der Medizinischen Hochschule Hannover (Direktor: Prof. Dr. med. R. Dengler)
Einfluss von Pentobarbital und Brilliantsäuregrün (E142) auf das reaktionskinetische Verhalten von Glutamat-Rezeptor-Ionenkanälen vom AMPA- und
Kainat-Typ
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Wolf E. Heineke aus Hannover
Hannover 2006
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Rektor: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. Johannes Bufler
Referent: Prof. `in Dr. Ursula Seidler Korreferent: PD Dr. Dirk Stichtenoth
Tag der mündlichen Prüfung: 9.01.2007
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Klaus Dieter Jürgens Prof. Dr. Sigurd Lenzen
Prof. Dr. Brinker
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 4
1.1 Einführung 4
1.2 Elektrophysiologische und molekularbiologische Eigenschaften
von Kainat-Rezeptoren 7
1.3 Elektrophysiologische und molekularbiologische Eigenschaften
von AMPA-Rezeptoren 13
1.4 Brilliantsäuregrün (E142) 19
1.5 Pentobarbital 20
1.6 Pharmakologische Auswirkungen auf AMPA- und Kainat-Rezeptoren 22
1.7 Problemstellung 25
2 Material und Methoden 27
2.1 Transiente Expression und Zellkultivierung 27
2.2 Transfektion 27
2.3 Lösungen 29
2.4 Die Patch-Clamp-Technik 31
2.5 Der Messstand 32
2.6 Das Prinzip der Patch-Clamp-Technik 37 2.7 Pulsprogramme und Auswertung der Daten 40
2.8 Statistische Verfahren 46
Persönliche Daten
Name Wolf E. Heineke
Geburt 20.01.1977 in Hannover Familienstand ledig Staatsangehörigkeit Deutsch
Adresse Fridericusstr. 5
48161 Münster
Tel.: 0 25 33 / 93 55 75 Schulbildung
06/96 Abitur am Gymnasium Andreanum in
Hildesheim Prüfungsfächer Biologie, Chemie, Gemeinschaftskunde
und Deutsch
Fremdsprachen Graecum, Latinum, Englisch für 7 Jahre Besonderes
03/95 2. Preis im Landeswettbewerb Niedersachsen Jugend forscht Wehrdienst
09/96-05/97 Luftlandesanitätskompanie 270 in Varel Studium
10/97-04/03 Humanmedizin an der Medizinischen
Hochschule Hannover
3 Ergebnisse 48 3.1 Pharmakologische Wirkung von Pentobarbital
am Kainat-Rezeptor GluR6Q 48
3.2 Pharmakologische Wirkung von Brilliantsäuregrün
am Kainat-Rezeptor GluR6Q 54
3.3 Pharmakologische Wirkung von Brilliantsäuregrün am
AMPA-Rezeptor GluR2flipRN 60
3.4 Vergleich der pharmakologischen Effekte durch Pentobarbital
und Brilliantsäuregrün am Kainat-Rezeptor GluR6Q 66 3.5 Vergleich der pharmakologischen Effekte am AMPA-
und am Kainat-Rezeptor durch Brilliantsäuregrün 68
4 Diskussion der Einflüsse von Brilliantsäuregrün und Pentobarbital auf die Kinetik des GluR6Q und des GluR2flipRN 74
4.1 Block durch Pentobarbital am GluR6Q 75
4.2 Brilliantsäuregrün am Kainat- und am AMPA-Rezeptor 83
5 Zusammenfassung 90
6 Literatur 93
03/2003 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 04/03-05/04 Humanmedizin an der Westfälischen
Wilhelms-Universität Münster,
Praktisches Jahr
05/2004 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Beruf
seit 6/04 Assistenzarzt in der Klinik für Neuro- logie des Klinikum Dortmund gGmbH, Direktor Prof. Dr. med. M. Schwarz seit 1/07 Assistenzarzt in der Klinik für Neurologie
mit klinischer Neurophysiologie des Herz-Jesu-Krankenhauses Münster- Hiltrup, Chefarzt: Dr. med. W. Kusch Dissertation
seit 11/00 in der Abteilung Neurologie und
experimentelle Neurophysiologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Betreuer: Prof. Dr. med. J. Bufler
Thema Einfluss von Pentobarbital und Brilliant- säuregrün (E142) auf das reaktionskine- tische Verhalten von Glutamat-Rezeptor-
1 Einleitung
1.1 Einführung
Die Signalübertragung zwischen einzelnen Neuronen verläuft über elektrische und chemische Synapsen. Chemische Synapsen bestehen aus der axonalen Endigung des präsynaptischen Neurons, dem synaptischen Spalt und dem postsynaptischen Neuron (Eccles 1964). In elektrischen Synapsen erfolgt die schnelle verzögerungsfreie, aber auch unmodulierte interneuronale Reizweiterleitung über „gap junctions“. Die Signalweiterleitung über die im ZNS von Vertebraten vorwiegend vorkommenden chemischen Synapsen ist durch Freisetzung von Transmittern aus der präsynaptischen Membran, Passieren des synaptischen Spaltes und dem Andocken an Rezeptoren des postsynaptischen Neurons charakterisiert. Die postsynaptisch gebundenen Transmitter erzeugen an ionotropen ligandenaktivierten Rezeptoren eine direkte Öffnung der integrierten Ionenkanalpore mit folgender De- oder Hyperpolarisation (Mayer und Westbrook 1987). Binden die Transmittersubstanzen an metabotrope Rezeptoren, kommt es zu einer viel langsameren indirekten Reizweiterleitung über „second-messenger-Systeme“
(Pin und Duvoison 1995). Neurone des zentralen Nervensystems integrieren eine Vielzahl von hemmenden und erregenden synaptischen Eingangssignalen zu einer koordinierten Antwort (De Biasi und Rustioni 1988).
Publikation Bufler, J., Cordes, A., Heineke, W., 08/01 Dengler, R., Krampfl, K. (2001) Pento-
barbital and brilliant green modulate the current response of recombinant rat kainate-type GluR6 receptor channels differentially, Neuroscience Letters 312, 91-94
Famulaturen
01.3.-31.3.2000 Allgemeinchirurgie/DRK-Klinik Mark Brandenburg in Berlin
19.3.-8.4.2001 Neurologie/Medizinische Hochschule
Hannover (MHH)
16.7.-16.8.2001 Innere Medizin/Withybush Hospital
Haverfordwest, Großbritannien
11.9.-11.10.2001 Neurologie/Praxisfamulatur
18.2.-15.3.2002 Pädiatrie/Städtisches Krankenhaus
Hildesheim Praktisches Jahr
04/03-08/03 Innere Medizin/Clemenshospital Münster 8/03-11/03 Neurologie/Universitätsklinikum Münster
12/03-3/04 Chirurgie/Clemenshospital Münster
Der wichtigste inhibitorische Überträgerstoff des zentralen Nervensystems ist γ- Aminobuttersäure (GABA), der wichtigste exzitatorische - in dieser Arbeit verwendete - ist Glutamat. Die Bedeutung von Glutamat als Neurotransmitter neben seinen Funktionen im Zellmetabolismus als Baustein von Proteinen, Bestandteil der Fettsäuresynthese, des Stickstoffmetabolismus und auch als Substrat für die Synthese des Transmitters GABA wurde erst durch die Klonierung spezifischer exzitatorischer Aminosäure-Rezeptoren (EAA- Rezeptoren) gesichert (Übersicht bei Dingledine und Mc Bain 1994). Die strukturchemische Charakteristik der Transmittersubstanzen, die an EAA- Rezeptoren binden, ist durch eine saure Gruppe in α-Position zur Aminogruppe und durch eine weitere saure Gruppe, die zwei bis drei Kohlenstoffatome von der ersten Gruppe entfernt bindet, geprägt (Übersicht bei Dingledine und Mc Bain 1994).
Den EAA-Rezeptoren vom Glutamattyp wird eine zentrale Rolle im exzitatorischen Transmittersystem des zentralen Nervensystems von Vertebraten zugesprochen. Auch die Glutamatrezeptoren werden in ionotrope und metabotrope aufgeteilt. Ionotrope Glutamatrezeptoren setzen sich aus 4-5 Untereinheiten zusammen, die eine kationenselektive zentrale Kanalpore auskleiden. Ionotrope Glutamatrezeptoren werden nach pharmakologischen und elektrophysiologischen Gesichtspunkten in die drei Unterfamilien AMPA- (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid), Kainat- und NMDA- (N-methyl-D-aspartate) Rezeptoren unterteilt (Hollmann et al. 1989). Der erste funktionelle ionotrope Glutamatrezeptor wurde 1989 geklont (Hollmann et al.
WS 2001/2002 und SS 2002 Kreislauf- und Energiehaushalt-Praktika Im Zentrum Physiologie der MHH
WS 2000/2001 und WS 2001/2002 Makroskopische und mikroskopische Neuroanatomie zweimalig in der Abteilung Neuroanatomie der MHH Stationsaushilfe
01/98-06/02 Extrawachen in der Medizinischen
Hochschule Hannover
Aufgaben im Tennisverein
02/2000 – 09/2001 Vorstandsarbeit beim MTV Rethmar Besondere Kenntnisse
Fremdsprachen Englisch EDV-Kenntnisse Word, Exel, SPSS, Corel Draw Hobbys Tennis, Lesen, Wintersport, Kultur
Münster, 17.02.2007
1989), andere folgten in den darauffolgenden Jahren (Übersicht bei Hollmann und Heinemann 1994). Die Fähigkeit, die geklonten Rezeptoren in heterologen Systemen, wie Xenopus Oocyten oder wie den hier genutzten transfizierten Zellreihen zu exprimieren, ermöglicht die gezielte Untersuchung der reaktionskinetischen Charakteristika homomerer und heteromerer ionotroper Glutamat-Ionenkanäle mit Hilfe elektrophysiologischer Messverfahren wie der auch in dieser Arbeit genutzten Patch-Clamp-Technik.
Die Patch-Clamp-Technik stellt heutzutage eine wichtige Methode bei der Untersuchung komplexer Regulationsmechanismen an der neuronalen Synapse dar und ermöglicht die Bearbeitung interessanter Fragestellungen auf dem Gebiet der Neurophysiologie und Pharmakologie. Die Black-Film-Technik von HIadky and Haydon (1970), mit der das Verhalten von einzelnen Ionenkanälen in künstlichen Membranen gezeigt werden konnte, war ein Grundstein für die Entwicklung der Patch-Clamp-Technik (Übersicht bei Numberger und Draguhn 1996). 1972 konnten Katz und Miledi bestimmte Eigenschaften des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors durch das Verfahren der Rauschanalyse bestimmen. 1976 gelang es Neher und Sakmann durch die messtechnische Weiterentwicklung, einzelne Ionenkanal-Ströme im Bereich weniger pA darzustellen. Das Herauslösen eines kleinen Membranflecks aus einer ganzen Zelle und dessen Isolation gegenüber der Umgebung mit einem Pipettenwiderstand im Bereich von >10 GΩ ermöglichte Neher und Sakmann (1976) das Aufzeichnen von Einzelkanalereignissen.
Hierdurch eröffnete sich ein Einblick in zahlreiche Einzelheiten von Transmitter-
Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel
„Einfluss von Pentobarbital und Brilliantsäuregrün (E142) auf das reaktionskinetische Verhalten von Glutamat-Rezeptor-Ionenkanälen vom AMPA- und Kainat-Typ“
im Zentrum Neurologie und Neurophysiologie der Medizinischen Hochschule Hannover unter Betreuung von Herrn Prof. Dr. med. J. Bufler und unter der Leitung von Prof. Dr. med. R. Dengler ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe.
Ergebnisse der Dissertation wurden in folgendem Publikationsorgan
Bufler, J., Cordes, A., Heineke, W., Dengler, R., Krampfl, K.(2001) Pentobarbital and brilliant green modulate the current response of recombinant rat kainate-type GluR6 receptor channels differentially. Neuroscience Letters 312, 91-94.
veröffentlicht.
Münster, 17.02.2007
...
Wolf Heineke
Rezeptor-Beziehungen. Neben dem Interesse der reaktionskinetischen Interaktion der EAA-Rezeptoren mit bestimmten Aminosäuren ist das Interesse an der Wirkung zahlreicher anderer Substanzen auf EAA-Rezeptoren sehr groß. Spezielles Interesse besteht für klinisch eingesetzte Substanzen, wie auch für die in dieser Arbeit mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik kombiniert mit einem ultraschnellen Applikationssystem untersuchten und in der Anästhesie und Neurologie eingesetzten Barbiturate. Letzlich ist jede Substanz, die eine Subtypifizierung von EAA-Rezeptoren ermöglichen könnte, von Interesse. So ist auch die in dieser Arbeit durchgeführte Untersuchung des Einflusses des Lebensmittelfarbstoffes Brilliantsäuregrün (E142) auf die untersuchten Glutamatrezeptoren zu verstehen (Bufler et al. 2001).
1.2 Elektrophysiologische und molekularbiologische Eigenschaften von Kainat-Rezeptoren
Kainat-Rezeptoren sind in den meisten Regionen des zentralen Nervensystems zu finden. Die GluR6-Untereinheit ist in hohen Anteilen im Bulbus olfactorius, im Hippocampus und im Cerebellum exprimiert. Innerhalb eines Neurons liegen ionotrope Glutamatrezeptoren, wie auch Kainat-Rezeptoren, meist postsynaptisch vor. Immunogold-Markierungen und Patch-Clamp- Untersuchungen haben jedoch auch präsynaptisch ionotrope Kainat- Rezeptoren nachgewiesen. Neben der extrazellulären synaptischen Verteilung der Kainat-Rezeptoren gibt es Beweise für eine weite intrazelluläre Verbreitung
Ich danke Herrn Prof. Dr. J. Bufler für die Überlassung dieses interessanten Themas, die hervorragende Betreuung der Arbeit und die wissenschaftliche und klinische Ausbildung.
Herrn Prof. Dr. R. Dengler danke ich für die Arbeitsmöglichkeit und Ausbildung in der Abteilung Neurologie und Neurophysiologie. Danken möchte ich auch Herrn PD. Dr. K. Krampfl für die methodische Ausbildung, ausgezeichnete Betreuung und Förderung bei der Fertigstellung der Arbeit. Nicht unerwähnt bleiben soll Herr Dr. F. Schlesinger, der mir immer mit Rat und Tat zur Seite stand. Herrn Prof. Dr. H. Hecker danke ich für die Beratung in der statistischen Gestaltung der Arbeit. Frau U. Jensen und Frau S. Henke, sowie Herrn J. Kilian und Herrn A. Niesel sei für die ausgezeichnete technische Unterstützung gedankt. Auch allen anderen Kollegen und Mitarbeitern der Arbeitsgemeinschaft von Herrn Prof. Dr. J. Bufler danke ich für die hervorragende Zusammenarbeit und das gute Klima im Labor.
Zu besonderem Dank bin ich meinen Eltern, die mir Studium und Promotion ermöglichten, verpflichtet. Meiner Freundin Martina danke ich für ihre Unterstützung.
von Kainat-Rezeptoren, die als ein Reservepool für die Oberflächenrezeptoren diskutiert werden (Petralia et al. 1999).
Die physiologische Rolle von Kainat-Rezeptoren ist längst noch nicht geklärt.
„Molecular Mapping“ lokalisierte den Kainat-Rezeptor GluR5 auf Chromosom 21 (Eubanks et al. 1993; Potier et al. 1994). Ein Zusammenhang des Down- Syndroms (Trisomie 21) mit einer Kainat-Rezeptor-Mutation ist daher wahrscheinlich (Gregor et al. 1994). Des Weiteren gibt es Hinweise eines Zusammentreffens von Kainat-Rezeptor-Mutationen und der familiären Form der Amyotrophen Lateralsklerose (Eubanks et al. 1993). Die größten Hinweise einer pathophysiologischen Bedeutung von Kainat-Rezeptoren gibt es jedoch für Epilepsien. Schon länger bekannt ist, dass eine Beeinträchtigung der gabaergen Inhibition epileptogen wirkt. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass Kainat-Rezeptoren die Effizienz gabaerger Synapsen kontrollieren und somit potentielles Ziel einer antiepileptischen Therapie sein können. Eine Assoziation von juvenilen Absencen mit Varianten von GluR5 (Sander et al. 1995;1997) und der Beobachtung, dass GluR6-defiziente Mäuse weniger epileptische Anfälle ausbilden (Mulle et al. 1998), zeigt die Bedeutung dieser Rezeptoren für die Ausbildung einer Epilepsie. Zudem gibt es Hinweise, dass Kainat-Rezeptoren bei der Schmerzverarbeitung im Rückenmarksbereich maßgeblich beteiligt sind (Simmons et al. 1998).
Die Kainat-Rezeptoren werden in die zwei Unterfamilien „Low-Affinity Kainat Receptors“ (GluR5, GluR6 und GluR7) und „High-Affinity Kainat Receptors“
(KA1 und KA2) unterteilt. Die Untereinheiten GluR 5-7 teilen eine Aminosäuren- Sequenz-Homologie von 75-80 % miteinander. Homomere Expressionen aller drei Untereinheiten bilden funktionelle Rezeptor-Ionen-Kanäle aus. Die Untereinheiten KA1 und KA2 haben untereinander eine Sequenzhomologie von etwa 70 % und bilden nur funktionelle Kanäle, wenn sie mit Low-Affinity KA Untereinheiten coexprimiert werden. Kainat-Rezeptoren haben einen ähnlichen Membranaufbau wie AMPA-Rezeptoren. Splicevarianten sind nur bei GluR5- und GluR7-Untereinheiten bekannt (Übersicht bei Ehlers et al. 1996). GluR5 und GluR6 können an der sogenannten Editierungs-Q/R-Stelle einem posttranskriptionellem „mRNA-Editing“ unterliegen. Die nicht-editierte GluR6Q- Form hat an der Q/R-Stelle ein Glutamin (Q), die editierte Form ein Arginin (R).
Im Gehirn eines Erwachsenen liegen 39 % der GluR5-Rezeptoruntereinheiten und 75 % der GluR6-Untereinheiten in editierter Form vor (Sommer et al. 1991).
Die editierte Form ist durch ein lineares Strom-Spannungsverhältnis mit einer relativ niedrigen Ca2+-Permeabilität ausgezeichnet, wohingegen die uneditierte Form durch eine stark nach innen gerichtete Strom-Spannungsbeziehung und einer hohen Ca2+-Permeabilität gekennzeichnet ist (Egebjerg et al. 1993).
Kainat löst einen desensitisierenden Strom an Kainat-Rezeptoren aus. Die Reihenfolge der Agonisten-Affinität am GluR6 wird wie folgt angegeben:
Domoat > Kainat > Quisqualat > Glutamat.
Die elektrophysiologischen Parameter Aktivierung (ttp, time to peak), Spitzenstromamplitude (Pmax), Desensitisierung (τDes), Deaktivierung (τDeak), steady-state (c) und Resensitisierung (τRes) kennzeichnen die Kinetik eines
Rezeptors. Sie quantifizieren die physiologische Rolle des Rezeptors und machen Rückschlüsse von der Kinetik auf strukturelle Unterschiede möglich.
Desensitisierung ( in ms) : Abnahme der Stromamplitude in Anwesenheit des Agonisten
τDes
maximale Amplitude ( in pA):
die meisten Rezeptoren sind im Offenzustand
Pmax
maximale Amplitude ( in pA):
die meisten Rezeptoren sind im Offenzustand
Pmax
Deaktivierung ( in ms):
Abfall des Stromes nach Been- digung der Applikation des Agonisten
τDeak
Deaktivierung ( in ms):
Abfall des Stromes nach Been- digung der Applikation des Agonisten
τDeak
steady-state-Strom (c in pA):
Gleichgewichtseinstellung in Anwesenheit des Agonis- ten zwischen Offenzustand und desensitisiertem Zustand des Rezeptors
Aktivierung (ttp, time to peak in ms):
Anstiegszeit zwischen 20 % und 80 % der maximalen Amplitude
Applikationszeit des Agonisten (3 mM Glutamat)
Applikationszeit des Agonisten (3 mM Glutamat)
ttp c
Pmax
Pmax
20 %
80 %
τDes
τDeak
τDeak
A
B
Abb. 1. Allgemeine elektrophysiologische Charakteristika von Stromtransienten der AMPA- und Kainat-Typ-Rezeptor-Kanäle bei einem 200 ms- [A] und einem 1 ms-Schuss [B] am Beispiel des GluR2flip-Kanals. Erläuterungen in der Abbildung und im Text.
Bei ultraschschneller Applikation von Glutamat lassen sich an AMPA- und Kainat-Rezeptoren mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik die erwähnten
Stromtransienten nachweisen, die durch einen schnellen Stromanstieg (ttp) bis zum Erreichen einer maximalen Spitzenstromamplitude (Pmax) und einem anschließenden Stromabfall unter Anwesenheit des Agonisten (Abb. 1 A), der sogenannten Desensitisierung (τDes), oder dem Stromabfall nach abrupter Beendigung der Agonistenzufuhr, der sogenannten Deaktivierung (τDeak), (Abb. 1 B) charakterisiert sind. Der Ionen-Strom durch Non-NMDA-Rezeptoren desensitisiert in Anwesenheit des Agonisten bis zum Erreichen eines niedrigen Plateaulevels, der sogenannten steady-state-Stromamplitude (c), zwischen 0,36% bei GluR6-Kainat-Rezeptoren (Heckmann et al. 1996) bis zu 10 % der maximalen Spitzenstromamplitude bei GluR2flip-Kanälen. Die Kinetik des rekombinanten GluR6Q-Kanals ist sowohl durch schnelle Aktivierung und Desensitisierung als auch durch langsame „Recovery“ von der Desensitisierung charakterisiert. Die in dieser Arbeit nicht gemessene „Recovery“ oder Resensitisierung stellt die Rückführung aus dem desensitisierten Zustand dar.
Die Aktivierung (ttp, als 20-80 % des Anstieges gemessen) ist mit 0.2 ms bei einer sättigenden Glutamat-Konzentration für den GluR6Q beschrieben (Abb. 1). Sie sinkt mit steigender Glutamatkonzentration, erklärbar durch die konzentrationsabhängige Bindungsrate (Heckmann et al. 1996). Die Desensitisierung ist wahrscheinlich durch eine reversible Konformationsänderung des Rezeptors nach Agonistenbindung bedingt. Die Desensitisierung ist ab 0.3 mM Glutamat konzentrationsunabhängig. Unter 0,3 mM ist sie um so größer je kleiner die Glutamatkonzentration ist (Heckmann et al. 1996). Die Desensitisierung zeichnet sich durch einen monoexponentiellen Stromabfall mit einer Zeitkonstante von 8-10 ms bei hippokampalen Kainat-
Rezeptoren aus (Paternain et al. 1998) und wird mit einer Zeit von 5-8 ms bei rekombinanten GluR6Q beschrieben (Heckmann et al. 1996; Traynelis et al.
1997). Aus evolutionsbiologischer Sicht scheint sie einen Sicherheitsmechanismus vor zu großen und zu langen Erregungen ähnlich der Inaktivierung bei Na+-Kanälen darzustellen. Die Deaktivierung, die die Zeit der Glutamatabdiffusion darstellt, wird für den GluR6Q-Kanal mit 2 ms angegeben (Heckmann et al. 1996). Zur Aktivierung und Desensitisierung des GluR6Q wurde von M. Heckmann ein zyklisches Reaktionsschema mit zwei Agonistenbindungsstellen und zwei Desensitisierungszuständen entwickelt (Heckmann et al. 1996, Erläuterung siehe Diskussion).
Abb. 2. Das zirkuläre reaktionskinetische Modell für die Interaktion von AMPA- und Kainat- Rezeptoren mit entsprechenden Agonisten zeigt das Bindungs- und Reaktionsverhalten (aus Heckmann et al. 1996).
A = Agonist, R = nicht ligierter, geschlossener Zustand des Rezeptor-Kanals, AR = einfach- ligierter Zustand, A2R = doppelt-ligierter Zustand, A2O = offener Zustand, A2D = desensitisierter, zweifach-ligierter Zustand, AD = desensitisierter, einfach-ligierter Zustand. Hin- bzw. Rückraten zwischen den jeweiligen Rezeptorzuständen werden durch k1, k-1, k2, k-2, k3, k-3, α, β, d1, d-1, d2, d-2 beschrieben. Erläuterungen zu ähnlichem Reaktionsschema des Ach-Rezeptors siehe Abb.
24.
1.3 Elektrophysiologische und molekularbiologische Eigenschaften von AMPA-Rezeptoren
Auch die AMPA-Rezeptoren sind im Gehirn weit verbreitet. Die GluR2- Untereinheit kommt im Neokortex, im Hippokampus, Nucleus caudatus, Putamen, Nucleus reticularis thalami, Hypothalamus, Cerebellum, Rückenmark und der Retina in hohen Anteilen vor (Hollmann und Heinemann 1994).
Subzellulär kommen AMPA-Rezeptoren hauptsächlich postsynaptisch vor, wobei wahrscheinlich intrazellulär gebildete AMPA-Rezeptoren als Ersatz für die Oberflächen-Rezeptoren vorhanden sind. Immunogold Labeling hat bisher nur die GluR4-Untereinheit unter den AMPA-Rezeptoren in einer präsynaptischen Lage nachgewiesen (Petralia et al. 1999).
AMPA-Rezeptoren sind nach ihrer hohen Affinität zu AMPA (α-amino-3- hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionat) benannt (Keinänen et al. 1990).
Weitere Agonisten sind Glutamat, Kainat, Domoat und Quisqualat, jedoch nicht NMDA. Kainat löst einen nicht desensitisierenden Strom an AMPA-Rezeptoren aus. Die genannten Substanzen führen zur Öffnung einer Kationen-selektiven Kanalpore. Man geht davon aus, dass vier Untereinheiten die kinetischen und pharmakologischen Eigenschaften eines Kanals bestimmen. Die Variabilität der heterooligomeren Kombinationen verschiedener Untereinheiten führt zu einer Vielzahl von Kanälen, die sich in Strukur und Kinetik unterscheiden (Rosenmund et al. 1998; Mansour et al. 2001). Die vier Untereinheiten GluR1, GluR2, GluR3 und GluR4 werden differenziert. Sie haben eine 68-74%ige Sequenzhomologie. Diese Sequenzgleichheit zwischen den vier Untereinheiten
und der signifikante Unterschied zu anderen Unterfamilien grenzt sie als eigene Unterfamilie ab. Für alle Glutamatrezeptoren sind drei Transmembrandomänen (M1, M3 und M4) mit einer intrazellulären Membranschleife M2, einem extrazellulären N-Terminus und einem intrazellulären C-Terminus beschrieben (Abb. 3). Die Ligandenbindungsdomäne S1 befindet sich extrazellulär in Verlängerung des N-Terminus vor dem Transmembranprotein M1. Der andere Proteinkomplex zur Ligandenbindung S2 liegt ebenfalls extrazellulär auf einer Schleife zwischen M3 und M4 (Hollmann et al. 1994; Dingledine et al. 1999;
Hollmann 1999, Abb. 3).
Abb. 3. Topologisches Modell von Glutamatrezeptoren am Beispiel der Untereinheit GluR1 des AMPA-Rezeptors. 3 Transmembranproteine M1, M3 und M4, die extrazellulären Schleifen S1 und S2, das intramembranäre Porenprotein M2, das extrazelluläre NH2- und dasintrazelluläre COOH-Ende sind zu sehen. S1 und S2 bilden über „Lobe“ 1 und „Lobe“ 2 die Glutamat- Bindungsstelle. (M. Hollmann et al. 1994 in Jonas 1999).
Alle 4 AMPA-Untereinheiten liegen in zwei Splicevarianten von M4 vor, die durch das Herausschneiden des Exons 12 (flip) oder Exon 13 (flop) determiniert werden. Bei Ratten wurde ein Wechsel eines bestimmten Anteils an pränatalen flip-Varianten hin zu postnatalen flop-Varianten festgestellt (Monyer et al. 1991).
Das alternative „Splicing“ der flip/flop-Domäne bestimmt die Desensitisierungskinetik des Rezeptors (Mosbacher et al. 1994). Patch-Clamp- Experimente in Kombination mit einer ultraschnellen Agonistenapplikationstechnik an „outside-out-patches“ von transfizierten humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) 293 Zellen zeigen für den editierten GluR2flip eine langsame Desensitisierung mit τDes = 9.86 ms (n =10) und eine schnelle τDes = 1.87 ms für den GluR2flop (Krampfl et al. 2001). Das ist die größte Differenz zwischen flip und flop, die bei AMPA-Rezeptoruntereinheiten existiert. Es konnte gezeigt werden, dass die flip-Form des GluR2 in den pyramidalen Neuronen predominant ist, die langsamere Desensitisierungskinetiken haben (Lambolez et al. 1996).
Ab 3 mM Glutamat ist die Desensitisierungszeitkonstante konzentrationsunabhängig, für kleinere Konzentrationen ist sie größer (Koike et al. 2000). Die Rezeptoren erholen sich nach einer gewissen Zeit (Recovery) wieder von der Desensitisierung und sind damit wieder voll erregbar.
Signifikante Desensitisierung der AMPA-Rezeptoren entsteht bei synaptisch freigesetztem Glutamat. Sie regelt die Größe der synaptischen Transmission von repititiven Stimuli (Trussel et al. 1993; Otis et al. 1996). Im Gegensatz zur Desensitisierungzeit wird die Deaktivierungzeit durch alternatives „Splicing“
oder „nuclear-editing“ nicht beeinflußt. Sie beträgt für den GluR2flip τDeak = 1.14 ms und für GluR2 flop 0.92 ms (Krampfl et al.2001).
Die GluR2-Untereinheit spielt durch ihre schnelle Desensitisierungs- und Resensitisierungscharakteristika eine entscheidende Rolle bei der schnellen
exzitatorischen Transmission. GluR2 grenzt sich durch seine lineare Strom- Spannungsbeziehung und niedrige Ca2+-Permeabilität von den anderen AMPA- Untereinheiten ab (Jonas et al. 1994). Die Ursache für diese Unterschiede liegen in der Q/R/(N)-Stelle des Transmembranproteins M2. 100 % der GluR2- Untereinheiten unterliegen dem „RNA-Editing“ an der Q/R/(N)-Stelle. Sie haben an dieser Stelle ein Arginin (R), im Gegensatz zu den anderen Untereinheiten, die alle ein Glutamin (Q) exprimieren. Das Glutamin wird an der Q/R/(N)-Stelle posttranskriptionell im Rahmen eines „RNA-Editing“ durch Arginin ersetzt. Auch die z.T. pränatal noch uneditierten Q-Formen sind nach der Geburt editiert (Sommer et al. 1991). Patch-Clamp-Experimente mit „outside-out-patches“ von Xenopus Oocyten zeigten keine signifikanten Unterschiede der kinetischen Parameter zwischen homomeren GluR2Q und heteromeren GluR2Q/GluR2R (Koike et al. 2000). Eine weitere - auch in dieser Arbeit genutzte - in vitro durch Punktmutationen hergestellte Variante enthält die Aminosäure Asparagin (N) an der Q/R/(N)-Editierungsstelle, die eine der (R)-Form ähnliche Charakteristik aufweist, sich jedoch durch eine höhere Leitfähigkeit auszeichnet und somit Vorteile für die elektrophysiologische Charakterisierung der Untereinheiten hat (Krampfl et al. 2002). Eine andere nur teilweise editierte Editierungsstelle, die R/G-Stelle, liegt am N-Ende der flip-flop-Splice-Domäne im zweiten extrazellulären Protein. Die editierte Form hat durch den posttranskriptionellen Basenaustausch an Stelle des Arginin-Codons (AGA) ein Glycincodon (GGA) (Lomeli et al. 1994). Die so editierten AMPA-Rezeptoren zeigen eine verkürzte Resensitisierungszeit und damit eine höhere Öffnungsfrequenz der entsprechenden Glutamatrezeptoren (Krampfl et al. 2002).
Durch alternatives „Splicing“ in flip oder flop und posttranskriptionellem „RNA- Editing“ an der Q/R/(N)-Stelle oder teilweise auch an der R/G-Stelle ergeben sich zahlreiche GluR2-Varianten. Unterschiedliche reaktionskinetische Eigenschaften machen es möglich, sie zu unterscheiden.
Folgende einheitliche Nomenklatur wurde in dieser Arbeit für AMPA-Rezeptor- Untereinheiten zur abgekürzten Beschreibung der durch mRNA-Editierungen und das alternative Splicen definierten Subtypen heterooligomerer Koassemblierungen angewandt:
Glu(tamat) R(ezeptor)1-4 flip/flop R(Arginin)/G(Glycin) Q(Glutamin)/R(Arginin)/(N)(Asparagin)
bzw. folgende für Kainat-Rezeptor-Untereinheiten:
Glu(tamat) R(ezeptor)5-7 Q(Glutamin)/R(Arginin) z. B.: GluR6Q
1.4 Brilliantsäuregrün (E 142)
Abb. 4. Brillantsäuregrün, Green S. N-[4-[[4-(Dimethylamino)phenyl]-[2-hydroxy-3,6-disulfo-1- naphthyl]methylen]-2,5-cyclo-hexadien-1-yliden]-N-methyl-methanaminium-hydroxid
(Natriumsalz).
Der synthetische Triphenyl-Methan-Farbstoff Brilliantsäuregrün (C27H25N2NaO7S2, 576.6 g = 1 mol) wird zum Färben von Lebensmitteln und Kosmetika verwendet (Abb. 4). Brilliantsäuregrün (Synonyma: BS, Lissamingrün, Green S, E 142, C.I. 44090, C-Grün 4, C.I. Acid Green 50) darf in Deutschland unter Kenntlichmachung nur für bestimmte Lebensmittel (z. B.
Süßwaren, Liköre, Obst) und Arzneimittel verwendet werden [§ 6 Absatz (1) Zusatzstoffzulassungsverordnung]. Brilliantsäuregrün (BS) wird vom Darm nahezu nicht absorbiert und innerhalb von 72 h wieder ausgeschieden (Dalgaard-Mikkelson et al. 1962; Phillips et al. 1980). Der 1984 festgesetzte Grenzwert für Lebensmittel, ADI-Wert (acceptable daily intake) beträgt für Brilliantsäuregrün 5mg/kg/Körpergewicht (Bertram 1989). Bisherige Untersuchungen an Ratten zur akuten Toxizität sowie Teratogenitätstests und Langzeituntersuchungen haben keine unerwünschten Wirkungen gezeigt (Brantom et al. 1987; Bertram 1989). Unter der Grenze von 500 mg/kg/d Brilliantsäuregrün treten keine pathologischen Befunde auf. Bei einer höheren Dosis kam es bei Ratten zu erhöhter Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme, zu einer milden Anämie bei Splenomegalie, einer Thyroideadegeneration, Anzeichen für leichte Nierenschäden und intestinalen Lymphknotenvergrößerungen (Clode et al. 1987; Moorhouse et al. 1987).
Brilliantsäuregrün findet auch seine Anwendung zur visuellen Darstellung von Testsubstanzen in der Patch-Clamp-Technik. Bei Patch-Clamp-Experimenten in unserem Labor an der Glutamatrezeptoruntereinheit GluR6Q wurde dabei ein Effekt von BS auf die kinetischen Parameter deutlich, der in dieser Arbeit genau untersucht wird.
1.5 Pentobarbital
A B
Abb. 5. Strukturformel von dem in dieser Arbeit untersuchten Pentobarbital (A) und dem verwandten, noch relativ häufig eingesetzten Phenobarbital (B). Beide gehören zur Gruppe der Barbiturate.
Pentobarbital (C11H18N2O3, 5-Ethyl-5-(1-methylbutyl)-barbitursäure, Molmasse = 226,274 g) ist ein in der Humanmedizin nicht mehr eingesetztes, früher als Schlafmittel genutztes, langwirksames, schlecht wasserlösliches, überwiegend renal eliminiertes Barbiturat (Abb. 5 A). Therapeutische Serumkonzentrationen nach intravenöser Applikation von Pentobarbital liegen bei bis zu 200 µM (Wermeling et al. 1987). Da die Hälfte des Pentobarbitals proteingebunden ist, beträgt der freie Medikamentenspiegel in etwa 100 µM (Urban et al. 1995).
Kurzwirksame lipophile Barbiturate haben im Gegensatz zu den weniger lipophileren langwirksamen Barbituraten einen schnellen Wirkungseintritt, sowie
eine schnelle Wirkungsbeendigung durch Umverteilung und Metabolisierung.
Barbitursäure, die unter H2O-Abspaltung aus Harnstoff und Mevalonsäure ensteht, kennzeichnet die Grundstruktur der Barbiturate. Unterschiedliche Substituenten am Grundmolekül bestimmen die Pharmakokinetik. Nur in der nicht dissoziierten lipophilen Form passieren Barbiturate die Blut-Hirn- Schranke. Sie wirken antikonvulsiv und je nach Dosis sedativ, hypnotisch oder narkotisch. In hypnotischer Dosierung sind die unerwünschten Wirkungen neben anderen ein Arzneimittelüberhang, paradoxe Erregung, Abhängigkeit, Entzugssymptomatik bei plötzlichem Absetzen, in narkotischer Dosis Atemdepression, Muskelrelaxation und negative Inotropie. Barbiturate wie Phenobarbital (Luminal®, Abb. 5 B) werden als Mittel der ersten Wahl als Antikonvulsiva zur Therapie und Kontrolle von Neugeborenenkrämpfen und häufig wiederkehrenden Fieberkrämpfen eingesetzt (Hall et al. 1998). Des Weiteren wird Phenobarbital als Mittel der zweiten Wahl bei generalisiert- tonisch-klonischen cerebralen Krampfanfällen sowohl als Mono- als auch als Kombinationstherapie mit Ethosuximid und als dritte Wahl gegen fokale Anfälle eingesetzt (Ptsalos et al. 2000). Eine weitere Indikation ist der Status epilepticus als ultima ratio in Form einer Phenobarbital oder Thiopental-Narkose (Beyenburg et al. 2000). Zusätzlich werden Barbiturate als Mittel der zweiten Wahl zur Neuroprotektion bei hirnödembedingt erhöhtem Hirndruck eingesetzt (Bullogh et al. 1996; Horn et al. 1999). Der Gebrauch als Schlafmittel gilt aufgrund des Nebenwirkungsprofils als nicht mehr zeitgemäß und wurde durch andere Medikamente abgelöst. Barbiturate wie Methohexital, Thiopental und Hexobarbital werden auch als Kurzzeitnarkotika angewandt.
Barbiturate bewirken am GABAA-Rezeptor eine Potenzierung der GABA- induzierten Erregung (Evans 1979), eine direkte Agonistenfunktion (Franks und Lieb 1994; Robertson 1989; Krampfl et al. 2002) und einen Offen-Kanal-Block bei höheren Konzentrationen (Krampfl et al. 2002). Auch am nikotinischen Acethylcholinrezeptor erzeugt Pentobarbital einen Offen-Kanal-Block, kombiniert mit einem kompetitiven Block (Krampfl et al. 2000). Die Auswirkungen auf Glutamatrezeptoren sind noch nicht vollständig geklärt.
Bisher ist eine inhibitorische Wirkung von Pentobarbital und Phenobarbital an der Kainat-Rezeptor-Untereinheit GluR6 in klinisch relevanten Dosierungen bekannt (Dildy-Mayfield et al. 1996 und Minami et al. 1998). Ebenfalls noch nicht endgültig geklärt sind die Blockmechanismen Pentobarbitals an AMPA- Typ-Rezeptoren. Möglich ist ein Offen-Kanal-Block (Marszalec und Narahashi 1993) oder eine Inhibierung aufgrund einer Stabilisierung des desensitisierten Status (Jackson et al. 2003, siehe auch Diskussion).
1.6 Pharmakologische Auswirkungen auf AMPA- und Kainat-Rezeptoren
Subtypspezifische Substanzen können durch ihre unterschiedlichen pharmakologischen Wirkungen auf die Kinetik bei der Identifizierung von AMPA- bzw. Kainat-Rezeptor-Untereinheiten im ZNS behilflich sein. Zusätzlich besteht zusammen mit molekularbiologischen Methoden die Möglichkeit, die Funktion der Proteinstrukturen zu ergründen. Viele unterschiedliche Substanzen interagieren mit GluR6-Kanälen. Es wurde in Experimenten mit
Zellen in der Ganzzellableitung (whole-cell-Experimente) gezeigt, dass Volatile Anästhetika wie Enflurane und Halothane GluR6-Kanal-Ströme in anästhetischen Dosen unter Kainatapplikation zwischen 30 und 40 % vergrößern, wohingegen sie AMPA-Rezeptoren um 15 bis 20 % inhibieren (Dildy-Mayfield et al. 1996). Die Mutagenese der Aminosäure (AS) Glycin-819 der M4-Region (Abb. 3) zeigte, dass diese AS für die Vergrößerung der Rezeptorfunktion durch Volatile Anästhetika wie Halothan (Minami et al. 1998) wichtig ist. Die Wirkungen Pentobarbitals und Ethanols hingegen waren durch die Mutation der Transmembran 4- (TM4)-Region unbeeinflußt. Beide Substanzen inhibierten in klinischer Dosierung bei hohen Kainat- Konzentrationen die Spitzenstromamplitude des GluR6-Kanals um jeweils 25 % und die AMPA-Untereinheit GluR3 um 10 % für Pentobarbital bzw. 23 % für Ethanol. Niedrigere Kainat-Konzentrationen hatten eine stärkere Inhibierung der Spitzenstromamplitude zur Folge (Dildy-Mayfield und Harris 1996; Möykkynen et al. 2003). Cyclothiazide führt zu einer erhöhten Erregung der AMPA- Rezeptoren und Inhibierung der Desensitisierung, hat jedoch keine Auswirkungen auf GluR5 und GluR6 (Partin et al. 1993; Wong et al. 1993;
Koike et al. 2000). Möykkynen zeigte indirekt über Koapplikation von Cyclothiazide, einem Glutamatagonisten, und Ethanol an AMPA-Rezeptoren, dass Ethanol über eine Stabilisierung des desensitisierten Status sowohl den
„steady-state-Strom“ als auch die Spitzenstromamplitude inhibiert. Der Farbstoff Evans Blue hat einen sehr vielfältigen konzentrationsabhängigen Einfluß auf die Spitzenstromamplitude und die Desensitisierung von AMPA- und Kainat- Rezeptoren. Die GluR6-Untereinheit wird durch Evans Blue erst bei einer
Konzentration von 100 µM geblockt, wohingegen die GluR2-Untereinheit vom AMPA-Typ schon ab einer Konzentration von 1 µM geblockt wird (Schürmann et al. 1997). Die Verbindung Concanavalin A (ConA) ist dafür bekannt, dass sie die glutamatinduzierte Erregung von Kainat-Rezeptoren (GluR5 und GluR6) stärker potenziert als von AMPA-Rezeptoren (Egebjerg et al. 1991). Schließlich blockieren Polyamin Toxine und ihre Analoga Calcium-permeable AMPA- und Kainat-Rezeptoruntereinheiten selektiv, wohingegen niedrig Calcium-permeable Rezeptoren, wie auch die editierte GluR2-Untereinheit, nicht blockiert werden (Blaschke et al. 1993; Herlitze et al. 1993).
1.7 Problemstellung
In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der modifizierten Patch-Clamp-Technik erstmalig die Einflüsse des Lebensmittelfarbstoffes Brilliantsäuregrün (E 142) an Glutamatrezeptoren vom AMPA- und Kainat-Typ, sowie die pharmakologischen Effekte von Pentobarbital auf einen Glutamatrezeptor vom Kainat-Typ untersucht. Die Patch-Clamp-Messungen wurden an aus ganzen Zellen herausgelösten Membranflecken mit nach außen zeigender extrazellulärer Seite (outside-out-Konfiguration, Abb. 11) oder an ganzen Zellen (whole-cell-Konfiguration, Abb. 11) durchgeführt. Hierbei wurde eine piezogesteuerte ultraschnelle Applikation von Testlösungen verwendet, die mít dem schnellen Lösungswechsel die synaptische Transmission in vitro simuliert.
Mit dem Ziel, eine weitere subtypspezifische Substanz zur Unterscheidung von Glutamatrezeptoren zu charakterisieren, die Testung der interaktionsärmsten Konzentration für die Anwendung im Labor als Färbemittel für Lösungen zur Darstellung des Liquidfilaments des piezobetriebenen ultraschnellen Perfusionssystems in der Patch-Clamp-Technik und die unterschiedlichen Auswirkungen auf die Kinetik der untersuchten Rezeptoren zu diskutieren, wurde in dieser Arbeit die Substanz Brilliantsäuregrün in ihrem Effekt auf die Desensitierung (τDes), die Deaktivierung (τDeak), die Anstiegszeit (ttp, time to peak), die Spitzenstromamplitude (Pmax) und die Relation des Stromes bei Gleichgewichtseinstellung zwischen offenem und desensitisiertem Zustand zur Stromamplitude (relativer steady-state) auf den Kainat-Rezeptor GluR6Q und den AMPA-Rezeptor GluR2flipRN untersucht und verglichen.
Die gemessen Effekte von Pentobarbital auf die kinetischen Parameter des Kainat-Typ-Rezeptors GluR6Q wurden mit den Auswirkungen durch Brilliantsäuregrün verglichen und im Zusammenhang mit bekannten Wirkungen von Pentobarbital an anderen ionotropen Rezeptoren diskutiert.
2 Material und Methoden
2.1 Transiente Expression und Zellkultivierung
Zur Expression von Glutamatrezeptor-Kanälen (GluR-Kanälen) verwendete transformierte humane embryonale Nierenzellen (HEK) 293 werden im Medium (Kulturmedium; s. Kap. 2.3 Lösungen) bei 37˚C in einem mit 5 % CO2 und 95 % Raumluft gefüllten Inkubator in speziellen Zellkulturflaschen kultiviert.
Die AMPA- und Kainat-Rezeptor-cDNAs liegen als Expressionskonstrukte subkloniert in pcDNA3-Expressionsvektoren (Invitrogen) vor. Ebenfalls in pcDNA3 kloniertes grünes Fluoreszenzprotein (GFP) dient der fluoreszenzoptischen Identifizierung transfizierter Zellen. Die Transfektion der Rezeptor-cDNA in HEK293-Zellen erfolgt am Vortag eines jeden Experimentiertages, da die transient exprimierten Rezeptoren etwa zwischen der 15. und 72. Stunde nach Transfektion ausreichend exprimiert werden (Neumann et al. 1982; Krampfl et al. 2001).
2.2 Transfektion
Unter der Transfektion wird das Einbringen von Fremd-DNA in lebende eukaryotische Zellen verstanden. In dieser Arbeit wurde die entsprechende Rezeptor-cDNA mit Hilfe der Elektroporations-Technik in HEK293-Zellen eingeschleust.
Die Transfektion der Rezeptor-cDNA in HEK293-Zellen wird unter sterilen Bedingungen an einer sterilen Werkbank durchgeführt. Zu Beginn wird das Kulturmedium von einer konfluent mit HEK293-Zellen bewachsenen Zellkulturflasche abgekippt und der Flaschenboden mit 3 ml PBS (s. Kap. 2.3.
Lösungen) vorsichtig gereinigt. Durch die Zugabe einer Trypsin-Lösung werden die Zellen durch sanftes Klopfen und Schütteln vom Boden der Flasche gelöst.
Die Neutralisation der enzymatischen Wirkung vom Trypsin erfolgt durch das Trypsin-Inaktivatorhaltige Kulturmedium (siehe Kap. 2.3 Lösungen). Nach gründlichem Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren werden 3 ml der Suspension zum Animpfen einer neuen Kulturflasche verwendet und der Rest in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen pipettiert. Während der anschließenden Zentrifugation (5 min bei 1000 rpm und 36˚C) werden die mit Deckgläschen (Durchmesser 12 mm) versehenen runden Zellkammern (Wells) sowie die neu beimpfte Flasche mit Kulturmedium aufgefüllt. Die Portionen aus aliquotiertem GFP (3 µg Fluoreszenzprotein-DNA) und 10-25 µg der gewünschten für die AMPA- oder Kainat-Rezeptor-Untereinheit kodierten cDNA werden in einem Eppendorffgefäß vermischt. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen, 2.0 ml Elektroporationspuffer (s. Kap. 2.3 Lösungen) und 50 µl 1 M MgSO4 hinzugegeben und durch weiteres Auf- und Abpipettieren gründlich resuspendiert. Je 0.4 ml der Zellsuspension werden in einem weiteren Schritt in dem Eppendorffgefäß mit der Plasmid-DNA vermischt und dann in die Elektroporationküvette pipettiert. Durch Applikation eines Strompulses durch die Elektroden der Küvette (Elektroporation) wird die Membran der HEK293-Zellen kurzfristig für die Plasmid-DNA permeabel, wodurch die Aufnahme der cDNA in
die Zelle ermöglicht wird. Die transfizierten HEK293-Zellen werden in Wells a`
40-60 µl pipettiert und für ca. 15 Stunden im Brutschrank inkubiert.
2.3 Lösungen
Zur Kultivierung der HEK293-Zellen wird ein spezielles Nährmedium verwendet, das sich aus 500 ml Hams F-12 Medium, 500 ml Dulbecco´s Modifiertes Eagle Medium (DMEM), 10 % fetalem Kälberserum (FCS) und 5 ml einer Penicillin- Streptomycin-Lösung (10 IE/100 ml Penicillin, 10000 µg/100 ml Streptomycin) zusammensetzt. Als Badlösung bzw. Hintergrundlösung wird eine Ringerlösung (162 mM NaCl, 5.3 mM KCl, 0.67 mM Na2HPO4, 0.22 mM KH2PO4, 15 mM Hepes und 6 mM α-D-Glucose) verwendet. Nach Einstellung des pH-Wertes auf pH = 7,4 mit Natronlauge (NaOH) wird 2 mM CaCl2 hinzugegeben. Die Einstellung der Osmolarität auf 340 mOsm erfolgte zuletzt mit Mannit. Die Intrazellulärlösung, bestehend aus: 140 mM KCl, 2 mM MgCl2, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES und 10 mM Glucose, ist für das Füllen der Patchpipetten vorgesehen. Die pH-Einstellung mit 1 M KOH auf pH = 7,4 und die Einstellung der Osmolarität mit Mannit auf 305 mOsm erfolgt abschließend. PBS (phosphate buffered saline) dient der Reinigung der am Boden der Kulturflaschen wachsenden HEK293-Zellen vom serumhaltigen Medium. 10 Einheiten PBS-Stammlösung werden mit 1.3 M NaCl, 70 mM Na2HPO4 in entionisiertem Wasser angesetzt, (DEPC (Diethylpyrocarbonat)-behandelt) und autoklaviert. Ein spezieller Puffer (50 mM K2HPO4, 20 mM K-Acetat, 1 l Aqua dest.) dient als Elektroporationspuffer (siehe Kapitel 2.2 Transfektion). Der ph
wird mit Essigsäure auf 7.35 eingestellt. Die Lösung wird sterilfiltriert und dann autoklaviert. Zum Lösen der HEK293-Zellen vom Boden der Zellkulturflasche wird Trypsin verwendet. Eine Einheit Trypsin-Stammlösung wird mit neun Einheiten PBS verdünnt.
Die untersuchten Testsubstanzen Brilliantsäuregrün (Lebensmittelfarbstoff E142, C27 H25 N2 NaO7 S2, (Abb. 4)) und Pentobarbital (Abb.5 A) liegen beide als Pulver vor. Zur Herstellung der Testlösungen werden Brilliantsäuregrün bzw.
Pentobarbital zusammen mit Glutamat-Kristallen in Extrazellularlösung gelöst.
Die Lösungen haben eine Zusammensetzung aus jeweils 3 mmol Glutamat und 0.1, 0.3, 1, 3 oder 10 mmol Brilliantsäuregrün bzw. Pentobarbital. Um ein Auspflocken der höchsten Pentobarbitalkonzentration zu verhindern, wurde es in 2 Tropfen DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst. Je nach Konzentration der Testsubstanz Brilliansäuregrün färben sich die Lösungen von schwach bis tief blau, im Falle von Pentobarbital sind sie farblos. Zur Herstellung der Kontroll- Lösung wird kristalloides Glutamat in Extrazellularpuffer aufgelöst und schließlich so verdünnt, dass eine Lösung mit einer Glutamatkonzentration von 3 mmol vorliegt.
Die Kontroll-Lösung und die zu untersuchende Brilliantsäuregrün- bzw.
Pentobarbital-Lösung füllen zwei getrennte Applikationssäulen. In der Pentobarbital-Testreihe werden die Kontroll-Lösungen zum Sichtbarmachen der ausströmenden Flüssigkeit mit Evans Blue angefärbt, in der Brilliantsäuregrün- Testreihe ist Brilliantsäuregrün selber das Färbemittel. In aufsteigender
Konzentrationsreihe werden abwechselnd Kontroll- und Test-Lösung appliziert.
Die Messungen beginnen und enden mit Kontrollableitungen.
2.4 Die Patch-Clamp-Technik
Als Vorläufer der Patch-Clamp-Technik entwickelten Kenneth S. Cole und H. J.
Curtis die Technik der Spannungsklemme (Voltage-Clamp) Ende der dreiziger Jahre. Mit dieser Technik untersuchten Hodgkin und Huxley Anfang der fünziger Jahre die Entstehung des Aktionspotentials am Riesenaxon des Tintenfisches. Sie konnten die Ionenflüsse des Aktionspotentials näher charakterisieren und erhielten erste Hinweise auf spannungsabhängige ionenselektive „Tore“ in der Zellmembran. 1972 gelang es Bernhard Katz zusammen mit Ricardo Miledi zum ersten Mal die Eigenschaften von Ionenkanälen in der Membran erregbarer Zellen zu messen. Sie konnten aus ihrer Analyse des „elektrischen Rauschens“ ableiten, dass ein Acetylcholinrezeptor nach Acetylcholinapplikation rund zehn Millionen Ionen pro Sekunde leitet und festigten damit die Hypothese, dass es sich damit um einen Ionenstrom und nicht um einen aktiven Carriertransport handelt. Erst Anfang der siebziger Jahre erreichten Erwin Neher und Bert Sakmann die direkte Beobachtung einzelner Kanäle. Dieser Fortschritt gelang ihnen durch eine modifizierte Voltage-Clamp-Technik, der sogenannten Patch-Clamp-Technik.
Das Verwenden einer frischen, polierten und mit leichtem Unterdruck versehenen Patchpipette führte durch Reduktion von Leckströmen zu einer Reduktion des „Hintergrundrauschens“.
2.5 Der Messstand
Zur Fokussierung und Darstellung von Pipettenspitze und HEK293-Zellen wird ein aufrechtes Mikroskop (Zeiss) mit einem 40-fach verstärkendem Wasserimmerssionsobjektiv verwendet. In den Objekttisch ist eine durchsichtige Einsenkung eingebaut, die mit Badlösung über eine Zulaufvorrichtung perfundiert wird.
Abb. 6. Fotographische Abbildung der Patch-Clamp-Einheit mit Mikroskop (1), Pipettenhalter (2), Objekttisch mit Messkammer (3), Mikromanipulator (4), Ticker (5), Applikationsumschalter (6), Hintergrundperfusionssystem (7), Badlösungsvorratsflasche (8), Unterdruckspritze (9).
In dem Flüssigkeitsfilament der in der Stömungsrichtung der Zulaufvorrichtung positionierten Applikationskapillare finden die Messungen statt (Abb. 8). Ein Ablauf, sowie eine Überlaufvorrichtung dienen zur Aufrechterhaltung eines konstanten Flüssigkeitsspiegels. Die HEK-Zellen werden auf dem Boden der
Messkammer zentral positioniert. Die Fokussierung der Pipette bzw. der Zelle geschieht durch Annäherung des Objektives relativ zur Objekttischkammer mit Hilfe eines hydraulischen Manipulators in einem Winkel von ungefähr 45º (Abb.
6 und 8). Für die genaue Einstellung der Pipette unter dem Mikroskop und die subtile Annäherung an die wenige Mikrometer große Zelle wird ein Mikromanipulator mit Bewegungsgenauigkeit von unter 1 µm benutzt.
Mikroskop, Mikromanipulator und Pippettenhalter (Abb. 7) sind auf einem schwingungsgedämpften Tisch befestigt, um störende Bewegungen zwischen Pipette und Präparat zu verhindern (Abb. 6 u. 9). Eine Verminderung des
„Hintergrundrauschens“ wird über einen Faraday-Käfig gewährleistet. Ein Silber/Silberchlorid-Draht stellt die elektrische Verbindung zwischen Pipette und Vorverstärker her (Abb. 7).
Abb. 7. Pipettenhalter mit Elektrodendraht aus Silber, Patchpipette und elektrischem Anschluß zum Vorverstärker (aus Numberger und Draguhn 1996).
Eine langsame Hintergrundperfusion dient zur Durchführung von Vorinkubationsexperimenten, in der die Testlösung die gesamte Badlösung ersetzt (Abb. 6, Abb 15 F, Tab. 8). Für diese Arbeit wurde hauptsächlich ein ultraschnelles Applikationssystem verwendet. Die Testsubstanz oder die Kontroll-Lösung strömen aus einer Kapillare (Lösungsfilament) eines luftdruckbetriebenem Zweikammersystems in eine Messkammer, in die die
„gepatchte“ Zelle gesteuert wird (Abb. 8). Das über ein Piezokristall gesteuerte ultraschnelle Perfusionssystem wird zur schnellen Applikation des Neurotransmitters Glutamat auf Membranflecken (outside-out-patches) oder kleine ganze Zellen in der „whole-cell-Konfiguration“ verwendet (Dudel et al.
1990; Jahn et al. 1997; Jonas 1995; Jones und Westbrook 1996; Franke et al.
1987). Dieses System ermöglicht es, den Lösungswechsel unter 100 µs bis auf 40 µs genau zu definieren (Bufler et al. 1996; Heckmann et al. 1996; Jahn et al.
1998, Krampfl et al. 2001).
Abb. 8. Vereinfachte Darstellung der schnellen Applikationstechnik (seitliche Ansicht). Das Lösungsfilament (liquid filament) ist dunkelgrau dargestellt. Die beiden Fotographien rechts (Ansicht von oben) zeigen die Position der Pipettenspitze (siehe Pfeil) zum Lösungsfilament vor Applikation (oben) und nach Applikation (unten), (aus Numberger und Draguhn 1996).
Die ultraschnelle Substanzapplikation ist somit ein System, das den Lösungswechsel in kürzerer Zeit vornimmt als die schnellste zu messende Zeitkonstante (z. B. Anstiegszeit, Deaktivierung oder Desensitisierung). Die Kontrolle des schnellen Lösungswechsels nach jedem Experiment erfolgt durch eine in die Messkammer eingeführte, mit hypoosmolarer Lösung (Aqua dest.
und extrazelluläre Lösung im Verhältnis 9:1) gefüllten Pipette (Open-Tip- Messung, Abb. 12).
Abb. 9. Fotographische Abbildung eines Patch-Clamp-Messstandes, bestehend aus Faraday- Käfig (1), schwingungsgedämpftem Tisch (2), Patch-Clamp-Einheit (3), (siehe Abb. 6), Absaug- und Überlaufpumpen (4), Analog-Digital-Umwandler (5), Oszilloskop (6), Patch-Clamp- Verstärker (7), Ticker-Verstärker (8), Computereinheit zur „online“ Datenregistrierung (9) und DZM-Pipetten-Puller (10).
Je nach Fragestellung wird die Pulsdauer und Pulsfrequenz mit Hilfe der Software pClamp6 (Axon Instruments) programmiert und durch ein Piezo- Kristall-getriggertes Applikationssystem auf die Zelle oder den Membranfleck appliziert.
Für die Messungen werden Patchpipetten aus Borosilikatglas (Borosilikat, GC150TF-10 1.5 mm Außendurchmesser; 1.17 mm Innendurchmesser) in einem DZM-Pipetten-Puller (Zeitz Instruments) in zwei Arbeitsschritten hergestellt und unter Hitze poliert. Der von der Pipettenöffnung abhängige Widerstand liegt zu Beginn der Messung zwischen 6 und 12 MΩ. Nach Füllen der Pipette mit 0.01 ml Intrazellularlösung (s. Kap. Lösungen) und festem Einspannen in den Pipettenhalter, sowie Anvisierung der Zelle kann über eine seitlich am Pipettenhalter angebrachte Unterdruckvorrichtung die Zelle angesaugt werden.
2.6 Das Prinzip der Patch-Clamp-Technik
Abb. 10. Vereinfachte Darstellung der elektrischen Verschaltung zum Prinzip der Patch-Clamp- Technik. Upip: Pipettenspannung = Membranspannung in mV; Usoll: Sollspannung = Kommandospannung in mV; Uaus: Ausgangsspannung in mV; Rf = Rückkopplungswiderstand in Ω. Weitere Erläuterungen im Text (aus Numberger und Draguhn 1996).
Die Patch-Clamp-Technik stellt eine elektrophysiologische Methode dar, mit der das Messen von Ionenkanalströmen durch Membranen von nativen oder kultivierten Zellen ermöglicht wird. Gemessen wird jedoch nicht der direkte Strom, sondern ein sogenannter Kompensationsstrom. Dabei handelt es sich um eine Strominjektion des Vorverstärkers in die Pipette, die genau dann stattfindet, wenn das Membranpotential von einer vorgegebenen Sollspannung
Usoll abweicht. Der Kompensationsstrom ist genauso groß wie der Strom, der durch die Membran fließt, er ist diesem nur entgegengerichtet. Grundlage für diesen Vorgang ist ein Rückkopplungsmechanismus: Das Membranpotential wird gemessen und mit der Kommandospannung (Sollspannung) verglichen.
Bei einer Abweichung beider Potentiale wird der oben erwähnte Kompensationstrom in die Zelle injiziert. Die Funktionsweise des Vorverstärkers ist vereinfacht in dem Schaltbild in Abbildung 10 dargestellt. In den Operationsverstärker (OPA) wird das Pipettenpotential Upip und die über den Verstärker vom Experimentator vorgegebene Sollspannung Usoll eingespeist.
Bei einer Differenz dieser beiden Spannungen ensteht am Ausgang des OPA eine verstärkte, aber proportionale Spannung. Die über dem Rückkopplungswiderstand Rf liegende Spannung erzeugt einen Stromfluß (Kompensationsstrom) in der Pipette, aufgrund seines hohen Widerstandes nicht im OPA. Der Strom fließt bis zum Angleichen von Upip und Usoll. Die Ausgangsspannung, d.h. die Spannung über Rf wird an die Steuereinheit des Verstärkers gesandt und dort mit einem von Rf abhängigen Kalibrierungsfaktor in Stromstärke umgerechnet. Bei der Messung ist schließlich zum einen das Potential der Zelle oder der Pipette gleich Usoll und zum anderen wird der hierfür notwendige Kompensationsstrom aufgezeichnet.
Nach Auffinden einer geeigneten fluoreszierenden Zelle wird mit Hilfe des Mikromanipulators die zuvor in das Sichtfeld gebrachte Pipettenspitze langsam an die Zelle herangeführt. Die Erzeugung eines Widerstandes im GΩ-Bereich zwischen der Patchpipette und der Zellmembran durch Anlegen eines leichten
Unterdruckes ist Vorraussetzung für die elektrische Isolierung des durch die Elektrode bedeckten Membranbereiches von der Umgebung und damit für eine qualitativ hohe Messung. Durch Manipulationen mit dem Mikromanipulator, der Unterdruckvorrichtung oder Applikation kurzer Stromimpulse über den Verstärker können verschiedene Messkonfigurationen erzeugt werden (Abb. 11;
verändert nach Hamill et al. 1981). Die herausgelöste ganze Zelle (whole-cell) oder der aus der „whole-cell“ durch langsames Zurückziehen gewonnene Membranfleck mit nach außen zeigender extrazellulärer Seite (outside-out- patch) werden schließlich in die Messkammer vor die Kapillare des Applikationssystems gefahren. Die Pipette wird so vor dem ausströmenden Flüssigkeitsfilament eingestellt, so dass sie nur für die Zeit des Pulsprogramms mit der laminar ausströmenden Testsubstanz bzw. Kontroll-Lösung in Kontakt steht (Pusch und Neher, 1988; Marty und Neher, 1995).
Abb. 11. Vereinfachte Anordnung verschiedener Patch-Konfigurationen. Nach Kontakt der Zellmembran mit der Patchpipette und Anlegen eines Unterdruckes wird die Ausgangskonfiguration „cell attached“ erreicht. Ein höherer Unterdruck wird angelegt, um den von der Patchpipettenöffnung eingeschlossenen Membranteil einzureißen und damit eine Verbindung zwischen intrazellulärem Raum der Zelle und dem Inneren der Patchpipette zu schaffen. Entweder wird diese Zelle in der „whole-cell-Konfiguration“ langsam gelöst und in die Messkammer gesteuert oder die Patchpipette löst durch langsames Zurückziehen von der Zellmembran einen Membranfleck heraus, der schließlich ebenfalls in die Messkammer gefahren wird. Die extrazelluläre Seite des Membranfleckes zeigt charakteristischerweise nach außen (outside-out-patch), (aus Numberger und Draguhn 1996).
2.7 Pulsprogramme und Auswertung der Daten
Wie bereits in Kapitel 1 beschrieben, kommt es bei der Aktivierung von AMPA- und Kainat-Rezeptoren durch Glutamat zu einem schnellen Anstieg des
Stromtransienten bis zum Erreichen einer maximalen Amplitude und schließlich zu einer Abnahme der Stromantwort in Anwesenheit des Agonisten bis zur Einstellung eines Gleichgewichtsstromes. Das hier verwendete Computerprogramm clampEx (Axon Instruments) erlaubt die Aufnahme der Daten und die Erstellung von Pulsprogrammen, die die Applikationsdauer der Testlösung, sowie die Pausenintervalldauer vorgeben. Die in dieser Arbeit untersuchten unterschiedlichen kinetischen Größen erfordern zwei unterschiedliche Messprotokolle (Abb. 13, Tab. 1).
Zur Untersuchung der Deaktivierung werden Einzelpulse von 1 ms Dauer (Messprotokoll B) verwendet (Abb. 13 B). Die Parameter Desensitisierung und
„steady-state-Strom“ werden mit Hilfe von Einzelpulsen von 50, 100 oder 200 ms Dauer (Messprotokoll A, Abb. 13 A), die Aktivierung und die Spitzenstromamplitude in beiden Messprotokollen gemessen. Diese beiden Messprotokolle werden zur Untersuchung der Dosis-Wirkungsbeziehung auf die kinetischen Parameter in aufsteigenden Konzentrationsreihen von Brilliantsäuregrün bzw. Pentobarbital beginnend mit 10-4 bis maximal 10-2 mol angewandt. Der Puls wird für die Kontroll-Lösung und in jedem Konzentrationsbereich der Testsubstanz (Brilliantsäuregrün oder Pentobarbital) 3 bis 10 mal wiederholt. Eine weitere Variation stellen Vorinkubationsexperimente mit Pentobarbital zur Messung eines möglichen kompetitiven Blocks durch die Testsubstanzen dar. Dazu wird vor der schnellen Applikation eines 100 ms-Pulses Pentobarbital über die Hintergrundlösung appliziert.
Die Daten werden mit dem Programm Clampfit (Axon Instruments) ausgewertet. In jeder Sequenz (Kontrolle oder Testsubstanz) werden die 3-10 Einzelschüsse gemittelt und schließlich analysiert. τDeak, τDes und die ttp werden bei der statistischen Auswertung als Absolutwerte verwandt, die Amplitude wird vor der statistischen Auswertung aufgrund zu großer Schwankungen zwischen den Experimenten und zum Ausgleich einer zunehmenden Inaktivierung der gemessenen Ströme mit fortschreitender Dauer des Experimentes (Rundown) in die normalisierte Amplitude und der „steady-state“ in den relativen „steady- state“ umgerechnet (siehe Kap. 3.1-3.3). Die normalisierte Amplitude entspricht dem Mittelwert des Verums (Amplitude in pA) dividiert durch den Mittelwert der Kontrollen (Amplitude in pA) vor und nach der Testsubstanz-Gabe [Verum/(Kontrolle vor + Kontrolle nach )/2] ± Standardfehler. Der relative „steady- state“ berechnet sich aus dem Verhältnis aus „steady-state“ und Amplitude (relativer steady-state = steady-state/Amplitude). Zum Vergleich der Mittelwerte der kinetischen Parameter beider Rezeptoren (s. Kap. 3.5) und beider Testsubstanzen am Kainat-Rezeptor (s. Kap. 3.4) wurden die prozentualen Änderungen der Messgrößen des Verums gegenüber den Messgrößen der Kontrolle bestimmt (siehe Tab. 20).
Alle Experimente zum Messprotokoll B zur Bestimmung der Deaktivierung wurden an „outside-out-patches“ des AMPA-Rezeptors GluR2flipRN bzw. des Kainat-Rezeptors GluR6Q durchgeführt. Auch die Experimente des Kainat- Rezeptors zum Messprotokoll A zur Bestimmung der Desensitisierung liefen an Membranflecken in der „outside-out-Konfiguration“. Lediglich die
Desensitisierungskinetik (Messprotokoll A) des AMPA-Rezeptors GluR2flipRN konnte nur an „whole-cell-Experimenten“ bestimmt werden, da an „outside-out- patches“ keine messbaren Ströme vorzufinden waren.
ttp= 0.15 ms
30 pA 2 ms
Abb. 12. Darstellung eines „leaky patches“ mit einem Lösungswechsel innerhalb von 0.15 ms durch das piezobetriebene Applikationssystem und eines monoexponentiellen Fits der Anstiegszeit.
Puls
Puls A
B
Abb. 13. Schematische Darstellung der beiden verwendeten Pulsprogramme. Pulsprogramm A:
Einzelpulsprogramm zur Bestimmung der Aktivierung, Desensitisierung, des „steady-state- Stromes“ und der Spitzenstromamplitude mit einem 50-, 100- oder 200-ms-Einzelpuls für GluR6Q mit Wechsel zwischen schneller Applikaton von 3 mM Glutamat-Kontroll-Lösung und Brilliantsäuregrün-Glutamat-Lösung bzw. Pentobarbital-Glutamat-Lösung und für den GluR2 flipRN mit Wechsel zwischen Kontroll-Lösung und aufsteigenden Brilliantsäuregrün- Konzentrationen + 3 mM Glutamat (Dosis-Wirkungs-Experimente). Zusätzlich Vorinkubationsexperimente mit Pentobarbital am GluR6Q mit anschließendem 100-ms- Einzelpuls mit Pentobarbital-Glutamat-Lösung (Test eines kompetitiven Blocks). Zwischen den Einzelpulsen beträgt das Pausenintervall bei den Vorinkubationsexperimenten 30-60 s, bei den übrigen 10 s. Pulsprogramm B: Einzelpulsprogramm zur Bestimmung der Deaktivierung, Spitzenstromamplitude und Aktivierung, jeweils 1-ms-Einzelpulse wie in der oben unter A beschriebenen Struktur ohne Vorinkubationsexperimente.
Pulsprogramm- dauer [ms]
Programmtyp
Haltepotential [mV]
Verstärkung [mV/pA]
variable kinetische Parameter
50 100 200
A
-40 bis -60 10 bis 200 ttp [ms]
peak [pA]
Desensitisierung (τDes)
[ms]
steady state (c) [pA]
1
B
-40 bis -60 10 bis 200 ttp [ms]
peak [pA]
Deaktivierung (τDeak)
[ms]
Tab. 1. Darstellung der beiden unterschiedlichen Pulsprogrammtypen. Das Pulsprogramm, das Haltepotential und die Verstärkung werden während des gesamten Experiments konstant gehalten. Die gemessenen variablen Größen sind die kinetischen Parameter: time to peak (ttp), Amplitude (peak), Desensitisierung (τDes), Deaktivierung (τDeak) und „steady-state“ (c). τDeak,τDes
und die ttp werden bei der statistischen Auswertung als Absolutwerte verwandt, die Amplitude wird vor der statistischen Auswertung in die normalisierte Amplitude und der „steady-state“ in den relativen „steady-state“ umgerechnet. Die normalisierte Amplitude entspricht dem Mittelwert des Verums (Amplitude in pA) dividiert durch den Mittelwert der Kontrollen (Amplitude in pA) vor und nach der Testsubstanz-Gabe [Verum/(Kontrolle vor + Kontrolle nach )/2] ± Standardfehler. Der relative „steady-state“ berechnet sich aus dem Verhältnis aus „steady-state“ und Amplitude (relativer steady-state = steady-state/Amplitude).
2.8 Statistische Verfahren
Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS (Version 11.5). Nach dem Erstellen einer Matrix wurden die Daten zunächst deskriptiv untersucht. Die Signifikanzen der Mittelwertvergleiche der kinetischen Parameter innerhalb einer Stichprobe wurden mit dem t-Test für abhängige Stichproben bei vollständig geordneten Hypothesen (multipler Test), (Lehmacher 1991; Hecker 1974) getestet, wohingegen die Gruppenvergleiche mit dem t-Test nach Student für unabhängige Stichproben bei vollständig geordneten Hypothesen durchgeführt wurden. Die t-Tests wurden bei einem Signifikanzniveau von α≤ 0.05 zweiseitig getestet.
Der t-Test vollständig geordneter Hypothesen für abhängige Stichproben wurde als multipler Test für die Messreihen der Substanzen benutzt. Die Mittelwerte der elektrophysiologischen Parameter wurden jeweils in 3 Konzentrationen von Brilliantsäuregrün bzw. Pentobarbital und jeweils 3 mM Glutamat gegen die Kontrolle (3 mM Glutamat) getestet. Zur Beschränkung der Irrtumswahrscheinlichkeit auf 0.05 und zur Vermeidung der sogenannten
„Inflation des α-Fehlers“, wurde der t-Test sequentiell - bei der höchsten Konzentration beginnend und bei der kleinsten endend - durchgeführt. Die Gesamtprozedur wurde gestoppt, sobald eine Nullhypothese akzeptiert werden mußte (Lehmacher 1991). Zum Beispiel wurde mit dem t-Test für abhängige Stichproben für τDes an der Untereinheit GluR6Q des Kainatrezeptors bei der Konzentration 10 mM Pentobarbital + 3 mM Glutamat gegenüber τDes der
Kontrolle mit 3 mM Glutamat begonnen. Bei signifikantem Unterschied folgte die Testung von τDes der Konzentration 3 mM Pentobarbital + 3 mM Glutamat gegenüber τDes der Kontrolle, bei nicht signifikantem Ergebnis wurde der Test gestoppt.
Mit dem t-Test nach Student für unabhängige Stichproben (Pospeschill 2000) wurden zum einen die elektrophysiologischen Parameter der Substanzen Pentobarbital und Billiantsäuregrün am gleichen Rezeptor GluR6Q miteinander verglichen (Substanzvergleich, siehe Tab. 20), zum anderen die Parameter von Brilliantsäuregrün an den beiden Rezeptoren GluR6Q und GluR2flipRN (Rezeptorvergleich, siehe Tab. 20). Zum Beispiel wurde der t-Test für unabhängige Stichproben für die relative prozentuale Abweichung von τDes bei Pentobarbitalapplikation zu τDes der Kontrolle (Pentobarbitalgruppe) mit der relativen prozentualen Abweichung von τDes bei Brilliantsäuregrünapplikation zu τDes der Kontrolle (Brilliantsäuregrüngruppe) an der Untereinheit GluR6Q des Kainat-Rezeptors verglichen. Vor Anwendung des t-Testes für unabhängige Stichproben wurde mit dem Levene-Test getestet, ob Varianzhomogenität zwischen den beiden Gruppen besteht. Bei einer Signifikanz (σ) > 0.2 wurde der t-Test für gleiche, bei σ < 0.2 der t-Test für ungleiche Varianzhomogenitäten durchgeführt (Pospeschill 2000). Auch der t-Test für unabhängige Stichproben wurde als multipler Test sequentiell mit der größten Konzentration beginnend und mit der kleinsten endend bis zur Akzeptanz einer Nullhypothese durchgeführt.
