Klinik für Rinder
Untersuchungen zur Kryokonservierbarkeit
von Bullensperma unter besonderer Berücksichtigung des Verdünnungsgrades und des Seminalplasmas
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Alice Fischer
aus Husum
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Heinrich Bollwein
1. Gutachter: Prof. Dr. H. Bollwein 2. Gutachter: Prof. Dr. D. Waberski
Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2008
Virtuelles Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen an der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Diese Arbeit wurde von der
Rinderzucht Schleswig-Holstein eG (RSH eG), Neumünster finanziell unterstützt.
Meinen Eltern
Angela und Peter Fischer
in Liebe und Dankbarkeit gewidmet.
Inhaltsverzeichnis:
1. EINLEITUNG 1
2. LITERATURÜBERSICHT 3
2.1 Morphologie des Spermiums und durchflusszytometrische Verfahren zur
Bestimmung von Spermienqualitätsparametern 3
2.1.1 Die Plasmamembran 5
2.1.2 Das Akrosom 6
2.1.2.1 Die Kapazitation 7
2.1.2.2 Die Akrosomenreaktion 9
2.1.3 Der Zellkern 13
2.2 Herkunft und Zusammensetzung des Seminalplasmas und elektrophore-
tische Auftrennung von Seminalplasmaproteinen 15
2.2.1 Das Seminalplasma 15
2.2.1.1 Definition von Seminalplasma und akzessorischem Sekret 15
2.2.1.2 Akzessorische Geschlechtsdrüsen 16
2.2.1.3 Zusammensetzung des Seminalplasmas 17
2.2.1.3.1 Proteine des Seminalplasmas 18
2.2.1.3.2 Bestimmung des Proteingehaltes im Seminalplasma 24
2.2.1.4 Seminalplasma und oxidativer Stress 25
2.2.1.5 Seminalplasma und Kapazitation bzw. Akrosomenreaktion 28
2.2.1.6 Seminalplasma und Einfrierfähigkeit 29
2.2.1.7 Seminalplasma und Fertilität 30
2.2.2 Elektrophoretische Auftrennung von Seminalplasmaproteinen 32
2.2.2.1 Prinzip der Elektrophorese 32
2.2.2.2 Zweidimensionale Polyakrylamidgel-Elektrophorese 32
2.2.2.2.1 Isoelektrische Fokussierung 33
2.2.2.2.2 SDS-PAGE nach Laemmli 34
2.2.2.2.3 Detektion der Proteinspots 35
2.3 Kryokonservierung von Spermien und Einfluss der Spermienkonzentration
beim Einfrieren auf Spermienqualitätsparameter 36
2.3.1 Kryokonservierung 36
2.3.1.1 Allgemeine Aspekte zur Kryokonservierung 36 2.3.1.2 Negative Auswirkungen der Kryokonservierung auf die Spermien 36 2.3.2 Einfluss der Spermienkonzentration beim Einfrieren auf die Spermienqualität
und die Fertilität 38
2.3.2.1 Anzahl inseminierter Spermien und Verdünnungseffekt 38 2.3.2.1.1 Auswirkungen der Verdünnung auf die Plasmamembran- integrität, den akrosomalen Status und die Anzahl
akzessorischer Spermien 41
2.3.2.1.2 Auswirkung der Verdünnung auf die Spermienchromatin-
struktur 42
3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN 44
3.1 Versuchsaufbau 44
3.1.1 Zusammenhänge zwischen Spermakonzentration und Spermaqualität 44 3.1.2 Spermaqualität in Abhängigkeit vom Zusatz unterschiedlicher
Seminalplasmakonzentrationen 45
3.1.3 Zusammenhänge zwischen Seminalplasmaproteinen, antioxidativem
Status und Spermaqualität 48
3.2 Bullen 49
3.3 Samengewinnung 49
3.4 Kryokonservierung 50
3.5 Aufwärmen, Auftauen und Verdünnen des Spermas 51
3.6 Auftauen des Seminalplasmas 52
3.7 Durchführung der durchflusszytometrischen Untersuchungen 52
3.7.1 Durchflusszytometer 52
3.7.1.1 FITC-PNA/PI-Färbung 53
3.7.1.2 Spermienchromatinstrukturanalyse (SCSA™) 55
3.8 Zweidimensionale SDS-Polyakrylamid-Gelelektrophorese des
Seminalplasmas 57
3.8.1 Proteinkonzentrationsbestimmung nach BRADFORD 57
3.8.2 Isoelektrische Fokussierung (1.Dimension) 58
3.8.3 Äquilibrierung der IPG-Streifen 59
3.8.4 Auftrennung der Proteine nach der molekularen Grösse (2. Dimension) 60
3.8.5 Färbung der Gele 61
3.8.5.1 Silberfärbung 61
3.8.5.2 Coomassie-Färbung 62
3.8.6 Analyse der Proteinspots 62
3.8.7 Tandem-Massenspektroskopie 63
3.8.8 Bestimmung des oxidativen Status der Seminalplasmaproben 64
3.8.8.1 Totale antioxidative Kapazität (TAC) 64
3.8.8.2 Superoxid-Dismutase (SOD) 65
3.9 Überprüfung der Reproduzierbarkeit der durchflusszytometrischen
Methoden sowie der zweidimensionalen Gelelektrophorese 66
3.10 Statistische Auswertung 66
4. ERGEBNISSE 68
4.1 Reproduzierbarkeit durchflusszytometrischer Tests 68
4.2 Zusammenhänge zwischen Spermakonzentration und Spermaqualität 69
4.2.1 Spermaqualität vor und nach der Kryokonservierung bzw. unmittelbar
nach dem Auftauen oder einer dreistündigen Inkubation bei 37°C 69 4.2.2 Ejakulat- und individuellbedingte Variabilität der Spermaqualität 71 4.2.3 Zusammenhänge zwischen den Spermienparametern 73
4.3 Spermaqualität in Abhängigkeit vom Zusatz unterschiedlicher
Seminalplasmakonzentrationen 73
4.4 Zusammenhänge zwischen Seminalplasmaproteinen, antioxidativem
Status des Seminalplasmas und Spermaqualität 76
4.4.1 Reproduzierbarkeit der 2 D Gelelektrophorese 76
4.4.2 Charakteristika der Seminalplasmaproteine 76
4.4.3 Spermaqualität 78
4.4.4 Untersuchungen des antioxidativen Status des Seminalplasmas 79 4.4.5 Vergleich der ejakulat- und individuellbedingten Variabilitäten der
Spermaqualitätsparameter, der antioxidativen Faktoren des Seminal-
plasmas und verschiedener Proteinspots des Seminalplasmas 79 4.4.6 Zusammenhang zwischen Seminalplasmaproteinen und der Sperma-
qualität bzw. dem antioxidativen Status des Seminalplasmas 81 4.4.7 Aminosäuresequenzen relevanter Proteinspots und Identifikation
der Proteinnamen 84
5. DISKUSSION 85
5.1 Zusammenhänge zwischen Spermakonzentration und Spermaqualität 85
5.1.1 Reproduzierbarkeit der durchflusszytometrischen Tests 85 5.1.2 Ejakulat- und individuellbedingte Schwankungen der durchflusszyto-
metrisch ermittelten Spermaqualitätsparametern 85 5.1.3 Zusammenhänge zwischen den durchflusszytometrischen Tests bei
den verschiedenen Spermienkonzentrationen 87 5.1.4 Einfluss verschiedener Spermienkonzentrationen auf durchflusszyto-
metrisch ermittelte Spermienqualitätsparameter 88
5.1.4.1 Einfluss auf plasmamembranintakte Zellen (PMI) 88 5.1.4.2 Einfluss auf Zellen mit positivem akrosomalen Status (PAS) 92
5.1.4.3 Einfluss auf die DNA-Integrität 94
5.2 Spermaqualität in Abhängigkeit vom Zusatz von Seminalplasma 96
5.2.1 Einfluss der Seminalplasmakonzentration auf durchflusszytometrisch
ermittelte Spermienqualitätsparameter 96
5.2.2 Einfluss auf plasmamembranintakte Zellen (PMI) 97 5.2.3 Einfluss auf Zellen mit positivem akrosomalen Status (PAS) 98
5.2.4 Einfluss auf die DNA-Integrität 99
5.3 Zusammenhänge zwischen Seminalplasmaproteinen, antioxidativem
Status des Seminalplasmas und Spermaqualität 100
5.3.1 Reproduzierbarkeit der Gelanfertigung 100
5.3.2 Charakteristika der Seminalplasmaproteine 100
5.3.3 Zusammenhang zwischen Seminalplasmaproteinen und Spermaqualität 101 5.3.4 Zusammenhang zwischen Seminalplasmaproteinen und antioxidativen
Status des Seminalplasmas 103
5.4 Schlussfolgerungen und Ausblick 104
6. ZUSAMMENFASSUNG 106
7. SUMMARY 108
8. ANHANG 110
8.1 Chemikalien, Medien und Geräte für flowzytometrische Versuche 110
8.1.1 Tyrode-Medium 110
8.1.2 TNE-Puffer 111
8.1.3 Chemikalien 111
8.1.4 Fluorochrome 112
8.1.5 Herstellung der Spermiensuspensionen in Abhängigkeit von der
Verdünnung 113
8.1.6 Geräte und Materialien 114
8.2 Chemikalien, Medien und Geräte für die 2 D Gelelektrophorese 115
8.2.1 Chemikalien und Zubehör 115
8.2.2 Anzusetzende Lösungen 116
8.2.3 Färbelösungen und -methode ProteoSilver™Silver Stain Kit (Sigma Aldrich) 118
8.2.4 Geräte 120
8.3 Aminosäurencode nach IUPAC/IUB 121
8.4 Tabelle des Versuchsaufbaus 122
8.5 Tabelle der Parameter der einzelnen Bullen des Versuchs 3 123
8.6 Korrelationsmatrix des Versuchs 3 125
8.7 Darstellung der vier Spermienpopulationen des FITC-PNA/PI-Assay in
Abhängigkeit verschiedener Verdünnungen 127
8.8 Abkürzungsverzeichnis 128
9. LITERATURVERZEICHNIS 132
1. EINLEITUNG
Die Künstliche Besamung ist die wichtigste Biotechnologie in der Tierproduktion, wobei beim Rind vorwiegend kryokonserviertes Sperma eingesetzt wird. Es kommt hierbei jedoch zu erheblichen Qualitätsverlusten, welche auf eine Reihe von Faktoren zurückzuführen sind. Hierzu zählen neben bullenspezifischen Eigenschaften (WATSON 1995, 2000) auch der benutzte Verdünner (KARABINUS et al. 1991; THUN et al. 2002), der Verdünnungsgrad des Spermas (GARNER et al.
1997; PRATHALINGAM et al. 2006; BALLESTER et al. 2007), bestimmte Seminalplasmaproteine (JOBIM et al. 2004) sowie antioxidative Faktoren des Ejakulats (BILODEAU et al. 2000; STRADAIOLI et al. 2007).
Hinsichtlich des Effekts des Verdünnungsgrades gibt es sehr widersprüchliche Ergebnisse. Diese reichen von positiven bis hin zu negativen Auswirkungen auf die Spermaqualität, wobei die Versuche jedoch jeweils nur an relativ geringen Tierzahlen durchgeführt wurden (GARNER et al. 1997; PRATHALINGAM et al. 2006;
BALLESTER et al. 2007). Die Verdünnung des Spermas ist neben der Reduzierung der Spermienzahl mit einer Abnahme des Gehalts an Seminalplasma verbunden, wobei es auch über den Einfluss des Seminalplasmas auf die Integrität der Spermien sehr unterschiedliche Aussagen gibt (ACOTT u. HOSKINS 1978; GARCIA u.
GRAHAM 1987a; MAXWELL u. JOHNSON 1999; WAY et al. 2000). Wichtige Inhaltsstoffe des Seminalplasmas sind Antioxidantien, welche besonders während des Einfrier- und Auftauprozesses der Spermien eine bedeutende Rolle zu spielen scheinen, da diese Vorgänge mit hohem oxidativen Stress verbunden sind (HOLT 2000; CHATTERJEE u. GAGNON 2001). In den letzten Jahren sind aber auch Beobachtungen gemacht wurden, dass sich bestimmte Proteine im Seminalplasma positiv auf die Kryokonservierbarkeit des Spermas auswirken (JOBIM et al. 2004).
Das Ziel dieser Arbeit war, an einer repräsentativen Bullenzahl zu testen, welche Auswirkungen eine steigende Verdünnung des Samens auf die Spermaqualität hat.
Von den Bullen wurden ausserdem wiederholt Ejakulate gewonnen, um zu
überprüfen, ob eventuell vorhandene Effekte auf tierindividuelle oder ejakulatbedingte Faktoren zurückzuführen sind. Ausserdem sollte getestet werden, ob durch Zusatz von Seminalplasma zu den Spermien beziehungsweise Erniedrigung des Seminalplasmagehaltes die Spermaqualität verbessert werden kann. Schließlich sollte noch überprüft werden, ob und welche Proteine im Seminalplasma Einfluss auf die Spermaqualität, insbesondere die Plasmamembranintegrität haben.
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1. Morphologie des Spermiums und durchflusszytometrische Verfahren zur Bestimmung von Spermienqualitätsparametern
Im Folgenden werden die wichtigsten morphologischen Aspekte des Spermiums für ein besseres Verständnis der Arbeit beschrieben. Jedem Kapitel folgt eine Beschreibung eines durchflusszytometrischen Verfahrens, welches zur Detektion und zur Bestimmung des funktionellen Zustands des entsprechenden morphologischen Merkmals dient.
Aufbau des Spermiums
Am Spermium können lichtmikroskopisch der Kopf und der Schwanz unterschieden werden. Elektronenmikroskopisch lassen sich die Samenzellen weiter analysieren (Abb. 2.1) und der Schwanz in einen kurzen Halsabschnitt, ein Mittelstück, ein Hauptstück und ein Endstück untergliedern (SINOWATZ 2001).
Abb. 2.1: Aufbau des Spermiums nach Gadella et al. (2001).
Durchflusszytometrische Bestimmung von Spermaqualitätsparametern
Durch die Entwicklung der ersten Durchflusszytometer im Jahre 1965 wurde es möglich, große Anzahlen von Zellstrukturen und deren physiologische Eigenschaften mit Hilfe optischer Messungen objektiv zu beurteilen (GROGAN u. COLLINS 1990).
Auch Spermien lassen sich mit dieser Technik untersuchen. Hierfür werden sie mittels eines Fluoreszenzfarbstoffs angefärbt und durch einen Flüssigkeitsstrom an einem Laser vorbeigeleitet. Ein optisches System detektiert die von jeder Zelle durch den Laser angeregten charakteristischen Lichtemissionen, welche anschließend in digitale Signale umgewandelt werden und mit Hilfe eines Computers ausgewertet werden können (BALLACHEY et al. 1986).
Durch die Anfärbbarkeit der Spermienzellen kann auf deren funktionalen Status geschlossen werden. Es lassen sich dadurch Rückschlüsse auf z.B. die Integrität der Plasmamembran, den akrosomalen Status oder die Integrität der Chromatinstruktur einer Spermienpopulation ziehen.
Plasmamembran
äußere Akrosomenmembran Akrosomeninhalt
innere Akrosomenmembran Kernmembran, die Chromatin- substanz umschließend postakrosomale Zentriole Mitochondrien
akrosomaler Bereich
postakrosomaler Bereich Halsregion Mittelstück
Hauptstück
Endstück
Kopf
Schwanz
Mehrere Parameter lassen sich auch simultan ermitteln, da man die Fluorochrome auch kombiniert einsetzen kann (EVENSON et al. 1982; ERICSSON et al. 1993;
GARNER et al. 1994). Verglichen mit mikroskopischen Untersuchungen gibt es eine Reihe von Vorteilen bei der Flowzytometrie: Die Untersuchung ist schneller (1000 Zellen/Sekunde), die Überprüfung der Zellparameter erfolgt anhand von Maßangaben des Gerätes und findet nicht durch einen subjektiven Betrachter statt, es können sehr große Anzahlen von Zellen untersucht werden, wodurch bessere statistische Sicherheit gewährt ist und letztlich sind die Ergebnisse des Gerätes erwartungsgetreu, da alle Zellen, die in das Gerät gegeben werden, auch analysiert werden (EVENSON et al. 1986).
2.1.1 Die Plasmamembran
Die gesamte Samenzelle wird von einer Plasmamembran umhüllt, welche die Organellen und intrazellulären Komponenten zusammenhält (SILVA u. GADELLA 2006). Der Aufbau dieser Membran zeigt das typische Bauprinzip von Biomembranen mit Doppellipidschicht, eingelagerten Cholesterinmolekülen, globulären Proteinen und anderen integralen und assoziierten Makromolekülen (SINGER u. NICOLSON 1972). Sie unterscheidet sich jedoch in einigen Aspekten von Plasmamembranen anderer somatischer Zellen: Es gibt einen hohen Anteil von ungesättigten Fettsäuren in den Phospholipiden und durch einen hohen Cholesteringehalt ist die Fluidität besonders im Kopfbereich stark herabgesetzt (ROVAN 2001). Durch die semipermeable Eigenschaft der Membran wird der chemische Gradient für Ionen und andere lösliche Komponenten aufrechterhalten (SILVA u. GADELLA 2006).
Die Plasmamembran der Spermien spielt eine wichtige Rolle bei der Interaktion zwischen Spermium und Oozyte (LENZI et al. 1996). Der Membranlipidaufbau und die Fluidität der Membran entwickeln sich während der Reifung des Spermiums.
Hierdurch wird die Verschmelzung des genetischen Materials des Spermiums mit dem der Oozyte während der Befruchtung sichergestellt (LADHA 1998).
Aufgrund des Verlustes der meisten Zellorganellen und der Beendigung der DNA- Transkription im reifen Spermium ist eine Neusynthese von Plasmamembrankomponenten unmöglich (FLESCH u. GADELLA 2000; GADELLA et al. 2001). Eine Schädigung der Plasmamembran führt daher zu einem irreversiblen Verlust der Motilität und Fertilisationsfähigkeit (GRAHAM et al. 1990;
AURICH 2005).
Durchflusszytometrische Evaluierung der Integrität der Plasmamembran von Spermien
Die schnelle und genaue Erfassung von lebenden und toten Spermien in einer Probe ist wichtig für die Bestimmung ihrer Qualität (GARNER et al. 1986). Hierbei bedient man sich Färbungen, die lebende Spermien mit intakter Membran anders anfärben als tote Spermien mit defekter Membran.
Propidiumiodid (PI) ist ein roter, spezifisch die Nukleinsäuren anfärbender Fluoreszenzfarbstoff, welcher intakte Membranen nicht zu durchdringen vermag und somit nur plasmamembrandefekte Spermienzellen anfärben kann (GARNER et al.
1986). Zur Charakterisierung lebender, membranintakter Zellen eignen sich 6- Carboxyfluorescein (CFDA) oder SYBR-14, welche beide für Membranen permeabel sind und die Zellkerne von lebenden Zellen grün anfärben (GARNER et al. 1986;
GARNER et al. 1994; GARNER u. JOHNSON 1995).
2.1.2. Das Akrosom
Das Akrosom stülpt sich kappenartig an der apikalen Seite des Spermienkopfes über den darunter liegenden Kern (Abb. 2.1). Die dem Kern nahe Membran wird als innere Akrosomenmembran und die der Plasmamembran angenäherte Membran als äußere Akrosomenmembran bezeichnet (SCHUELKE 1982, ROVAN 2001). Das Akrosom bildet sich bei der Spermatogenese aus dem Golgi-Apparat. Der Inhalt erscheint elektronendicht und feinkörnig. Es handelt sich vor allem um Proteine mit enzymatischer Funktion wie Akrosin, Hyaluronidase und verschiedene saure
Hydrolasen und Esterasen (EDDY u. O`BRIEN 1994). Diese akrosomalen Enzyme werden bei der Interaktion von Spermium und Oozyte aktiviert (ROVAN 2001).
2.1.2.1 Die Kapazitation
Bereits 1951 wurde entdeckt, dass sich Spermien für eine gewisse Zeit im weiblichen Genitale aufhalten müssen, um die Zona pellucida der Eizelle durchdringen zu können (AUSTIN 1951; CHANG 1951). AUSTIN führte 1952 den Begriff der Kapazitation ein. Man versteht unter Kapazitation den Reifungsprozess der Spermatozoen im weiblichen Genitale. Ejakulierte Säugetierspermien müssen diesen Prozess durchlaufen, um die Akrosomenreaktion durchzuführen und die Eizelle befruchten zu können (TOEPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001).
Die Dauer zwischen Kapazitation, Akrosomenreaktion und Zelltod verläuft bei den einzelnen Spermien zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Damit sind zu verschiedenen Zeitpunkten kapazitierte Spermien vorhanden und erhöhen einen Befruchtungserfolg der ovulierten Eizelle (DIDION u. GRAVES 1986).
Der genaue Mechanismus der Kapazitation ist bis zum heutigen Zeitpunkt noch nicht bekannt. Obwohl keine morphologischen Veränderungen am Spermium während der Kapazitation auftreten (BEDFORD 1970), finden eine Reihe von biochemischen Veränderungen statt (LANE et al. 1999). Hierzu zählen der Verlust von Cholesterol aus der Plasmamembran (Abb. 2.2), wodurch es zu einer Herabsetzung des Cholesterol:Phospholipid Verhältnisses und zu einer Destabilisierung der Membran kommt (DAVIS et al. 1980, DAVIS 1981, GO u. WOLF 1985). Es kommt weiterhin zu einer Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes (SINGH et al. 1978), zu einem Abstreifen von Oberflächenkomponenten, welche sich während der Nebenhodenpassage und durch den Kontakt mit Seminalplasma der Membranoberfläche des Spermiums aufgelagert haben (OLIPHANT 1976). Des weiteren findet eine Erhöhung des intrazellulären pH-Werts statt (VREDENBURGH- WILBERG u. PARRISH 1995).
Abb. 2.2: Schematische Darstellung der initialen Vorgänge des Kapazitationsprozesses (nachTOEPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001).
a) oberflächenassoziierte Proteine schützen die Spermienoberfläche
b) oberflächenassoziierte Proteine werden entfernt. Die Membran wird permeabel für Kalziumionen, und Cholesterin (Chol) kann mit Hilfe lipidbindender Proteine des weiblichen Genitaltraktes aus der Spermienmembran entfernt werden
c) die Spermienmembran besitzt nun eine erhöhte Fluidität, welche die Reorganisation mobiler Membranproteine und die Bildung von proteinfreien Mikrodomänen fördert
Die Umgestaltung des molekularen Aufbaus betrifft besonders die periakrosomale Plasmamembran und führt hier zur Bildung von proteinarmen Mikrodomänen, über die vermutlich bei der später stattfindenden Akrosomenreaktion die vielfältigen Punktfusionen mit der darunter liegenden äußeren akrosomalen Membran ablaufen (TOEPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001).
Zudem kommt es während der Kapazitation zu einer Veränderung des Bewegungsmusters des Spermiums, auch „Hyperaktivierung“ genannt. Diese entsteht vermutlich durch die Umverteilung der Membrankomponenten (YANAGIMACHI 1994; TOEPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001).
Ein kapazitationsauslösender Faktor wurde in Oviduktflüssigkeit nachgewiesen.
Dieser hat die höchste Aktivität während des Östrus und physiologische und chemische Eigenschaften, die einem heparinartigen Glykosaminoglykan ähneln (PARRISH et al. 1989). Die Kapazitation lässt sich auch durch Inkubation der Spermien in einem heparinhaltigen Medium auslösen, wobei es mit steigender Heparinkonzentration zu einer erhöhten Zahl an kapazitierten Spermien kommt
(PARRISH et al. 1988). Der bei der Kapazitation beobachtete Cholesterolefflux ist abhängig von der Fähigkeit des umgebenden Mediums Cholesterol zu binden (THERIEN et al. 1998). Albumin (DAVIS et al. 1980; GO u. WOLF 1985) und High- Density-Lipoprotein (EHRENWALD et al. 1990), welche im weiblichen Genitaltrakt vorkommen, erleichtern als Cholesterolakzeptoren den Cholesterolefflux, der während eines frühen Stadiums der Kapazitation auftritt.
Der Cholesterolefflux verläuft in zwei Phasen. Der erste Efflux findet aufgrund des Kontaktes von bovinen Seminalplasmaproteinen (BSP-Proteine) zum Spermium während der Ejakulation statt. Der zweite, bedeutendere Cholesterolausstrom findet mittels High-Density-Lipoprotein (HDL) im weiblichen Genitale statt (THERIEN et al.
1998). Die Hauptproteine des Seminalplasmas alleine vermögen keine Kapazitation auszulösen. Sie können jedoch in Kombination mit Heparin oder HDL die Kapazitation von bovinen epididymalen Spermien beschleunigen. Diese Seminalplasmaproteine haben daher eine kapazitationsschützende Wirkung auf die Spermien, bis diese den richtigen Ort erreicht haben und dort stimulieren die Seminalplasmaproteine im weiblichen Genitaltrakt mittels Heparin oder HDL die Kapazitation (THERIEN et al. 1997).
2.1.2.2 Die Akrosomenreaktion
Bei kapazitierten Spermien, die an der Zona pellucida spezifisch gebunden sind, wird die für die Befruchtung wichtige Akrosomenreaktion (AR) ausgelöst. Bei diesem Vorgang kommt es zu punktförmigen Fusionen, auch Vesikulation genannt (BARROS et al. 1967), zwischen der Plasmamembran und der äußeren akrosomalen Membran (Abb. 2.3). Durch die hierbei entstehenden Löcher können die Enzyme des Akrosoms freigesetzt werden. Mit fortschreitender Reaktion verschwindet das Akrosom und die innere Akrosomenmembran begrenzt das Spermium im Kopfbereich (TOEPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001).
Abb. 2.3: Schematische Darstellung der Vesikulation (nach BARROS et al. 1967).
Die AR ist abhängig vom extrazellulären Kalziumgehalt (YANAGIMACHI u. USUI 1974). Das zentrale Ereignis für die Exozytose des Akrosoms ist der Einstrom von extrazellulärem Kalzium. Die Erhöhung des Kalziumspiegels wird durch rezeptorvermittelte Signaltransduktion kontrolliert. Diese Signaltransduktion wird nach Bindung des Spermiums an die Zona pellucida durch deren Glykoproteine aktiviert und führt zur Öffnung von Kalziumkanälen in der Spermienmembran (FLORMAN et al. 1992;TOEPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001).
Eines der freigesetzten Enzyme ist Hyaluronidase, welche dem Spermium vermutlich bei der Penetration von Cumuluszellen und der Corona radiata hilft (TALBOT 1984).
Das prominenteste Enzym des Akrosoms ist Proakrosin, die Proform einer Protease, die nach ihrer Exocytose zu Akrosin aktiviert wird und die Zonaproteine chymotrypsinähnlich verdaut (ROVAN 2001). Neben der Proteaseaktivität besitzt Akrosin auch noch eine kohlenhydratbindende Eigenschaft (TOPFER-PETERSEN u.
HENSCHEN 1987). Hierdurch wird das bereits akrosomenreagierte Spermium durch eine sog. sekundäre Bindung an die Zona pellucida geheftet (HOWES u. JONES 2002).
Die AR kann nicht nur durch die Bindung der Plasmamembran des Spermiums an Glykoproteine der Zona pellucida ausgelöst werden, sondern auch in vitro durch Kontakt des Spermiums mit löslichen Extrakten der Zona pellucida (FLORMAN u.
FIRST 1988). Ebenso kann die AR bei Spermien durch Progesteron initiiert werden (MELENDREZ et al. 1994; MEYERS et al. 1995; THERIEN u. MANJUNATH 2003).
Oft verwendet man zum Auslösen einer AR in vitro das Kalziumionophor A23187 (GREEN 1976). Für das Auslösen der AR durch A23187 ist eine vorherige Kapazitation nicht notwendig, da durch diese Substanz der intrazelluläre Regulationsmechanismus umgangen wird und es direkt zu einem massiven Einstrom von Kalzium kommt (BRUCKER u. LIPFORD 1995). Der Kalziumeinstrom wird hierbei durch einen Austausch gegen H+ Ionen herbeigeführt (BREITBART et al.
1997).
Beim Zelltod kann es zu einer falschen oder spontanen AR kommen, welche von einer physiologischen unterschieden werden muss (BEDFORD 1970; BRUCKER u.
LIPFORD 1995). Bei der spontanen AR wird ohne einen Einfluss bestimmter Substanzen auf das Spermium die äußere Akrosomenmembran aufgelöst (YANAGIMACHI 1994).
Durchflusszytometrische Bestimmung des akrosomalen Status
Wie schon im vorherigen Abschnitt beschrieben wurde, kann es beim Zelltod zu einer falschen oder spontanen AR kommen, welche von einer physiologischen unterschieden werden muss (BEDFORD 1970; BRUCKER u. LIPFORD 1995). Eine echte Akrosomenreaktion, die einer Befruchtung vorausgeht, entsteht nur in lebenden Spermien und benötigt ein intaktes und reaktionsfähiges Akrosom (THOMAS et al. 1997; ABOU-HAILA u. TULSIANI 2000). Daher ist es neben der Untersuchung des akrosomalen Status auch wichtig zu wissen, ob es sich um eine lebende oder tote Zelle handelt (AALSETH u. SAACKE 1986). Eine derartige Untersuchung ist möglich mit der kombinierten Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe Phycoerythrin – Peanut Agglutinin (PE-PNA) bzw. Fluoreszein- Isothiocyanat - Peanut Agglutinin (FITC-PNA), mit SYBR™-14 bzw. SYTO®-17 und PI (THOMAS et al. 1997; NAGY et al. 2003) oder nur durch den kombinierten Einsatz von FITC-PNA mit PI (RATHI et al. 2001).
Es gibt verschiedene Lektine mit einer hohen Affinität zur akrosomalen Membran oder Matrix (CROSS et al. 1986; MORTIMER et al. 1987). Durch Konjugation der Lektine mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) kommt es
zur Fluoreszenz der Akrosome (BLOTTNER et al. 1998). Verwendung finden vor allem die Lektine von Arachis hypogea (Peanut Agglutinin, PNA) und Pisum sativum agglutinin (PSA). PSA hat zwei Bindungsstellen für Mannose und D-Glucosid und bindet an die akrosomale Matrix (CROSS et al. 1986; FARLIN et al. 1992). PNA dagegen bindet spezifisch an die äußere akrosomale Membran und emittiert bei Konjugation an FITC nach Anregung grünes Licht (MORTIMER et al. 1987: CHENG et al. 1996; BLOTTNER et al. 1998; GADELLA et al. 2001; NAGY et al. 2003). Da FITC-PNA nicht an die Plasmamembran des Spermiums bindet (CHENG et al.
1996), erscheint erst dann eine Grünfluoreszenz, wenn es durch den Prozess der Vesikulation zu Fusionen zwischen der Plasmamembran und der äußeren akrosomalen Membran gekommen ist und der Farbstoff an die äußere Akrosomenmembran binden kann. Daher zeigen akrosomenreagierte Spermien eine grün fluoreszierende Kopfkappe.
Beim kombinierten Einsatz von FITC-PNA und PI können vier verschiedene Zellpopulationen unterschieden werden (RATHI et al. 2001):
1. Spermien mit positivem akrosomalen Status und geschädigter Plasmamembran,
2. Zellen mit negativem akrosomalen Status und geschädigter Plasmamembran, 3. Spermien mit intakter Plasmamembran und positivem akrosomalen Status, 4. Spermien mitintakter Plasmamembran und negativem akrosomalen Status.
Es kann demnach durch Anwendung der Zweifachfärbung FITC-PNA und PI zwischen plasmamembranintakten und plasmamembrandefekten Spermien mit einem positiven oder negativen akrosomalen Status unterschieden werden.
Induktion der Akrosomenreaktion
Eine Akrosomenreaktion lässt sich auch in vitro durch verschiedene Substanzen auslösen (FLESCH u. GADELLA 2000). Da erhöhte intrazelluläre Kalziumspiegel die akrosomale Reaktion initiieren, wird bereits seit mehreren Jahren das Kalziumionophor A23187 zur Induktion der akrosomalen Reaktion in vitro eingesetzt (ROLDAN u. HARRISON 1989; KOHN u. SCHILL 1998; PEREIRA et al. 2000).
Aufgrund ihres hydrophoben Charakters sind Kalziumionophore in der Lage, Ionen durch Membranen zu transportieren (PEREIRA et al. 2000). Das Ionophor A23187 umgeht die Notwendigkeit einer Kapazitation durch Bildung eines lipophilen Komplexes mit Kalziumionen, wodurch es zu einem schnellen Transport von Kalzium durch die Spermienmembran kommt (SUMMERS et al. 1976; AITKEN et al. 1984;
LIU u. BAKER 1998). Sobald ein bestimmter Grenzwert der Kalziumkonzentration im Zellinneren erreicht wird, beginnt die AR (LANGLAIS u. ROBERTS 1985). Bei Behandlung von bovinen Spermien mit Kalziumionophor zeigten PEREIRA et al.
(2000) einen signifikanten Anstieg von lebenden, akrosomenreagierten Zellen.
In Versuchen von BYRD und WOLF (1986) konnte gezeigt werden, dass besonders schon kapazitierte Spermien auf eine Induktion mittels Kalziumionophor reagieren.
Der Zusatz des Kalziumionophors führt in bereits kapazitierten Spermien aufgrund deren Fragilität der Plasmamembran zur AR (GADELLA et al. 2001).
Es sollte beachtet werden, dass bei der Induktion der AR mittels eines Kalziumionophors mehrere Signaltransduktionswege der physiologischen Initiierung der AR umgangen werden (GADELLA et al. 2001). Es gibt somit Unterschiede zwischen der physiologischen, durch die Zona pellucida ausgelösten und der durch schädigende Einflüsse bzw. durch das Kalziumionophor hervorgerufenen AR (CUMMINS et al. 1991).
2.1.3 Der Zellkern
Die Grundlage des Spermienkopfes bildet der Zellkern mit seinem haploiden Chromosomensatz (SINNOWATZ 2001). Er reicht von der Kopfspitze bis zum Halsbereich, seine Membran ist der inneren Akrosomenmembran dicht angelagert und das Kernchromatin erscheint im Elektonenmikroskop strukturlos und extrem elektronendicht (ROVAN 2001). Das Chromatin des Spermiums ist lamellenartig verpackt und unterscheidet sich von dem somatischer Zellen im Grad der Kondensation (GOLAN et al. 1997, SARTORI BLANC et al. 2001). Die DNA- Konzentrationen im Spermiennukleus gehören mit zu den höchsten, die in der Natur
gefunden wurden. Während der Spermiogenese werden die Histone, an welche die DNA gebunden ist, zuerst durch sog. Transitionsproteine und anschließend durch Protamine ersetzt (GREEN et al. 1994). Bei den Protaminen handelt es sich um kleine basische Proteine, welche sich enger an die DNA binden als die Histone, wodurch es zu einer engeren Packung der DNA kommt. Dieser Vorgang wird als Chromatin-Kondensation bezeichnet (GOLAN et al. 1997). Bei allen Säugetieren enthalten die Protamine große Mengen an Cystein. Durch Disulfidbindungen zwischen benachbarten Protaminmolekülen werden diese um die DNA-Helix herumgewickelt (BALHORN et al. 1991). An die DNA wird Protamin vor allen durch elektrostatische Wechselwirkungen von Argininmolekülen gebunden (MAIER et al.
1990).
Es gibt zwei verschiedene Klassen von Protaminen, die bei Säugetieren isoliert wurden und Protamin 1 bzw. Protamin 2 genannt werden. Alle Tierarten besitzen Protamin 1, welches kleiner als Protamin 2 ist. Einige Nagetiere und Primaten besitzen zusätzlich Protamin 2 (BALHORN et al. 1991). Bei beiden Molekülen handelt es sich um basische Proteine mit ca. 50 Aminosäuren, die reich an Arginin und Cystein sind. Histidin kommt dagegen nur in Protamin 2 vor.
Durch die Komprimierung des Chromatins wird die Erbsubstanz während der Spermiogenese und der epididymalen Reifung gegen Umwelteinflüsse und mutagene Substanzen geschützt. Hiermit wird gewährleistet, dass die Integrität des genetischen Materials bis zum Zeitpunkt der Fertilisation aufrechterhalten bleibt (LOVE u. KENNEY 1998).
Durchflusszytometrische Analyse der Spermienchromatinstruktur mittels Akridinorange-Färbung
Der Spermienchromatinstruktur Assay (SCSA™) wurde zuerst von EVENSON et al (1980) beschrieben und dient zur Untersuchung der Integrität der Spermienchromatinstruktur. Das Sperma wird bei diesem Test zunächst einem stark sauren Milieu (pH 1,2) ausgesetzt, um hierdurch eine Denaturierung der Chromatinstruktur hervorzurufen. Diese Denaturierung führt teilweise zur Trennung der normalerweise doppelt vorliegenden DNA-Stränge in Einzelstränge. Das Ausmaß
der provozierten Denaturierung hängt von der Integrität des Spermienchromatins ab.
Anschließend wird der fluoreszierende, metachromatische Farbstoff Akridinorange (AO) zugegeben, um den Grad der Denaturierung zu identifizieren. Sofern AO mit doppelsträngiger DNA in Verbindung kommt, fluoresziert diese durch die Anregung des Laserlichts grün. Bei einzelsträngiger DNA wird dagegen eine rote Fluoreszenz emittiert (EVENSON et al. 1999; EVENSON et al. 2002). Mittels Durchflusszytometrie wird die Fluoreszenz für jedes Spermium bestimmt und nachfolgend der Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz (rot und grün) errechnet. Dieser Wert wird nach der neuen Nomenklatur als DNA-Fragmentationsindex (DFI) bezeichnet und kann Werte zwischen 0 und 1 annehmen (EVENSON et al. 2002). Je höher die DNA- Fragmentation der Spermien ist, desto höher ist der DFI-Wert. Werden die Spermien in Abhängigkeit ihrer DFI-Werte in einem Häufigkeitsdiagramm dargestellt, so können zwei Populationen differenziert werden: Neben der Hauptpopulation mit niedrigen DFI-Werten gibt es eine weitere Population mit erhöhten DFI-Werten, welche auch als DFI-Spermien bezeichnet werden (EVENSON et al. 2002). Der Wert DFI% gibt den Anteil letztgenannter Spermien in der Gesamtpopulation der Spermien an.
2.2. Herkunft und Zusammensetzung des Seminalplasmas und elektrophoretische Auftrennung von Seminalplasmaproteinen
2.2.1 Das Seminalplasma
2.2.1.1 Definition von Seminalplasma und akzessorischem Sekret
Als Seminalplasma bezeichnet man die Sekrete der akzessorischen Geschlechtsdrüsen (WIESNER u. RIBBECK 2000). Dagegen versteht man unter dem Begriff „akzessorisches Sekret“ die Summe aller nicht den Testes entstammenden Komponenten des Ejakulates. Bei den meisten Spezies ist es weitgehend mit dem Seminalplasma identisch (PETZOLDT 2001). Entsprechend der
speziesspezifischen Ausprägung der akzessorischen Geschlechtsdrüsen variiert die Zusammensetzung des Seminalplasmas zwischen den einzelnen Tierarten.
2.2.1.2 Akzessorische Geschlechtsdrüsen
Die akzessorischen Geschlechtsdrüsen liegen in der Umgebung des Beckenstücks der Harnröhre (Abb. 2.4).
Zu den akzessorischen Geschlechtsdrüsen zählen die Samenleiterampulle (Ampulla ductus deferentis), die paarig angelegte Samenblasendrüse (Glandula vesicularis), die unpaare Prostata (Glandula prostatica), die ebenfalls paarig vorkommende Harnröhrenzwiebeldrüse (Glandula bulbourethralis) sowie die Urethraldrüsen (Glandulae urethrales).
Abb. 2.4: Schema der männlichen Geschlechtsorgane zur Darstellung der arttypischen Merk- male der akzessorischen Geschlechtsdrüsen des Rindes. a = rechter Hoden und Nebenhoden; b = Samenleiter; c = Harnblase; d = Harnleiter, e = Beckenstück der Harnröhre mit Mündungen der akzessorischen Geschlechtsdrüsen; f = Penis mit Penisstück der Harnröhre; g Beckenboden; Gestrichelt: Samenleiterampulle bzw.
Bereich der Gll. Ampullae; Schwarz: Corpus bzw. Pars disseminata der Prostata;
Punktiert: Gl. vesicularis; Hellgrau: Gl. Bulbourethralis (modifiziert nach NICKEL et al. 1987).
Die Samenleiterampulle ist als spindelförmige Auftreibung des Endstücks des Ductus deferens ausgebildet. Wichtige Sekretionsprodukte der tubuloalveolären Ampullendrüsen sind Fruktose und das bovine Seminalplasma (BSP) Protein A1 bzw. A2 (BSP-A1/BSP-A2). Diese Proteine werden auch PDC-109, oder „major
protein“ genannt. Sie unterscheiden sich nur im Glykolysierungsgrad und besitzen dieselbe Polypeptidstruktur (ESCH et al. 1983). Während die Fruktose für den Energiestoffwechsel der Spermien notwendig ist, werden BSP-A1/BSP-A2 an die Zellmembran der Spermien absorbiert und tragen zu ihrer funktionellen Ausreifung bei (SINOWATZ 2001). Die Samenblasendrüse erscheint als derbe, höckrige Drüse mit einer Größe von 7 bis 12 cm. Ihr gelatinöses Sekret enthält Fruktose und ebenfalls das „major protein“, welches von dieser Drüse in großer Menge sezerniert wird (SINOWATZ 2001). Die Prostata besteht aus dem Corpus prostatae und der Pars disseminata. Hier wird ein schwach saures, dünnflüssiges und farbloses Sekret produziert. Es enthält Enzyme (prostataspezifische saure Phosphatase, Proteasen).
Das Prostatasekret wird bei der Ejakulation dem Sperma beigemengt und soll die Motilität der Spermien entfachen. Das schwach alkalische Sekret der Harnröhrenzwiebeldrüse dient zur Neutralisation von Urinresten in der männlichen Harnröhre und des sauren Scheidenmillieus (SINOWATZ 2001).
2.2.1.3 Zusammensetzung des Seminalplasmas
Das Seminalplasma besteht aus einer Mischung von sowohl organischen als auch anorganischen Bestandteilen, wobei als Bestandteile mit einer höheren molekularen Masse vor allem die Proteine zu nennen sind (TEDESCHI et al. 2000). Folgende Hauptgruppen der stofflichen Komponenten lassen sich unterscheiden: Ionen und anorganische Bestandteile, kleine organische Moleküle, Steroide und Prostaglandine, Proteine und Enzyme (MANN u. LUTWAK-MANN 1981).
Hinsichtlich des Volumens und der Zusammensetzung des Seminalplasmas ist eine biologisch bedingte ausgeprägte Variabilität möglich, da die Sekretbildung zwar einer hormonellen Steuerung unterliegt, die Sekretabgabe jedoch keinen Regelmechanismen. Das Sekret einer jeden Drüse und das Seminalplasma in seiner Gesamtheit werden somit unkontrolliert während der Ejakulation abgegeben (PETZOLDT 2001).
Im Seminalplasma befinden sich die organischen Bestandteile in sehr hohen Konzentrationen, so dass der osmotische Status des Seminalplasmas von den organischen Bestandteilen abhängt und nicht von den anorganischen wie in anderen Körperflüssigkeiten (MANN u. LUTWAK-MANN 1981). Das Seminalplasma geht nur eine zeitlich und stofflich begrenzte Interaktion mit den Spermien ein bzw. tritt im weiblichen Genitale mit weiteren Sekreten in Wechselwirkung (PETZOLDT 2001).
2.2.1.3.1 Proteine des Seminalplasmas
Während der Passage durch den männlichen und weiblichen Reproduktionstrakt durchlaufen die Spermien eine Reihe von Reifungsprozessen, zu denen auch die Interaktion verschiedener Seminalplasmaproteine an die Spermienoberfläche gehört.
Modifikationen, die vorwiegend die Spermienmembran betreffen, werden durch den direkten Kontakt mit Faktoren des umgebenen Millieus vermittelt und beruhen auf einer Umstrukturierung/Remodellierung und dem Verlust von Membranproteinen bzw. der Integration neuer Proteine. Diese, besonders die Zellmembran betreffenden, Veränderungen sind für den Erwerb der Befruchtungskompetenz der Spermatozoen von großer Bedeutung (TOEPFER-PETERSEN et al. 2005).
Im Folgenden werden fertilitätsrelevante Proteinfamilien des Seminalplasmas näher beschrieben.
A. Fibronektin-Typ 2-Domänen-Proteine
Die Fibronektin-Typ2- (Fn2) Domänen Proteine des Seminalplasmas zeichnen sich durch zwei bzw. vier im Tandem angeordnete, konservierte Fn2-Domänen aus, die sich durch unterschiedlich lange N-Termini und durch den Grad ihrer Glykolysierung unterscheiden (MULLER et al. 2002; SCHAFER et al. 2003; TOEPFER-PETERSEN et al. 2005; FAN et al. 2006).
Beim Hengst werden die langen Formen (EQ12) vor allem im Nebenhoden synthetisiert, während die kurzen Fn-2 Proteine (SP1/2) von der Ampulla ductus deferentis produziert werden (EKHLASI-HUNDRIESER et al. 2005b).
Die Hauptproteine im Seminalplasma vom Rind (MANJUNATH u. SAIRAM 1987), Pferd (CALVETE et al. 1995a, CALVETE et al. 1995b; MENARD et al. 2003), Ziege (VILLEMURE et al. 2003) und Bison (BOISVERT et al. 2004) sind alle durch das Vorhandensein von ihren konservierten Fn-2-Typ-Domänen gekennzeichnet (SMITH et al. 2000). Verwandte Proteine sind ebenfalls als geringe Bestandteile im Seminalplasma von Schweinen gefunden worden (CALVETE et al. 1997; EKHLASI- HUNDRIESER et al. 2007).
BSP-Proteine
Die bovinen Seminalplasmaproteine gehören zu den am Besten untersuchten Proteinen des männlichen Genitaltraktes und werden zusammen als BSPs (bovine seminal plasma proteins) bezeichnet. zu ihnen gehören die BSP-A1/A3, BSP-A3 und BSP-30kDa, die jeweils zwei tandemartig verknüpfte Fibronektin-Typ2-Domänen aufweisen und sich nur durch unterschiedlich lange N-terminale Bereiche unterscheiden (THERIEN et al. 1995; MANJUNATH u. THERIEN 2002). Da sich BSP-A1 und BSP-A2 nur im Grad ihrer Glykolysierung unterscheiden, werden sie auch als PDC-109 (Protein with N-terminus aspartic acid, D, and carboxy terminus Cystein, having 109 amino acids) zusammengefasst (GWATHMEY et al. 2003).
Sie sind mit die am häufigsten von der Samenblasendrüse produzierten Proteine beim männlichen Rind und machen über 60% des Gesamtproteingehaltes des Seminalplasmas aus (SALOIS et al. 1999; MULLER et al. 2002).
Die molekulare Masse von BSP-A1, -A2 and -A3 liegt zwischen 15 und 16,5 kDa, wogegen BSP-30-kDa eine molekulare Masse von 28 kDa besitzt. BSP-A1, -A2 und - 30-kDa sind Glykoproteine, dagegen enthält BSP-A3 keine Kohlenhydrate. BSP-A1 und –A2 weisen die gleiche Aminosäuresequenz auf und unterscheiden sich nur im Grad der Glykolysierung. Bei allen BSP-Proteinen handelt es sich um saure Proteine mit einem isoelektrischen Punkt (pI) von 3,6 bis 5,2 (DESNOYERS et al. 1994;
MANJUNATH u. THERIEN 2002; MULLER et al. 2002; MOURA et al. 2007b).
Diese Proteine werden an die Spermienmembran während der Ejakulation gebunden (MANJUNATH u. THERIEN 2002; MULLER et al. 2002), wobei die Bindung zwischen den BSP-Proteinen und Cholin-Phospholipiden der Spermienmembran stattfindet (DESNOYERS u. MANJUNATH 1992; TOEPFER-PETERSEN et al.
2005).
Die BSP-Proteine fördern die durch Heparin (THERIEN et al. 1995) und High- Density-Lipoprotein (HDL) (THERIEN et al. 1997) induzierte Kapazitation. Ein früher Schritt bei der Kapazitation ist der Verlust der Membran an Cholesterin (DAVIS 1981). Die BSP-Proteine sind fähig, den Cholesterolefflux epididymaler Spermien in einer zeit- und dosisabhängigen Weise zu stimulieren (THERIEN et al. 1998).
BSP A1 und –A2 können an fucosehaltige Strukturen binden, die vom Oviduktepithelium exprimiert werden (IGNOTZ et al. 2001). Daher spielen diese Proteine nach der Bindung an die Spermienmembran eine wichtige Rolle bei der Etablierung eines Spermienreservoirs im Ovidukt (GWATHMEY et al. 2003).
Es wurde nachgewiesen, dass BSP-30-kDa mit der Bullenfertilität korreliert ist (MOURA et al. 2006). Bei diesem Versuch wurden die Proteine des akzessorischen Sekrets von 37 Bullen mittels einer zweidimensionalen Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend der Gehalt verschiedener Proteine mit Fertilitätsindices der Tiere in Beziehung gesetzt (in Form von Abweichung [%] der NRR des Bullen von der durchschnittlichen NRR der Besamungsstation). Zwischen den verschiedenen Isoformen des BSP-30-kDa Proteins und dem Fertilitätsindex bestand ein quadratischer Zusammenhang (R2 = 0,18; p = 0,03), wobei mit steigenden Gehalten dieses Proteins eine bessere Fertilität zu beobachten war, sehr hohe Gehalte jedoch einen negativen Einfluss auf die Fertilität ausübten.
B. Spermadhäsine
Spermadhäsine repräsentieren eine Familie von funktionell unterschiedlichen Proteinen, die eine sog. CUB-Domäne besitzen. Die CUB-Domäne wurde aufgrund der drei ersten Proteine benannt, bei denen dieser Bereich entdeckt wurde:
Complement subcomponents Clr/Cls, Uegf und Bmp1 (BORK u. BECKMANN 1993).
Diese Proteine enthalten 110 bis 133 Aminosäuren mit einer Sequenzidentität von 40 bis 60% und zwei evolutionär konservierte Disulfidbrücken, welche die sog. CUB- Domäne stabilisieren (TOEPFER-PETERSEN et al. 2005). Aufgrund der Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz und der gleichen hydrohoben Eigenschaften wird von einer hoch konservierten CUB-Domäne in allen Spermadhäsinen ausgegangen (EKHLASI- HUNDRIESER et al. 2002). Beim Schwein wurden bisher fünf verschiedene Spermadhäsine (AQN-1, AQN-3, AWN, PSP-1 und PSP2) entdeckt (SANZ et al.
1991; SANZ et al. 1992a; SANZ et al. 1992b; KWOK et al. 1993). Beim Pferd wurde das HSP-7, ein AWN homologes Protein identifiziert (REINERT et al. 1996). Auch beim Ziegenbock wurde kürzlich BSFP als Mitglied der Spermadhäsinfamilie entdeckt (MELO et al. 2008). Beim Rind gibt es nur zwei Spermadhäsine: „acidic seminal fluid protein“ (aSFP) und Z13 (EINSPANIER et al. 1991; TEDESCHI et al.
2000).
Die Spermadhäsine liegen oberflächenassoziiert auf dem Spermienkopf vor und zeigen zahlreiche Bindungsaffinitäten, z.B. zu Kohlenhydraten, Glykosaminoglykanen, Phospholipiden und Protease-Inhibitoren, woraus geschlossen werden kann, dass diese Proteine an mehreren Schritten des Fertilisationsprozesses beteiligt sind (TOPFER-PETERSEN et al. 1998). Auch konnte gezeigt werden, dass die Spermadhäsine beim Schwein zur Bildung des Spermienreservoirs im Ovidukt beitragen (WAGNER et al. 2002; EKHLASI- HUNDRIESER et al. 2005a).
„Acidic seminal fluid protein“
Hauptproduktionsorte des aSFP sind die Ampulla und die Glandula vesicularis (EINSPANIER et al. 1993). Das aSFP hat einen pI von 4,8. Auch der Gehalt an zahlreichen sauren Aminosäuren weist auf den sauren Charakter dieses Moleküls hin. Es stimuliert Zellteilung und Progesteronsekretion von bovinen Granulosazellen (EINSPANIER et al. 1991). Das aSFP hat zu 50% die gleiche Aminosäurensequenz wie porcine Spermadhäsine. Dieses Protein wird in der Samenblase gebildet und bindet sich während der Ejakulation locker an die Spermienoberfläche in Form einer dünnen Schicht und spielt eine Rolle als Dekapazitationsfaktor (DOSTALOVA et al.
1994). aSFP zeigt weder Kohlenhydrat- noch Zonabindungseigenschaften, wodurch eine Beteiligung an der Spermien-Eizell-Interaktion ausgeschlossen werden kann (DOSTALOVA et al. 1994). Das Protein führt zu einem Absinken der Motilität von Spermien in vitro. Dieser Effekt könnte sich positiv auf die vor der Ejakulation in der Ampulla gespeicherten Spermien auswirken, da durch die Motilitätseinschränkung Energie gespart wird (SCHÖNECK et al. 1996). Die Lipidoxidation wird selbst durch geringe Konzentrationen an aSFP reduziert, woraus geschlossen werden kann, dass Spermien durch dieses Protein gegenüber freien Radikalen geschützt werden (SCHÖNECK et al. 1996). Die antioxidativen Fähigkeiten können nach EINSPANIER et al. (1994) durch das Vorhandensein von Isoformen mit einem unterschiedlichen Reduktionsstatus erklärt werden. Es war in Versuchen eine oxidierte Form mit einem pI von 4,7, eine teilweise reduzierte mit einem pI von 4,8 und eine vollkommen reduzierte Form mit pI 5,1 zu finden. Da das aSFP in annähernd anaerobem Milieu der Glandula vesicularis gebildet wird, kann davon ausgegangen werden, dass dort als aktive Formen nur die total reduzierten oder teilweise oxidierten Formen vorliegen.
Spermadhäsin Z13
Vor einigen Jahren wurde das zweite bovine Spermadhäsin Z13 identifiziert (TEDESCHI et al. 2000). Z13 besteht aus 116 Aminosäuren und ist zu 40% wie aSFP aufgebaut. Zu 49% bzw. 38% gleicht es dem porcinen PSP-1 bzw. PSP-2. Das Protein ist nicht glykosyliert und besitzt keine heparinbindenden Eigenschaften (TEDESCHI et al. 2000). Der Gehalt an Z13 im akzessorischen Sekret von Bullen zeigte eine inverse Korrelation zur Bullenfertilität (MOURA et al. 2006). Auch bei dem von KILLIAN et al. (1993) beschriebenen niedermolekularen Antifertilitätspeptid in bovinem Seminalplasma handelt es sich um Spermadhesin Z13 (MOURA et al.
2006).
C. CRISP-Proteine (Cysteinreiche sekretorische Proteine)
CRISP-Proteine sind gekennzeichnet durch 16 Cysteinreste, wobei der Abstand zwischen den Cysteinresten in jedem Protein dieser Gruppe evolutionär konserviert ist. Durch Disulfidbrückenbildung kommt es zu einer dreifachen Domänenbildung des Moleküls: einem N-terminalen Bereich mit ungefähr 50 Aminosäuren, einem N- terminalen Cysteincluster, das durch drei Disulfidbrücken gebildet wird und einer C- terminalen cysteinreichen Domäne. CRISP-Proteine wurden bisher im männlichen Genitaltrakt von Säugetieren (Ratte, Maus und Pferd), Reptilien und Amphibien charakterisiert (TOEPFER-PETERSEN et al. 2005). Sie werden im Nebenhoden und in größen Mengen in der Ampulla ductus deferentis synthetisiert (SCHAMBONY et al. 1998). Diese Proteine erfüllen unterschiedliche Aufgabe bei der Spermien- Oozyten-Fusion oder auch bei der Blockade von Ionenkanälen (TOEPFER- PETERSEN et al. 2005).
D. „Tissue Inhibitor of Metalloproteinases” (TIMPs)
Die TIMPs sind in die extrazelluläre Matrix sezernierte Enzyme, welche spezifische, funktionelle Antagonisten der Metalloproteinasen darstellen (NAGASE u.
WOESSNER 1999). Es gibt vier Vertreter der TIMP-Familie (TIMP-1, -2, -3 und -4), welche viele strukturelle Gemeinsamkeiten haben (GOMEZ et al. 1997), hierzu zählen die 12 evolutionär hoch konservierten Cysteinreste, welche Disulfidbrücken bilden (MCCAULEY et al. 2001).
Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 2 (TIMP 2)
TIMP2 hat ein Molekulargewicht von 25-26 kDa und der isoelektrische Punkt liegt zwischen 6,7 und 7,2 (MOURA et al. 2007b). TIMP1 und -2 können den Aktivitäten von Metalloproteinasen entgegenwirken und sich somit auf den Umbau der extrazellulären Matrix auswirken (NAGASE u. WOESSNER 1999; GOMEZ et al.
1997; MOURA et al. 2007b).
Bei Ratten wird TIMP2-mRNA in Sertoli- und Leydigschen Zwischenzellen des Hoden exprimiert (GRIMA et al. 1996). Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass sich TIMP-2-mRNA ohne gewebespezifische Veränderungen sowohl in der Prostata und in der Bulbourethraldrüse, als auch in der Glandula vesicularis von Bullen befindet (MCCAULEY et al. 2001). Bei TIMP2 handelt es sich um das 24 kDa Protein mit heparinbindenden Eigenschaften, welches von BELLIN et al. (1996;
1998) bei Bullen mit höherer Fertilität gefunden wurde (MCCAULEY et al. 2001). Bei den Versuchen von BELLIN et al. (1996, 1998) wurde mittels monoklonalen Antikörpern das Vorhandensein von drei verschiedenen heparinbindenden Proteinen, unter welchen sich auch das schon oben erwähnte 24 kDa-Protein befand, auf Spermienmembranen getestet. Die Bullen, welche über alle drei heparinbindenden Proteine auf den Spermienmembranen verfügten, waren mit einer durchschnittlichen Befruchtungsrate von 81,5% hoch fertil. Bei der anderen Bullengruppe, bei denen keine dieser heparinbindenden Proteine gefunden werden konnten, lag die Befruchtungsrate nur bei 41,9%.
TIMP2 bindet sich in vitro an die Spermienmembran von epididymalen Spermien und könnte daher durch diese Membranassoziation eine signifikante Rolle in der Regulation der Bullenfertilität spielen (MCCAULEY et al. 2001). Es wird von MOURA et al. (2007) vermutet, dass TIMP2 einen Einfluss auf die Interaktion des Spermiums mit den Barrieren der Cumuluszellen, der Zona pellucida und der Oocytenmembran ausübt.
2.2.1.3.2 Bestimmung des Proteingehaltes im Seminalplasma
Die Bestimmung des Proteingehaltes von Seminalplasma und auch anderen proteinhaltigen Flüssigkeiten kann nach der Methode von BRADFORD (1976) erfolgen. Diese Methode verwendet den Farbstoff Brilliant Blau G-250, welcher in zwei verschiedenen Farberscheinungen, rot und blau, vorliegen kann (REISNER et al. 1975). Sobald sich dieser Farbstoff an Proteine bindet, kommt es zu einer Veränderung des Absorptionsmaximums von 465 zu 595nm und er liegt dann in der
blauen Form vor. Die Extinktionsänderung des Farbstoffs ist hierbei dem Proteingehalt der Lösung proportional, woraus auf den vorhandenen Proteingehalt geschlossen werden kann. Vorteile des Tests sind die kurze Reaktionszeit, da schon nach zwei Minuten ein Ergebnis abgelesen werden kann. Der Farbstoff-Protein- Komplexes bleibt für eine Stunde stabil und schließlich ergeben sich keine Wechselwirkungen zwischen Farbstoff und in der Lösung vorhandenen Kationen oder Kohlehydraten (BRADFORD 1976).
2.2.1.4 Seminalplasma und oxidativer Stress
Zu den Reaktiven Sauerstoffradikalen (Reactive oxygen species, ROS) gehören neben Singulett-Sauerstoff, welcher einen angeregten Sauerstoffzustand mit dem Symbol O2• beschreibt, die bei der Reduktion des Sauerstoffs zu Wasser auftretenden Zwischenprodukte (Abb. 2.5): Superoxidanionen-Radikale (O2•─), Wassertstoffperoxid (H2O2) und Hydroxyl-Radikale (OH•) (DROGE 2002). Diese Moleküle sind sehr reaktiv aufgrund des Vorhandenseins ungepaarter Elektronen (SIKKA et al. 1995). ROS im Ejakulat stammen von Leukozyten und von beschädigten Spermien (AITKEN 1995). Auch während des Einfrier- und Auftauvorganges bei der Kryokonservierung werden von den Spermien ROS produziert (CHATTERJEE u. GAGNON 2001), wobei gleichzeitig der Gehalt an Antioxidantien in den Spermien abnimmt (BILODEAU et al. 2000).
Abb. 2.5: Transferreaktionen der Reduktion des Sauerstoffmoleküls zu Wasser (modifiziert nach BOVERIS 1998)
ROS sind beteiligt an der Lipidperoxidation und verursachen sowohl DNA-, als auch Proteinschäden (HALLIWELL u. GUTTERIDGE 1984; ALVAREZ et al. 1987;
FARBER 1994; AITKEN et al. 1998). Sie führen weiterhin zu einer herabgesetzten Spermienmotilität (ARMSTRONG et al. 1999). Andererseits ist ein gewisses Maß an ROS auch Bestandteil der normalen Zellfunktionen (AITKEN et al. 1998). So haben geringe Level an ROS positive Auswirkungen auf die Spermien-Oozyten Fusion (AITKEN et al. 1998), das Binden der Spermien an die Zona pellucida (KODAMA et al. 1996) und die Spermienkapazitation (LECLERC et al. 1997).
Das Gleichgewicht zwischen den nützlichen und schädlichen Effekten der ROS ist stark von der Ausstattung des Seminalplasmas mit antioxidativen Systemen abhängig (DE LAMIRANDE et al. 1997; BILODEAU et al. 2000). Antioxidantien sind Moleküle, welche die Bildung von ROS verhindern oder sich der Wirkung der ROS entgegenstellen können (SIKKA et al. 1995). Als oxidativen Stress bezeichnet man eine Situation, bei welcher es zum Überwiegen der oxidativen gegenüber antioxidativen Prozessen kommt. Dies kann zu Zellschädigungen führen (SIES 1986;
LENZI et al. 2000).
Die Hauptenzyme bei der Beseitigung von ROS im Ejakulat sind Katalase, Glutathion-Peroxidase (GPx) und Superoxid-Dismutase (SOD) (BILODEAU et al.
2000). SOD bewirkt die Überführung von O2•─ zu O2 und H2O2, während Katalase H2O2 zu O2 und Wasser umwandelt (SIKKA et al. 1995). Glutathion-Peroxidase erfüllt die antioxidative Tätigkeit in Kombination mit Glutathion-Reduktase (GRD). GPx katalysiert die Umwandlung von H2O2 zu Wasser, hierbei wird reduziertes Glutathion (GSH) in oxidiertes Glutathion (GSSG) umgewandelt (Abb. 2.6), welches dann wiederum durch die GRD zu GSH reduziert wird (IRVINE 1996; LUBERDA 2005).
Abb. 2.6: Zusammenspiel von Glutathion-Peroxidase und Glutathion-Reduktase bei der Um- wandlung von Wasserstoffperoxid zu Wasser (modifiziert nach IRVINE 1996).
Vor allem die antioxidativen Enzyme, die sich im Seminalplasma befinden, tragen zum Schutz vor oxidativem Stress bei und weniger die sich in den Spermienzellen befindlichen Enzyme (IRVINE 1996; BAUMBER u. BALL 2005; ROCA et al. 2005).
Neben den oben genannten antioxidativen Enzymen (Katalase, SOD, GPx) gibt es auch viele nicht-enzymatische Antioxidantien im Seminalplasma. Zu diesen zählen:
Glutathion, Alpha-Tocopherol und Ascorbat (LENZI et al. 2000). Über die Wirkung des Glutathions wurde bereits zuvor im Zusammenspiel mit der Glutathionperoxidase berichtet. Alpha-Tocopherol und Ascorbat arbeiten in synergistischer Wirkung bei der Beseitigung von Radikalen zusammen. Hierbei wird zunächst Tocopherol durch Zusammentreffen mit einem Radikal in Tocopheroxyl-Radikal umgewandelt, welches dann wiederum durch Ascorbat entschärft und somit recycelt als Tocopherol zur Verfügung steht (BUETTNER 1993; BUETTNER u. SCHAFER 2000).
Beim Mensch haben Seminalplasmaproben von fertilen Männern eine höhere antioxidative Kapazität als von sub- bzw. infertilen Männern (LEWIS et al. 1995;
SMITH et al. 1996). Die Anwesenheit von Seminalplasma mit seiner antioxidativen Kapazität schützt die Spermien gegen die durch ROS induzierbare Lipidperoxidation und DNA-Schädigung (LENZI et al. 2000; POTTS et al. 2000).
2.2.1.5 Seminalplasma und Kapazitation bzw. Akrosomenreaktion
Die Zugabe von Seminalplasma zu bereits kapazitierten Spermien führt zu einer Dekapazitation dieser Zellen. Bei den Dekapazitationsfaktoren handelt es sich um Seminalplasmaproteine, die sich an der Spermienoberfläche anreichern und zum Schutz der Spermien vor einer frühzeitigen Kapazitation während der Ejakulation und des Transports durch den weiblichen Genitaltrakt dienen (BADER 2001).
Das aSFP bindet sich an die Spermienoberfläche, ist jedoch nach einer Kapazitation nicht mehr auf den Spermien nachweisbar, so dass von DOSTALOVA et al. (1994) eine dekapazitierende Wirkung angenommen wird.
Eine zentrale Rolle bei der Kapazitation, AR und auch bei der Hyperaktivierung spielt die Kalziumaufnahme. Es konnte ein alkalisches Protein, das Caltrin (=Calcium transport inhibitor) aus dem bovinen Seminalplasma isoliert werden, welches die Kalziumaufnahme blockiert. Caltrin bindet an die Plasmamembran und an Regionen des Spermienschwanzes. Diese Bindung stimuliert die Ca2+Mg2+ ATPase der Plasmamembran, durch welche im Inneren des Spermiums geringe Kalziumgehalte aufrechterhalten werden. Ein frühzeitiger Kalziumeinstrom und somit das Initialstadium der AR von Spermien wird dadurch gehemmt (RUFO et al. 1982).
Eine Inkubation von Spermien mit cholesterinhaltigen Vesikeln führt zur Dekapazitation. Im Seminalplasma des Kaninchens befinden sich lipidhaltige Vesikel, welche die Kapazitation der Spermien verhindern. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass der Einbau von Cholesterin in die Plasmamembran der Spermien zu einer Stabilisierung führt (DAVIS 1976). Eine Stabilisierung der Spermienmembran wird auch durch das Polyamin Spermin verursacht. Selbst bei geringen Konzentrationen wird es an die Spermien gebunden und verhindert eine Kapazitation und AR.
Während des Spermientransports durch das weibliche Genitale wird Spermin vom Spermium entfernt und es kann zur Kapazitation kommen (RUBINSTEIN u.
BREITBART 1991).
Verschiedene Untersuchungen deuten auch auf kapazitationsfördernde Faktoren im Seminalplasma hin. Die Bindung der Spermien an die Zona pellucida führt nur dann
zur AR, wenn Nebenhodenspermien zuvor Kontakt mit Seminalplasma hatten (FLORMAN u. FIRST 1988).
Die BSP-Proteine (BSP-A1/BSP-A2, BSP-A3 und PSP-30kDa) binden während der Ejakulation an Phospholipide der Spermien (DESNOYERS u. MANJUNATH 1992;
MANJUNATH et al. 1994). Sie beschleunigen die mittels Heparin und HDL induzierte Kapazitation von bovinen epididymalen Spermien (THERIEN et al. 1995 ;THERIEN et al. 1997) und erleichtern die Kapazitation, indem sie den Cholesterol- und Phospholipidefflux der Spermienmembran fördern (THERIEN et al. 1998;
MANJUNATH u. THERIEN 2002).
2.2.1.6 Seminalplasma und Einfrierfähigkeit
Obwohl das Seminalplasma das Medium ist, mit dem die Spermien in den weiblichen Genitaltrakt gelangen, ist es nicht das geeignete Medium für das Überleben von Spermien, wenn sie in vitro gelagert werden (GARCIA u. GRAHAM 1987b).
Epididymale Bullen- und Eberspermien sind resistenter gegenüber Kälteschock als ejakulierte. Für diese Erkenntnis wurden ejakulierte und epididymale Spermien, die nach Kastration des selben Tieres gewonnen wurden, einer Temperatur von 0°C für eine Dauer von 10 Minuten ausgesetzt und anschließend wurde der prozentuale Anteil lebender Spermien ermittelt anhand Auszählung der Spermien, die mit einer Opalblau-Eosin-Lösung gefärbt waren (LASLEY u. BOGART 1944; LASLEY u.
MAYER 1944). Andererseits führt eine Entfernung der Glandula vesicularis zu reduzierter Vitalität der Spermien nach der Kryokonservierung (KING u.
MACPHERSON 1969).
Der Cholesterolefflux aus der Spermienmembran kann die Resistenz des Spermiums gegenüber dem Kälteschock vermindern (DARIN-BENNETT u. WHITE 1977; WHITE 1993); daher kann der durch BSP ausgelöste Cholsterolausstom auch Auswirkungen auf die Einfrierbarkeit und den Erfolg des Kryokonservierungsprozesses haben (NAUC u. MANJUNATH 2000). Die Überlebensrate von Bullenspermien in Verdünnern, die einen hohen Prozentsatz von Seminalplasmasalzen aufwiesen, ist erniedrigt (GARCIA u. GRAHAM 1987b).
Im Seminalplasmaproteinprofil gibt es Unterschiede zwischen Bullen mit guter und geringer Einfrierfähigkeit. JOBIM et al. (2004) verglichen zwei Gruppen von Bullen miteinander, wobei die eine Gruppe (n = 10) durch eine gute Einfrierbarkeit in einer zweijährigen Zeitspanne gekennzeichnet war mit mindestens 90% Vitalität der Ejakulate nach dem Auftauen. Die andere Gruppe (n = 6) wurde mit Werten von unter 90% „vitalen“ Ejakulaten (0% bis 86%) nach dem Auftauen als schlechter kryokonservierbar eingestuft. Hierbei waren die Minimalanforderungen für ein
„vitales“ Ejakulat die folgenden: 30% Motilität, 45% akrosomale Integrität nach Inkubation, 15% Motilität, 20% Hauptdefekte, 25% Nebendefekte und 30% totale Spermiendefekte. Von jedem der 16 Bullen wurde eine Seminalplasmaprobe mittels einer zweidimensionalen Gelelektrophorese untersucht und der relative Proteingehalt der Spots mit der Einfrierbarkeit verglichen. Das aSFP, Clusterin, BSP A1/A2 sowie BSP A3 sind Marker für eine gute Einfrierbarkeit des Ejakulates, da diese einen höheren Proteingehalt in der Gruppe der Bullen mit der guten Kryokonservierbarkeit aufwiesen. Ein weiteres Protein mit Namen Lipocalin-like-Prostaglandin-D-Synthase ist gefunden worden, welches in einer höheren Proteinkonzentration (0,31 % relativer Proteingehalt vs. 0,09 % bei der gut kryokonservierbaren Gruppe) bei der Gruppe mit geringer Einfrierbarkeit vorlag (JOBIM et al. 2004).
2.2.1.7 Seminalplasma und Fertilität
Seminalplasma übt durch vielfältige Wirkungsmechanismen im Rahmen der Kapazitation, der Gametenerkennung und auch durch die Wechselwirkungen mit dem weiblichen Genitale einen Einfluss auf die Fruchtbarkeit aus (TOEPFER- PETERSEN et al. 1998). Bei mehreren Spezies konnte festgestellt werden, dass spezifische Seminalplasmaproteine in enger Beziehung zur Fruchtbarkeit stehen (PETZOLDT 2001; MOURA et al. 2007a).
Die Fähigkeit der epididymalen Spermien von subfertilen Bullen (6,2 % geringere Fertilität als die durchschnittliche Fertilität der Besamungsstation) die Zona-freien Oocyten zu penetrieren, wird verbessert bei Inkubationen dieser Spermien mit akzessorischem Sekret von Bullen hoher Fertilität, gekennzeichnet durch 6%
bessere Non-Return-Raten (NRR) als die durchschnittlichen NRR der Besamungsstation (HENAULT et al. 1995). Das Entfernen der akzessorischen Geschlechtsdrüsen ist schädlich für die embryonale Entwicklung bei Hamstern (CHOW et al. 2003).
Im Jahre 1993 wurden vier Proteine in bovinen Seminalplasma mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese gefunden, wobei zwei dieser Proteine (26 kDa, pI 6,2 und 55kDa, pI 4,5) häufiger und stärker bei Bullen mit hoher Fertilität zu finden waren. Die anderen zwei Proteine (16 kDa, pI 4,1 und 16 kDa, pI 6,7) erschienen prominenter bei Bullen mit niedrigerer Fertilität. Die Einteilung in Gruppen bezüglich der Fertilität erfolgte als Abweichung in % von der durchschnittlichen Fertilität der Besamungsstation, auf der die Bullen gehalten wurden. Der Durchschnittswert wurde gleich Null gesetzt und hohe Fertilität reichte von 0 bis +6, während niedrigere Fertilität durch Werte zwischen 0 und -8 gekennzeichnet war (KILLIAN et al. 1993).
Das eine Protein (26 kDa, pI 6,2), welches von KILLIAN et al. (1993) mit hoher Fertilität assoziiert wurde, konnte als Lipocalin-Typ Prostaglandin D Synthetase identifiziert werden (GERENA et al. 1998).
MOURA et al (2006) führte eine Auftrennung von Proteinen des akzessorischen Sekretes von Bullen mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese durch. Das akzessorische Sekret wurde durch eine chirurgische Massnahme gewonnen, bei welcher ein Katheter in das Vas deferens gesetzt wurde, um akzessorisches Sekret ohne Beimengungen von Spermien oder Komponenten des Nebenhodens zu gewinnen. Die Expression bestimmter Proteine des akzessorischen Sekrets wurde anschließend mit NRR nach 60 Tagen in Beziehung gesetzt. Auch bei diesem Versuch wurde die Fertilität angegeben als prozentuale Abweichung der NRR des Bullen von der durchschnittlichen NRR aller Bullen der Besamungsstation. Somit reichten die Fertilitätswerte von -18,1% bis +7,7%. Es konnten vier fertilitätsassoziierte Proteine identifiziert werden : Osteopontin, Phospholipase A2 und BSP -30-kDa waren in höheren Gehalten bei hochfertilen Bullen zu finden, während Spermadhäsin Z13 in einem geringeren Proteingehalt bei hochfertilen Bullen vorlag (MOURA et al. 2006). Osteopontin entspricht dem von KILLIAN et al.
beschriebenen zweiten positiv-fertilitätskorrelierten Protein (CANCEL et al. 1997) und
