Dye Signal

(1)

Leibniz‐Institut DSMZ‐Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

Cord Uphoff

Leibniz‐Institut DSMZ‐Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Braunschweig

Sicheres und kontaminationsfreies Arbeiten mit

Zellkulturen

(2)

Zuverlässigkeit wissenschaftlicher und präklinischer Daten

Translationale Forschung Modellsysteme

Diagnoseverfahren zielgerichtete Therapeutika

Verbesserung der allgem. Gesundheit

(3)

Identität

• Authentizität

• Kreuzkontaminationen

• falsch bezeichnete Zelllinien

• falsch klassifizierte Zelllinien

Qualitätskriterien von Zelllinien

Database of Cross-Contaminated or Misidentified Cell Lines Amanda Capes-Davis and R. Ian Freshney

http://www.hpacultures.org.uk/media/E50/3B/Cell_Line_Cross_Contaminations_

v6_0.pdf

(4)

Kontaminationen und Infektionen

• langsam wachsende Bakterien (z.B. Mykoplasmen)

• Viren

Qualitätskriterien von Zelllinien

Stabilität von Zelllinien

• genetische Stabilität

• epigenetische Stabilität

(5)

Prävalenz von Zellkulturkontaminationen (DSMZ)

• Hefen und Pilze: _~ 2%

• „Konventionelle“ Bakterien: _~ 2%

• Mykoplasmen: >20%

• Viren in latenter Phase: ca. 8%

(z.B. EBV, HBV)

• Aktive Viren: ca. 5%

(z.B. EBV, HHV‐8, HPV, C‐Typ‐Retroviren)

• Kreuzkontaminationen: ca. 15%

(6)

Ausmaß von Kreuz‐ und Mykoplasmakontaminationen

69%

18%

6%

7%

authentisch und mykoplasmafrei

falsch und Mykoplasmen

falsch, aber mykoplasmafrei 607 Leukämie‐Lymphom Zelllinien

authentisch, aber Mykoplasmen

(7)

Verifikation der Authentizität von Zelllinien

• Spezies: PCR, Isoenzymanalyse

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000

100 150 200 250 300 350

HE LA.A0 1_ 04 10 05 09 P0

Size (nt)

Dye Signal

134, 65 1 38, 89

143, 72

151,90 1 85,3 3

192,90 199,78

208, 96

2 24, 03 231, 90

2 39, 8 8 247, 97

2 82, 57 286,65

302,94 307, 00

• Individuum: DNA‐Profil Zytogenetik

• Gewebe/Tumor: Immunphänotypisierung Genexpression Zytogenetik

(8)

Nonaplex Single‐Locus DNA Typisierung von STRs

AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT

Allel 6

Allel 3

AGAT AGAT AGAT

D5S818

CSF1 D5S818

TH01 TPOX

D13S317

D7S820

D16S539

vWA

A212

A218

(9)

ACC Cell Line Lot Datum D5 D5' D13 D13 D7 D7' D16 D16 vWA vWA' TH01 TH01' TPOX TPOX' CSF1 CSF1' Amel Amel'

57 HELA Referenz ^11.1.2000 11 12 12 14 8 12 9 10 16 18 7 7 8 12 9 10 X X

57 HELA 12 ^17.4.2005 11 12 12 14 8 12 9 10 16 18 7 7 8 12 9 10 X X

Vom Signal zur Datenbank

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000

100 150 200 250 300 350

HELA.A01_04100509P0

Size (nt)

DyeSignal

11 D5 12 D5 16 vWA

18 vWA

7 TH01

12 D13

13.3 D13

X Amel

8 D7

8 TPOX

12 D7

12 TPOX

9 D16

10 D16

9 CSF1

10 CSF1

1

M 2 3 4 5 6 7 8 9 101 12 1

1

3 APO B1

D17S5

D1S80

D2S44

(10)

Mykoplasmen auf HELA Zellen

Mycoplasma hyorhinis

Mycoplasma fermentans

(11)

Protokoll für die Detektion von Mykoplasma‐Kontaminationen

Zelllinie: Ankunft

Quarantäne Kulturlabor Mykoplasmatestung

Mykoplasma positiv Eliminierung

wenigstens zwei

sensitive Detektions- methoden

Mykoplasma negativ Sterilkultur-Labor Zelllinie: kontinuierliche Kultur

Monatliche Mykoplasmatestung eine schnelle und sensitive Detektions- methode

(12)

Behandlung von Mykoplasmainfektionen

85 83

77 75

73

66

12 7

17 16 19 24

3 11

6 9 8

0 10 20 40 60 80 100

Sparfloxacin BM-Cyclin

Ciprofloxac in

Plasmoc in

Enrofloxacin MR A

Cell Death Resistance

Cured

Uphoff & Drexler, In Vitro Cell Dev Biol 38: 86‐89 (2002)

%

(13)

Virusdiagnostik

Zellkultur aktive Viren

Zellen

DNA-Präparation Überstand

integrierte und zelluläre Virusformen

RNA-Präparation

PCR

cDNA Synthese

¾HBV

PCR

¾HCV

Zellen

Präparation von zellulärer DNA PCR

¾EBV (latent/lytisch)

¾HIV-1/-2

¾HTLV-I/-II Ultrazentrifugation

(14)

Ausstattung für aseptische Arbeiten in der entsprechenden biologischen Sicherheitsstufe

‐zertifizierte mikrobiologische Sicherheitswerkbänke Klasse II

‐Inkubatoren

‐Wasserbäder, Zentrifugen, Glas‐und Plastikwaren etc.

‐monatliche Reinigung der Oberflächen

Zugangsbeschränkung: keine Versuchstierhaltung nicht authorisierte Personen

Sterilität: chemische Desinfektion vor und nach Benutzung zentrale Sterilisationseinrichtung

Zellkultureinrichtung

(15)

Anwender

Befolgung strenger aseptischer Techniken und guter Laborpraxis (Grundregeln guter mikrobiologischer Technik)

Laborprotokolle für jede Zellkultur

Keine Gespräche während der Arbeit mit Zellkulturen

(16)

Zellkulturen

Bezug von Zellkulturen von anerkannten Zellkultursammlungen

Expansion neuer Zellkulturen und Kryokonservierung (“master” und “working cell bank”) Regelmäßige Überprüfung der Zellkultur auf Infektionen und Identität

Ausschließliche Nutzung von Medien und Reagenzien für jeweils eine Zelllinie Vermeidung der Überpassagierung von Zellkulturen

Kein prophylaktischer Einsatz von Antibiotika

(17)

Qualitätskontrolle

Zuverlässige Mykoplasma‐Detektionsverfahren etablieren und regelmäßig durchführten

Identität von Zellkulturen sollte vor Projektbeginn bestätigt werden

Medienbestandteile sollten auf Sterilität getestet werden

(18)

Zusammenfassung

• Kreuzkontaminationen und Kontaminationen mit Mykoplasmen gehören zu den häufigsten und hartnäckigsten Probleme in der Zellkulturtechnik

• Regelmäßige Testung der Zellkulturen ist von eminenter Bedeutung

• Bei Einhaltung der Regeln der guten Zellkulturtechnik lassen sich Kontaminationen zuverlässig vermeiden

• Viruskontaminationen und die Freisetzung der Viren sind im Allgemeinen risikobestimmend für die Zellkulturen

(19)

Zusammenfassung

(20)

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

Kontakt: Dr. Cord Uphoff

Bereich Menschliche und Tierische Zellkulturen Tel: 0531-2616156