biosynthese wird das Insulin zunächst in Form von Sekretgranula gespeichert und bei Bedarf ins Blut abgegeben.

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2.2.1.2. Insulinfreisetzung aus den B-Zellen

Beim Monogastrier wird die Insulinfreisetzung über den Anstieg der Blutglucosekonzentration ausgelöst. Die B-Zellen des Pancreas weisen eine erhebliche Dichte an GLUT-2 auf. Der hohe Km-Wert der GLUT-2 (Km 40 mmol/l) ermöglicht eine linear mit der Blutglucosekonzentration zunehmende Aufnahme von Glucose in die B-Zellen. Die Aktivität der Glucokinase der B-Zellen ist verglichen mit der anderer Körperzellen ausgesprochen hoch (EFRAT et al. 1994). Somit wird die Glucose unmittelbar metabolisiert, woraus ein Anstieg der cytosolischen ATP- Konzentration resultiert. Die ATP-Konzentration korreliert umgekehrt proportional mit der Aktivität von ATP-sensitiven Kaliumkanälen in der Zellmembran. Somit resultiert aus einer erhöhten ATP-Korrelation eine verminderte Leitfähigkeit der Membran für Kaliumionen und damit eine Depolarisation der B-Zelle. Es erfolgt ein Calciumeinstrom, der schließlich die vermehrte Exozytose der Insulin speichernden Sekretgranula induziert. Diese verschmelzen mit der Zellmembran, so dass das Insulin in den perikapillären Raum und mit dem Blutstrom in den Körperkreislauf gelangt (LÖFFLER u. PETRIDES 2003).

Die Insulinfreisetzung in die Blutbahn erfolgt biphasisch. Innerhalb von zwei bis fünf Minuten nach der Erfassung der erhöhten Blutglucosekonzentration wird das in den B-Zellen gespeicherte Insulin freigesetzt; dies ist der erste Peak (FISCHER et al.

1975). Bei längerfristig hoher Glucosekonzentration kommt es zu einer anhaltenden Insulinbiosynthese und Abgabe. Da der minimale Zeitraum für die Synthese und Freisetzung von Insulin etwa bei einer Stunde liegt, ist der zweite Insulinpeak etwa nach dieser Zeit im Blut zu registrieren (SCHATZ 1977).

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2.2.1.3. Induktion der Insulinfreisetzung Monogastrier

Bei Monogastriern ist die Blutglucose-Konzentration der wichtigste Trigger für die Insulinsekretion (LÖFFLER u. PETRIDES 2003). Zudem führen der postprandial erhöhte Parasympathikotonus und spezifische gastrointestinale Hormone (Inkretine) nach oraler Glucoseaufnahme zu höheren Insulinkonzentrationen als nach intravenöser Applikation der gleichen Glucosemenge. Auch die adrenerg vermittelte Catecholaminsekretion beeinflusst die Insulinfreisetzung (BASSETT 1974). Die Catecholamine, die an die α2-Rezeptoren der Plasmamembran der B-Zellen binden, hemmen die Adenylatcyclase und damit den Calciumeinstrom und in Folge die Insulinsekretion. Der direkte Gegenspieler des Insulins ist das in den A-Zellen des endocrinen Pancreas gebildete Glucagon. Die Sekretion wird ausgelöst durch eine Abnahme der Glucosekonzentration im Blut. Glucagon wirkt katabol: es steigert die Glycogenolyse und die hepatische Gluconeogenese. Während Insulin neben der Leber auch wesentlich extrahepatische Gewebe (wie Fettgewebe und Skelettmuskulatur) beeinflusst, ist für Glucagon die Leber das primäre Zielorgan (BROCKMAN et al. 1975). Somatostatin aus den δ-Zellen der Langerhans-Inseln hemmt durch Aktivierung der Kaliumkanäle die Glucose-induzierte Depolarisation und damit die Insulinfreisetzung. Galanin als Neurotransmitter sympathischer Fasern hemmt die Insulinabgabe durch Induktion der Somatostatinfreisetzung und gleichzeitiger Stimulation der Glucagonfreisetzung aus den A-Zellen des Pancreas (BROCKMANN 1986).

Wiederkäuer

Es ist wenig bekannt über die Induktion der Insulinfreisetzung bei Wiederkäuern. Die Insulinsekretion ist vor allem von der Propionatkonzentration im Portalblut und einem prandial erhöhten Vagotonus abhängig (MANNS u. BODA 1967, BLOOM u.

EDWARDS 1981, MINEO et al. 1990, WEEKES 1991). Daneben führen auch kurzkettige Fettsäuren in supraphysiologischen Konzentrationen, Aminosäuren und gastrointestinale Hormone zu einer Stimulation der Insulinsekretion. Beim Wiederkäuer steigern zudem Propionat und Butyrat auch die Glucagonsekretion, um

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eine Insulin-induzierte Hypoglycämie zu vermeiden. Experimentell lässt sich auch beim Wiederkäuer ein Anstieg der Insulinkonzentration nach Bolusinjektion von Glucose nachweisen (MINEO et al. 1990, RUCKEBUSCH et al. 1991, HUSVETH et al. 1996, ELMAHDI et al. 1997). Die geringere funktionelle Bedeutung der Glucose ist teleologisch verständlich, da die Glucosekonzentration im Portalblut bei rohfaserreichen Rationen postprandial nicht wesentlich ansteigt.

Neben den absoluten Konzentrationen von Insulin und Glucagon beeinflusst das jeweilige Insulin-Glucagon-Verhältnis bei Wiederkäuern offenbar wesentlich die Glucosehomöostase (GIESECKE 1991).

2.2.1.4. Insulinrezeptor

Voraussetzung für die Insulinwirkung ist seine Bindung an den spezifischen, in der Plasmamembran lokalisierten Rezeptor (KAHN 1978). Der Insulinrezeptor ist ein Heterotetramer und gehört zur Familie der Tyrosinkinase-Rezeptoren. Er besteht aus je zwei gleichen α- und β-Untereinheiten. Jede α-Untereinheit ist mit einer β- Untereinheit assoziiert, und die α-Untereinheiten sind untereinander durch Disulfidbrücken verbunden (LÖFFLER u. PETRIDES 2003). Die α-Anteile sind ausschließlich auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran lokalisiert, sie beherbergen die Bindungsstellen für Insulin. Die β-Anteile reichen durch die Plasmamembran hindurch bis in den Intrazellulärraum hinein. Die intrazellulären Teile des Rezeptors fungieren als Tyrosin-Kinase. Nach Bindung von Insulin an den Rezeptor bindet die Tyrosin-Kinase Adenosintriphosphat (ATP) und führt Autophosphorylierungen der β-Untereinheiten durch (TAYLOR 1991, CZECH 1995, WHITE 1997, TAHA u. KLIP 1999). Dadurch wird eine Signalkaskade in Gang gesetzt, an deren Ende die Translokation des Glucosetransporters aus einem intrazellulären Pool in die Plasmamembran steht.

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2.2.1.5. Insulininduzierte Signalkaskaden

Diese Kaskaden wurden vorwiegend an Labornagern analysiert. Sie werden durch die Bindung von Insulin an die α-Untereinheit seines Rezeptors in der Plasmamembran in Gang gesetzt.

Durch die Bindung von Insulin an seinen Rezeptor wird die PI3-Kinase- und die Cbl / CAP vermittelte Insulinsignalkaskade aktiviert. Durch nacheinander folgende Phosphorylierungsreaktionen, die überwiegend an der Plasmamembran stattfinden, erfolgt die Signaltransduktion zu den GLUT4-enthaltenden Membranvesikeln. Der Insulinstimulus führt gleichzeitig zu einer Umformierung des Aktin-Zytoskeletts über TC10, ein rho family small GTP-binding protein, das als Gerüststruktur für beteiligte Signalproteine dient und als Matrix bei der Translokation der GLUT4-Speichervesikel agiert (MARTIN et al. 1996, GUAL et al. 2002). Die Membranfusion erfolgt in faltenförmigen Straffungen der Plasmamembran und wird durch die Aktivität von komplexierten SNARE-Proteinen reguliert (RUDICH u. KLIP 2003).

Die Resultate dieser Signalwege sind die Translokation der GLUT-4 enthaltenden Vesikel zur Plasmamembran (CZECH u. CORVERA 1999, TAHA u. KLIP 1999) und ein erleichterter Transport des GLUT-4 durch Endosomen (RUDICH u. KLIP 2003).

2.2.1.6. Insertion des GLUT-4 in die Zellmembran

Unter Insertion wird in diesem Zusammenhang der Transport von GLUT-4 aus seinem tubulovesikulären Pool in die Plasmamembran verstanden. Dieser Vorgang schließt sich an die durch Insulin induzierten Kaskaden an und bewirkt eine zwei- bis vierfach erhöhte Glucoseaufnahme der Muskelzelle von Menschen und Ratten (RUDICH u. KLIP 2003).

Der überwiegende Teil (60 %) der intrazellulär vorhandenen GLUT-4 befindet sich in kleinen Vesikeln und tubulo-vesikulären Strukturen, die einen eigenständigen Pool nahe der Plasmamembran bilden (REA u. JAMES 1997, PESSIN et al. 1999).

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Ein noch ungeklärtes Gebiet ist die Aktivierung des Transporters selbst. Der GLUT-4 wird vermutlich erst zur Plasmamembran transportiert und anschließend durch eine insulinvermittelte Dephosphorylierung mit folgender Konformationsänderung aktiviert (HANSEN et al. 1998, FURTADO et al. 2003).

Die Transporter setzen sich zum einen aus denen zusammen, die gerade internalisiert wurden. Zum anderen werden die GLUT-4 aus dem tubulovesikulären Pool freigesetzt und in Vesikel aufgenommen, die der Insertion dienen (ZIERATH 1995, TAHA u. KLIP 2003).

2.2.1.7. Internalisierung des GLUT-4

Die Internalisierung beschreibt den GLUT-4-Transport von der Plasmamembran in rezirkulierende Endosomen und/oder den tubulovesikulären Pool. Ob die Internalisierung des Transporters durch Insulin beeinflusst wird, ist noch nicht endgültig geklärt (GOULD u. HOLMAN 1993). Nach CZECH (1995) nimmt unter Insulinwirkung die Endozytose des GLUT-4 ab, so dass mehr Transporter im Plasmalemm zur Verfügung stehen, wodurch mehr Glucose in die Zellen internalisiert werden kann.

An der Internalisierung des GLUT-4 in das Cytoplasma ist eine Sequenz aromatischer Basen am N-Terminus des Transporters beteiligt, sowie ein Di-Leucin Motiv am C-Terminus, welches auch für die intrazelluläre Retention des Transporters kodiert (WATSON u. PESSIN 2001, FURTADO et al. 2003).

Die GLUT-4 werden in Clathrin coated pits in die Zelle internalisiert und durchlaufen nach Abspaltung des Clathrins zahlreiche endosomale Strukturen, darunter frühe Endosomen (E. E. = early endosomes) und rezirkulierende Endosomen (R. E. = recycling endosomes). Andernfalls gelangen die Transporter mit Hilfe ihrer spezifischen Aminosäuresequenz im N-Terminus in ihren intrazellulären

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endosomalen Pool, wo sie bis zu einer erneuten Stimulation bleiben (GOULD u.

HOLMAN 1993, CZECH 1995, REA u. JAMES 1997, PESSIN et al. 1999).

2.2.1.8. Insulinwirkung Kurzfristige Insulinwirkungen

Die Bindung von Insulin an die spezifischen Tyrosinkinase-Rezeptoren erhöht die periphere Glucoseaufnahme in den Intrazellularraum, besonders in Muskulatur und Fettgewebe. Dies geschieht durch vermehrte Insertion von GLUT-4-Proteinen aus intrazellulären Membranvesikeln in die Phospholipiddoppelschicht der Plasmamembran. Es resultiert eine Senkung des Blutglucosespiegels, die Steigerung der Glycogensynthese und der Glycolyse in der Skelettmuskulatur sowie der Triacylglycerinsynthese im Fettgewebe (LÖFFLER u. PETRIDES 2003).

Insulin stimuliert die Lipogenese und hemmt die Lipolyse. Der antilipolytische Effekt des Insulins resultiert aus einem Abfall der cAMP-Konzentration infolge Hemmung der Phosphodiesterase. Durch niedrige cAMP-Konzentrationen können die Lipasen nicht in ihre aktive, phosphorylierte Form überführt werden (LÖFFLER u. PETRIDES 2003).

Gleichzeitig unterdrückt Insulin die hepatische Gluconeogenese, da die glucogenetischen Vorläufersubstanzen vermehrt in die Muskulatur gelangen; die Aufnahme von Glucosevorläufern in die Leber wird so vermindert (BROCKMAN 1986). Möglicherweise wird die Gluconeogenese aus glucoplastischen Aminosäuren in der Leber durch die Hemmung der Alanin-Pyruvat-Transaminase oder durch Blockierung der Aufnahme von Glucosevorstufen in die Leber auf Enzymebene verhindert (LÖFFLER u. PETRIDES 2003). Auch die Erhöhung der hepatischen Glycogensynthese durch Insulin beruht auf der Senkung des cAMP-Spiegels (BROCKMAN et al. 1975). Es kommt zu einer Hemmung des Glycogenabbaus und zu einer Stimulierung der Glycogensynthese (LÖFFLER u. PETRIDES 2003).

(29)

Eine physiologische Hyperinsulinämie führt durch Insulin-Rezeptorsubstrat-1 (IRS-1) zur vermehrten Bildung von Stickoxid (NO) und somit zu einer peripheren Vasodilatation (MONTAGNANI et al. 2002); die Glucoseverfügbarkeit in der Peripherie wird so beeinflusst (LI et al. 2005). Die Proteinsynthese im Muskel wird durch die Steigerung des Aminosäuretransports in die Muskelzellen erhöht (WEEKES 1991).

Weiterhin fungiert Insulin als wichtigster Suppressor der Ketogenese, während Glucagon die Ketogenese stimuliert (FERNANDEZ-FIGARES et al. 2004). Ferner scheint Insulin zentral als Sättigungssignal zu wirken – hohe Plasma- Insulinkonzentrationen waren mit einer verringerten Trockensubstanzaufnahme von Kühen korreliert (BRADFORD u. ALLEN 2007).

Mittelfristige Insulinwirkungen

Die Stimulierung der Glycolyse kann auch über die Induktion der Glucokinase und Pyruvatkinase erfolgen. Genauso wird die Gluconeogenese über längere Zeit durch Suppression der Pyruvat-Carboxykinase gehemmt (LÖFFLER u. PETRIDES 2003).

Insulin stimuliert über längere Zeit über den mTOR pathway die Proteinbiosynthese.

Langfristige Insulinwirkungen

Aufgrund ähnlicher intrazellulärer Signalwege von Insulin und IGF-1 (IRS-1) sind deren Wirkungen eng verknüpft (LÖFFLER u. PETRIDES 2003).

Als Wachstumshormon hat Insulin proliferative und mitogene Effekte über einen weiteren Signalweg des Insulinrezeptors. Über Ras, Raf und mitogen-activated Proteinkinasen Erk 1 und 2 hat die Insulinstimulation der Zelle Einfluss auf die Regulation der Genexpression. Bei bestehender Insulinresistenz, z. B. bei einer Diabetes-Erkrankung, führt die Inhibition des metabolischen Signalweges zu einer erhöhten mitogenen Aktivität des Insulins in Endothelzellen (MONTAGNANI 2002a) und übt somit eine atherogene Wirkung aus.

(30)

2.2.1.9. Insulinabbau

Der Abbau des zirkulierenden Insulins erfolgt bei einer Serum-Halbwertzeit von 10- 15 Minuten durch das in der Leber lokalisierte Insulin-degrading-enzyme (LÖFFLER u. PETRIDES 2003). Im Einzelnen betragen die Halbwertzeiten für Insulin bei Schafen 18 min, bei Ponies 20 min, bei Schweinen 10 min und bei Kamelen 36 min (KASKE et al. 2001). Nach Internalisierung der Insulin-Rezeptor-Komplexe werden die Disulfidbrücken durch die Glutathion-Insulin-Transhydrogenase gespalten, danach erfolgt der proteolytische Abbau der Peptidketten (LÖFFLER u. PETRIDES 2003).

2.3 Insulinresistenz

Eine Insulinresistenz wird definiert als Stoffwechselsituation, bei der eine physiologische Insulinkonzentration eine subnormale biologische Antwort induziert (KAHN 1978, RIZZA et al. 1981). Die Insulinresistenz basiert auf einer verminderten Insulin-Sensitivität und/oder Insulin-Response.

Bei einer verminderten Insulin-Sensitivität sind höhere Insulinmengen erforderlich, um einen halbmaximalen biologischen Effekt (Km) zu erzielen. Die maximale biologische Antwort kann im Vergleich zu Kontrolltieren erreicht werden. Typische Beispiele für Zustände mit verminderter Insulin-Sensitivität sind Adipositas, nicht- Insulin-abhängiger-Diabetes mellitus (NIDDM) und Glucocorticoidtherapie (KAHN 1978, RIZZA et al. 1981, BERGMAN et al. 1989, BLOCK u. BUSE 1989).

Ein verminderter Insulin-Response ist charakterisiert durch einen verminderten maximalen biologischen Effekt des Insulins, der Km-Wert bleibt unverändert. Bei diesen Individuen ist die periphere Glucoseaufnahme unabhängig von der Insulinkonzentration geringer als bei gesunden Kontrollindividuen (RIZZA et al.

1981). Beispiele für Folgen des verminderten Insulin-Response sind Hypertension,

(31)

Dyslipidämie und atherosklerotische cardiovasculäre Erkrankungen (DE FRONZO u.

FERRANNINI 1991). Die Dosis-Wirkungsbeziehungs-Kurve veranschaulicht Änderungen in Sensitivität oder Response (Abb. 2).

Grundsätzlich kann eine Insulinresistenz auf verschiedenen Ursachen beruhen:

Prärezeptor-Ebene: verminderte Ansprechbarkeit der B-Zellen des Pancreas Rezeptor-Ebene: verminderte Rezeptorendichte bzw. -affinität

Postrezeptor-Ebene: Störungen der intrazellulären Signalübertragung nach Bindung von Insulin am Rezeptor (VERNON u. SASAKI 1991).

Als Anlass einer verminderten Insulin-Sensitivität wird ein Defekt auf Rezeptor-Ebene gesehen. Ursachen hierfür liegen in einer verminderten Rezeptorendichte in den Zielgeweben, in einer geringeren Affinität des Rezeptors für Insulin, in einer verminderten Insulin-stimulierten Rezeptor-Autophosphorylierung oder in einer verminderten Aktivität der Rezeptor-gebundenen Tyrosinkinase (ARNER et al. 1986).

Ein verminderter Insulin-Response scheint primär auf Defekten auf Postrezeptor- Ebene zu beruhen (KAHN 1978, SASAKI u. WATANABE 1990). Ursachen hierfür können Störungen der komplexen intrazellulären Signaltransduktion nach Bindung des Insulins an den Rezeptor oder eine Depletion des GLUT-4 sein (BERGER et al.

1989, SASAKI 1990).

Die biologische Potenz von Insulin variiert mit dem Lebensalter, dem Ernährungszustand und dem Reproduktionsstatus; sie unterliegt außerdem einer circadianen Rhythmik. Die Höhe der Insulinkonzentration im Blut ist somit kein optimaler Parameter zur Einschätzung der Insulinwirkung (VEITINGER 1983). Die nähere Charakterisierung einer Insulinresistenz bezüglich Sensitivität und Response kann mittels hyperinsulinämischer euglycämischer Clamp (HIEC)-Untersuchungen erfolgen.

(32)

Abb. 2: Formen der Insulinresistenz (RIZZA et al. 1981): bei einer verminderten Insulin-Sensitivität sind höhere Insulinmengen erforderlich, um einen halbmaximalen biologischen Effekt (Km) zu erzielen. Die maximale biologische Antwort kann erreicht werden. Ein verminderter Insulin- Response ist charakterisiert durch einen verminderten maximalen biologischen Effekt des Insulins, der Km-Wert bleibt unverändert.

2.3.1. Insulinresistenz der Wiederkäuer 2.3.1.1. Speziesunterschiede

Wiederkäuer gelten physiologisch als Insulin-resistenter verglichen mit monogastrischen Spezies; dies entspricht einer phylogenetischen Adaptation resultierend aus der Ernährungsstrategie der Wiederkäuer (ELMAHDI et al. 1997, KASKE et al. 2001).

Km

(33)

Während eines hyperinsulinämischen euglycämischen Clamps wiesen niedrigere Glucoseumsatzraten bei Wiederkäuern (ROSE u. OBARA 1996, KASKE et al. 2001) verglichen mit Menschen (RIZZA et al. 1981) und Schweinen (CHANDRASENA et al.

1984) auf einen verminderten Insulin-Response hin. Ponies und Kamele erwiesen sich als Insulin-resistenter als Schafe, vor allem verursacht durch einen niedrigen peripheren Insulin-Response (KASKE et al. 2001). Ergebnisse hinsichtlich der Insulin-Sensitivität fielen unterschiedlich aus. WEEKES (1991) präsentierte eine ähnliche Sensitivität des Schafes im Vergleich zum Menschen mit halbmaximaler steady-state Glucose-Infusionsrate (SSGIR) bei einer Insulinkonzentration von 50 µU/l. JANES et al. (1985) wiesen eine deutlich niedrigere Insulin-Sensitivität der Schafe nach, die sich auf eine halbmaximale SSGIR bei einer Insulinkonzentration von 100 µU/l bezieht.

2.3.1.2 Einfluss des Alters auf die Insulinresistenz

Bei Lämmern ist der Insulin-Response der Leber sowie der periphere Insulin- Response und -Sensitivität größer als bei adulten Tieren. Bei Lämmern im Alter von 7 Tagen wurden während hyperinsulinämischer euglycämischer Clamps (HIEC: 100 mU/kg/min Insulin-Infusion) Glucose-Infusionsraten von 89 µmol/kg/min gemessen.

Diese sanken bei 35 Tage alten Lämmern bei gleichem experimentellen Ansatz auf 24 µmol/kg/min. Die endogene Glucoseproduktion im HIEC wurde bei den jungen Lämmern um 53 % vermindert, bei den älteren Tieren nur noch um 38 % (GELARDI et al. 1999).

Ab einem Alter von fünf Monaten änderte sich der periphere Insulin-Response der Lämmer nicht mehr. Bei neun Monate alten Tieren waren höhere Insulinkonzentrationen erforderlich, um den halbmaximalen Effekt zu erreichen (Km).

Die Insulin-Sensitivität war bei fünf Monate alten Lämmern somit noch höher als bei neun Monate alten Tieren (SANO et al. 1996).

(34)

2.3.1.3 Einfluss der Fütterung auf die Insulinresistenz

Die Glucose- und Insulinkonzentrationen werden beim Wiederkäuer ebenso wie beim Monogastrier durch die Fütterung beeinflusst. Häufiges Füttern erhöhte bei Schafen die mittlere Insulinkonzentration eines Tages (MINEO et al. 1990). Eine Mangelernährung reduzierte die basale Glucoseeintrittsrate in die Zellen und die Insulin-abhängige Glucoseutilisation; die endogene Glucoseproduktion war erhöht (PETTERSON et al. 1993). Eine kraftfutterreiche Ration erhöhte bei Wiederkäuern den peripheren Insulin-Response, verglichen mit Cellulose-reich gefütterten Tieren (SANO et al. 1992). Die Fütterung von Heu bzw. eine Fütterung auf Maisbasis beeinflusste nicht den Insulineffekt auf die periphere Glucoseutilisation und endogene Glucoseproduktion (JANES et al. 1985).

Im Kälberalter scheint die Art der Fütterung die Entwicklung einer Insulinresistenz zu beeinflussen. Mastkälber, die ab der fünften Lebenswoche intensiv mit Milchaustauscher gefüttert wurden (Lebendmasse-Zunahmen um 1,4 kg/d), wiesen im HIEC mit 161 kg eine steady-state Glucose-Infusionsrate (SSGIR) von 26 µmol/kg/min auf (HOSTETTLER-ALLEN et al. 1994), die vergleichbar war mit der adulter Schafe (JANES et al. 1985). Sie erwiesen sich als Insulin-resistenter als eine Woche alte Lämmer (GELARDI et al. 1999) und zeigten eine halb so hohe SSGIR wie Menschen (DE FRONZO et al. 1979). Demgegenüber wiesen Ratten eine 70 % höhere SSGIR auf als die der Mastkälber (FARRELL et al. 1988).

Eine ausschließliche Milchfütterung bei Mastkälbern induzierte im Alter von 16 Wochen eine schwere Insulinresistenz verglichen mit Kälbern, die mit sechs Wochen abgetränkt und mit Heu gefüttert wurden (PALMQUIST et al. 1992). Auch HUGI et al.

(1998) fütterten Mastkälber von 70 bis 190 kg Lebendmasse intensiv (1,4 kg Lebendmasse-Zunahmen/d) mit einem lactosereichen Milchaustauscher. Es wurden HIEC (1,15 mU/kg/min Insulin-Infusion) am Anfang und am Ende dieser Periode durchgeführt. Diese ergaben, dass die SSGIR von anfangs 33 µmol/kg/min (mit 70 kg Lebendmasse) auf 19 µmol/kg/min mit 190 kg Lebendmasse bei den intensiv gefütterten Kälbern abnahm. Die Entwicklung einer peripheren Insulinresistenz

(35)

schien dabei auf einer geringeren Anzahl an Insulin-Rezeptoren im Muskelgewebe zu basieren (HUGI et al. 1998).

Bei Aufzuchtkälbern, die wiederkäuergerecht ausreichend Grundfutter erhielten, sanken dagegen die Glucose- und Insulinkonzentrationen mit zunehmendem Alter (FAHEY u. BERGER 1988). Sie sind demnach Insulin-sensitiver als die intensiv gefütterten Mastkälber.

2.3.1.4 Einfluss hormoneller und metabolischer Konstellationen auf die Insulinresistenz

Beim gesunden adulten Wiederkäuern ändert sich der Insulinstatus in Abhängigkeit vom Reproduktionsstatus im Sinne einer homöorhetischen Anpassung. Während der Trächtigkeit ist der periphere Insulin-Response relativ niedrig (KRÄFT 2004), während die uterine Glucoseaufnahme und -utilisation nicht verändert sind und nicht durch Änderungen der maternalen Insulinkonzentration beeinflusst werden (HAY et al. 1988). Entsprechend der hohen metabolischen Priorität des Fetus (HOLTENIUS et al. 2003) wird so ein ausreichender Transfer von Glucose zum Fetus gewährleistet.

Bei gesunden Kühen ist in den ersten Laktationswochen eine höhere Ansprechbarkeit peripherer Gewebe auf Insulin nachweisbar, verglichen mit Untersuchungen während der späten Trächtigkeit (KRÄFT 2004). Niedrige Insulin- und hohe Somatostatin- bzw. Glucagonkonzentrationen führen zu einer Maximierung der hepatischen Gluconeogenese und erleichtern die Bereitstellung von Energie durch Lipomobilisation. Das Euter ist demgegenüber mangels Rezeptoren Insulin- resistent. Diese kritische Phase der negativen Energiebilanz wird so durch die Mehrzahl der Kühe im Rahmen einer adaptativen Reaktion des Endokrinums überwunden (HERDT 2000).

(36)

Eine überschießende Lipomobilisation dagegen induziert durch die drastisch erhöhte Konzentration der nicht-veresterten Fettsäuren (NEFA) eine Hemmung der GLUT-4- Translokation und somit auch eine verminderte Glucoseaufnahme in periphere Gewebe (BODEN 1994). Nach KRÄFT (2004) ist bei leberverfetteten Kühen der maximale Glucoseumsatz umso niedriger, je höher die basale NEFA-Konzentration ist. Demnach scheinen die hohen NEFA-Konzentrationen die Ursache der Insulinresistenz zu sein. Kühe, die an Leberverfettung und Ketose leiden, zeigten niedrige basale Insulinspiegel, die mit einem niedrigen Insulin-Response und einer hohen Insulin-Sensitivität korrelierten. Die hohe Konzentration an Ketonkörpern scheint einen zusätzlichen negativen Effekt auf die Insulinresistenz zu haben (Abb.

3). Der verminderte Insulin-Response der leberverfetteten, ketotischen Kühen geht trotz hoher Insulin-Sensitivität mit einem ausgeprägten Energiemangel extrahepatischer Gewebe einher (KRÄFT 2004).

(37)

Abb. 3: Dosis-Wirkungskurven: die fünf Punkte jeder Kurve zeigen die Mittelwerte(± SD) der steady-state Plasma-Insulinkonzentrationen und die jeweils zur Aufrechterhaltung der basalen Glucosekonzentrationen erforderlichen steady-state Glucoseinfusionsraten für fünf aufeinander folgende Insulin-Infusionsperioden eines HIEC mit steigenden Konzentrationen (0,1; 0,5; 2; 5; 10 mU/kg/min). Die grüne Kurve repräsentiert die Dosis-Wirkungsbeziehung gesunder laktierender Kühe, die gelbe Kurve die von an Fettleber erkrankten Kühen und die rote Kurve zeigt die Dosis- Wirkungsbeziehung von an Fettleber und Ketose erkrankten Kühen (KRÄFT 2004). Es ergibt sich eine ausgeprägte Insulinresistenz der an Ketose leidenden Kühe.

Steady-state Insulin-Konzentration [ µU / ml ]

0 200 400 600 800 1000

Steady-state Glucose-Infusionsrate [ µmol / kg / min ]

0 5 10 15 20 25 30 35

40 Klinisch gesund,

laktierend

Fettleber Fettleber und Ketose

(38)

Kurz- und langfristige Stress- und/oder Schmerzsituationen wirken sich auch auf die Insulinwirkung aus. Adrenalin induziert die Sekretion von Glucagon und hemmt die Sekretion von Insulin (CRYER 1993). Es antagonisiert die Wirkung von Insulin, indem es die Glucoseaufnahme in den Muskel reduziert. Schließlich stimuliert Adrenalin kurzfristig die Lipolyse im Fettgewebe (CAPALDO et al. 1992), und zwar insbesondere bei körperlicher Anstrengung und Kältestress (PETHICK u. DUNSHEA 1993). Anhaltend hohe Glucocorticoidspiegel bei langfristigem Stress führen zu einer Insulinresistenz, die sich in einer verminderten Glucosetoleranz und einer reduzierten Insulin-Sensitivität manifestiert (HARBER u. WEINSTEIN 1992). Die Proteolyse, die Aufnahme von Aminosäuren in die Leber und die hepatische Gluconeogenese werden durch Glucocorticoide gefördert (EXTON et al. 1976).

2.3.1.5 Einfluss des Ernährungszustandes auf die Insulinresistenz

Der Zusammenhang zwischen Adipositas und einer Insulinresistenz ist bei Menschen und Labornagern lange bekannt (DE FRONZO 1982). Die periphere Insulinresistenz wird Typ-2 Diabetes genannt und ist eine weit verbreitete Erkrankung bei Menschen aller Industrienationen und während der letzten Jahre auch der Schwellenländer. Der Typ-2 Diabetes tritt bei immer jüngeren Menschen auf. Es wurde ein Zusammenhang festgestellt zwischen reichlicher bis übermäßiger Ernährung mit mangelnder Bewegung und der frühzeitigen Erkrankung an Typ-2 Diabetes (CHAN et al. 1994, CAPRIO et al. 1996, LINDSAY et al. 2000, KOHN u.

BOOTH 2003, PFEIFFER 2003). Diese Insulinresistenz führt zur chronischen Hyperglycämie, die wiederum durch Bildung von Sauerstoffradikalen chronischen oxidativen Stress für alle Gewebe bedeutet. Die B-Zelle ist für diesen oxidativen Stress ein Primärziel, da sie, verglichen mit anderen Geweben, die geringste Aktivität antioxidativer Enzyme aufweist. Dieser Effekt hoher Glucosekonzentrationen wird Glucosetoxizität genannt und löst eine verminderte Insulin-Genexpression einhergehend mit einem geringeren Insulingehalt der B-Zellen aus (ROBERTSON et al. 2006). Heute wird Obesitas als chronischer, subakuter systemischer Entzündungszustand angesehen, der wiederum bei der Pathogenese der

(39)

Insulinresistenz und Typ-2 Diabetes mellitus eine Rolle spielt (SHOELSON et al.

2007).

Kühe, die an Leberverfettung und Ketose leiden, und einen body condition score (BCS) von 3,4 aufweisen, haben den geringsten Insulin-Response verglichen mit trockenstehenden bzw. laktierenden gesunden und laktierenden leberverfetteten Tieren (KRÄFT 2004). Ursache können die hohen NEFA-Konzentrationen der ketotischen Kühe sein, da die NEFA´s die Insulin-stimulierte Glucoseaufnahme hemmen (BODEN et al. 1991, KRÄFT 2004).

2.3.1.6 Molekulare Mechanismen der Insulinresistenz

Viele Untersuchungen zeigen, dass die Auslöser für eine Insulinresistenz auf Postrezeptor-Ebene liegen können (KOLTERMAN et al. 1980, MARSHAL u.

OLEFSKY 1981, HARING 1991). Es werden verschiedene Mechanismen diskutiert.

Zum einen kann eine Serin-Phosphorylierung der Insulinrezeptor-Substrate (IRS) die Fähigkeit der IRS, an die PI3-Kinase zu binden, reduzieren. Es resultiert eine verringerte Aktivierung der Signalkaskade (AGUIRRE et al. 2002). Diese pathophysiologische Serin-Phosphorylierung kann als Antwort auf verschiedene Umstände wie Obesitas, Hyperinsulinämie, erhöhte Konzentrationen an NEFA, Stress oder Entzündung erfolgen (PENDE et al. 2000, HIROSUMI et al. 2002).

Weiterhin kann eine Mitochondrien-Dysfunktion oder ein reduzierter Mitochondriengehalt der Zellen in Verbindung mit einer reduzierten Fettsäureoxidation und Akkumulation von Acyl-CoA und Diacylglycerol eine Insulinresistenz induzieren (LOWELL u. SHULMAN 2005). Auch eine Dysbalance zwischen den Anteilen der PI3-Kinase-Untereinheiten verursacht eine Insulinresistenz (UEKI 2002). Dabei sind erhöhte Anteile von 85p zum Verhältnis 85p:PI3-Kinase die molekulare Ursache. Auslösend wirken zum Beispiel Obesitas, Typ-2 Diabetes mellitus oder Steroide in erhöhten Konzentrationen (BANDYOPADHYAY 2005).

(40)

2.4 Metabolische Programmierung

2.4.1 Definition

Metabolische Programmierung („metabolic programming“) ist definiert als eine langfristige Beeinflussung metabolisch-endokrinologischer Leitparameter durch einen kurzfristigen intrauterinen und/oder postnatalen nutritiven Stimulus (LUCAS 1991).

2.4.2 Geschichtlicher Hintergrund

Jean Baptiste Lamarck erkannte 1809 als allgemeines Prinzip der Evolution die Fähigkeit von Organismen, sich durch Adaptation oder Variation von Merkmalen der Umwelt anzupassen. Er schlug eine Erklärung vor, die sich „inheritance of acquired characters“ nennt (SULLIVAN u. BAROSS 2006).

Über 150 Jahre später wurden dezidiertere Studien hinsichtlich der Auswirkungen der neonatalen Ernährung auf den heranwachsenden Organismus durchgeführt. So beschrieben 1979 FREINKEL und METZGER das Konzept der “fuel-mediated teratogenesis”. Sie zeigten lang anhaltende negative Einflüsse auf den Organismus, die auf die intrauterine Entwicklung des Fetus in einem diabetischen Muttertier zurückzuführen waren (FREINKEL 1980). Im gleichen Jahr bewiesen AERTS und VAN ASSCHE (1979) die Übertragung eines Gestationsdiabetes bei Ratten auf die weiblichen Nachkommen. Einige Jahre zuvor postulierte bereits DÖRNER (1975) ein generelles ätiologisches Konzept der „epigenetischen“ perinatalen „Programmierung“

von lebenslangen Funktionen der regulatorischen Systeme. Er demonstrierte in klinischen und experimentellen Studien, dass insbesondere Hormone umweltabhängige Organisatoren des neuroendocrinen Systems sind, die schlussendlich alle Prozesse des Lebens regeln. Er ging davon aus, dass vor allem unphysiologische Konzentrationen von Hormonen in kritischen Entwicklungsphasen zu einer lebenslangen Fehlprogrammierung fundamentaler Regelsysteme führen können (DÖRNER 1975).

(41)

Fünfzehn Jahre später stellte LUCAS folgende Definition der metabolischen Programmierung auf: “a stimulus or insult at a critical period of development has lasting or lifelong significance” (LUCAS 1991).

Schließlich postulierten HALES und BARKER (1992) einen Zusammenhang zwischen dem Geburtsgewicht von Babies und dem Risiko dieser Individuen, später am metabolischen Syndrom zu erkranken. So war in einer Studie in Großbritannien bei einem Geburtsgewicht von unter 2,95 kg das Risiko über zehnmal höher, einhergehend mit einer Insulinresistenz, im späteren Leben an Obesitas, Typ-2- Diabetes, Bluthochdruck oder coronaren Herzleiden zu erkranken (HALES u.

BARKER 1992). Die hieraus abgeleitete „thrifty phenotype hypothesis“ basiert auf epidemiologischen Untersuchungen an Männern aus England (BARKER et al. 1993).

Die Hypothese besagt, dass eine ungünstige intrauterine Versorgung die fetale hormonelle und metabolische Konstellation beeinflusst und in einem geringen Geburtsgewicht resultiert. Die Adaptationsreaktionen erleichtern das fetale Überleben bei einer vergleichbar schlechten, postnatalen Ernährungssituation. Wenn postnatal jedoch eine überreichliche Ernährungssituation eintritt, so ist die Wahrscheinlichkeit für metabolische Entgleisungen drastisch erhöht (HOLNESS et al. 2000).

Als teleologische Erklärung der metabolischen Programmierung wird darauf hingewiesen, dass in der Frühgeschichte Jäger und Sammler meist intermittierend und nur selten ausreichend Nahrung aufnahmen. Ein Fetus war dadurch häufig einer Mangelernährung ausgesetzt. Die resultierende metabolische Programmierung führte zur Anpassung an einen Hungerstatus. Das ganze Leben lang würde ein entsprechend programmierter Organismus in Phasen von ausreichender Verfügbarkeit so schnell und so viel wie möglich an Energie speichern (HALES 2000, HALES u. OZANNE 2003). In der heutigen Ernährungssituation westlicher Länder, in der hochwertige Nahrung im Überfluss verfügbar ist, kann diese Programmierung jedoch Auslöser für metabolische Entgleisungen sein. Entsprechend der „predictive adaptive response hypothesis“ gilt der Grad der Diskrepanz zwischen der prä- und

(42)

postnatalen Versorgungslage als wichtige Determinante für die nachfolgende Disposition für metabolische Erkrankungen (GLUCKMAN u. HANSON 2006).

2.4.3 Epidemiologische Studien zur metabolischen Programmierung 2.4.3.1 Maternaler Diabetes

Anlass für genauere Untersuchungen war die hohe Prävalenz von Typ-2 Diabetes bei den weiblichen Nachkommen in Familien. Diese lag zwei bis drei Mal höher als die der paternalen Seite (DÖRNER et al. 1975, DÖRNER et al. 1987). Ein teratogenes maternofetales Imprinting der Typ-2 Diabetes Prädisposition wurde vermutet, welches wahrscheinlich durch erhöhte Insulinkonzentrationen während der Schwangerschaft ausgelöst wurde (DÖRNER u. PLAGEMANN 1994). Spätere Untersuchungen bestätigten ein erhöhtes Risiko für Kinder diabetischer Mütter, später an Adipositas, verminderter Glucosetoleranz und Typ-2 Diabetes zu erkranken (PLAGEMANN et al. 1997, HOLEMANS et al. 2003, PLAGEMANN 2003).

Weiterführende Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass erhöhte Insulinkonzentrationen im fetalen und perinatalen Leben pathognomonisch bei Kindern von Müttern sind, die während der Schwangerschaft an Diabetes (Typ-1, Typ-2, Gestationsdiabetes) leiden (DÖRNER u. PLAGEMANN 1994, PLAGEMANN 2005a). Perinatal erhöhte Insulinkonzentrationen traten dabei unabhängig vom Geburtsgewicht auf (HARDER et al. 2001). Der perinatale Einfluss der maternalen Hyperinsulinämie auf den Fetus wurde somit als entscheidend für das Risiko einer Erkrankung an Diabetes-Typ-2 der Nachkommen im späteren Alter angesehen.

2.4.3.2 Pränatale Unterernährung

Es ergibt sich aus der Kombination von geringem Geburtsgewicht und schnellem Wachstum in frühen Lebensjahren ein besonderes Risiko, an Diabetes-Typ-2 zu erkranken (DABELEA et al. 1999, FORSEN et al. 2000, ONG et al. 2004, OZANNE et al. 2005).

(43)

Die metabolische Programmierung bei intrauteriner Wachstumsretardierung beruht offenbar auf epigenetischen Mechanismen (DNA-Methylierung und Histonmodifikation). Konsequenzen sind eine gestörte Vascularisation und Innervation der Langerhans-Inseln, welche zu einer verringerten B-Zellfunktion führt (HALES u. BARKER 1992). Weitere Studien zeigten eine verminderte Größe der fetalen Langerhans-Inseln und eine geringere Anzahl an pancreatischen B-Zellen verglichen mit Kontrollindividuen (HOLEMANS et al. 2003). OZANNE et al. (2005) zeigten bei 20-jährigen Männern, die zur Geburt untergewichtig (≤ 2,7 kg) waren, eine verminderte Expression von spezifischen Insulinsignal-Proteinen (Proteinkinase C, p85α, p110β und GLUT-4). Hyperinsulinämische euglycämische Clamps bei 25- Jährigen, die einer intrauterinen Wachstumsretardierung unterlagen, zeigten eine verminderte insulinstimulierte Glucoseaufnahme des peripheren Gewebes. Die insulinstimulierte Suppression der Lipolyse korrelierte signifikant mit der peripheren Glucoseaufnahme (JAQUET et al. 2000). Diese Veränderungen gehen einer verminderten Glucosetoleranz voraus.

2.4.4 Experimentelle Studien zur metabolischen Programmierung

Um die Ergebnisse epidemiologischer Studien genauer zu untersuchen, wurden verschiedene experimentelle Studienansätze überwiegend mit Labornagern durchgeführt.

2.4.4.1 Intrauterine Programmierung bei Labornagern 2.4.4.1.1 Diabetes bei Labornagern

Eine erhöhte Insulinkonzentration im Fetus während kritischer Phasen der neuronalen Entwicklung – insbesondere des Hypothalamus – kann durch verschiedene experimentelle Modelle herbeigeführt werden. Zum einen kann Streptozotocin, ein B-Zell-Toxin, am Tag der Konzeption den Muttertieren verabreicht werden (PLAGEMANN et al. 1999a). Eine postnatale Hyperinsulinämie wird auch

(44)

induziert durch Applikation eines Langzeitinsulins direkt in den Hypothalamus neugeborener Ratten (PLAGEMANN et al. 1992a). Die früh erfahrene Hyperinsulinämie führte bei den Nachkommen zu einer Fehlprogrammierung zentralnervöser Regulatoren für Körpergewicht und Metabolismus im Hypothalamus.

Dies ist möglich, da das selbstlimitierende Transportsystem der Blut-Hirn-Schranke für Insulin im perinatalen Zeitraum noch nicht vollständig ausdifferenziert ist.

Versuche an Ratten zeigten, dass eine perinatal erfahrene Hyperinsulinämie „erlernt“

ist und dadurch eine basale Hyperinsulinämie lebenslang bestehen bleibt (DÖRNER u. PLAGEMANN 1994). Außerdem wurde eine Unterentwicklung des Sättigungszentrums im ventromedialen Nucleus des Hypothalamus (VMH) festgestellt (DÖRNER et al. 1988, DÖRNER u. PLAGEMANN 1994, PLAGEMANN et al. 1999a). Es bestand eine Resistenz gegenüber den Sättigungssignalen Insulin und Leptin (PLAGEMANN 2003). Überdies induzierte eine perinatale Hyperinsulinämie bei Ratten eine erhöhte Anzahl an Neuronen positiv für Neuropeptid Y (NPY), Galanin und Agouti-related Protein, die alle die Futteraufnahme stimulieren.

Neurone, die anorektische Neurotransmitter bilden, wie MSH ( -melanocyte stimulating hormone) und Proopiomelanocortin (POMC), waren demgegenüber verglichen mit Kontrolltieren weniger im VMH nachweisbar (FAHRENKROG et al.

2004). Solche Ratten wurden adipös, zeigten eine ausgeprägte verminderte Glucosetoleranz, eine erhöhte tägliche Futteraufnahme und eine lebenslang persistierende, basale Hyperinsulinämie (PLAGEMANN et al. 1992a, PLAGEMANN et al. 1992b).

Hervorzuheben ist, dass die aus der maternalen Programmierung resultierende verminderte Glucosetoleranz, Hyperinsulinämie und Hypoplasie des VMH bei Ratten epigenetisch bis in die dritte Folgegeneration auf der maternalen Seite weitergegeben wurde (VAN ASSCHE u. AERTS 1985, DÖRNER et al. 1988, DÖRNER u. PLAGEMANN 1994).

(45)

2.4.4.1.2 Maternale Proteinrestriktion

Bei drei Wochen alten Rattenwelpen von Muttertieren, die während der Trächtigkeit proteinarm gefüttert wurden, war der Insulingehalt der B-Zellen um 50 % niedriger als bei Vergleichstieren; zudem war die Durchblutung der Langerhans-Inseln geringer und der Insulin-like Growth-factor 2 (IGF-2) wurde im endocrinen Pancreas weniger exprimiert (PETRIK et al. 1999). Die IGF-2 Expression schützt die Zellen vor Apoptose; entsprechend geht die verminderte IGF-2-Expression mit einer erhöhten Apoptoserate einher (HOLEMANS et al. 2003).

Eine maternale Proteinrestriktion induzierte bei Rattenwelpen eine verminderte suppressive Wirkung des Insulins auf die catecholaminstimulierte Lipolyse im Fettgewebe. Es resultierte eine massive Freisetzung von Fettsäuren (HALES 2000, HALES u. BARKER 2001, HALES u. OZANNE 2003), die wiederum den peripheren Insulin-Response durch Hemmung der Glucosetransporter reduziert (PFEIFFER 2003, STANNARD u. JOHNSON 2004).

Durch eine maternale proteinarme Fütterung kam es bei den Rattenwelpen im juvenilen Alter zunächst zur vermehrten Expression von Insulinrezeptoren (SHEPHERD et al. 1997, HALES 2000, HOLNESS et al. 2000, HALES u. OZANNE 2003), GLUT-4 (HOLNESS et al. 2000) und niedrigen Insulinkonzentrationen und somit zu einer erhöhten Insulin-Sensitivität (HALES u. OZANNE 2003). Mit 15 Monaten zeigten sich eine beeinträchtigte Glucosetoleranz und mit 17 Monaten eine Insulinresistenz (HALES u. OZANNE 2003). Bei reichlicher Fütterung sank mit zunehmendem Alter die Aktivität der Insulin-Signaltransduktionsmoleküle in der Muskulatur und teilweise auch im Fettgewebe, woraus sich eine verminderte Glucoseaufnahme der Zellen ergab. In der Folgezeit entwickelte sich eine periphere Insulinresistenz (FERNANDEZ-TWINN et al. 2005, OZANNE et al. 2005).

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Tab. 1: Auswirkungen der maternalen Proteinrestriktion bei jungen und adulten Ratten (OZANNE et al. 1996, OZANNE et al. 1998, OZANNE et al.

2003, FERNANDEZ-TWINN et al. 2005);

PKC – Proteinkinase C, PI-3-Kinase – Phosphatidylinositol-3-Kinase

6 Wochen–

3 Monate alte Ratten

15 Monate alte männliche Ratten

21 Monate alte weibliche Ratten Insulin-Rezeptoren Anzahl

GLUT-4 Expression Lipolyse

Glucose-Toleranz Insulin-Konzentration nüchtern

Insulin-Konzentration nach Glucose-Load PKC- und PI-3-Kinase Aktivität

>>> Insulin- Sensitivität

>>> Insulin- Resistenz

2.4.4.2 Postnatale Programmierung bei Labornagern

Der Einfluss der postnatalen Ernährung auf die metabolische Programmierung wurde bislang nicht so intensiv untersucht wie der Einfluss des intrauterinen Milieus. Dafür dürfte der sehr viel höhere experimentelle Aufwand ausschlaggebend sein.

2.4.4.2.1 Wurfgrößenverkleinerung bei Labornagern

Eine postnatale Überernährung von Rattenwelpen während der Säugeperiode von drei Wochen kann durch eine Wurfgrößenverkleinerung auf z. B. drei Welpen pro

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laktierender Ratte erreicht werden. Diese Überernährung führte zu einer frühen postnatalen Hyperinsulinämie und Hyperleptinämie, gefolgt von Hyperphagie und Obesitas (BOULLU-CIOCCA et al. 2005). Obwohl nach dem Absetzen eine Kontrolldiät verfüttert wurde, blieben diese Veränderungen das gesamte Leben lang bestehen. MILLER und PARSONAGE demonstrierten schon 1972 eine strenge inverse Korrelation zwischen dem Fettgehalt des adulten Körpers und der Anzahl der Rattenwelpen pro Wurf. Es wurde keine oder nur eine geringe Abweichung der Glucosetoleranz vom physiologischen Niveau beobachtet (YOU et al. 1990). Im Gegensatz dazu fanden PLAGEMANN et al. (1999b) bei diesen Ratten zusätzlich zu der Hyperinsulinämie, Übergewicht und Hyperphagie auch eine verminderte Glucosetoleranz und Hyperleptinämie. VELKOSKA et al. (2005) fanden in vergleichbaren Experimenten neben der Hyperleptinämie und erhöhtem Körpergewicht eine Normoinsulinämie und bestätigten die erhöhte Fettmasse des Organismus sowie eine erhöhte Anzahl an Fettzellen. Es wurden erhöhte intrahypothalamische Insulinkonzentrationen während des frühen postnatalen Lebens nachgewiesen (PLAGEMANN et al. 1999c), sowie eine erhöhte Anzahl von NPY-positiven Neuronen im Hypothalamus (PLAGEMANN et al. 1999d). Auch diese Ratten waren im adulten Alter resistent gegenüber Insulin und Leptin (DAVIDOWA u.

PLAGEMANN 2000).

2.4.4.2.2 Wurfgrößenvergrößerung bei Labornagern

Wurde der Rattenwurf vergrößert auf z. B. 12 Welpen pro Muttertier, nahmen die Welpen bis zum Absetzen unterdurchschnittlich zu. Nach Fütterung der Kontrolldiät zeigten diese Tiere im späteren Leben weder Übergewicht noch Hyperinsulinämie oder eine verminderte Glucosetoleranz (DÖRNER u. PLAGEMANN 1994). Die Tiere entwickelten eine Hypoleptinämie und eine mit Kontrolltieren vergleichbare Stimulierung des NPY-Systems (PLAGEMANN et al. 1999d).