t bes werte für die Desensitisierung liegen mit .9 ms ± 0.3 (n = 60) nahe den zuvor publizierten Daten (Heckmann et al.
ainat- le en unte ei tens ezifisc e
en zwischen 2 und 10 ms (Bufler et al. 1997). Die it bei 3 mM tamat ist mit .46 ms unwesentlich langsamer als
ezepto r h Heckmann et al. veröffentlichte ittelwert von 0.22 ms bei 10 mM Glutamat. Somit bestehen vergleichbare
d Ergeb isse im Vergleich zuvor publizierter Daten.
Rez l cker können zur Charakterisierung von hen Eigenschaften hinzugezogen werden 8 e Bedeutung der beschriebenen entgegengesetzten
entoba folgenden Kapiteln
kutiert.
messen Werte an der GluR2flipRN-Untereinheit vom on 3 mM Glu t sind für De itisierung mit ms (n = 20 e ng mit .07 ± .1 (n = 1 ) ähn h
izierten. hum
eine Des tisierungszeit von 9.86 ± 0.79 ms (n = 10) (Krampfl d eine D erungszeitko stante von 1.14 ± 0.31 ms (n = 4)
s von n säure
k es GluR6Q und des GluR2flipRN
Die in dieser Arbei timmten Mittel 5
1996). Die K Rezeptor-Kanä zeig r nhei p h
Desensitisierungszeit
Aktivierungze Glu 0
der am Kainat-R r-Kanal 1996 du c M
Bedingungen un n
Subtypspezifische eptorb o einheitenspezifisch-pharmakokinetisc (Weigand et al. 199 ). Di
Effekte von P rbita .1 – 4.2 dis
l und Brilliantsäuregrün wird in den 4
Die in dieser Studie ge
AMPA-Typ bei Applikation v tama sens
10.25 ± 0.42 ) und für Deaktivi ru 2 0 4 9 lic den zuvor ublp Rekombinante ane AMPA-Typ-GluR2flipRN zeigen in der Literatur ensi
et al. 2001) un eaktivi n
bei 10 mM Glutamat. Auch die Anstiegszeit mit 0.5 ± 0.03 ist mit gaben vereinbar. Der unterschiedliche Grad der Einflüsse vo
Literaturan n
rilliantsäuregrün auf den AMPA-Rezeptor und den Kainat-Rezeptor und den
linrezeptor) rampfl et al. 2000, Löwenick et al. 2001) und Tubocurarine am γ-nAChR
er normalisierten Amplitude (Abb. 14 B, C, 15 C, Tab. 7).
B
möglichen Einsatz als typspezifische Substanz wird im Kapitel 4.2 diskutiert.
4.1 Block durch Pentobarbital am GluR6Q
Die in dieser Arbeit gemessene Abnahme der Desensitisierungszeit nach Öffnung des Glutamatkanals läßt sich am ehesten mit einem Offen-Kanal-Block am GluR6Q durch Pentobarbital erklären. Der Block führt wie der Offen-Kanal-Block durch Pentobarbital am є-nAChR (nikotinischen Acetylcho
(K
(Bufler et al. 1996b) zu einem monoexponentiellen Abfall der Glutamat-aktivierten Kurve, zu einem kleinen „steady-state“ (Tab. 5, Abb. 15 D) und zu abfallenden Desensitisierungen mit steigender Pentobarbitalkonzentration (Abb.
14 B, 15 A, Tab. 3), allerdings selbst bei hohen Konzentrationen zu keinem signifikanten Abfall d
Minami führte 1998 Voltage-Clamp-Versuche an auf Oocyten exprimierten GluR6Q-Kanälen durch. 0.2 mM Pentobarbital inhibierte die Amplitude signifikant um 40 ± 5 % nach einer Präinkubation in der Badlösung von 2 min und einer nachfolgenden Koapplikation mit Kainat über 20 s. Diese Vorinkubationsexperimente - wie auch die weiter unten diskutierten in dieser
Studie durchgeführten Präinkubationsexperimente - geben zusätzlich Anhalt für einen kompetitiven Block durch Pentobarbital.
Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten mit ultraschneller lutamat- und Pentobarbitalapplikation ohne Präinkubation verschnellert sich
tobarbital in Konzentrationen wischen 1 mM und 10 mM + 3mM Glutamat in einer
, enn der Kanal durch einen Agonisten geöffnet wurde. Diesen
Block-eine Konkurrenz um die Bindung und Wirkung der Testsubstanz mit dem G
die Desensitierung unter Koapplikation von Pen z
konzentrationsabhängigen Weise um bis zu 58 % signifikant (Tab. 20, Abb.
22 A). Der Block ist reversibel (Abb. 14 A), die Aktivierung (Abb. 14 D, 15 E) und die Deaktivierung werden nicht beeinträchtigt (Abb. 15 B).
Die beobachtete Verkürzung der Desensitisierung durch Pentobarbital ist vergleichbar mit einem 1996 von Bufler und 2000 von Krampfl beschriebenen Effekt von D-Tubocurarine bzw. Pentobarbital an nikotinischen Acethylcholinrezeptoren. In diesem Zusammenhang werden zwei Blockmechanismen unterschieden: Offen-Kanal-Block versus kompetitiver Block. Beim offenen Kanal-Block kann die Testsubstanz erst binden und wirken w
Mechanismus testet man durch Koapplikation der Testsubstanz mit dem Agonisten ohne Präinkubation der Testsubstanz in der Badlösung. Der kompetitive Block hingegen wird nach Präinkubation der Testsubstanz (Antagonist) in der Badlösung und anschließender Applikation des Agonisten + der komplementären Antagonisten-Konzentration getestet. Diesem Block liegt
Agonisten an dem geschlossenen Rezeptor zugrunde. Weder die Aktivierung noch die Desensitisierung werden durch ihn verändert.
-Tubocurarine führte am n-AchR bei ultraschneller Koapplikation mit
) und hier die nterschiedlichen Wege der Blockmechanismen veranschaulichen soll (siehe D
Acetylcholin durch einen Offen-Kanal-Block zu einer Reduktion des Stromabfalls und der Amplitude (Bufler et al. 1996b). Zusätzlich kam es aber auch zu einem kompetitiven Block durch D-Tubocurarine. Die Amplitude verkleinerte sich nach Präinkubation von D-Tubocurarine in der Hintergrundlösung und anschließender Koapplikation mit D-Tubocurarine. Die Daten wurden auf der Basis eines zirkulären Reaktionsschemas, das in ähnlicher Form auch für Kainat-Rezeptoren besteht (Abb. 2
u
Abb. 24) quantitativ ausgewertet sowie Bindungs- und Diffusionsraten bestimmt (Bufler et al. 1996b).
Abb. 24 Zirkuläres Reaktionsschema zur Darstellung des kompetitiven und des
Offen-Kanal-oder dem Offen-Kanal-Block-Status (A2BC) desensitisiert (D) der geöffnete Kanal zu A2D bzw.
Blockes am Ach-Rezeptor. Der Agonist (A) führt zum Offenzustand (O), der Antagonist (C) zum geblockten Status (BC, kompetitiver Block), aus dem Offenzustand mit zwei Agonisten (A2O)
A2DC. Hin- bzw. Rückraten zwischen den jeweiligen Rezeptorzuständen werden durch b1, b-1, b2, b-2, b3, b-3, k1, k-1, k2, k-2, k3, k-3, k4, k-4, α, β, d1, d-1, d2, d-2, d3, d-3 beschrieben. Weitere Erläuterungen siehe im Text (aus Bufler et al. 1996b).
Wie in dem Schema deutlich wird, binden zwei Agonisten (A) an den Rezeptor (R) und führen zu einem geöffneten Zustand (O). Der aktivierte Kanal (A2O)
Die hier gemessenen Ergebnisse von Pentobarbital am Kainat-Rezeptor deuten darauf hin, dass der Desensitisierungszustand A2DC schneller durchlaufen wird als die Desensitisierung ohne blockende Substanz.
Diese Verkürzung der Inaktivierungszeit kann als beschleunigter Wirkungsverlust im Rahmen eines Offenkanalblockes gewertet werden.
Bei der Testung von Physostigmine und Procaine am Acetylcholinrezeptor fiel
chlußfolgerung, dass die Affinität von Procaine und Physostigmine nicht so inaktiviert unter Agonistenanwesenheit in den desensitisierten Zustand mit zwei gebundenen Agonisten (A2D). Die Abdiffusion der beiden Agonisten schließt den Kreis zum Ausgangszustand, dem nicht aktivierten Rezeptor (R). Beim kompetitiven Block bindet der Antagonist (C) an den geschlossenen Rezeptor und führt zu einem geblockten Status (B) mit der applizierten Substanz (C).
Wird dagegen die Substanz (C) zusammen mit dem Agonisten, also an den geöffneten Kanal A2O appliziert, kommt es zu einem geblockten Status in Anwesenheit des Agonisten und der Blocksubstanz (A2BC), dem Offen-Kanal-Block. Aus dem geblockten Zustand desensitisiert der Rezeptor (A2DC) und findet nach Abdiffusion des Blockers wieder Anschluß an den physiologischen Reaktionskreis (A2D).
auf, dass der Offen-Kanal-Block durch sehr hohe Dissoziationsraten (b-1) des Block-Medikamentes vom offenen Status charakterisiert ist (Bufler et al. 1996a).
Diese hohe Abdiffusionsrate des Medikamentes äußerte sich in Nachöffnungen des Kanals nach und während eines Pulsverlaufes und führte zu der S
groß ist wie von Tubocurarine, dessen Abdiffusionrate um das 250fache niedriger war (Bufler et al. 1996b). Da nach dem hier untersuchten Block durch Pentobarbital am GluR6Q keine Nachöffnungen wie durch Physostigmin am Ach-Rezeptor zu beobachten sind, könnte es sich um niedrige Dissoziationsraten Pentobarbitals vom GluR6Q handeln.
Der Offenkanalblock von Tubocurarine, Physostigmine und Procaine am Acetylcholinrezeptor findet im Gegensatz zum kompetitiven Block nicht bei anästhetischen Dosen statt (Bufler et al. 1996a + b).
Der in der Literatur beschriebene Blockmechanismus am GluR6Q nach Präinkubation von Pentobarbital, bei dem es sich am ehesten um einen kompetitiven Block handelt, fand in dem anästhetischen Bereich zwischen 0.05 mM (Franks und Lieb 1994) und 0.187 mM (Richards 1972) statt. Im Vergleich dazu wiederum wird der hier als Offen-Kanal-Block gemessene und gedeutete Blockmechanismus am GluR6Q durch Pentobarbital erst bei einer Konzentration von 1 mM signifikant (Abb. 15, Tab. 3-7) und liegt damit auch außerhalb des anästhetischen Bereichs.
Auch in einer jüngeren Publikation war nach Vorinkubation von 0.1 mM Pentobarbital und anschließender Koapplikation mit 0.01 mM Kainat eine Inhibierung der Spitzenstromamplitude um etwa 30 %, sowie nach Präinkubation von 0.3 mM Pentobarbital (Pb) von sogar -50 % zu beobachten (Dildy-Mayfield et al. 1996). Die in dieser Arbeit durchgeführten Vorinkubationsexperimente mit 1 und 3 mM Pb und anschließender Koapplikation mit 3 mM Glutamat deuten ebenfalls auf einen kompetitiven Block
durch Pentobarbital hin. Dafür spricht, dass unter Hintergrundperfusion von 1 mM Pb die normalisierte Spitzenstromamplitude um 20 % und durch 3 mM um 36 % gehemmt wird, Desensitisierung und Aktivierung aber nicht signifikant von den Experimenten ohne Präinkubation abweichen (Abb. 15 F, Tab.8).
Kinetische Auswirkungen von Barbituraten sind außer an Acetylcholin- und lutamat-Rezeptoren hauptsächlich an GABA-Rezeptoren beschrieben
obarbital führt es zu einer
Offen-Kanal-Blockes könnte in dem G
(Krampfl et al. 2002). Bemerkenswerterweise haben Barbiturate am GABAA -Rezeptor drei unterschiedliche Effekte: Koaktivierung, direkte Aktivierung und Blockade. Bis zu einer Konzentration von 1 mM Pent
Vergrößerung der Amplitude, über diese Konzentration hinaus gewinnt ein Offen-Kanal-Block überhand und führt zu einem Amplitudenverlust. Wie auch beim Block durch Pentobarbital, Tubocurarine, Physostigmine und Procaine am Acetylcholinrezeptor und wie der in dieser Studie gemessene Block von Pentobarbital am Kainat-Rezeptor tritt der Offen-Kanal-Block am GABA-Rezeptor erst bei höheren toxischen Konzentrationen auf. Anästhetische Dosen Pentobarbitals hingegen aktivieren den GABA-Rezeptor. Die evolutionsbiologische Bedeutung dieses
Schutz vor zerstörenden Konzentrationen und Strömen liegen (Dudel 1995).
Jackson et al. beleuchteten in ihrer 2003 veröffentlichten Publikation
„Desensitization of AMPA Receptors facilitates use dependent inhibition by pentobarbital“ die Einflüsse von Pentobarbital an AMPA-Rezeptoren der CA1 Region im Hippocampus. Bisher wurde ebenfalls ein Offen-Kanal-Block als Interpretation eines Amplitudenverlustes, eines „steady-state-Verlustes“ und
einer Desensitisierungsreduktion gewertet (Marszalec und Narahashi 1993).
Jackson konnte beweisen, dass Pentobarbital eher zu einer Stabilisierung eines Agonist-gebundenen desensitisierten Status führt als zu einer Wirkung auf den geöffneten Status im Rahmen eines Offen-Kanal-Blockes. Der Block verstärkte
ch, pannungsunabhängig. Die stärksten Argumente gegen einen Offen-Kanal-sich nicht einheitlich bei gleichbleibender Blockkonzentration und steigender Agonistenkonzentration, sondern nahm sogar ab. Typisch für einen Offen-Kanal-Blocker wäre aber eine Verstärkung des Blocks bei maximaler Öffnung durch den Agonisten. Die bekannte Fähigkeit eines Offen-Kanal-Blockers nach Ablösen des Agonisten gebunden oder „gefangen“ zu bleiben fand sich auch bei Jacksons Experimenten. Er zeigte jedoch, dass der desensitisierte Status entscheidende Bedeutung für das Ausmaß des Blockes hat. Dazu hemmte er die Desensitisierung des Glutamat-induzierten Stromes mit Cyclothiazide. Das Blockausmaß betrug nur noch 6.4 % im Vergleich zu einem Block ohne Desensitierungshemmung um 71.3 %. Auch das sogenannte Gefangensein von Pentobarbital (Pb), das sich in einer verlängerten „Recovery“, also der Wiedererregung nach Desensitisierung des Rezeptors äußert, war bei Koapplikation von Cyclothiazide verschwunden. Zudem waren die Wirkungen Pentobarbitals, wie für einen Offen-Kanal-Block untypis s
Block und für einen von der Desensitisierungskinetik abhängigen Block zeigten die Experimente mit Miniatur EPSC´s in kultivierten hippocampalen Neuronen von GluR2-defizienten Mäusen und GluR2 (+/+)-Mäusen. Pentobarbital hatte überhaupt keinen Einfluß, währenddessen der Offen-Kanal-Blocker Spermine zu einer signifikanten Amplitudenreduktion der GluR2-defizienten Neuronen
führte. Da die erregenden postsynaptischen Potentiale (EPSCs) in Miniaturausgabe sich durch einen unbedeutend kleinen Anteil Desensitisierung auszeichnen war die Unwirksamkeit Pbs ein weiterer Beweis der Affinität von Pentobarbital zum desensitisierten Zustand. Auch das Charakteristikum des Offen-Kanal-Blockes eines linear sich vergrößernden Blockes mit steigender Blocker-Konzentration konnte nicht erfüllt werden. (Chen und Lipton 1997;
Bowie et al. 1998). Ein möglicher neuer Erklärungsansatz könnten laut Jackson durch Pentobarbital ausgelöste Konformationsänderungen in der Kanal-Region des Rezeptors sein (Jackson et al. 2003).
Auch dieser Mechanismus der Interaktion von Pentobarbital im desensitisierten Zustand könnte in dieser Studie bei der kinetischen Beeinflussung von Pb am GluR6Q zugrundeliegen. Um diesen Block experimentell gegen einen Offen-Kanal-Block abzugrenzen, müßte man bei fixer Pentobarbitalkonzentration ansteigende Agonistenkonzentrationen applizieren. Eine Vergrößerung des Blockes mit ansteigender Glutamatkonzentration würde für einen Offen-Kanal-Block sprechen. Eine weitere Differenzierungsmöglichkeit des Blockmechanismus von Pentobarbital am GluR6Q könnte die Messung der Desensitisierung und der „Recovery“ (der vollständigen Wiedererregung nach dem Block) bei Applikation von Concanavalin A ergeben (Minami et al. 1998).
Concanavalin A unterdrückt die Desensitisierung beim Kainat-Rezeptor und könnte wie auch bei Jackson die Substanz Cyclothiazide (Partin et al. 1996;
Patneau et al. 1993) die Bedeutung der Desensitisierung und das Auswaschverhalten bzw. das Gefangenhalten von Pentobarbital, ausgedrückt in der „Recovery“, verdeutlichen. Eine unbeeinträchtigte „Recovery“ und ein
fehlender Block unter Concanavalin A nach Applikation von Pb würde Jacksons desensitisierungsabhängigen Block favorisieren.
4.2 Brilliantsäuregrün am Kainat- und am AMPA-Rezeptor
Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass Brilliantsäuregrün (BS) mit ionischen ligandgesteuerten Kanälen interagiert. Experimentell waren drei unterschiedliche Effekte erkennbar, wenn BS mit Glutamat an GluR6Q-Kanälen von „outside-out-patches“ coappliziert wurde: (1) Anstieg der Zeitkonstante Desensitisierung (Abb. 16 A, 17 A, 18 A, Tab. 9 und Tab. 20); (2) Anstieg der normalisierten Amplitude (Abb. 16 A, 17 B, 18 B, Tab. 11 und Tab. 20) und (3) Anstieg der Zeitkonstante Deaktivierung (Abb. 16 B, 18 C, Tab.10 und Tab. 20).
Diese modulierenden Effekte können Hinweise für eine höhere Offenwahrscheinlichkeit des GluR6Q-Kanals durch Brilliantsäuregrün sein. Sie sprechen für eine Interferenz von Brilliantsäuregrün mit dem Ablösen von Glutamat vom Rezeptor. Es könnte eine Ähnlichkeit zu der Interaktion zwischen volatilen Anästhetika und den GluR6Q-Kanälen bestehen (Minami et al. 1998).
Minami zeigte anhand der Patch-Clamp-Technik und ausgewählten GluR6-Kanal-Mutationen, dass volatile Anästhetika wie Isoflurane, Halothane und Enflurane bei Präinkubation über 2 min und Koapplikation mit Kainat über 20 s, sowie Verhinderung der Desensitisierung durch Concanvalin zu einer Potenzierung der Amplitude um 100-120 % durch Halothane, 50-60 % durch Enflurane und Isoflurane bei einer Konzentration von jeweils 2 mM führen. Die
Untersuchungen ergaben eine entscheidende Bedeutung der Aminosäure Glycin 819 in der Transmembran 4-Region (TM4; Abb. 3 und 25) für die
indung volatiler Anästhetika. Bei Austausch dieser Aminosäure durch andere rößerung der Amplitude. Die Rezeptorfunktion und speziell die Konzentration für Kainat, bei
ereich der TM4-Region - ein möglicher molekularer Erklärungsansatz sein.
B
kam es nahezu zu einem Sistieren der ursprünglichen Verg
der die halbmaximale Wirkung erreicht wird (EC 50) waren nicht beeinträchtigt, so dass keine Interferenz zwischen Kainat und volatilen Anästhetika um die selbe Bindungsstelle als Erklärung in Frage kam.
Da auch Brilliantsäuregrün, ähnlich den volatilen Anästhetika, zu einer Vergrößerung der Amplitude führt (32.58 % bei 10 mM BS), könnte ein ähnlicher Mechanismus und sogar die gleiche Bindungsstelle - Glycin 819 im B
Um das zu testen, müßte eine Mutationsvariation wie bei Minami sukzessive durchgeführt werden. Zudem könnte auch für volatile Anästhetika am GluR6Q getestet werden, ob sie zu einer Desensitisierungs- und Deaktivierungsvergrößerung unter Glutamat führen. Dazu wären Bedingungen wie in dieser Studie notwendig, mit Kombination der Mutationsvariation von Minami.
Die Spezifität der Effekte durch Brilliantsäuregrün wurde am AMPA-Rezeptor GluR2flipRN überprüft. Es ergibt sich ein ähnliches Bild wie beim Kainat-Rezeptor in schwächerer Ausprägung: Desensitisierung und Amplitude vergrößern sich signifikant zur Kontrollgruppe, jedoch wird im Gegensatz zum
GluR6Q-Kanal die Zeit des Abdiffundierens von Glutamat vom GluR2-Kanal (Deaktivierung) nicht durch Brilliantsäuregrün beinträchtigt.
Die beschriebenen Effekte könnten ein Hinweis dafür sein, dass Brilliantsäuregrün auch die Offenwahrscheinlichkeiten des AMPA-Rezeptors vergrößert. Der unterschiedliche Grad der kinetischen Beeinflussung auf Desensitisierung und Amplitude und der Unterschied im Einfluß auf die Deaktivierung durch Brilliantsäuregrün (BS) könnten mit unterschiedlichen molekularen Mechanismen an beiden Rezeptoren zusammenhängen.
dungsstelle von BS und Halothane an der GluR6-Untereinheit vom ainat-Typ nicht aus, da die TM4-Region des AMPA-Rezeptors an den Im Kontrast zu den Ähnlichkeiten der kinetischen Einflüsse von BS und volatilen Anästhetika bei der GluR6Q-Untereinheit vom Kainat-Typ werden AMPA-Rezeptoren durch volatile Anästhetika inhibiert (Dildy-Mayfield et al. 1996) und durch Brilliantsäuregrün leicht potenziert. Diese entgegengesetzten Wirkungen beider Substanzen könnten ein Hinweis für unterschiedliche Bindungstellen oder Mechanismen an AMPA-Rezeptoren sein.
Die unterschiedlichen Wirkungsweisen von volatilen Anästhetika an AMPA- und Kainat-Rezeptoren schließen jedoch einen ähnlichen Mechanismus und die selbe Bin
K
entscheidenden Stellen eine andere Aminosäuresequenz aufweist als die des Kainat-Rezeptors (Abb. 3 und 25).
Abb. 25 Aminosäuresequenz des Transmembranproteins 4 (TM4) der GluR6-Untereinheit vom Kainat-Typ im Vergleich zur GluR3-Untereinheit vom AMPA-Typ. In der Abbildung wird GluR6 it GluR3 anstelle der hier untersuchten GluR2-Untereinheit vom AMPA-Typ verglichen. In den
schwarze Pfeil zeigt auf Glycin 819, der Aminosäure, die für die Amplitudenpotenzierung durch
2 anstelle von Isoleucin 818, lycin 819, Isoleucin 821 und Isoleucin 823: Valin 818, Alanin 819, Valin 821
e potente Substanz zur Unterscheidung der dieser Studie getesteten Glutamatrezeptoren ist, wird im folgenden diskutiert.
Eine hochsignifikante Unterscheidung des Kainat- vom AMPA-Rezeptor liegt
m
entscheidenen Aminosäuresequenzen sind GluR2 und GluR3 jedoch identisch. Der breite volatile Anästhetika hauptverantwortlich ist. Die äquivalente Aminosäure der GluR3-Untereinheit ist Alanin 819 (aus Minami et al. 1998).
So findet man beim GluR6-Kanal an den mit einer signifikanten Vergrößerung der Amplitude einhergenden Aminosäuresequenzen bei Zugabe von Halothane im Vergleich zur Aminosäuresequenz vom GluR
G
und Tyrosin 823. In der Abbildung wird der GluR6-Kanal mit dem GluR3-Kanal vom AMPA-Typ anstelle des hier untersuchten GluR2-Kanals vom AMPA-Typ verglichen. In den entscheidenen Aminosäuresequenzen sind GluR2 und GluR3 jedoch identisch.
Die Frage, ob Brilliantsäuregrün ein in
bei einer 100 ms andauernden Koapplikation von 10 mM Brilliantsäuregrün und 3 mM Glutamat vor. Eine Erregung der GluR2flipRN-Untereinheit mit 10 mM Brilliantsäuregrün und 3 mM Glutamat vergrößert die Desensitisierung durchschnittlich um annähernd 23 %. Die gleiche Dosis unter gleichen Versuchsbedingungen am GluR6Q vergrößert die Desensitisierung durchschnittlich um knapp 174 %. Diese signifikante Unterscheidung gelingt bei kleinen Fallzahlen zwischen 5 und 7 und setzt für den t-Test für τDes keine
ei Applikation von 10 mM Brilliantsäuregrün um 455,17 % reversibel
Q und GluR2flipRN nicht mehr; weder die esensitisierung noch die normalisierte Amplitude weisen im Varianzhomogenität zwischen der GluR6Q- und GluR2flipRN-Gruppe vorraus (Tabelle 20, Rezeptorvergleich mit Brilliantsäuregrün, Levene Test). Die sicherste Unterscheidung beider Rezeptoren durch Brilliantsäuregrün gelingt in der Messung der Deaktivierung. Wird die Deaktivierung des Kainat-Rezeptors b
vergrößert, ändert sich dagegen die Deaktivierung des AMPA-Rezeptors nicht signifikant zur Kontrollmessung (Abb. 23 B). Eine hochsignifikante Unterscheidung (p = 0.001) ist somit möglich (Tab. 20). Bei höheren Fallzahlen dürfte auch Varianzhomogenität gewährleistet sein. Sie ist aber aufgrund der großen Differenz nicht erforderlich.
Dagegen eignet sich 3 mM Brilliantsäuregrün als Differenzierungsdosis zwischen dem GluR6
D
Rezeptorenvergleich signifikante Zahlenwerte zueinander auf.
Brilliantsäuregrün wird im Patch-Clamp-Labor häufig zum Anfärben von Lösungen benutzt. Die Anfärbung ist notwendig, weil die Patchpipette unter optischer Kontrolle im Mikroskop so an das Liquidfilament des schnellen Applikationssystems (Abb. 8) angenähert werden muß, dass sie für den Applikationszeitraum in das Liquidfilament eintaucht (Franke et al. 1987). Wie die Messungen gezeigt haben, vergrößert BS ab einer Konzentration von 3 mM an der GluR6Q- und der GluR2flipRN-Untereinheit Desensitisierung und Amplitude und am GluR6Q die Deaktivierung bei 10 mM BS signifikant (Abb.
18, 21 und 23). Um die in dieser Studie gemessenen Effekte durch das Färbemittel Brilliantsäuregrün am GluR6Q und am GluR2flipRN und eventuell auch an anderen Kainat- und AMPA-Rezeptoren zu vermeiden und eine Maskierung der pharmakologischen Auswirkungen der eigentlichen Testsubstanz auszuschließen, sollte Brilliantsäuregrün nicht über 1 mM verwendet werden.
Brilliantsäuregrün verursacht entgegengesetzte, signifikant unterschiedliche kinetische Auswirkungen auf die Desensitisierung der GluR6Q-Untereinheit im
ergleich zu Pentobarbital. 10 und 3 mM BS vergrößern die Desensitisierung
zen zur Klärung er Funktion der Aminosäuren in den Transmembranproteinen des Rezeptors genutzt werden (wie für Pentobarbital schon geschehen). Dazu müßte eine V
um 174 % und 63 % versus einer Reduktion durch 10 und 3 mM Pb um 57 % und 46 % (Abb. 22 A).
Beide Substanzen könnten möglicherweise in der Auffindung des GluR6Q in Hirnschnitten genutzt werden. Zudem könnten beide Substan
d
Mutations-Variation der Transmembranproteine verbunden mit Patch-Clamp-Messungen der kinetischen Parameter ähnlich den Versuchen 1998 von Minami durchgeführt werden.
5 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Untersuchungen zur Auswirkung der Substanz Brilliantsäuregrün auf die Kinetik eines rekombinaten Kainat-Typ- Glutamatrezeptors (GluR6Q) und eines AMPA-Typ-Glutamatrezeptors (GluR2 flipRN) sowie des Medikamentes Pentobarbital auf den Kainat-Rezeptor GluR6Q durchgeführt. Kainat- und AMPA-Typ-Glutamatrezeptoren stellen eine Unterform ionotroper Glutamatrezeptoren dar und sind für die synaptische Transmission im ZNS von Vertebraten verantwortlich. Der physiologisch im ZNS vorkommende exzitatorische Transmitter Glutamat erreicht bei der synaptischen Transmission in Bruchteilen von Sekunden hohe Konzentrationen und führt an den postsynaptisch gelegenen Kainat- und AMPA-Rezeptoren nach Bindung zu einem Kationenstrom durch die Zentralpore des Glutamatrezeptors.
Verschiedene Substanzen waren auch schon in der Vergangenheit hilfreich, um Glutamatrezeptoren - z. B. in Hirnschnitten - zu differenzieren. Sie führten sogar
Verschiedene Substanzen waren auch schon in der Vergangenheit hilfreich, um Glutamatrezeptoren - z. B. in Hirnschnitten - zu differenzieren. Sie führten sogar