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wichtigsten exzitatorischen Transmitter im zentralen Nervensystem dar. Bereits 1954 wurde die exzitatorische Wirkung des Glutamats beschrieben (Hayashi, 1954). Wenige Jahre später wurde nachgewiesen, dass Glutamat spinale Neurone depolarisiert (Curtis et al., 1959; Zieglgänsberger und Puil, 1973). Glutamat ist eine im Organismus ubiquitär vorkommende Aminosäure mit vielfältigen Aufgaben. So dient Glutamat als Baustein für Proteine, als Bestandteil der Fettsäuresynthese und des Stickstoffmetabolismus. Außerdem ist es Substrat für die Synthese des inhibitorischen Transmitters γ Aminobuttersäure (GABA).
Durch die Klonierung spezifischer exzitatorischer Aminosäure Rezeptoren (EAA Rezeptoren) wurde nachgewiesen, dass Glutamat im ZNS als Transmitter dient.
Glutamat wird in den Nerventerminalen synthetisiert und in den synaptischen Vesikeln aufgenommen (Übersicht bei Dingledine und McBain, 1994; Nicholls, 1994).
Nach Depolarisation der Terminale wird in Abhängigkeit von der Erhöhung der präsynaptischen Ca2+ Konzentration Glutamat in den synaptischen Spalt ausgeschüttet. Darauf erfolgt die Bindung an ionotrope und metabotrope EAA Rezeptoren. Die Aktivierung bzw. Öffnung durch exzitatorische Aminosäuren führt zu einer lokalen Depolarisation der postsynaptischen Membran.
Duvoisin, 1995), während ionotrope exzitatorische Aminosäure Rezeptoren Liganden aktivierte selektive Kationenkanäle sind (Mayer und Westbrook, 1987).
Man unterscheidet NMDA Rezeptoren und Non NMDA Rezptoren. Zu den Non NMDA Rezeptoren zählen die AMPA Rezeptoren und die Kainat Rezeptoren. Die AMPA Rezeptoren werden spezifisch durch α Amino 3 Hydroxy 5 Methyl 4 Isoxazol Propionsäure (AMPA) aktiviert. Diese Rezeptoren aktivieren und desensitisieren im Verlauf weniger Millisekunden (Bettler und Mull, 1995; Hollmann und Heinemann, 1994; Seeburg, 1993). AMPA Rezeptoren vermitteln den überwiegenden Teil der schnellen exzitatorischen Neurotransmission und werden vorwiegend in exzitatorischen Synapsen exprimiert (Seeburg, 1993).
Kainat Rezeptoren werden spezifisch durch Kainat aktiviert und werden in Spinalganglien des Rückenmarks exprimiert, wobei ihre Funktion noch unklar ist (Bettler und Mulle, 1995; Hollmann und Heinemann, 1994; Seeburg, 1993).
Die NMDA Rezeptoren kommen ubiquitär im ZNS vor und spielen unter anderem eine wichtige Rolle bei der Nozizeption. Im Vergleich zu den AMPA und Kainat Reteptoren zeichnen sie sich durch eine langsamere Kinetik aus. NMDA Rezeptoren werden spezifisch durch N Methyl D Aspartat aktiviert (Hollmann und Heinemann 1994;
McBain und Mayer 1995; Seeburg 1993).
In der Gruppe der AMPA Rezeptoren wurden bisher vier verschiedene Untereinheiten (GluR1 4) mit mehr als zwanzig Subtypen identifiziert (Hollmann und Heinemann, 1994; Dingledine et al., 1999).
1.1.3 Charakteristika der AMPA Typ Glutamat Rezeptor Untereinheiten
Im Gegensatz zu anderen Liganden aktivierten Ionenkanälen, wie die nikotinischen Acetylcholin Rezeptoren oder GABAA Rezeptoren, zeichnen sich die AMPA Rezeptoren sowohl durch homooligomere sowie durch heterooligomere Assemblierung verschiedener Untereinheiten aus. Bis heute sind vier verschiedene Untereinheiten (GluR1 4) bekannt. In situ Hybridisierungen von Primatenhirnen konnten zeigen, dass die GluR1, 2, und 3 –Untereinheiten in mittlerer bis hoher Dichte in den meisten Hirnregionen vorkommen (Beneyto et al., 2004). Eine ähnliche Verteilung findet sich auch im menschlichen Motorkortex (Petri et al., 2004). Man nimmt an, dass die
kinetischen und pharmakologischen Eigenschaften eines Kanals jeweils durch vier Untereinheiten bestimmt werden. Aufgrund der Vielfalt der heterooligomeren Assemblierung verschiedener Untereinheiten zu einem Kanal entsteht eine Vielzahl von Kanälen, die sich in ihren kinetischen Eigenschaften und ihrem strukturellen Aufbau unterscheiden (Rosenmund et al., 1998; Mansour et al., 2001). Man geht davon aus, dass ein funktioneller AMPA Rezeptor als Tetramer vorliegt, also vier Untereinheiten einen Rezeptor bilden (Rosenmund et al., 1998), wobei bevorzugt Heterodimere gebildet werden
Abbildung 1 zeigt die Zusammensetzung eines AMPA Rezeptors aus vier Untereinheiten, wobei sich zwei Untereinheiten (X = AMPA Untereineiht 1 und Y = AMPA Untereinheit 2) nach dem dargestellten Verteilungsprinzip zu einem funktionellen Ionenkanal zusammensetzen (verändert nach Mansour et al., 2001)
2minosäuresequenz der einzelnen AMPA Rezeptor Untereinheiten von etwa 70%
(Keinänen et al.,1990).
Die Vielfältigkeit der verschiedenen Untereinheiten wird weiterhin durch alternatives Splicen und posttranskriptionelle mRNA Editierung erhöht.
Abbildung 2 zeigt die vereinfachte schematische Darstellung einer AMPA Rezeptor Untereinheit. Erklärung im Text.
Den AMPA Rezeptor Untereinheiten GluR1 4 gemeinsam ist, dass sie in jeweils zwei Splice Varianten, flip und flop, vorkommen. Jede Untereinheit liegt als eine der beiden Varianten vor, die durch mRNA Splicing zweier alternativer Exons der genomischen Sequenz entstehen. Die Translokationsprodukte finden sich zwischen der M3 und M4 Domäne (Sommer et al., 1990; Monyer et al., 1991; Seeburg et al., 1993; Swanson et al., 1997). 38 Aminosäuren werden durch die 115 Basenpaare
langen flip/flop mRNA Sequenzen kodiert. Je nach AMPA Rezeptor Untereinheit unterscheiden sich die flip/flop Varianten in fünf bis neun Aminosäuren.
Glutamat löst einen kurzen Spitzenstrom aus. Daraufhin erfolgt in Anwesenheit des Agonisten ein Stromabfall, die sogenannte Desensitisierung. Erst nach Erreichen einer Plateau Phase, dem steady state, wird von einem Zustand des Equilibriums zwischen dem Offenzustand und dem desensitisierten Zustand des Rezeptors gesprochen (Jonas und Sakmann, 1992; Sommer et al., 1990). Bei den flop Varianten der GluR1 4 beträgt dieser steady state Strom weniger als 1 2 % des Gesamtstromes (Partin et al., 1993; Sommer et al., 1990). Die Desensitisierung der GluR2flop Varianten erfolgt schneller als die der flip Varianten, während die GluR3flop Varianten eine langsamere Resensitisierungskinetik aufweisen als die GluR3flip Varianten. Die Flip und Flop Varianten des GluR1 unterscheiden sich nicht signifikant in ihren kinetischen Eigenschaften (Koike et al., 2000; Mosbacher et al., 1994). Es konnte gezeigt werden, dass postnatal ein Shift von der Expression der flip Varianten zu den flop Varianten stattfindet (Monyer et al., 1994).
Weitere C terminale Splice Varianten sind für den GluR2 und GluR4 (GluR2C, GluR4C) beschrieben (Gallo et al., 1992; Köhler et al., 1994). In wie weit hierdurch die Rezeptorkinetik beeinflusst wird, ist bisher unbekannt.
Für die Untereinheiten GluR2, 3 und 4 existiert eine mRNA Editierungsstelle. Diese auf Exon 13 lokalisierte R/G Editierungsstelle führt durch Austausch einer Base zur Translation der Aminosäure Glyzin (G), statt ursprünglich Arginin (R). Das Codon für Arginin befindet sich direkt vor der flip/flop Sequenz und ist das letzte auf dem Exon 13 lokalisierte Codon (Lomeli et al., 1994). AMPA Rezeptor Untereinheiten, bei denen an der R/G Editierungsstelle durch posttranskriptionellen Basenaustausch Arginin durch Glyzin ersetzt wurde, zeigen eine schnellere Kinetik in Bezug auf die Desensitisierung und Resensitisierung. Die verkürzte Resensitisierungszeit der editierten Form führt zu einer höheren Öffnungsfrequenz der entsprechenden Rezeptoren (Krampfl et al., 2002).
impermeabel für Kalzium, während die nicht editierten GluR2 Untereinheiten eine hohe Kalziumpermeabilität aufweisen (Burnashev et al., 1992; Burnashev et al., 1995; Curutchet et al., 1992; Hollmann et al., 1991; Hollmann und Heinemann, 1994; Hume et al., 1991; Mishina et al., 1991; Köhler et al., 1994; Seeburg et al., 1993; Verdoorn et al., 1991). Die editierte GluR2 Untereinheit weist im Gegensatz zu allen anderen AMPA Rezeptor Untereinheiten eine lineare Strom Spannungs Beziehung auf (Boulter et al. 1990; Jonas et al. 1994; Nakanishi et al. 1990;
Verdoorn et al. 1991). Die sogenannte N editierte GluR2 Untereinheit ist eine, in vitro durch Punktmutation hergestellte Variante, bei der anstelle des Glutamins (Q) Asparagin Rest (N) translatiert wird. Diese Form der GluR2 Untereinheit zeichnet sich durch eine ähnliche Charakteristik wie die an der Q/R Editierungsstelle editierte Form aus, besitzt aber eine höhere Leitfähigkeit, wodurch sie Vorteile für elektrophysiologische Untersuchungen aufweist (Krampfl et al., 2002).
Es wird davon ausgegangen, dass verschiedene Untereinheiten in einem funktionellen Rezeptor sich in ihren kinetischen Eigenschaften, wie Desensitisierung und Resensitisierung, gegenseitig beeinflussen (Mansour et al., 2001; Brorson et al., 2004). Elektrophysiologische Untersuchungen an heteromeren AMPA Rezeptoren, bestehend aus den Untereinheiten GluR1 flip und GluR2 flip RN, konnten zeigen, dass die Resensitisierung dieser Rezeptoren durch die GluR2 flip RN Untereinheit dominiert wird, unabhängig vom Anteil der cDNA Menge der GluR2 flip RN Untereinheit. Die Desensitisierung veränderte sich hierbei je nach cDNA Menge der einzelnen Untereinheiten, und näherte sich jeweils der Kinetik der Untereinheit, die stärker exprimiert wurde (Grosskreutz et al., 2003).
P
(c in pA)
Gleichgewichtseinstellung in Anwesenheit des Agonisten zwischen Offenzustand und desensitisierten Zustand des Rezeptors
( in ms): Abnahme der
Stromamplitude nach Beendigung der Applikation des Agonisten
τdeakt.
( in ms): Abnahme der
Stromamplitude in Anwesenheit des Agonisten
τdes.
maximale Amplitude (Pmax. in pA)
(t in ms)R
Applikationszeit des Agonisten (10 mM Glutamat)
c
tR
τdes.
Pmax
τdeakt
Abbildung 4 zeigt allgemeine elektrophysiologische Eigenschaften von Stromtransienten der AMPA Rezeptor Kanälen, am Beispiel eines homomeren GluR2 flip GR Kanals.
Die in Abbildung 3 gezeigte Stromkurve stellt einen typischen Stromtransienten eines AMPA Rezeptors dar. Nach schneller Applikation einer sättigenden Konzentration von Glutamat kommt es zu einem schnellen Stromanstieg bis zum Erreichen einer maximalen Spitzenstromamplitude. Danach erfolgt in Anwesenheit des Agonisten ein Stromabfall, die sogenannte Desensitisierung, bis zu einer niedrigen „steady state Stromamplitude“. Dieser „steady state Strom“ kann bei GluR2 flip Kanälen bis zu 10
% der maximalen Spitzenstromamplitude ausmachen.
In den weiteren Kapiteln dieser Arbeit werden folgende Abkürzungen zur Beschreibung der einzelnen Subtypen der AMPA Rezeptor Untereinheiten verwendet:
1.1.4 Klinische Bedeutung der AMPA Typ Glutamat Rezeptoren
1.1.4.1 Exzitotoxizität des Glutamats
Normalerweise ist die extrazelluläre Glutamatkonzentration sehr niedrig (0,6 M), da hohe Glutamatkonzentrationen neurotoxisch wirken können (Lipton et al., 1994). Als Exzitotoxizität wird eine exzessive Aktivierung von Glutamatrezeptoren bezeichnet mit der Folge einer massiven Erhöhung der synaptischen Glutamatkonzentration.
Hierdurch kommt es zur prolongierten Neuronendepolarisation. Die andauernde Depolarisation führt durch drei Mechanismen zum Untergang von Nervenzellen (Doble et al.,1999):
І.
Osmotische Zellschwellung durch erhöhten Na+ und H2O Einstrom
ІІ.
Exzessiver Ca2+ Einstrom in die Zelle
ІІІ.
Weiterandauernde Glutamat Ausschüttung durch Zelluntergang oder Ca2+
induzierter postsynaptischer Glutamatvesikel Exozytose, was zu einer Ausbreitung der Exzitotoxizität führt.
Der Mechanismus der Exzitotoxizität wird in der Pathogenese vieler neurodegenerativer Erkrankungen diskutiert. So fanden sich bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose (ALS) erhöhte Glutamatkonzentrationen in Rückenmark und motorischen Kortex (Rothstein et al. 1990). Bei Patienten mit Epilepsie und Hippocampussklerose zeigten sich iktal und postiktal erhöhte Glutamatkonzentrationen (Mathern et al. 1999). In Mausmodellen konnten Hinweise dafür gefunden werden, dass bei spongioformer Enzephalopathie (Creutzfeld Jacob Erkrankung) die Glutamataufnahme in Astrozytenkulturen gehemmt wird (Brown et al. 1999). Auch für Morbus Parkinson, Morbus Huntington und Morbus Alzheimer wird die Exzitotoxizität des Glutamats als ein pathogenetischer Faktor vermutet. Zu dieser
chronischen Exzitotoxizität kommt es durch den Anstieg des intrazellulären Ca2+
Spiegels durch einen erhöhten Ca2+ Einstrom durch glutamataktivierte Ionenkanäle, durch eine verminderte intrazelluläre Ca2+ Pufferkapazität und durch die verminderte Funktion glialer Glutamat Transporter (Ludolf et al., 2000, Rowland und Shneider, 2001).
Nicht nur bei chronischen neurologischen Erkrankungen sondern auch bei akuten neurologischen Erkrankungen scheint die exzitotoxische Wirkung des Glutamates eine wichtige Rolle zu spielen. Auch hier wurden Veränderungen im Glutamattransporter System beschrieben (Doble et al., 1999, Lipton et al., 1994, Rao et al., 1998, Robinson et al., 1999, Torp et al., 1995). So führt die mechanische Zellschädigung bei einem Schädel Hirn Trauma zu einer exzessiven Glutamatfreisetzung. Eine akute Ischämie, Hypoxie oder Hypoglykämie hemmt die Na+/K+ ATPase, wodurch es aufgrund des Abfalls des elektrochemischen Gradienten zu einem intrazellulären Na+ Anstieg kommt. Der Na+ Glutamat Kotransport sistiert bzw. kehrt sich um, wodurch die extrazelluläre Glutamatkonzentration ansteigt. Auch in diesen Fällen führt die starke Erhöhung der Glutamatkonzentration zur Glutamatrezeptor vermittelten Exzitotoxizität.
1.1.4.2 Bedeutung der AMPA Typ Glutamat Rezeptoren bei der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)
Bei der chronischen Exzitotoxizität scheint der unkontrollierte Ca2+ Einstrom durch Ca2+ permeable AMPA Rezeptoren ein wichtiger Pathomechanismus zu sein. Die Ca2+ Leitfähigkeit wird durch die Q/R Editierungsstelle determiniert. Somit wird die Ca2+ Leitfähigkeit durch die GluR2 Untereinheiten determiniert, da nur sie diese Editierungsstelle aufweisen (siehe auch Kapitel 1.1.3). Ein funktioneller AMPA Rezeptor ist impermeabel für Ca2+ Ionen, wenn in einer oder mehreren Untereinheiten die Editierung der Aminosäure Arginin (R) vorliegt. Es wird vermutet,
Das Krankheitsbild der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) wurde erstmals 1869 von J. M. Charcot beschrieben. Morphologisch liegt eine Degeneration des 1. und 2.
Motoneurons zugrunde. Histopathologisch zeigt sich ein Neuronenverlust im Bereich des primärmotorischen Kortex, der kaudalen Hirnnerven und in den Vorderhörnern des Rückenmarks. Die Symptomatik ist durch atrophische Paresen und Muskelfaszikulationen gekennzeichnet. Eine kausale Therapie der ALS existiert bislang noch nicht. Nach einer Krankheitsdauer von 3 5 Jahren versterben die Patienten durch Ateminsuffizienz oder Aspirationspneumonie aufgrund massiver Schluckstörungen.
Die amyotrophe Lateralsklerose scheint in ihrer Pathogenese multiple Faktoren aufzuweisen. So werden Mutationen im Gen der Cu/Zn Superoxiddismutase 1 (SOD1, insbesondere bei der familiären ALS/FALS), Veränderungen von Neurofilamenten, eine erhöhte Belastung mit freien Radikalen (auch als „oxidativer Stress“ bezeichnet), verschiedene Formen mitochondrialer Schädigungen, eine erhöhte Expression proapoptotischer Proteine sowie eine Fehlregulation neurotropher Faktoren als Ursache diskutiert (Eisen et al., 1995; Eisen et al., 1998; Übersicht bei Ludolph, 2000; Rowland und Shneider, 2001). Rothstein wies 1990 als erster erhöhte Konzentrationen von Glutamat im Liquor und Serum von ALS Patienten nach (Rothstein et al., 1990). Außerdem fanden sich Auffälligkeiten eines synaptischen Glutamat Transporters (Rothstein et al., 1992), der Ca2+ Pufferkapazität vulnerabler Neurone (Ince et al., 1993), sowie Auffälligkeiten an postsynaptischen glutamatgesteuerten Ionenkanalrezeptoren (Samarasinghe et al., 1996; Williams et al., 1997; Takuma et al., 1999). Vor allem wurden Auffälligkeiten in der Zusammensetzung der Untereinheiten von AMPA Rezeptoren beschrieben (Williams et al., 1997). Weiterhin zeigte sich, dass die GluR2 Untereinheit in den Neuronen des motorischen Systems verhältnismäßig schwach exprimiert wird (Takuma et al., 1999). Besonders die Ca2+ impermeable GluR2 Untereinheit wird bei Patienten mit ALS schwach exprimiert (Shaw et al., 1999).
Die Inkubation von kultivierten Ratten Motoneuronen mit Inhibitoren der Glutamataufnahmeproteine führte in vitro zum Zelltod. Wurden diese Zellen mit AMPA Rezeptor Antagonisten inkubiert lies sich dieses verhindern (Rothstein et al., 1993). Couratier inkubierte Primärkulturen kortikaler Rattenneurone mit Liquor von ALS Patienten, wodurch es ebenfalls zum Zelltod kam (Couratier et al., 1993). Auch
dieser Effekt ließ sich durch die Verabreichung von AMPA Rezeptor Antagonisten verhindern. Neure Untersuchungen zeigten, dass der Glutamat induzierte Zelltod von Motoneuronen durch die Blockade von AMPA Rezeptoren verhindert werden kann, während die Gabe von NMDA Rezeptor Antagonisten keinen Schutz vor Exzitotoxizität bot (Vandenberghe et al., 2000; Urushitani, 2001).
1.2 Fragestellung
Um die Pathophysiologie von neurodegenerativen Erkrankungen verstehen zu können, ist es notwendig die physiologischen Gegebenheiten zu kennen. Mit Kenntnis der elektrophysiologischen Eigenschaften von AMPA Rezeptoren und den pathomorphologischen Veränderungen bei neurodegenerativen Erkrankungen lassen sich zudem pharmakologische Angriffspunkte identifizieren.
Mit der Annahme, dass AMPA Rezeptoren mehrheitlich als Heterooligomere vorliegen, die sich insbesondere aus GluR1 und GluR2 Untereinheiten zusammensetzen (Mansour et al., 2001) und auf der Grundlage basierend, dass die Resensitisierungskinetik durch die editierte GluR2 Untereinheit dominiert wird (Grosskreutz et al., 2003), sollen in dieser Arbeit verschiedene heterooligomere Assemblierungen von AMPA Rezeptor Untereinheiten mit der Patch Clamp Technik untersucht werden. Ziel ist es die elektrophysiologischen Eigenschaften der verschiedenen Untereinheiten Kombinationen zu beschreiben. Zu diesem Zweck wurden die Parameter Desensitisierung, Resensitisierung und die Strom Spannungs Beziehung folgender Coexpressionen bestimmt: GluR1 flip/GluR2 flop GN, GluR1 flip/GluR3 flip, GluR1 flop/GluR2 flip GQ, GluR1 flop/GluR2 flop RN, GluR1 flop/GluR2 flop GN, GluR1 flop/GluR3 flop, GluR2 flip GQ/GluR2 flop GN, GluR2 flip GN Glu3 flip, GluR2 flip RN/GluR3 flop, GluR2 flop RN/GluR2 flop RN, GluR2 flop GN/GluR3 flop
3lop und GluR2 flip GR untersucht. Ziel dieser Untersuchungen war es die Wirkung des IEM 1460 zu analysieren und die Ergebnisse in Bezug auf einen möglichen neuroprotektiven Effekt zu diskutieren.
( ()
@.1 Tansiente Expression und Zellkultivierung
In einem Kulturmedium, bestehend aus 500 ml Hams F 12 Medium, 500 ml Dulbecco’ s Modifiertes Eagle Medium (DMEM), 10 % fetalem Kälberserum sowie 5 ml einer Antibiotikalösung, die sich aus 100 IE/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin zusammensetzt, wurden die transformierten humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) 293, welche zur Expression von GluR Kanälen verwendet wurden, bei 37o C in einem Inkubator mit 5 % CO2 und 95 % Raumluft in speziellen Zellkulturflaschen kultiviert.
Die cDNA der AMPA Rezeptoren (GluR1 flip und flop, GluR2 flip und flop sowie editierte und nicht editierte Form, GluR3 flip und flop) lag als Expressionsprodukt subkloniert in pcDNA3 Expressionsvektoren (Invitrogen) vor. Zur Identifikation der transfizierten Zellen diente ein grünes Fluoreszenzprotein (GFP).
Am Vortag eines jeden Experimentiertages wurde die Rezeptor cDNA in die HEK293 Zellen transfiziert, da die transient exprimierten Rezeptoren zwischen der 15. und 72.
Stunde nach der Transfektion ausreichend exprimiert werden (Neumann et al. 1982, Krampfl et al., 2001).
2.2 Transfektion
Das Einbringen von Fremd DNA in lebende eukaryote Zellen bezeichnet man als Transfektion. Mit der sogenannten Elektroporationstechnik wurde die Rezeptor cDNA in die HEK293 Zellen eingebracht.
/H mM NaH2PO4 in entionisiertem Wasser angesetzt, (DEPC (Diethylpyrocarbonat) behandelt) und autoklaviert. Die Zellen wurden vorsichtig unter Zugabe einer Trypsin Lösung vom Flaschenboden gelöst. Es erfolgt nun eine Resuspendierung durch Auf und Abpipettieren. 3 ml der Suspension wurden zum Animpfen einer neuen Kulturflasche verwendet, während der Rest in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen pipettiert wurde und anschließend für 5 Minuten bei 1000 rpm und 36o zentrifugiert wurde. In der Zwischenzeit wurden die, mit 12 mm dicken Deckgläschen versehenen, runden Zellkammern (Wells) sowie die neu beimpfte Flasche mit Kulturmedium aufgefüllt. Für die Expression heterodimerer AMPA Rezeptor Untereinheiten wurde die jeweilige cDNA in einem Verhältnis von 0:4, 1:3, 2:2, 3:1, 5:1 oder 4:0 miteinander kombiniert. In einem Eppendorfgefäß wurden nun 20 g des „cDNA Gemisches“ und 5 g Fluoreszenzprotein DNA (GFP) vermischt und anschließend zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Rest mit 50 l MgSO4 und 2 ml Elektroporationspuffer, bestehend aus 50 mM K2HPO4 und 20 mM K Acetat in 1 l Aqua dest., aufgefüllt. Es erfolgte eine erneute Resuspendierung durch weiteres Auf und Abpipettieren. Daraufhin wurden Plasmid DNA und jeweils 0,4 ml Zellsuspension in dem Eppendorfgefäß vermischt und in die Elektroporationsküvette pipettiert. In der Küvette befinden sich Elektroden, durch die ein Stromimpuls appliziert wird.
Durch diesen Stromimpuls wird die Membran der HEK293 Zellen vorübergehend für die Plasmid DNA permeabel, so dass sie in die Zelle aufgenommen wird. Die transfizierten Zellen wurden in Wells a 40 60 l pipettiert und für mindestens 15 Stunden im Brutschrank inkubiert.
2.3 Versuchsaufbau
Um die HEK293 Zellen darzustellen wurde ein aufrechtes Mikroskop (Zeiss) mit einem 40 fach Wasserimmersionsobjektiv verwendet. Der Patch Clamp Meßplatz steht auf einem schwingungsgedämpften Tisch um gegenüber mechanischen Erschütterungen und Schwingungen geschützt zu sein. Damit keine elektrischen Signale von außen die Messungen stören, befindet sich der Messplatz in einem Metallkäfig (Faraday Käfig). Ein Mikromanipulator mit einer Bewegungsgenauigkeit
unter 1 m sorgt für die exakte Steuerung der Patchpipette innerhalb des Sichtfeldes in der Messkammer. Der Pipettenhalter ist fest auf dem schwingungsgedämpften Tisch montiert. Die Patchpipette wird in einem flachen Winkel zwischen Messkammer und Objektiv positioniert und im Pipettenhalter fixiert. Die Patchpipetten aus Borosilicatglas wurden an einem DZM Pipetten Puller (Zeitz Instruments) in zwei Schritten hergestellt und unter Hitze poliert. Es wurden in dieser Arbeit Pipetten mit einem Ausgangswiederstand von 7 10 M . Die Pipetten wurden mit 0,01ml Intrazellularlösung gefüllt, welche sich aus 140 mM KCL, 11 mM EGTA, 10 mM Hepes, 10mM Glukose und 2mM MgCl2 zusammensetzt. Der pH Wert dieser Lösung wurde mit 1 M KOH auf 7,4 eingestellt und die Osmolarität mit Mannit auf einen Wert von 340 mosml1 eingestellt.
Das Ansaugen der Zellen an die Patchpipette ist aufgrund einer Unterdruckvorrichtung, die seitlich am Pipettenhalter angebracht ist, möglich. Der Unterdruck wird durch vorsichtiges Aufziehen einer 50 ml Perfusorspritze erzeugt. In der Mitte des Objekttisches ist eine Öffnung in der die rechtwinklige Kunststoff Messkammer eingelassen ist. Am Boden der Messkammer ist ein, mit Silikon abgedichtetes, Glasplättchen angebracht. Seitlich der Messkammer ist ein Glasrohr befestigt, womit die Kammer mit der sogenannten Badlösung mit einer Perfusionsgeschwindigkeit von 2ml/min perfundiert wird. Am anderen Ende befindet sich eine Absaugvorrichtung. Das Glasrohr besitzt eine etwa 0,8 cm lange Einfräsung, so dass eine Verbindung zur Messkammer besteht und so die Kammer kontinuierlich mit Badlösung umspült wird. In die Einfräsung des Glasrohres ist eine Kapillare zur Applikation der Testlösungen. Um einen konstanten Flüssigkeitsspiegel in der Kammer zu halten ist eine weitere Absaugvorrichtung am Kammerrand installiert, wodurch auch ein Überlaufen der Badlösung verhindert wird. Als Badlösung wurde eine Ringerlösung verwendet, welche aus 162 mM Na Cl, 5,3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 0,67 mM Na2H2PO4, 0,22 mM KH2PO4, 15 mM Hepes und 5,6 mM Glukose besteht.
Der pH Wert wurde mit NaOH (Natronlauge) auf 7,4 , die Osmolarität auf 340
*
@
4
6
1) Mikromanipulator, 2) Pipettenhalter mit Patchpipette, 3) hydraulischer Objekttisch mit Messkammer, 4) Mikroskop mit 40 fach Wasserimmersionsobjektiv, 5 Ansaugspritze, 6) Applikationssystem
1 2
3
4 5 6
7
8
1) Faradaykäfig, 2) Digital Analog Umwandler, 3) Lichtverstärker, 4) Oszilloskop, 5) Patch Clamp Verstärker, 6) Tickerverstärker, 7) Computer zur Datenregistrierung, 8) schwingungs gedämpfter Tisch
Die Geräte befinden sich rechts neben dem Patch Clamp Messstand, der auf diesem Bild nicht zu erkennen ist.
2$$ildung 4 zeigt Bilder des Messplatzes. Nicht zu erkennen sind die Absaugpumpen, die sich außerhalb des Faraday Käfig befinden.
Die Deckgläschen, auf denen die HEK293 Zellen kultiviert wurden, wurden in die Mitte der Messkammer positioniert. Die Pipettenspitze wurde zunächst in das Sichtfeld eingeführt und nach Identifizierung einer entsprechend fluoreszierenden Zelle, vorsichtig an die Zelle herangeführt. Zwischen Patchpipette und Zellmembran entstand ein Widerstand im G Bereich und durch Erzeugung eines leichten Unterdruckes wurde nun der Membranbereich, der durch die Elektrode bedeckt wurde, elektrisch isoliert. Abbildung 5 zeigt verschiedene Messkonfigurationen, die durch Manipulationen am Mikromanipulator, der Unterdruckvorrichtung oder durch Applikation kurzer Stromimpulse, erreicht werden können.
+
2$dichten mit geringem Widerstand (~25M ) kurzzeitiges Anlegen eines Unterdruckes
mit hohem Widerstand (G )
,-.)/
Anlegen von Unterdruck
Abziehen der Patchpipette
Abziehen der
Patchpipette Abziehen der
Patchpipette Abziehen
der
Patchpipette
Abziehen der Patchpipette
Exposition des Vesikels an der Luft/Wasser Phasengrenze
,0)./ , / , /
+
Die Abbildung zeigt die vereinfachte Darstellung unterschiedlicher Patch Konfigurationen. Zunächst wird durch Kontakt der Patchpipette mit der Zellmembran und Anlegen eines leichten Unterdruckes die Ausgangskonfiguration „cell attached“
erreicht. Wird nun der Unterdruck vorsichtig erhöht kommt es zum Einreißen des von der Pipette eingeschlossenen Membranteils. Hierdurch entsteht eine Verbindung zwischen dem Intrazellularraum der Zelle und dem Inneren der Patchpipette. Die
,elle befindet sich nun in der „whole cell Konfiguration“ und kann direkt für Messungen verwendet werden. Wird die Pipette jedoch langsam entfernt, wird ein Membranfleck aus der Zellmembran herausgerissen. Hierbei ist die extrazelluläre Seite der Zellmembran bzw. des Membranfleckes nach außen gerichtet. Wird die Patchpipette in der „cell attached Konfiguration“ zurückgezogen und kurzzeitig der Luft Wassergrenze ausgesetzt, kommt es zur „inside out Konfiguration“, bei der die intrazelluläre Seite der Zellmembran bzw. des Membranfleckes nach außen gerichtet ist. (Abbildung modifiziert nach Hamill et al., 1981)
2.4 Prinzip und Anwendung der Patch Clamp Technik
Die Patch Clamp Technik ist ein Messverfahren ,dass die Aufzeichnung von Einzelkanalaktivitäten, deren Ströme Bereich weniger pA liegen, ermöglicht.
Gemessen wird bei der Patch Clamp Technik der Kompensationsstrom I. Dieser Kompensationsstrom errechnet sich aus der Differenz zwischen der Membranspannung (Membranspannung = Pipettenspannung Upip) und der sogenannten Soll oder Kommandospannung (Usoll). In einem, dem Verstärker vorgeschaltetem, Vorverstärker werden zunächst die Membranspannung Upip und die Sollspannung Usoll in einem Operationsverstärker miteinander verglichen. Danach wird über einen Rückkopplungswiderstand (Rf) ein entgegengesetzter Strom in die Zelle injiziert, der proportional der Differenz aus Upip und Usoll ist. Die Sollspannung Usoll und die, aus dem Differenzstrom errechnete, Spannung am Rückkopplungswiderstand Rf werden an den Verstärker weitergeleitet und zu einer Ausgangsspannung Uaus verrechnet. Der Kompensationsstrom I wird nach der Gleichung U=R*I umgerechnet.
1
Abbildung 6 zeigt die vereinfachte Darstellung der elektrischen Verschaltung eines Patch Clamp Verstärkers, mit Vorverstärker und schematischer Darstellung einer
„whole cell Messung“. Rf: Rückkopplungswiderstand in Ohm, Usoll: Kommando oder Sollspanung in mV, Upip: Pipetten bzw. Membranspannung in mV, Uaus: Ausgangsspannung in mV (Numberger und Draguhn, 1996)
@.5 Prinzip der schnellen Applikation
Damit eine schnelle Applikation des Neurotransmitters Glutamat auf die outside out patches bzw. kleine Zellen in whole cell Konfiguration gewährleistet werden konnte, wurde ein Piezokristall gesteuertes ultraschnelles Perfusionssystem verwendet (Dudel et al., 1990; Franke et al., 1987; Jahn et al., 1998). Dieses System ermöglicht einen Lösungsaustausch in unter 100 s (Bufler et al., 1996: Heckmann et al.,1996; Jahn et al. 1998; Krampfl et al., 2002) und bis zu 40 s an outside out patches.
2
Glaskappilare
Glasröhrchen mit Einfräsung Lösungsfilament
Badlösung/Hintergrundlösung (Extrazellulärflüssigkeit) Piezokristall gesteuerter Hub von 20 m
Patchpipette mit Elektrode
Referenzelektrode
Durch das Glasröhrchen fliest, durch Schwerkraft getrieben, die Badlösung (Extrazellulärlösung), auch Hintergrundlösung genannt. Innerhalb des Röhrchens befindet sich eine Glaskapillare, über die die Agonisten Lösung mit Überdruck appliziert wird. Hintergrundlösung und Agonisten Lösung haben die gleiche Fließrichtung, so dass sich unter laminaren Strömungsverhältnissen das sogenannte Lösungsfilament bildet, welches sich scharf von der Hintergrundlösung abgrenzt. Zur visuellen Identifizierung des Lösungsfilamentes wurde die Agonisten Lösung blau angefärbt. Die Zelle oder der outside out patch wird an der Grenze von Lösungsfilament und Hintergrundlösung platziert. Die Aktivierung des Piezokristalls führt dazu, dass sich das Flüssigkeitsfilament um 20 m auf die Zelle bzw. auf den outside out patch zubewegt. Wird der Piezokristall wieder inaktiviert bewegt sich das Flüssigkeitsfilament wieder zurück in seine Ausgangsposition (siehe Abbildung 9).
Somit wird die Applikationsdauer des Agonisten durch die Dauer der Aktivierung des Piezokristalls bestimmt. In dieser Arbeit wurde eine Dauer von 100 ms gewählt.
3
Piezokristall
geateuerter Hub von 20 m a) Ausgangsposition,
Patchpipette mit Zelle an der Grenze zwischen Flüssigkeitsfilament und Hintergrundlösung
b) Applikation, Patch taucht für 100 ms in das Lösungsfilament ein
c) Ende der Applikation, Rückkehr in die Ausgangsposition
Abbildung 8 zeigt die schematische Darstellung der Piezokristall gesteuerten Applikation (Abbildung modifiziert nach Numberger und Draghun, 1996).
Am Ende eines jeden Experimentes wurde der schnelle Lösungswechsel kontrolliert, indem eine mit hypoosmolarer Lösung (Aqua dest. und extrazelluläre Lösung im
<erhältnis 9:1) gefüllte Pipette den schnellen Austausch simulierte. Mit der Software pClamp6 (Axon Instruments) wurden Pulsdauer sowie Pulsfrequenz programmiert und mittels des Piezokristall getriggertem Applikationssystem auf die outside out patches oder die kleinen Zellen in whole cell Konfiguration appliziert. In allen Experimenten dieser Arbeit wurde eine einheitliche Konzentration von 10 mM Glutamat als Agonisten Lösung verwendet.
2.6 Verwendete Substanzen
Als Agonist wurde für die Messungen eine 10 millimolare Glutamat Lösung verwendet. An einem jeden Messtag wurde diese aus Na+ L Glutamat (Merck, USA) und Aqua dest. hergestellt. Der AMPA Rezeptor Antagonist IEM 1460 (Sigma, Deisenhofen Deutschland) wurde in Pulverform vom Hersteller geliefert. In Applikationspuffer aufgelöst wurden Antagonisten Lösungen in den Konzentrationen 0,01 mM, 0,1 mM, 0,3 mM und 1mM verwendet. Auch diese Lösungen wurden zu Beginn eines jeden Messtages neu angesetzt. Der chemische Name des IEM 1460 lautet 1 Trimethylammonium 5 (1 adamantinmethylammonium)penthan dibromid, die Summenformel ist C19H38N2Br2. In Abbildung 10 ist die Strukturformel des IEM 1460 wiedergegeben.
4
2.7 Datenerhebung und Auswertung
2.7.1 Pulsprogramme
Die Aktivierung von AMPA Rezeptoren führt zu einem schnellen Anstieg des Stromtransienten bis zum Erreichen einer maximalen Stromamplitude. Nachdem diese erreicht ist, fällt der Strom, in Anwesenheit des Agonisten, wieder bis zur Einstellung eines Gleichgewichtsstromes ab (siehe Kapitel 1.1.3).
Im Vorfeld der Experimente erfolgte, in Bezug auf die kinetischen Eigenschaften der AMPA Rezeptor Untereinheiten, die Abstimmung der Pulsprogramme. In Abbildung 10 sind die verwendeten Pulsprogramme schematisch dargestellt.
5
A
B
Puls 1
Puls 1 Pausenintervall von 10 300 ms zunehmend
Puls 2
Abbildung 10 :
Pulsprogramm A : Einzelpulsprogramm zur Bestimmung der Desensitisierung und Strom Spannungs Beziehung, die Länge eines Einzelpulses betrug 100 ms. Zwischen
-ulsprogramm B: Doppelpulsprogramm zur Bestimmung der Resensitisierung, die Länge der beiden Pulse betrug ebenfalls 100 ms. Das Pausenintervall (gestrichelte Linie) zwischen den beiden Pulsen begann mit 20 ms und verlängerte sich in 10 ms – Schritten bis 300 ms.
2.7.2 Stromaufzeichnung
Die Glutamat induzierten Ströme wurden mit der pClamp 6.0 Software (Axon Instruments) durch einen Computer gesteuerten Patch Clamp Verstärker (Axopatch 200B, Axon Instruments, Union City, CA) aufgezeichnet. Die Digitalisierungsrate betrug 20 kHz (Digidata 1200 Interface) und die Tiefpass Eckfrequenz 5 kHz. Die Ströme wurden auf einer Festplatte gespeichert und mit der Software Clampfit 6.0 (Axon Instruments) ausgewertet.
2.7.3 Messgrößen
2.7.3.1 Desensitisierung (
τ
des. in ms)Die Desensitisierung wurde an outside out patches gemessen. Whole cell patches haben zwar eine längere Haltbarkeit, doch konnten vergleichende Messungen an outside out patches und whole cell patches zeigen, dass whole cell patches eine langsamere Desensitisierungskinetik aufweisen als outside out patches (Grosskreutz et al., 2003). Die Desensitisierung wurde mit einer monoexponentiellen Funktion berechnet. Es wurde ein Haltepotential von –60 mV gewählt.
2.7.3.2 Resensitisierung (
τ
res. in ms)wurde ein Quotient gebildet. Die Berechnung der Resensitisierung erfolgte durch eine monoexponentielle Gleichung. Der errechnete Wert wird ohne Standardabweichung angegeben, da es sich um eine Zeitkonstante handelt, welche aus den gemittelten Werten der Resensitisierung der einzelnen Experimente errechnet wird. Das Haltepotential betrug auch hier –60 mV.
2.7.3.3 Maximale Stromamplitude (Pmax in pA)
Die Messung der maximalen Stromamplitude diente der Bestimmung der Strom Spannungs Beziehung und der Resensitisierung. Weiterhin erfolgte über die Messung der maximalen Stromamplitude die Bestimmung des Ausmaßes der, durch die Substanz IEM 1460 verursachte, Blockade der AMPA Rezeptoren.
2.7.3.4 Strom Spannungs Beziehung
Um die Strom Spannungskennlinie zu ermitteln wurden die maximalen Stromamplituden bei positiver und negativer Spannung gemessen. Aus diesen Werten wurde ein Quotient gebildet, der so genannte Rektifizierungs Index [Rektifizierungsindex = I(+40mV)/I( 40mV)]. Das Haltepotential betrug hierbei – 40 mV bzw. +40mV.
2.7.4 Auswertung
Die Auswertung erfolgte mit der Software pClamp6 (Axon Instruments), den Tabellenkalkulationsprogrammen Excel 2000 und Origin 7.0 , sowie SPSS 6.0. Zur statistischen Analyse wurde der Student’ s t test verwendet. Die Signifikanz wurde definiert bei p< 0,05 (Schlesinger et al. 2005, O’ Dowd et al. 1988). Abbildungen und Tabellen wurden mit Corel Draw 11.0 und Word 2000 erstellt. Die Fotos wurden mit einer Digitalkamera (Canon IXUS 430) aufgenommen und mit Canon Utilities ZoomBrowser EX 4.6 und Corel Draw 11.0 bearbeitet. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (± SEM = standard error of the mean) angegeben.
3.1 Kinetik der heterooligomeren humanen GluR1i/GluR2iGQ, GluR1i/GluR2oGN, GluR1o/GluR2iGQ, GluR1o/GluR2iGR, GluR1o/GluR2oRN und GluR1o/GluR2oGN Kanäle
3.1.1 Desensitisierung der heteromeren GluR1o/GluR2iGQ und GluR1o/GluR2iGR Kanäle
Die Desensitisierung der homomeren AMPA Rezeptor Untereinheiten ist in zahlreichen elektrophysiologischen Arbeiten untersucht worden. So wird die Desensitisierung für den GluR1i mit 3.2 ms und für den GluR1o 3.9 ms angegeben.
Die Desensitisierung der GluR2o –Untereinheiten wird mit 1.3 ms für den GluR2oGN und 5.5 ms für den GluR2oRN angegeben (Grosskreutz et al., 2003). Die Flip Varianten der GluR2 AMPA Rezeptor Untereinheiten desensitisieren deutlich langsamer(Grosskreutz et al., 2003; Krampfl et al., 2002; Krampfl et al., 2001). Da sich die Desensitisierung der GluR2o –Untereinheiten nicht wesentlich von den Desensitisierungszeiten der GluR1 Untereinheiten unterscheidet, sind in dieser Arbeit zur Bestimmung der Desensitisierung lediglich Coexpressionen aus GluR1o und GluR2i –Untereinheiten verwendet worden. Die Messungen wurden an outside out patches vorgenommen, da elektrophysiologische Untersuchungen an whole cells eine langsamere Kinetik in bezug auf die Desensitisierung gezeigt haben (Grosskreutz et al., 2003). Die Klemmspannung betrug bei diesen Experimenten –60 mV, die Konzentration der Glutamat Lösung betrug 10mM. Es wurden jeweils 3 Einzelpulse
Die heteromeren Rezeptoren wurden in den Mengenverhältnissen 1:3, 1:1, 3:1 und 5:1 transfiziert, wobei die Menge der DNA, die für eine GluR2i Untereinheit codierte jeweils zunahm (siehe Abbildung 12 und 13). Es wurde eine Gesamt DNA Menge von 20 g verwendet. Bei einem Verhältnis von 1:1 konnte für die Coexpression GluR1o/GluR2iGQ
τ
des. = 7.5 ms ± 0.2 (n = 7) ermittelt werden und für GluR1o/GluR2iGR betrugτ
des. = 7.3 ms ± 0.2 (n = 10). Die Desensitisierung aus GluR1o und GluR2i zeigte einen linearen Zusammenhang. Grosskreutz et al.beschrieb dieses Verhalten bereits für die Coexpression aus GluR1 flip und GluR2iRN (Grosskreutz et al., 2003).
Abbildung 11 zeigt originale Stromkurven mit einer Sollspannung von – 60 mV. Es ist deutlich zu erkennen, dass die Desensitisierung der heterooligomeren Assemblierung aus GluR1o und GluR2iGR mit zunehmender cDNA Menge des GluR2iGR konstant ansteigt.
und GluR2iGR, in Abhängigkeit von der transfizierten cDNA Menge der jeweiligen Untereinheit graphisch dar. Bei den durchgeführten Experimenten wurde eine Gesamtmenge von 20 g cDNA transfiziert. Es ist deutlich zu erkennen, dass die Desensitisierung fast linear mit der Zunahme der cDNA Menge der GluR2iGR Untereinheit ansteigt.
Die Messungen an der Coexpression GluR1o/GluR2iGQ erfolgten an der heterooligomeren Assemblierung mit einem cDNA Verhältnis von 1:1 (siehe auch Tabelle 2). Außerdem wurde die Desensitisierung des homomeren GluR2iGQ bestimmt. Die Desensitisierung des homomeren GluR2iGQ betrug 11.9 ± 0.5 (n = 8), die Desensitisierung der GluR1o/GluR2iGQ –Coexpression betrug 7.5 ± 0.2 (7). Da diese Werte nahezu den Werten der GluR1o/GluR2iGR –Coexpression entsprechen (siehe auch Tabelle 2), ist die heterooligomere Assemblierung aus GluR1o und GluR2iGQ in Abbildung12 nicht dargestellt.
3.1.2 Resensitisierung der heteromeren GluR1i/GluR2iGQ, GluR1i/GluR2oGN, GluR1o/GluR2iGQ, GluR1o/GluR2iGR, GluR1o/GluR2oRN und GluR1o/GluR2oGN Kanäle
Die Experimente zur Bestimmung der Resensitisierung wurden mit einer Sollspannung von –60 mV und der Applikation von 10 mM Glutamat durchgeführt.
Bei den Messungen wurde ein sogenanntes Doppelpulsprogramm verwendet, welches zwei Pulse von einer Länge von jeweils 100 ms abgibt. Das Intervall zwischen den beiden Pulsen begann bei 20 ms und stieg in 10 ms –Schritten bis auf 200 ms an (siehe Kapitel 2.7.1, siehe Abbildung 14). Aufgrund der dafür notwendigen längeren Messdauer wurden ausschließlich Whole cell patches verwendet (Grosskreutz et al., 2003). Wie auch bei der Ermittlung der Desensitisierung wurden AMPA Rezeptor Untereinheiten ausgewählt, die sich in ihrer Resensitisierung deutlich unterscheiden. Da die Kinetik der Resensitisierung der GluR2 Rezeptoren sowohl durch die Flip/flop Sequenz als auch über die R/G –
;ditierung gesteuert wird, wurden sowohl an GluR2o als auch an GluR2i, sowie an der R/G – Editierungsstelle editierte und nicht editierte GluR2 Untereinheiten gemessen (Grosskreutz et al., 2003; Krampfl et al., 2002). Die Resensitisierung der heterooligomeren Assemblierung aus GluR1i und GluR2iRN wurde in dieser Arbeit nicht untersucht da sie bereits bekannt ist (Grosskreutz et al., 2003).
Abbildung 13 zeigt eine originale Stromkurve mit einer Sollspannung von –60 mV. Zu sehen ist die Messung an der heteromeren Assemblierung von GluR1o/GluR2iGR. Das Mengenverhältnis der transfizierten cDNA beträgt 1:1. Es ist zu erkennen, dass die
:esensitisierung wurde in Abhängigkeit der jeweils transfizierten cDNA Menge, welche für die GluR1 Untereinheit bzw. GluR2 Untereinheit codiert, ermittelt. In früheren elektrophysiologischen Untersuchungen wurde die Resensitisierung (
τ
res. inms) für den homomeren GluR1o mit 134 ms, für den homomeren GluR2iGR mit 46 ms und für den homomeren GluR2oGN mit 30 ms angegeben (Grosskreutz et al., 2003; Krampfl et al., 2002). In dieser Arbeit betrug
τ
res. für den homomeren GluR1o 150 ms (n = 12), für den homomeren GluR2iGR 48 ms (n = 10) und für den homomeren GluR2oGN 30 ms (n = 11). Bei der Coexpression aus GluR1o/GluR2iGR konnte die Resensitisierung (τ
res in ms) mit einem Wert von 60.1 ms (n = 12), bei einem cDNA Mengen Verhältnis der einzelnen Untereinheiten von 1:1, ermittelt werden. Bei der Coexpression von GluR1o/GluR2oGN betrugτ
res 94.8 ms (n = 6) bei dem selben Mengenverhältnis der transfizierten cDNA. Die Gesamtmenge der cDNA betrug bei jeder Transfektion 20 g. Es zeigte sich, dass die Coexpression aus GluR1o und GluR2iGR noch bei einem cDNA Mengen Verhältnis von 5:1 (GluR1o = 5, GluR2iGR = 1) eine Resensitisierung von nur 94.7 ms aufwies, während die heterooligomere Assemblierung aus GluR1o und GluR2oGN bereits bei einem cDNA Mengen Verhältnis von 3:1 (GluR1o = 3, GluR2oGN = 1) mit 125.3 ms resensitisierte. Die Messungen konnten zeigen, dass die Resensitisierung eines AMPA Rezeptor Kanals, bestehend aus den Untereinheiten GluR1o und GluR2oGN, sich nahezu linear verhält. Ausgehend von der schnellen Resensitisierung des GluR2oGN mit 30 ms, stieg die Resensitisierung kontinuierlich mit der Zunahme der cDNA –Menge, die für den GluR1o codierte, an. Wurde jedoch die GluR2iGR Untereinheit anstatt der GluR2oG exprimiert stieg die Resensitisierung erst bei übermäßiger Exprimierung der GluR1o Untereinheit signifikant an (siehe Abbildung 14).
*
Abbildung 14A zeigt die graphische Darstellung der Resensitisierung des heteromeren GluR1o/GluR2iGR – Kanals und des heteromeren GluR1o/GluR2oGN – Kanals. Das Verhältnis der transfizierten cDNA für die entsprechenden Untereinheiten liegt bei 1:1 (Gesamtmenge der transfizierten cDNA betrug 20 g). Es ist ersichtlich, dass der GluR1o/GluR2iGR – Kanal signifikant schneller resensitisiert als der GluR1o/GluR2oGN –Kanal. In Abbildung 14B ist die Resensitisierung in Abhängigkeit von der transfizierten cDNA Menge graphisch dargestellt. Wie im Text beschrieben steigt die Resensitisierung des GluR1o/GluR2oGN –Kanals kontinuierlich mit der Zunahme der cDNA, die für den GluR1o codiert, an. Weiterhin kann man erkennen, dass der GluR1o/GluR2iGR –Kanal, trotz steigender cDNA Menge des GluR1o signifikant schneller resensitisiert.
In weiteren Experimenten wurden die heteromeren GluR1i/GluR2iGQ, GluR1i/GluR2oGN, GluR1o/GluR2iGQ und GluR1o/GluR2oRN –Kanäle untersucht. Es wurde jeweils eine Gesamtmenge cDNA von 20 g transfiziert wobei das Mengenverhältnis bei allen Rezeptoren 1:1 betrug. Außerdem wurde die Resensitisierung der jeweiligen homomeren Rezeptoren gemessen. So betrug
τ
res. fürden GluR1i/GluR2iGQ 51.5 ms (n = 16), für den GluR1i/GluR2oGN 92.8 ms (n = 5), für den GluR1o/GluR2iGQ 43.8 ms (n = 8) und für den GluR1o/GluR2oRN 101.3 ms (n = 9). Die Resensitisierung der homomeren Rezeptoren betrug für den GluR1i 160 ms (n = 13), für den GluR1o 150 ms (n = 12), für den GluR2iGQ 48 ms (n = 10), für den GluR2oGN 30 ms (n = 11) und für den GluR2oRN 75 ms (n = 7). Die Messungen bestätigten die Annahme, dass die heteromeren AMPA Rezeptoren, die eine oder mehrere GluR2i Untereinheit exprimierten, signifikant schneller resensitisierten als die heteromeren AMPA Rezeptoren, die eine oder mehrere GluR2o Untereinheit exprimierten. Bei den Rezeptoren, welche die GluR2o Untereinheit aufwiesen, konnte ausschließlich ein linearer Zusammenhang beobachtet werden. Wurde die GluR2i Untereinheit exprimiert lag die Resensitisierung nahe den Werten der homomeren GluR2i – Kanälen (siehe Abbildung 15).
+
Abbildung 15A: Graphische Darstellung der Resensitisierung des heteromeren GluR1i/GluR2iGQ –Kanals im Vergleich mit der Resensitisierung des homomeren GluR1i –Kanals und des homomeren GluR2iGQ –Kanals.
2$$ildung 15C: Graphische Darstellung der Resensitisierung des heteromeren GluR1i/GluR2oGN –Kanals im Vergleich mit der Resensitisierung des homomeren GluR1i –Kanals und des homomeren GluR2oGN –Kanals.
Abbildung 15D: Graphische Darstellung der Resensitisierung des heteromeren GluR1o/GluR2oRN –Kanals im Vergleich mit der Resensitisierung des homomeren GluR1o –Kanals und des homomeren GluR2oRN –Kanals.
Nähere Erläuterungen siehe Text.
Grosskreutz et al. beschrieb bereits, dass die Resensitisierung der heteromeren Assemblierung von GluR1i/GluR2iRN von der GluR2iRN Untereinheit dominiert wird (Grosskreutz et al., 2003). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Resensitisierung heteromerer AMPA Rezeptoren, die aus GluR1i bzw. GluR1o – Untereinheiten und GluR2i –Untereinheiten bestehen, durch die GluR2i – Untereinheiten bestimmt wird. Obwohl die R/G –Editierung von GluR2 – Untereinheiten die Geschwindigkeit der Resensitisierung bestimmt und somit maßgeblich für die Kinetik der Resensitisierung verantwortlich ist (Krampfl et al., 2002), hat sie auf dieses Verhalten der GluR2 Untereinheiten offensichtlich keinen Einfluss.
3.1.3 Strom Spannungs Beziehung der heteromeren GluR1o/2iGR – Kanälen und GluR1o/2oGN Kanäle
Die Q/R/(N) –Editierung ist für die Ca2+ Permeabilität sowie für die Charakterisierung der Strom Spannungs Beziehung der GluR2 –Untereinheiten verantwortlich. GluR2 –Untereinheiten, die an der Q/R/N – Editierungsstelle editiert sind (R oder N) weisen eine lineare Strom Spannungs Beziehung auf und sind für Ca2+ impermeabel (Burnashev et al., 1995; Hollmann und Heinemann, 1994; Jonas et al., 1994; Verdoorn et al., 1991). Alle anderen AMPA Rezeptor Untereinheiten
zeigen eine hohe Ca2+ Permeabilität und ein rektifizierendes I/V – Verhalten im Klemmspannungsbereich zwischen 0 mV und +40 mV. Die Messungen wurden an kleinen Zellen in der whole cell Konfiguration durchgeführt. Die Sollspannung wurde nach jeweils drei Einzelpulsen von einer Dauer von 100 ms beginnend mit – 80 mV um jeweils 20 mV erhöht. Es wurden insgesamt 20 g cDNA für die beiden AMPA Rezeptor Untereinheiten transfiziert. Gemessen wurden die Strom Spannungs Beziehung an den Mengenverhältnisse 1:3, 1:1, 3:1, 5:1 den jeweiligen homomeren AMPA Rezeptoren gegenüber gestellt, wobei die cDNA, die für die GluR2 – Untereinheit codiert, zunahm. Der heteromere GluR1o/GluR2iGR –Kanal zeigte in diesen Experimenten eine lineare Strom Spannungs Kennlinie (siehe Abbildung 17 und 18). Der Rektifizierungsindex (RI = I(+40mV)/I( 40mV)) wurde aus den Amplituden bei einer Sollspannung von +40 mV und 40mV gebildet und betrug für den GluR1o/GluR2iGR – Kanal 0.94 ± 0.06 (n = 3) bei einem Mengenverhältnis der jeweiligen cDNA von 1:1.
1
2$$ildung 16 zeigt eine originale Stromkurve des GluR1o/GluR2iGR. Das Mengenverhältnis der cDNA der beiden Untereinheiten beträgt 1:1.
Die Messungen zeigten, das die GluR2iGR Untereinheit die Strom Spannungs Kennlinie in der Coexpression aus GluR1o und GluR2iGR bestimmt. Der
Rektifizierungsindex für den homomeren GluR1o lag bei 0.2 ± 0.02 und für den GluR2iGR bei 0.99 ± 0.03.
2
2$$ildung 17: Graphische Darstellung des Rektifizierungsindex bei einer Sollspannung von +40 mV bzw. –40 mV des heteromeren GluR1o/GluR2iGR –Kanals ,sowie des heteromeren GluR1o/GluR2oGN –Kanals, in Abhängigkeit von der jeweils transfizierten cDNA Menge.
In weiteren Messungen wurde die Strom Spannungs Beziehung des heteromeren GluR1o/GluR2oGN – Kanals untersucht. Das Mengenverhältnis der cDNA der beiden Untereinheiten betrug 1:1 bei einer Gesamtmenge von 20 g transfizierter cDNA.
Auch der homomere, N editierte GluR2oG weist eine lineare Strom Spannungs Kennlinie auf nur ist er eine in vitro hergestellte Mutation des GluR2 Rezeptors. Da diese Variante des GluR2 annähernd die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften wie der GluR2iGR aufweist, aber eine wesentlich höhere Leitfähigkeit hat, wird er bevorzugt zu elekrophysiologischen Untersuchungen verwendet (Krampfl et al. 2002). Die Messungen am GluR1o/GluR2oGN –Kanal zeigten eine nichtlineare Strom Spannungs Kennlinie mit einem Rektifizierungsindex von 0.38 ± 0.08 (n = 4).
3
3.2 Kinetik der heterooligomeren humanen GluR2iGQ/GluR2oGN, GluR2iGN/GluR3i, Glu2iRN/GluR3o, GluR2oGN/GluR3o und GluR3i/GluR3o –Kanäle
3.2.1 Desensitisierung der heteromeren GluR2iGQ/GluR2oGN und GluR2iGN/3i –Kanäle.
Mit Einzelpulsexperimenten wurde die Desensitisierung des GluR2iGQ/GluR2oGN – Kanals in Abhängigkeit von der jeweils transfizierten cDNA der beiden Untereinheiten gemessen. Es wurde eine Gesamtmenge cDNA von 20
µ
g transfiziert und an den Mengenverhältnissen 0:1, 3:1, 1:1, 3:1, 5:1 und 1:0 gemessen, wobei die cDNA – Menge der GluR2iGQ Untereinheit zunahm. Die Desensitisierung wurde mit einer monoexponentiellen Funktionsgleichung berechnet. Für die beiden homomeren Rezeptoren betrug die Desensitisierungτ
des. 11.9 ± 0.5 ms (n = 6) für den GluR2iGQ und für den GluR2oGN 1.9 ± 0.1 ms (n = 8). Bei einem cDNA –Mengenverhältnis der beiden Rezeptoren von 1:1 lagτ
des. bei 6.7 ± 0.3 ms (n = 9). Ausgehend von der schnellen Desensitisierung des homomeren GluR2oGN nahmτ
des. kontinuierlich zu. Je mehr cDNA des GluR2iGQ transfiziert wurde desto langsamer desensitisierte der Rezeptor (Abbildung 20). Die Desensitisierung der Coexpression aus GluR2iGN und GluR3i wurde lediglich an einem cDNA –Mengenverhältnisses von 1:1 gemessen und den Messungen an den jeweiligen homomeren Rezeptoren gegenübergestellt. Für den homomeren GluR2iGN ergab sich eine Desensitisierung von 11.3 ± 0.3 ms (n = 8) und für den homomeren GluR3i von 2.8 ± 0.2 (n = 8). Der heteromere GluR2iGN/GluR3i desensitisierte mit 6.7 ± 0.3 ms (n = 8). Bei heteromeren AMPA Rezeptoren die aus den Untereinheiten GluR2iGN und GluR3i oder aus GluR2iGQ und GluR2oGN bestehen nähert sich die Desensitisierung jeweils der Untereinheit die stärker exprimiert wird.4
Abbildung 19 zeigt die graphische Darstellung der Desensitisierung in Abhängigkeit von der zur Transfektion angesetzten cDNA der beiden AMPA Rezeptor Untereinheiten GluR2iGQ und GluR2oGN. Das cDNA –Verhältnis 0:1 entspricht dem homomeren GluR2oGN und das Verhältnis 1:0 dem homomeren GluR2iGQ. Es ist deutlich zu erkennen, dass mit Zunahme der cDNA, die für den GluR2iGQ codiert, die
/.2.2 Resensitisierung der heteromeren GluR2iRN/GluR3o und GluR2oGN/GluR3o Kanäle
Die Resensitisierung des heteromeren GluR2oGN/GluR3o –Kanals wurde in Abhängigkeit von der transfizierten cDNA – Menge der jeweiligen Untereinheiten gemessen. Bei einer Gesamtmenge cDNA von 20
µ
g wurden die Mischungsverhältnisse 3:1, 1:1, 1:3, 1:5 ausgewählt und der Resensitisierung der beiden homomeren GluR2oGN und GluR3o – Kanälen gegenübergestellt. Der homomere GluR2oGN resensitisierte mit 30 ms (n = 11), während für den homomeren GluR3oτ
res. 130 ms (n = 12) betrug. Der heteromere Rezeptor aus GluR2iRN und GluR3o resensitisierte bei einem cDNA –Verhältnis von 1:1 mit 75.7 ms (n = 8). Ausgehend von der schnellen Resensitisierung des GluRoGN nahmτ
res. mit Zunahme der cDNA des GluR3o konstant zu (siehe Abbildung 21A und 21B).Außerdem wurden Messungen an einer Coexpression aus den Untereinheiten GluR2iRN und GluR3o durchgeführt. Bei diesen Messungen wurde jeweils die gleiche Menge cDNA der jeweiligen Untereinheiten transfiziert bei einer Gesamtmenge von 20
µ
g. Wie bei den vorangegangenen Experimenten wurde zunächst die Resensitisierung der homomeren Rezeptoren gemessen. So betrugτ
res. für den homomeren GluR2iRN 54 ms (n = 12) und für den homomeren GluR3o 130 ms (n = 12, der Wert stammt aus den vorangegangenen Experimenten). Die Coexpression dieser beiden Untereinheiten zeigte eine Resensitisierung von 96.8 ms (n = 9) (siehe auch Abbildung 22). Die Zeitkonstanten der Resensitisierung konnten mit einem monoexponentiellen Funktionsgleichung aus der Gesamtheit der gemittelten Kurven errechnet werden. Aus diesem Grund wird die Resensitisierung auch ohne Standardabweichung angegeben.
5
'
2$$ildung 20 A: Gezeigt ist eine originale Stromkurve eines heteromeren GluR2oGN/GluR3o Kanals. Das Haltepotential beträgt – 60 mV.
Das Mengenverhältnis der cDNA beträgt 1:1, bei einer Gesamtmenge von 20
µ
g.Abbildung 20 B: Zu sehen ist die graphische Darstellung der Resensitisierung der heteromeren Assemblierung aus GluR2oGN und GluR3o in Abhängigkeit von der transfizierten cDNA, wobei die cDNA – Menge des Glu3o zunimmt. Ein Mengenverhältnis von 1:0 steht für den homomeren GluR2oGN und ein Verhältnis von 0:1 für den homomeren GluR3o. Die Resensitisierung steigt mit Zunahme der cDNA des GluR3o nahezu linear an. Die Sollspannung betrug –60 mV, die Menge der transfizierten cDNA 20
µ
g. Bei der Resensitisierung handelt es sich um eine Zeitkonstante, die aus den gemittelten Werten der Resensitisierung der einzelnen Experimente berechnet wird. Somit wird die Resensitisierung ohne Standardabweichung angegeben.
2$$ildung 21 zeigt eine originale Stromkurve eines heteromeren GluR2iRN/GluR3o – Kanals. Die Sollspannung beträgt – 60 mV, die transfizierte cDNA – Menge 20 µg. Es wurde jeweils die gleiche Menge cDNA der beiden Untereinheiten transfiziert.
3.2.3 Strom Spannungs Beziehung der heteromeren GluR2iGQ/
GluR2oGN, GluR2iRN/GluR3o und GluR2oGN/GluR3o –Kanäle
Zur Bestimmung der Strom Spannungs Kennlinie wurden Einzelpulsexperimente an kleinen Zellen in der whole cell Konfiguration durchgeführt. Die Pulslänge betrug 100 ms und es wurden 10 mM Glutamat appliziert. Die Sollspannung wurde beginnend mit –80 mV nach jeweils 3 Pulsen um 20 mV erhöht. Der Rektifizierungsindex wurde aus dem Quotienten der maximalen Amplituden bei +40 mV und –40 mV gebildet (RI
= I(+40mV)/I( 40mV)). Die homomeren N editierten bzw. auch R editierten GluR2 – Untereinheiten weisen eine lineare Strom Spannungs Beziehung auf, während alle anderen AMPA Rezeptor Untereinheiten eine nichtlineare Strom Spannungs Beziehung aufweisen (Burnashev et al. 1995.; Krampfl et al. 2002). Bei den heteromeren Assemblierungen aus den AMPA Rezeptor Untereinheiten GluR2oGN und GluR2iGQ sowie GluR2oGN und GluR3o wurden in den cDNA – Mengenverhältnissen 3:1, 1:1, 1:3, 1:5 transfiziert, wobei die cDNA, die für die GluR2oGN –Untereinheit codiert zunahm. Diese Messungen wurden den jeweiligen homomeren Rezeptoren gegenübergestellt. Es zeigte sich, dass selbst bei Überexpremierung der GluR2oGN –Untereinheit die Strom Spannungs Kennlinie im positiven Spannungsbereich ein Plateau aufwies (siehe Abbildung 22 und 23). Für den GluR2oGN/GluR2iGQ ergab sich ein Rektifizierungsindex von 0.09 ± 0.01 (n = 3) und für den GluR2oGN/GluR3o von 0.27 ± 0.07 (n = 3), bei gleicher cDNA –Menge der jeweiligen Untereinheiten (siehe Abbildung 24).
Abbildung 22 zeigt überlagerte originale Stromkurven eines funktionellen AMPA Rezeptors, bestehend aus den Untereinheiten GluR2iGQ und GluR2oGN. Die Abflachung der Strom Spannungs Kennlinie bei positivem Haltepotential ist deutlich zu erkennen. Die jeweilige Sollspannung entspricht denen in der Abbildung.
Verglichen mit der Strom Spannungs Beziehung des heteromeren GluR1o/GluR2oGN zeigt sich bei einer Sollspannung von +40 mV kaum eine nennenswerte Stromamplitude (siehe hierzu Kapitel 3.1.3, Abbildung 18)
2$$ildung 23A zeigt die graphische Darstellung des Rektifizierungsindex in Abhängigkeit der jeweils transfizierten cDNA – Menge der beiden Untereinheiten. Das Verhältnis 1:0 steht für den homomeren GluR3o, 0:1 für den homomeren GluR2oGN.
Trotz Zunahme der cDNA des GluR2oGN nimmt der Rektifizierungsindex nur gering zu.
Abbildung 23B zeigt die graphische Darstellung des Rektifizierungsindex in Abhängigkeit der jeweils transfizierten cDNA – Menge der beiden Untereinheiten. Das Verhältnis 1:0 steht für den homomeren GluR2iGQ, 0:1 für den GluR2oGN. Selbst bei einer Überexpremierung des GluR2oGN (1:5) kommt es zu keiner signifikanten Zunahme des Rektifizierungsindex.
Die Messungen am heteromeren GluR2iRN/GluR3o erfolgte lediglich an einem Rezeptor –Kanal im Mengenverhältnis der cDNA von 1:1. Der Rektifizierungsindex betrug hier 0.02 ± 0.02 (n = 4) (siehe Abbildung 24).
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Abbildung 24 A zeigt eine originale Stromkurve eines heteromeren GluR2oGN/GluR3o – Kanals. Die Sollspannung entspricht der in der Abbildung. Es wurde für die beiden Untereinheiten die gleiche Menge cDNA transfiziert.
Abbildung 24 B zeigt eine originale Stromspur eines heteromeren GluR2iRN/GluR3o – Kanals. Die Sollspannung entspricht der in der Abbildung. Es wurde für die beiden
Fntereinheiten die gleiche Menge cDNA transfiziert.
3.3 Kinetik des heterooligomeren humanen GluR1i/GluR3i –Kanals
3.3.1 Resensitisierung des heteromeren GluR1i/GluR3i –Kanals
Die Bestimmung der Resensitisierung des heteromeren GluR1i/GluR3i erfolgte durch Doppelpulsexperimente. Es wurden zwei Pulse von jeweils 100 ms abgegeben. Das Intervall der beiden Pulse begann mit 20 ms und stieg in 10 ms –Schritten bis auf 200 ms an. Die Sollspannung betrug –60 mV und während der Pulse wurden 10 mM Glutamat appliziert. Die Resensitisierung τres. wurde in Abhängigkeit von der für die beiden Untereinheiten codierenden cDNA gemessen. Es wurde eine Gesamtmenge von 20 µg cDNA transfiziert. Ausgewählt wurden die Mischungsverhältnisse 3:1, 1:1, 1:3 und 1:7, wobei die Menge der cDNA, die für den GluR1i codiert zunahm. Die Messungen der heteromeren Assemblierung wurde der Resensitisierung der homomeren GluR1i und GluR3i gegenübergestellt. Der homomere GluR1i resensitisiert mit 160 ms (n = 13) und der homomere GluR3i mit 69 ms (n = 8). Bei dem heteromeren Rezeptor betrug τres 108 ms (n = 7) bei einem Mengenverhältnis von 1:1 der jeweiligen cDNA. Mit Zunahme der cDNA des GluR1i wurde die Resensitisierung konstant langsamer (siehe Abbildung 25). Die Messungen zeigten ausschließlich einen linearen Zusammenhang zwischen Strom und Spannung. Da die Desensitisierung der beiden Untereinheiten vergleichbar schnell ist und auch die Strom Spannungs Beziehung sowohl des GluR1i als auch des GluR3i eine Plateauphase im positiven Spannungsbereich zwischen + 10 und + 40 mV erreicht, wurden diese Parameter nicht bestimmt.
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