Untersuchung zur Verbesserung der Kryokonservierbarkeit von Bullensperma durch den Zusatz von Liposomen zum Verdünner

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchung zur Verbesserung der Kryokonservierbarkeit von Bullensperma durch den Zusatz von Liposomen

zum Verdünner

INAUGURAL − DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Torleif Röpke

Karlsruhe

Hannover 2011

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein

Klinik für Rinder

Prof. Willem F. Wolkers, PhD

Institut für Mehrphasenprozesse Leibniz Universität Hannover

PhD Harriette Oldenhof

Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein 2. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. Dagmar Waberski

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2011

Gefördert durch den Förderverein Biotechnologieforschung e.V., Bonn, Deutschland

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Meinen Eltern

in Liebe und Dankbarkeit

gewidmet

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INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ... 11

2 LITERATURÜBERSICHT ... 12

2.1 Kryokonservierung ... 12

2.2 Plasmamembran des Spermiums ... 14

2.3 Schäden durch Kryokonservierung ... 16

2.4 Kryoprotektiva und Äquilibrierungszeit ... 18

2.5 Liposomen als kryoprotektive Substanz ... 19

3 MATERIAL UND METHODEN ... 24

3.1 Bullen und Versuchssperma ... 24

3.1.1 Versuchstiere ... 24

3.1.2 Spermagewinnung ... 24

3.1.3 Spermabeurteilung ... 25

3.2 Kryokonservierung ... 25

3.2.1 Verdünnung mit einem auf TRIS basierenden Verdünner unter Zusatz von Hühnereigelb oder Liposomen ... 25

3.2.2 Konfektionierung und Einfriervorgang ... 29

3.2.3 Herstellung von geklärtem Eigelb ... 30

3.2.4 Herstellung von Liposomen ... 30

3.3 Untersuchungsmethoden zur Beurteilung der Spermaqualität ... 35

3.3.1 Computergestützte Motilitätsanalyse ... 35

3.3.2 Durchflusszytometrische Beurteilung der Integrität der Plasmamembran und des Akrosoms ... 36

3.4 Versuchsansätze ... 37

3.4.1 Effekte von EPC Liposomen auf die Spermaqualität vor und nach dem Tiefgefrieren ... 37

3.4.2 Effekte von Liposomen aus ungesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen Kopfgruppen auf die Spermaqualität ... 38

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INHALTSVERZEICHNIS

3.4.3 Effekte synthetischer Liposomen aus gesättigten Fettsäuren auf die

Spermaqualität. ... 39

3.4.4 Statistische Auswertung ... 40

4 ERGEBNISSE ... 41

4.1 Effekte unterschiedlicher Konzentrationen von EPC Liposomen und Äquilibrierungszeiten auf die Spermaqualität ... 41

4.2 Effekte von Liposomen aus EPC und Fettsäuren mit unterschiedlichen Kopfgruppen auf die Spermaqualität ... 44

4.3 Effekte synthetischer Liposomen auf die Spermaqualität ... 46

4.3.1 Liposomen aus ungesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen Kopfgruppen ... 46

4.3.2 Liposomen aus gesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen Kohlenstoffkettenlängen ... 48

5 DISKUSSION ... 50

5.1 Schlussfolgerung ... 54

6 ZUSAMMENFASSUNG ... 55

7 SUMMARY ... 57

8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 59

9 TABELLENVERZEICHNIS ... 63

10 LITERATURVERZEICHNIS ... 64

11 ANHANG ... 79

11.1 Extrusions-Technik ... 79

11.2 Zusammensetzung der Kontroll- und Liposomenansätze ... 81

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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abb. Abbildung

a. d. an der

ADR Arbeitsgemeinschaft Deutscher Rinderzüchter AR Akrosomreaktion

BSA bovine serum albumin

BSP bovine seminal plasma

bzw. beziehungsweise C Kohlenstoff CASA computer assisted semen analysis

CMA cell motion analysis

°C Grad Celsius

DLPC 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin

DLS dynamic light scattering

DMPC 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin DOPA 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphat

DOPC 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin

DOPE 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin DOPG 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-(1’-rac-glycerol) DOPS 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin

DPPC 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin DSPC 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin

DX DL, DM, DP oder DS

e. V. eingetragener Verein

EY egg yolk

EPC Egg-Phosphatidylcholin

et al. et alii

Fa. Firma

FITC Fluoreszein-Isothiocyanat FL Fluoreszenzkanal g Gramm

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× g Erdbeschleunigung

GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung GLY Glycerin h Stunde

KV künstliche Vagina

LDF low density lipoprotein Fraktion LMV large multilamellar vesicles LUV large unilamellar vesicles

mg Milligramm Min. Minute Mio. Million ml Milliliter mM mmol/l mol Mol

MW molecular weight

µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer nm Nanometer od. oder

p Signifikanzniveau PC Phosphatidylcholin PG Phosphatidylglycerol PI Propidiumiodid PMAI Plasmamembran und Akrosom intakt

PNA Peanut Agglutinin

PMOT Progressive Motilität

PS Phosphatidylserin

PX PC, PS, PG oder PE

ROS reactive oxygen species

RT Raumtemperatur

(9)

s Sekunde

SPF spezifisch pathogen frei

SUV small unilamellar vesicles

TG Tiefgefrierung

Tm phase-transition-temperature

TRIS Tris-hydroxymethyl-aminomethan

USA United States of America

z.B. zum Beispiel

% Prozent

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EINLEITUNG

1 EINLEITUNG

Seit der Entdeckung von Eigelb als schützenden Zusatz bei der Kryokonservierung von Spermatozoen wird es bei zahlreichen Spezies angewendet [1,2,3]. Jedoch birgt der bis heute erfolgreich eingesetzte Eigelbverdünner ein Kontaminationsrisiko [4] in sich und variiert zudem in der Zusammensetzung [5]. Es besteht daher der Wunsch, Eigelb im Tiefgefriermedium für Spermien durch definierte Komponenten zu ersetzen. Untersuchungen des Lipid- und Lipoproteinanteils im Eigelb deuten darauf hin, dass besonders der Phospholipidanteil diesen Schutz der Spermien während der Abkühlung ermöglicht [6,7].

Membranen werden als der wichtigste Ort von Gefrierschädigungen angesehen [8].

Während des Kälteschocks entlassen Spermienmembranen Phospholipide in das umgebende Medium. Darüber hinaus werden Membranschäden während des Kälteschocks in Verbindung mit einer Phasenseparation von Lipiden gebracht, da diese die Spermienmembran vorübergehend permeabel werden lässt [9,10,11]. Es wird vermutet, dass Strategien zur Membranmodifikation, wie die Inkubation von Spermien mit Eigelb oder Liposomen, entweder zum Anstieg oder Abfall der Kryo- stabilität von Zellen führen können. Der stabilisierende Effekt von Liposomen beim Tiefgefrieren und Auftauen von Zellen wurde zuerst bei Spermien entdeckt [7,12].

Seit wenigen Jahren werden Liposomen auch zur Konservierung von Erythrozyten mittels Tiefgefrierung [13] und Gefriertrocknung [14] eingesetzt.

In dieser Studie wurde die Wirkung von verschiedenen Sorten unilamellarer Liposo- men auf die Qualität von bovinen Spermatozoen vor und nach der Kryokonser- vierung untersucht und mit denen von Eigelb verglichen.

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LITERATURÜBERSICHT

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Kryokonservierung

Das Tiefgefrieren von Bullensperma ist ein in der Literatur umfangreich dargelegtes Gebiet. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll nur auf einige wichtige Aspekte zu dieser Thematik hingewiesen werden.

Die Grundlage für die Langzeitkonservierung und deren weltweiter züchterischer Einsatzmöglichkeit wurde mit der Entdeckung des Glycerins als potentiellem Kryo- protektivum bereits 1949 durch Polge et al. [15] gelegt. An Geflügelsperma beobachteten diese Autoren, dass die Zellen das Einfrieren durch Glycerinzugabe bei sehr tiefen Temperaturen überstanden und ihre Motilität erhalten blieb. Im Jahre 1953 entwickelten Polge und Rowson [16,17] eine praxisreife Methode zum Einfrieren von Bullensperma bei einer Temperatur von -79 °C. Diese Methode galt viele Jahre als Standardverfahren. Die heute in Europa angewendeten Tiefgefrier- verdünner enthalten als wichtigste Substanzen meist TRIS-Puffer, Glycerin und Eigelb oder Milch.

Obwohl Eigelb seit mehr als 60 Jahren als Kryoprotektivum angewendet wird, ist dessen exakte Schutzwirkung noch nicht ganz geklärt. Die „low density lipoprotein“

Fraktion (LDF) im Eigelb scheint eine Schutzfunktion während des Kälteschocks und der Tiefgefrierung auszuüben. Eine Hypothese ist, dass LDF den Verlust von Phos- pholipiden aus der Zellmembran weitestgehend verhindert und somit die Toleranz gegenüber dem Kälteschock zunimmt. Manjunath et al. [18] beschreiben die Interaktion zwischen LDF und BSP (bovine seminal plasma) - Proteinen des Semi- nalplasmas (BSP-A1/-A2, BSP-A3 und BSP-30-kDa) als eine schnelle, spezifische und stabile Bindung, die auch während des Auftauprozesses beibehalten wird. Die Interaktion von BSP-Proteinen mit der LDF des Eigelbs soll deren Bindung an die Spermienoberfläche und so die Stimulation eines Cholesterin- und Phospholipid- effluxes verhindern [19]. BSP-Proteine würden sonst die Motilität und die Fertilität negativ beeinflussen [19].

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LITERATURÜBERSICHT

In der heutigen Zeit zwingen Zuchtfortschritt, weltweiter Handel und Konkurrenzdruck auf nationaler und internationaler Ebene von Eigelb als Kryoprotektivum abzurücken, hin zu einem neuen Verdünner mit definierter chemischer Zusammensetzung und ohne Inhaltsstoffe tierischer Herkunft. Das Risiko einer Kontamination des Eidotters mit Bakterien und Mykoplasmen oder anderen Pathogenen ist unbestreitbar [4,20].

Gerade die seuchenhygienischen Aspekte spielen im internationalen Geschäft der Besamungsstationen - dem Im- und Export von Samenportionen - eine überge- ordnete Rolle. Aus diesem Grund sind sie ein wichtiges Argument für den Austausch tierischer Eiweiße gegen Komponenten nicht tierischer Herkunft im Verdünner- medium [20]. Bousseau et al. [20] konnten in einer Studie nachweisen, dass im Eigelb immer eine gewisse bakterielle Kontamination vorhanden ist. Eigelb aus spezifisch pathogen freien (SPF) Hühnereiern birgt ein geringeres Kontamina- tionsrisiko. Die vollständige Beseitigung der Keimbelastung durch Zugabe von Antibiotika ist bei praxisüblichen Konzentrationen an antibakteriellen Zusätzen (Gentamycin 250 μg/ml, Tylosin 50 μg/ml, Lincomycin 150 μg/ml und Spectinomycin 300 μg/ml) im eigelbhaltigen Verdünner Triladyl (Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) nicht möglich [20].

Vor einigen Jahren wurde begonnen, Eidotter durch steriles Soja-Lecithin zu ersetzen. Die Gefahr einer mikrobiellen Kontamination des Verdünners wurde damit gesenkt. Vergleichende Studien an aufgetauten Spermaproben von Split-Ejakulaten zwischen Verdünner mit Soja-Lecithin bzw. Eigelb wiesen keine signifikanten Unterschiede im Anteil lebender Zellen, im akrosomalen Status und in der Motilität auf [21].

Ein weiteres Argument gegen die Anwendung von Eigelb ist die starke Variabilität in dessen Zusammensetzung, was schließlich zu erheblichen Schwierigkeiten in der Standardisierung der Tiefgefrierkonservierung führt [22].

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LITERATURÜBERSICHT

2.2 Plasmamembran des Spermiums

Ein kurzer Überblick über Aufbau und Funktion der Plasmamembran von Spermien soll zum besseren Verständnis der vorliegenden Studie beitragen. Die Plasmamem- bran umhüllt die Samenzelle vollständig und hält Organellen und intrazelluläre Bestandteile zusammen [23]. Der Membranaufbau zeigt das typische Bauprinzip von Biomembranen (Abb. 2.1): eine Lipiddoppelschicht mit darin eingelagerten Choles- terinmolekülen, Proteinen, Glykolipiden und anderen integralen und assoziierten Makromolekülen [24].

Abb. 2.1: Schemazeichnung einer Lipidmembran. Proteine und Zucker bewegen sich innerhalb der fluiden Lipiddoppelschicht.

(Bildquelle: www.unitus.it/scienze/corsonew/lezione11.html)

Unterschiede zu Plasmamembranen anderer somatischer Zellen bestehen in dem höheren Anteil an ungesättigten Fettsäuren und dem höheren Cholesteringehalt, durch den die Fluidität besonders im Kopfbereich herabgesetzt wird [25]. Der Befruchtungserfolg hängt wesentlich von der Fluidität der Plasmamembran ab und wird von dem Gehalt an verschiedenen Fettsäuren beeinflusst [26]. Die vorherr- schenden Phospholipide in bovinen Spermien sind Phosphatidylcholin, Phosphatidyl- ethanolamin, Cholinplasmalogen, Ethanolaminplasmalogen, Phosphatidylserin, Sphingomyelin und Cardiolipin [27]. Der Lipidaufbau und die Fluidität der Membran

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LITERATURÜBERSICHT

ändern sich während des Reifungsprozesses der Samenzelle. Durch die wenigen verbleibenden Zellorganellen und den Abschluss der DNA Transkription im reifen Spermium ist eine Neusynthese von Plasmamembranbausteinen unmöglich [28].

Plasmamembranschädigungen führen zu einem irreversiblen Verlust von Motilität und Fertilität der Samenzelle [29].

Die physikalischen Eigenschaften biologischer Membranen werden durch Lipid- zusammensetzung, Temperatur und anderen Einflüssen von außen bestimmt. Bei der Phasenübergangstemperatur wechseln die Membranlipide von der hochstruktu- rierten Gelphase in die ungeordnete flüssigkristalline Phase und umgekehrt. Inner- halb des physiologischen Temperaturbereichs befindet sich die Lipid-Doppelschicht in der lamellar-flüssigkristallinen Struktur, dem Normalzustand der biologischen Membran. Bei niedrigen Temperaturen wechselt dieser Zustand in die starre Gelphase, in welcher die Fettsäureketten exakt geordnet vorliegen und so die zytoplasmatischen Prozesse beeinflussen. Die Phasenübergangstemperatur (Tm) ist für jede Lipidsorte charakteristisch. Die Lipidzusammensetzung der Membran ist stark an Ausmaß und Art der durch Kryokonservierung bedingten Schädigung beteiligt [30]. So wird z.B. die Phasenübergangstemperatur durch kurzkettige und ungesättigte Lipide herabgesetzt und steigt bei längeren Kohlenstoffketten an. In der Zellmembran, einem Gemisch aus Lipiden, Sterinen und Proteinen, bedeutet dies ein sehr komplexes Phasenübergangsverhalten der Membran. Spermien verschiedener Tierarten mit vergleichbarer Resistenz gegenüber dem Kälteschock besitzen Membranen, die sich in der Lipidzusammensetzung, dem Cholesterin/Phospholipid- Verhältnis, sowie Länge und Sättigungsgrad der Kohlenstoffketten ähneln [27]. So sind es vor allem „rohe“, unbearbeitete Lipide im Eigelb die mit der Spermien- membran interagieren [31].

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LITERATURÜBERSICHT

2.3 Schäden durch Kryokonservierung

Der Prozess der Kryokonservierung stellt eine extreme Belastung der Plasmamem- bran der Spermien dar [32,33]. Die Zellen werden dem Kälteschock, der Eiskristall- bildung und der zellulären Dehydratation ausgesetzt. Bereits bei einer Abkühlung auf +15 °C finden an der Zelle Veränderungen statt, die sich bis zu einer Temperatur von -4 °C intensivieren. Die Kälteschocksensibilität der Spermien ist tierartlich, aber auch inter- und intraindividuell unterschiedlich. Membran- und Akrosomenschädigungen sowie ein Abfall der Motilität sind charakteristische Phänomene [3].

Während des Abkühl- und Gefrierprozesses findet eine temperaturabhängige, sogenannte thermotrope, und durch Dehydratation verursachte, sogenannte lyotrope, Phasenverschiebung innerhalb der Plasmamembran statt. Dabei gehen Phospholipide der Membran vom Flüssig- in den Gelzustand über. Art und Ausmaß dieser Phasenübergänge werden von der molekularen Membranzusammensetzung vorgegeben. Sie ist mitverantwortlich für die unterschiedliche Abkühlempfindlichkeit bei den verschiedenen Tierarten [34]. Folgen dieses Geschehens sind eine laterale Phasenseparation von Membrankomponenten und eine erhöhte Membranperme- abilität [8,9]. Die Kühlung verändert somit den Phasenstatus und die strukturelle Organisation von Membrankomponenten, was zu einer Verschmelzung von Lipid Rafts in der Membran führt. Bei der Tiefgefrierung kommt es aufgrund der Freisetzung gebundenen Wassers um die Kopfgruppe der Phospholipide zu hohen kooperativen flüssig-zu-Gel-Phasenübergängen in Zellmembranen [35,36].

Sobald eine Lösung unter ihren Gefrierpunkt abgekühlt wird, entstehen Eiskristalle.

Nach Mazur [37] setzt die Eiskristallbildung im Außenmedium spontan oder induziert zwischen -5 °C und -10 °C ein. Im Gegensatz dazu gefriert die intrazelluläre Flüssig- keit bei diesen Temperaturen noch nicht. Die gelösten Elektrolyte verbleiben in den ungefrorenen extrazellulären Bereichen, der osmotische Druck nimmt bei Abnahme der Temperatur und Schrumpfung dieser Bereiche weiter zu und induziert einen Zellstress [38]. Dies führt zu einem höheren chemischen Potential im verbleibenden intrazellulären Wasser im Gegensatz zum extrazellulären Wasser. Es entsteht ein Konzentrationsgefälle, das durch entsprechenden Wasseraustritt aus der Zelle kompensiert werden muss, um das Gleichgewicht wieder herzustellen [39]. Die

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LITERATURÜBERSICHT

Abkühlgeschwindigkeit spielt bei der Art der Schädigung eine wichtige Rolle [40]. Bei der langsamen Abkühlung - hier herrscht die Dehydratisierung vor - kommt es durch osmotischen Stress infolge von Lösungseffekten zur Schädigung [41], während bei schnellen Abkühlraten die intrazelluläre Eiskristallbildung hauptverantwortlich für den schädigenden Zellstress und schließlich den Tod der Zelle ist. Das Abkühlen der Spermasuspension bis wenige Grade unter ihren Gefrierpunkt vor der Eiskristall- bildung wird als „Supercooling“ bezeichnet [42]. Bei der Entstehung von Eiskristallen wird überschüssige Energie in Form von Wärme abgegeben. Diese ist zellschädigend. Pribor [43] erkannte bei seiner Studie an Erythrozyten die zentrale Bedeutung von Abkühl- und Auftaugeschwindigkeiten für das Überleben der Zellen.

Reaktive Sauerstoffradikale (reactive oxygen species = ROS) werden während des Einfrier- und Auftauvorgangs bei der Kryokonservierung von den Spermien pro- duziert [44], wobei gleichzeitig der Gehalt an Antioxidantien in den Spermien abnimmt [45]. Antioxidative Abwehrmechanismen arbeiten bei niedrigen Tempera- turen nicht, was eine Anreicherung der ROS während des Tiefgefrierens zur Folge hat. ROS, die ein oder mehrere ungebundene Elektronen besitzen, führen in Zell- membranen zur Lipidperoxidation und einer Esterspaltung bei Phospholipiden [46].

Diese Vorgänge bewirken ein Absinken der Membranintegrität. Superoxidanionen, Hydrogenperoxide, Peroxylradikale und Hydroxylradikale gehören zu den ROS [47].

Um ihre Elektronenhüllen zu stabilisieren, reagieren sie mit den meisten organischen Substanzen und führen bei diesen zu einer Oxidation oder Reduktion. Durch den hohen Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren und nur geringen Konzentrationen von antioxidativen Enzymen im Zytoplasma steigt die Sensibilität der Plasmamembran für Lipidperoxidationen [46]. Intrazelluläre Antioxidantien können die Zellmembran, welche das Akrosom und den Spermienschwanz umgibt, nicht schützen. Hierfür sind nur die Antioxidantien im Seminalplasma geeignet [48].

Folgen der Lipidperoxidation sind die Beeinträchtigung der Motilität [49] und Schädigung der DNA, sowie der Proteine des Spermiums, was sich negativ auf die Fertilität auswirkt [50,51].

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LITERATURÜBERSICHT

2.4 Kryoprotektiva und Äquilibrierungszeit

Die Zugabe von Kryoprotektiva ist für das Überleben der Zellen während der Kryo- konservierung essentiell. Dieser Zusatz zum Verdünner in beinahe molaren Dimen- sionen bedeutet substantiellen, transienten Stress für die Samenzelle [52].

Propantriol (Trivialname Glycerin oder Glycerol) ist seit 1949 [15] das Kryopro- tektivum der Wahl für Spermatozoen. Die Schutzwirkung ist auf die Reduktion der Salzkonzentration zurückzuführen, die beim Einfrierprozess eine intrazelluläre Kristallisierung und irreversible Membrandenaturierung verhindert [53]. Jedoch sind Kryoprotektiva vorsichtig einzusetzen, da bei zu geringen Konzentrationen die Schutzwirkung während des Einfrierprozesses abnimmt und bei zu hohen Konzentrationen die toxischen Eigenschaften die Fertilität senken. De Leeuw et al.

[54] haben in ihrer Studie unter anderem die Wirkung von Glycerin und membran- stabilisierenden Substanzen (Eigelb, DOPC-, DOPC/DOPA/Cholesterin-Vesikel und BSA) anhand des prozentualen Anteils intakter Spermien nach dem Auftauen untersucht. Im Verdünner mit Glycerin und ohne Zusatz von Eigelb wurden 18%

weniger plasmamembranintakte Spermien gemessen als im herkömmlichen Verdünner mit 20% Eigelbanteil. Der Anteil plasmamembranintakter Zellen war im glycerinfreien Verdünner mit 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DOPC, 18:1) Liposomen allein um 16% höher als in Kombination mit 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphat (DOPA, 18:1) und Cholesterin, jedoch um 20% niedriger als mit Eigelb.

Eigelb ist der maßgebende zusätzliche Schutz gegen Schäden bei der Kryokonservierung, für den eine gleichwertige synthetische Alternative gefunden werden soll.

Im Anschluss an die Verdünnung wird das Sperma vor der Tiefgefrierung einer sogenannten Äquilibrierung bei 4 bis 5 °C unterzogen. In heute praxisüblichen Gefrierkonservierungsprotokollen werden Äquilibrierungszeiten von drei bis vier Stunden angegeben [55]. In der Literatur finden sich Empfehlungen für eine optimale Äquilibrierungszeit von wenigen Minuten bis zu 18 Stunden [56,57]. In der Studie von Griga [58] wurde die Spermaqualität nach Äquilibrierungsdauern von einer bis zu 48 Stunden bei 4 °C untersucht. Sie beobachteten signifikant höhere Anteile progressiv motiler und plasmamembranintakter Spermien nach dem Auftauen bei zunehmender

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LITERATURÜBERSICHT

Äquilibrierungsdauer. Durch die schnelle Aufnahme von Glycerin in das Spermium scheint eine längere Lagerzeit bei 4 °C hierbei von untergeordneter Bedeutung zu sein [54]. Eine längere Äquilibrierungszeit führt nicht in jedem Verdünnermedium zu einem positiven Effekt auf Motilität, Zell- und Akrosomenmembranintegrität der aufgetauten Spermien [59]. Die Autoren verglichen drei kommerziellen Verdünnern - Andromed, Biociphos Plus und Biladyl – hinsichtlich ihrer Kryokonservierungs- eignung von bovinen Spermien, wenn diese für 18 Stunden bei 4 °C vor dem Tiefgefrieren gelagert wurden. Die Verwendung von eigelbbasiertem Biladyl Verdünner führte zu einem signifikant höheren Anteil an akrosomintakten Spermien sowie einer längeren Lebensdauer der Spermien im Vergleich zu den beiden eigelbfreien Verdünnern Andromed und Biociphos Plus.

2.5 Liposomen als kryoprotektive Substanz

Untersuchungen der Lipid- und Lipoproteinanteile des Eigelbs lassen darauf schließen, dass im Besonderen die Phospholipidfraktion für den Schutz der Sper- mien während des Tiefgefrier- und Auftaupozesses sorgt [6,7]. Parks et al. [60]

konnten in ihrer Studie nachweisen, dass Liposomen, die aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC) bestehen, die Spermienzellen während der Kühlung und Lagerung bei 4 °C und vor dem Kälteschock schützen. Die Zugabe von Cholesterin zum Liposomen- verdünner reduzierte die schützende Wirkung durch EPC. Parks et al. [60] geben für diese Beobachtung die durch Cholesterin veränderte Fließeigenschaft der EPC Liposomen und die damit einhergehende Veränderung in der Fusionskompatibilität mit der Spermienmembran an. Der schützende Effekt von Liposomen beim Einfrieren und Auftauen von Zellen wurde erstmals bei Spermien festgestellt [12,61]. Im Jahre 1988 wurde ein analoger Effekt bei pflanzlichen Protoplasten nachgewiesen, bei denen die Fusion von Phosphatidylcholin-Liposomen mit diesen Organellen zu einer besseren Toleranz gegenüber dem Tiefgefrieren geführt hat [62].

Zwei Hauptgruppen natürlicher Phospholipide erlauben eine industrielle Herstellung und Anwendung: Glycerophospholipide mit einem Glycerolgerüst und Sphingophos-

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LITERATURÜBERSICHT

dung. Ei-Phospholipide sind vermutlich die reichhaltigste Phospholipidquelle in der Natur (Abb. 2.2). Flüssiger Hühnereidotter beinhaltet 30% Lipide (60% in der Trockensubstanz), mit etwa 9% Phospholipiden (18% in der Trockensubstanz) [63].

Der Phopholipidanteil im Eidotter setzt sich wie folgt zusammen: 16:0 zu 30%, 18:0 zu 16%, 18:1 zu 29%, 18:2 zu 14%, 18:3 zu 1%, 20:4 zu 5% und andere zu 5% [64].

Eigelbpulver

Trocknung

Entfettetes Eigelbpulver Dotterlipide

Ei-Phospholipide

Ei-Phosphatidylcholin (Egg PC)

Ethanol Aceton

Aceton Ethanol Aceton

Flüssiger Eidotter

Abb. 2.2: Prinzip der Herstellung von Phospholipiden aus Eidotter am Beispiel des Phosphatidylcholins (Egg PC).

Für gewöhnlich hat natürliches Phosphatidylcholin (PC) aus Eidotter eine hydrophil- lipophile Ausgewogenheit und eignet sich gut zur Herstellung von künstlichen Biomembranen. 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC, 16:0) ist ein gut untersuchtes synthetisches Phospholipid. DPPC liegt bei Temperaturen unter 35 °C in der gelartigen Form und bei Temperaturen über 41 °C in der flüssigen Form vor.

Bei einer Reduzierung der Kohlenstoffkette auf 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phos-

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LITERATURÜBERSICHT

phocholin (DMPC, 14:0) liegt eine Phasenübergangstemperatur (Tm) von 23 °C vor (Abb. 2.3). 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DSPC, 18:0) hat eine Tm von 55 °C. Das Einfügen einer Doppelbindung in jede der beiden Kohlenstoffketten von DSPC zur Formung von DOPC hat den gleichen Effekt wie die Kürzung der C-Ketten um mehr als sechs C-Atome [65] (Abb. 2.3).

Egg-Phosphatidylcholine (EPC)

1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DLPC, 12:0)

1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DMPC, 14:0)

1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC, 16:0)

1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DSPC, 18:0)

Abb. 2.3: Schematische Darstellung der Struktur der Lipide EPC, DLPC, DMPC, DPPC und DSPC. (Bildquelle: www.avantilipids.com)

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LITERATURÜBERSICHT

Die Lipide als integrale Bestandteile der Membran sind in der Regel ambiphile, chirale Moleküle bestehend aus einer polaren Kopfgruppe und einer apolaren Kohlenwasserstoffkette. Die Kopfgruppen sind meist stark hydrophil, während die Kohlenwasserstoffe der Kette stark hydrophob sind, was so den ambiphilen Charakter der Lipide begründet. Eine Exposition der Lipide gegenüber Wasser führt daher, aufgrund des hydrophoben Effekts, zu einer Selbstordnung. Je nach Lipid- konzentration und Methode der Bearbeitung formen sich unterschiedliche Strukturen.

Eine mögliche Darstellung von Lipid-Doppelschichten sind unilamellare Vesikel.

Zuerst bilden sich große Vesikel, die aus mehreren Lipidschichten (LMV = large multilamellar vesicles) aufgebaut sind (Abb. 2.4). Kleine einschichtige Vesikel (SUV = small unilamellar vesicles) lassen sich aus einer wässrigen Lipiddispersion durch Behandlung mit Ultraschall bilden. Große einschichtige Vesikel (LUV = large unilamellar vesicles) werden bei der Extrusion durch feinporige Filtermembranen geformt (Abb. 2.4). Bei diesem Vorgang entstehen Vesikel von exakt definierter Größe.

LMV

SUV

LUV

Abb. 2.4: Schematische Darstellung des Aufbaus unterschiedlicher Vesikel. LMV

= large multilamellar vesicles; LUV = large unilamellar vesicles; SUV = small unilamellar vesicles. (Bildquelle: www.avantilipids.com)

Graham und Foote [12] untersuchten die Wirkung mittels Ultraschall hergestellter Liposomen auf die Kryokonservierbarkeit von bovinen Spermien. Dabei setzten sie

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LITERATURÜBERSICHT

PC Lipide mit variierenden Kohlenstoffkettenlängen (8, 12, 14, 16, 18 und 20 C- Atome) und Doppelbindungen (0, 1, 2 oder 3), sowie Phosphatidylserin (PS) und Cholesterin jeweils allein oder in Kombination ein. Die getrockneten Lipide wurden im Verdünnermedium durch Wärmebehandlung in Lösung gebracht und im Ultra- schallbad für 5 Minuten mit einem Ultraschall-Desintegrator (Branson Sonifier, Branson Instruments Co. Stamford, CT) behandelt. Dieser Arbeitsschritt wurde bei permanenter Zufuhr von Stickstoffdampf durchgeführt. Nach der Ultraschall- behandlung wurde die Lösung zentrifugiert, der Überstand in ein Reagenzglas überführt und mit Stickstoff bedampft. Die Liposomen wurden in flüssigem Stickstoff gelagert und kurz vor der Verwendung bei Raumtemperatur aufgetaut. Phospholipide mit 8 C-Atomen wirkten bereits kurz nach der Verdünnung letal auf Spermien. Die Zugabe von PC Liposomen mit unterschiedlichen C-Kettenlängen oder Sättigungs- graden führte im Vergleich zur Inkubation mit PS Liposomen zu keiner Zunahme des Anteils motiler Spermien. Im Vergleich zu PS Liposomen allein hatte die Kombination aus PS und Cholesterin Liposomen einen um 13% höheren Anteil motiler Spermien nach dem Auftauen zur Folge. Der Anteil motiler Spermien im Verdünner mit Liposomen aus PS, PC 12 und Cholesterin war im Vergleich zu Eigelb bei der Kühlung und während des Tiefgefrierens und Auftauens um 1% niedriger. Aus diesen Ergebnissen folgerten Graham und Foote [12], dass Lipide, welche theoretisch die Phasenübergangstemperatur der Membran herabsetzen, ein Überleben der Zellen während der Tiefgefrierung auf -196 °C ermöglichen. Sie postulierten, dass aufgrund dieser Ergebnisse und der schnellen Wirkung von PS Liposomen, eine Fusion eher als ein Austausch für die Interaktion zwischen Plasmamembranen und Liposomen in Frage kommt. Weitere Studien belegen den schnellen Schutz von Spermien vor dem Kälteschock durch PC Lipide [66,67].

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MATERIAL UND METHODEN

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 Bullen und Versuchssperma 3.1.1 Versuchstiere

Zur Gewinnung des Spermas standen acht Bullen des Besamungsvereins Neustadt a. d. Aisch e. V. (BVN) zur Verfügung, darunter sieben zuchtwertgeprüfte Bullen und ein ungeprüfter Bulle der Rasse Deutsches Fleckvieh im Alter zwischen 1,5 und 11 Jahren. Von jedem Bullen wurden vier Ejakulate je Versuch untersucht. Darüber hinaus wurden neun Ejakulate von fünf Bullen der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verwendet. Vier von ihnen gehörten der Rasse Holstein Frisian an und einer der Rasse Deutsches Fleckvieh. Alle Bullen wurden zweimal pro Woche zur Spermagewinnung herangezogen.

Die Bullen wurden unter einheitlichen Bedingungen gehalten und gefüttert. Die Tiere zeigten während der gesamten Versuchsdauer ein ungestörtes Allgemeinbefinden und wiesen keine Sexualstörungen oder Erkrankungen der Geschlechtsorgane auf.

3.1.2 Spermagewinnung

Die Spermagewinnung wurde aus hygienischen und sicherheitstechnischen Gründen im Sprungraum durchgeführt. Unterstellbullen und ein Phantom standen für den Aufsprung zur Verfügung. Erst nach zwei bis drei „Blindsprüngen“ wurde die Samennahme mithilfe einer künstlichen Vagina (KV), Modell „Neustadt/Aisch“

(Müller, Nürnberg, Deutschland) durchgeführt. Ein spezieller Vaginenraum diente der Aufbewahrung, Reinigung und Sterilisation der KV. Vor Gebrauch wurden die KV in einem Brutschrank auf 42 °C vorgewärmt. Die innere Wand der Vagina wurde zur besseren Stimulation mittels Vaseline gleitfähig gemacht. Das Ejakulat wurde in einem Einwegkunststoffröhrchen (Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) aufge- fangen, welches über einen Gummitrichter an der KV befestigt war und zur besseren Wärmeisolation in einem Schutzmantel steckte. Nach dem Ablösen des Röhrchens

(25)

von der KV wurde es durch eine Schleuse in den Laborbereich verbracht und bis zur weiteren Bearbeitung in ein auf 32 °C eingestelltes Temperiergerät (Kugelbad, Fa.

Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) gestellt.

3.1.3 Spermabeurteilung

Das Sperma wurde makroskopisch auf Farbe, Konsistenz und Beimengungen untersucht. Zur Versuchsdurchführung wurden nur Ejakulate herangezogen, die frei von Schmutz, Harn oder Blut waren. Das Ejakulatvolumen wurde bestimmt und der prozentuale Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien im originären Sperma durch sub- jektive Schätzung ermittelt. Dazu diente ein Mikroskop mit beheizbarem Objekt- trägertisch, positivem Phasenkontrast und einem Okular sowie einem Objektiv mit jeweils 10-facher Vergrößerung (Dialux 20, Leitz, Wetzlar, Deutschland). Für die Beurteilung wurden mit Hilfe einer Pipette zwei kleine Tropfen des Ejakulates auf einen vorgewärmten Objektträger (37 °C) aufgebracht und mit je einem Deck- gläschen (18 x 18 mm) belegt. Ejakulate mit weniger als 60% vorwärtsbeweglichen Spermien wurden verworfen. Die Spermienkonzentration der Ejakulate wurde mit Hilfe eines Photometers (SMD 5, Programm 4, Minitube, Tiefenbach, Deutschland) oder mittels Zählkammer nach THOMA bestimmt und in Milliarden pro Milliliter angegeben. Ejakulate mit einer Dichte von weniger als 400 Mio. Spermien je Milliliter wurden verworfen. Anschließend wurde das Ejakulat mit Hilfe von Verdünnern auf eine Konzentration von 60 Mio. Spermien je Milliliter eingestellt.

3.2 Kryokonservierung

3.2.1 Verdünnung mit einem auf TRIS basierenden Verdünner unter Zusatz von Hühnereigelb oder Liposomen

Für die Kryokonservierung wurde jedes Ejakulat im Anschluss an die Beurteilung in sechs Portionen aufgeteilt und mit je einem Kontrollverdünner mit und einem ohne

(26)

Zusatz von Eigelb und vier unterschiedlichen Liposomen-Verdünnern verdünnt. Für die Kontrolle mit Eigelb wurde das Sperma mit vorgewärmtem TRIS-Tiefgefrier (TG)- Verdünner I (198 mM TRIS, 64 mM Zitronensäure, 55 mM Fructose 0,4 g/l Penicillin, 1,0 g/l Streptomycin, pH 7,0, 280-300 mOsm/kg) mit einem Zusatz von 8% geklärtem Eigelb auf 120 × 10⁶ Spermien/ml verdünnt und für 15 Minuten bei 23 °C inkubiert.

Anschließend wurde langsam die gleiche Menge an TRIS-TG-Verdünner II mit Eigelb sowie 12,8% Glycerin hinzugegeben. Somit befanden sich 60 × 10⁶ Spermien/ml Verdünner mit 6,4% Glycerin und 8% Eigelb im Endvolumen. Die Herstellung der Kontrolle ohne Eigelb erfolgte nach dem gleichen Prinzip wie mit Eigelb, jedoch wurde das Eigelb durch Wasser ersetzt (Abb. 3.1).

Für die Kryokonservierung mittels TRIS-TG-Verdünner mit einem Liposomenzusatz an Stelle von Eigelb wurde das Sperma mit TRIS-TG-Verdünner I mit 4 mg/ml Lipo- somen (LUV) verdünnt und für 15 Minuten bei 23 °C inkubiert. Im Anschluss daran wurde die gleiche Menge TRIS-TG-Verdünner II mit 12,8% Glycerin zugegeben. Im Endvolumen waren 60 × 10⁶ Spermien/ml, 6,4% Glycerin und 2 mg/ml Liposomen (Abb. 3.1). Die Zusammensetzungen der Kontroll- und Liposomenansätze sind im Anhang aufgeführt (Tabelle 11.1, 11.2 und 11.3).

Bei Experimenten mit unterschiedlichen Endkonzentrationen an Liposomen (0,2 bis 4 mg/ml) wurde der Samen zuerst im TRIS-TG-Verdünner I mit der jeweils zwei- fachen Menge der im Endvolumen gewünschten Liposomenkonzentration verdünnt.

(27)

TG-Verdünner I TRIS + EY TRIS - EY TRIS - EY + LUV 4,5 ml mit 32°C Kontrolle 1 Kontrolle 2 Varianten (120×10⁶/ml)

TG-Verdünner II

5,0 ml mit 24°C TRIS + EY + GLY TRIS - EY + GLY TRIS - EY + GLY (60×10⁶/ml)

Spermien in TRIS - EY (1,2×10⁹Spermien/ml)

je 0,5 ml

15 Min. Inkubation bei 23°C

24 h Aquilibrierung bei 4°C

Tiefgefrierung

TG-Verdünner I TRIS + EY TRIS - EY TRIS - EY + LUV 4,5 ml mit 32°C Kontrolle 1 Kontrolle 2 Varianten (120×10⁶/ml)

TG-Verdünner II

5,0 ml mit 24°C TRIS + EY + GLY TRIS - EY + GLY TRIS - EY + GLY (60×10⁶/ml)

Spermien in TRIS - EY (1,2×10⁹Spermien/ml)

je 0,5 ml

15 Min. Inkubation bei 23°C

24 h Aquilibrierung bei 4°C

Tiefgefrierung

Abb. 3.1: Übersicht über die Zusammensetzung der Kontrollansätze mit (TRIS + EY) und ohne Eigelb (TRIS - EY) und der Liposomenansätze (TRIS – EY + LUV). TG = Tiefgefrierung, EY = Eigelb, LUV = large unilamellar vesicles (2 mg/ml), GLY = Glycerin.

Alle für den Verdünnungsprozess notwendigen Utensilien wurden im Vorfeld auf 32 °C erwärmt. Wie bei der Anwendung des Verdünners nach Steinbach [68]

beschrieben, wurde bei allen Experimenten der Samen in zwei Schritten verdünnt.

Die erforderliche Menge an Frischsperma wurde anhand dieser Vorgaben errechnet und mit einer Pipette in ein Schraubglas (Schott AG, Mainz, Deutschland) vorgelegt.

Nun erfolgte der erste Verdünnungsschritt: 4,5 ml des auf 32 °C vorgewärmten Tiefgefrierverdünners I (TG-Verdünner I, ohne Glycerin) wurden unter langsamen Drehbewegungen des Schraubglases dem Sperma zupipettiert. Im Anschluss daran

(28)

wurden die Verdünnungsflaschen in ein auf 23 °C temperiertes Wasserbad umge- setzt und verblieben dort für ca. 15 Minuten. Danach wurden die Verdünnungs- flaschen aus dem Wasserbad entnommen, abgetrocknet und auf den Labortisch (Temperaturbereich 21 ± 3 °C) gestellt. Im folgenden zweiten Verdünnungsschritt wurden 5 ml des entsprechenden, auf 24 °C vorgewärmten TG-Verdünners II unter leichten Schwenk- und Drehbewegungen dem vorverdünnten Sperma zugesetzt. Die verschlossenen Verdünnerflaschen (Schott AG, Mainz, Deutschland) wurden in eine Schüttelvorrichtung (Landgraf Laborsysteme GmbH, Langenhagen, Deutschland), die sich in einem 4 °C Kühlraum befand, gestellt. Die modifizierte, der Verdünner- flaschengröße angepasste Schütteleinheit, sorgte für ein unablässiges Durch- mischen des Sperma-Verdünner-Gemisches. Auf diese Weise sollte der Kontakt der Spermien mit den verschiedenen Verdünnerkomponenten, wie z.B. Liposomen, verstärkt werden. Mit dem Verbringen in den Kühlraum begann die Äquilibrierung des ausverdünnten Spermas. Die Äquilibrierungszeit betrug je nach Versuch 6 oder 24 Stunden. Dabei kühlte das verdünnte Sperma zunächst innerhalb von ca. 75 min von 24 °C auf 4 °C herunter, was einer Abkühlrate von 0,27 °C/min entspricht. Die Temperaturen während der Abkühlphase wurden mit Temperaturfühlern (Fa.

Greisinger Electronic GmbH, Typ GTF 101 Pt 100, Regenstauf, Deutschland), einem 12 Kanal-Temperaturschreiber (Fa. Advantech Co., Ltd., Typ ADAM- 4015, ADAM- 4520 RS-232 to RS-422 / RS-485 Isolated Converter, Düsseldorf, Deutscland) und einer Messwerterfassungssoftware (DASY Lab 9.0, measX GmbH & Co. KG, Mönchengladbach, Deutschland) bestimmt. Die Temperaturfühler wurden in den Verdünnerflaschen angebracht bevor sie in den Kühlraum gestellt wurden. Die Temperaturerfassung erfolgte einmal pro Sekunde.

Die TRIS-TG-Verdünner I und II setzten sich aus 1,5-facher TRIS-Stammlösung, 40% geklärtem Eigelb in wässriger Lösung oder 40 mg/ml Liposomen in wässriger Lösung und 12,8% Glycerin zusammen. Die chemische Zusammensetzung der TRIS-Stammlösung zur Herstellung der TRIS-TG-Verünner I und II ist in Tabelle 3.1 aufgeführt.

(29)

Tabelle 3.1: Chemische Zusammensetzung der TRIS-Stammlösung zur Herstellung des TRIS-Tiefgefrierverünners I und II.

MW (g/mol)

für 1,5x TRIS gebe in 1000 ml (g)

Konzentration in 1,5x TRIS

Konzentration in 1x TRIS Tris-Hydroxy-Methyl-

Amino-Methan 121,14 36,05 297,59 mM 198,39 mM Citricacidmonohydrat 210,14 20,24 96,32 mM 64,21 mM D-Fructose 180,16 14,88 82,59 mM 55,06 mM Penicillin G 0,606 0,606 g/l 0,404 g/l

Streptomycin 1,50 1,50 g/l 1,0 g/l

3.2.2 Konfektionierung und Einfriervorgang

Unter Konfektionierung des Spermas ist das maschinelle oder manuelle Abfüllen der Besamungsportionen zu verstehen. Nach der Äquilibrierung bei 4 °C wurde das in 10 ml Tiefgefrierverdünner verdünnte Sperma in Pailletten (Typ Mini Pailletten, Einheit 0,25 ml, IMV, L`Aigle, Frankreich) abgefüllt und gekennzeichnet. Das maschinelle Abfüllen in Besamungsportionen erfolgte mit einer auf 4 °C temperierten und im Kühlkabinett stehenden Abfüllmaschine (MPP Quattro, Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) und die Beschriftung der Pailletten mit einem Drucker (JET 2 SE, Leibinger, Tuttlingen, Deutschland). Anschließend wurden die Pailletten auf Rampen aufgelegt und visuell auf eine korrekte Befüllung kontrolliert. Das Einfrieren der Besa- mungsportionen erfolgte in Stickstoffdampf bei -95 °C für 9 Minuten (NIFA Technolo- gies BV, Leeuwarden, Niederlande). Bei jedem Einfriervorgang waren 4 Rampen, die sich alle auf gleicher Höhe befanden, in der Einfriermaschine. Im Anschluss daran wurden die Pailletten in flüssigen Stickstoff überführt und bei -196 °C in einem Stickstoffcontainer gelagert.

(30)

3.2.3 Herstellung von geklärtem Eigelb

Das Eigelb für den modifizierten TRIS-Eigelb-TG-Verdünner nach Steinbach [68]

wurde aus Hühnereiern hergestellt, die aus kontrollierter Haltung und Fütterung des Lehr- und Forschungsgutes Ruthe der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover bezogen wurden. Die Eier wurden im Labor bei Zimmertemperatur unter möglichst sterilen Kautelen geöffnet, das Eiweiß verworfen und die Eigelbmembran durch Abrollen auf Filterpapier gereinigt. Anschließend wurde die Membran mit einer sterilen Kanüle perforiert, so dass das Eigelb in einen Messzylinder abtropfte. Mit destilliertem Wasser wurde im Verhältnis 2:3 aufgefüllt. Auf einem Rührtisch (IKAMAG RCT, IKA-Labortechnik Janke & Kunkel GmbH, Staufen, Deutschland) wurde die 40%ige Eigelblösung für 15 Minuten mit einem Magnetrührfisch homogenisiert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation (Sorvall RC 5C Plus, Newtown, CT , USA) bei einer Geschwindigkeit von 7800 × g und einer Innenraum- temperatur von 4 °C für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in Schraubgläser (Schott AG, Mainz, Deutschland) umgefüllt und der Niederschlag verworfen. Das zentrifugierte Eigelb wurde maximal fünf Tage bei 4 °C gelagert.

3.2.4 Herstellung von Liposomen

Die in dieser Studie verwendeten Lipide wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) bezogen: Egg-Phosphatidylcholin (EPC), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphocholin (DOPC, 18:1), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin (DOPS, 18:1), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-(1’-rac-glycerol) (DOPG, 18:1), 1,2- Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin (DOPE, 18:1), 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero- 3-Phosphocholin (DLPC, 12:0), 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DMPC, 14:0), 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC, 16:0), 1,2-Distearoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholin (DSPC, 18:0). Zusammensetzungen aus 45 mg EPC bzw.

DOPC und 5 mg DOPC, DOPS, DOPG oder DOPE wurden im Verhältnis 9:1 (w/w) hergestellt. Eine Zusammenfassung der verwendeten synthetischen Phospholipide zur Herstellung von Liposomen befindet sich in Tabelle 3.2.

(31)

Alle Lipide wurden in Chloroform gelöst geliefert und bei -20 °C gelagert. Im Labor wurde der Chloroformlösung ein Volumen abpipettiert, welches die für die spätere Lösung erforderliche Lipidmenge nach der Trocknungsphase enthielt. Zur weiteren Verarbeitung wurde das Reagenzglas (Schott AG, Mainz, Deutschland) mit Lipid- lösung unter einem Abzug zur Trocknung, je nach Lipidsorte für ein bis drei Tage aufgestellt und anschließend 10 Stunden lyophilisiert (Fa. Christ, Osterode, Deutschland). Das Ergebnis der Trocknungsphase ließ sich optisch anhand eines gelbkörnigen Lipidfilms für EPC und eines weißkörnigen Lipidfilms für synthetische Lipide kontrollieren. In diesem Zustand war eine Lagerung bei -20 °C über mehrere Wochen möglich. Zur Herstellung von großen multilamellaren Vesikeln (LMV) wurde der Lipidfilm mit destilliertem Wasser versetzt und für wenige Minuten in ein 30 °C warmes Wasserbad gestellt. Anschließend wurde der dünne Lipidfilm durch Schüt- teln und häufiges Vortexen gelöst. Zur weiteren Lösung wurde das Reagenzglas in flüssigen Stickstoff getaucht und anschließend in einem Wärmebad erwärmt. Die Temperatur des Wärmebads musste oberhalb der Phasenübergangs-Temperatur des jeweiligen Lipids, bis zu 63 °C warm gehalten werden, um die Lipidschichten zu lösen und LMV zu bilden. Der Vorgang des Tiefgefrierens und schnellen Auftauens wurde viermal wiederholt.

(32)

Tabelle 3.2: Übersicht über die verwendeten synthetischen Phospholipide zur Herstellung von Liposomen. R beschreibt die Fettsäureketten: An erster Stelle steht die Anzahl der Kohlenstoffatome, an zweiter die Zahl der Doppelbindungen. Tm ist die Phasenübergangstemperatur (phase- transition-temperature). Der Durchmesser gibt die Porengröße der Polycarbonatmembran bei der Liposomenherstellung an.

Phospholipid R Akronym Molekular-

gewicht (g/mol)

Tm

(°C)

Ladung

Durch- messer (nm)

Phosphocholin:

1,2-Dilauroyl 12:0 DLPC 621,8 -1 neutral 200 1,2-Dimyristoyl 14:0 DMPC 677,9 23 neutral 100/200 1,2-Dipalmitoyl 16:0 DPPC 734,1 41 neutral 200 1,2-Distearoyl 18:0 DSPC 790,2 53 neutral 200 1,2-Dioleoyl 18:1 DOPC 786,1 -22 neutral 100 Phosphoethanolamin

1,2-Dioleoyl 18:1 DOPE 744,1 25 neutral 100 Phosphatidylglycerol

1,2-Dioleoyl 18:1 DOPG 775,1 -18 negativ 100 Phosphatidylserin

1,2-Dioleoyl 18:1 DOPS 810,0 -11 negativ 100

Zur Herstellung von Liposomen mit 100 und 200 nm im Durchmesser wurde der Avanti® Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, USA) verwendet (Abb. 3.2 und 3.3). Der gewünschte Vesikeldurchmesser wurde während der Extrusion durch definierte Porengrößen der Polycarbonatmembran (Whatman, New Jersey, USA) erreicht. Die Fettsäureketten mussten für diese Behandlung oberhalb der Tem- peratur, bei der die Fettsäuren vom gelartigen in den flüssigen Zustand übergehen, gehalten werden. Hierzu wurde der Mini-Extruder auf einer Heizplatte auf den notwendigen Temperaturbereich erwärmt, ebenso die LMV-Suspension. Die weiterführenden Arbeitsschritte am Avanti® Mini-Extruder erfolgten nach Hersteller- angaben. Das Ergebnis war eine homogene, transparente bis weißlich-bläuliche Lösung mit unilamellaren Vesikeln bzw. Liposomen. Im Anschluss an den Herstel-

(33)

lungsprozess wurde die Liposomenlösung für maximal 24 Stunden bei 4 °C gelagert.

Mit dem Verfahren des Dynamic Light Scattering (DLS; Dynamische Lichtstreuung) (Viscotek, Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK) wurde eine Größen- messung der Liposomen vorgenommen. Bei dieser Methode wird das Streulicht eines Lasers an Molekülen in Lösung oder Suspension gemessen. Die Intensität des gestreuten Lichtes fluktuiert in Abhängigkeit von der Größe der Partikel. Mit dem DLS Verfahren wurde die Liposomengröße nach Verwendung einer 100 nm Polycarbonat- membran kontrolliert. Abbildung 3.1 zeigt die Größenverteilung der EPC Liposomen.

Die meisten dieser Liposomen hatten einen Radius von 64,8 nm, während ein geringer Teil der Liposomen einen Radius von weniger als 50 nm aufwies.

Alle Materialien, die während der Herstellung mit Lipiden in Kontakt kamen, wurden mit destilliertem Wasser gespült und mit 70% Ethanollösung gereinigt.

Abb. 3.2: Intensitätsverteilung von EPC Liposomen bei Verwendung einer 100 nm Polycarbonatmembran, gemessen mittels Dynamic Light Scattering (DLS) (Viscotek, Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK).

(34)

Abb. 3.3: Schematische Darstellung der Zusammensetzung des Avanti® Mini- Extruder von Avanti Polar Lipids, welcher zur Extrusion der Liposomen verwendet wurde. (Bildquelle: www.avantilipids.com)

A

B

Abb. 3.4: Avanti® Mini-Extruder von Avanti Polar Lipids in seine Einzelteile zerlegt (A) bzw. zusammengebaut in Gebrauch (B).

(Bildquelle: www.avantilipids.com)

(35)

3.3 Untersuchungsmethoden zur Beurteilung der Spermaqualität

3.3.1 Computergestützte Motilitätsanalyse

Jede Spermaprobe wurde mittels computergestützter Motilitätsanalyse (CASA:

computer assisted sperm analysis) vor und nach der Kryokonservierung untersucht.

Auf der Besamungsstation Neustadt a.d. Aisch wurde hierfür das SpermVision®- System (Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) verwendet. Dieses bestand aus einem Mikroskop (Olympus C x 31, Olympus Europa Holding GmbH, Deutschland) mit negativem Phasenkontrast, einer Digitalkamera (PT-41-04M60, Teledyne DALSA, Ontario, Kanada) und einem PC, auf dem die SpermVision®-Software Version 3.5 installiert war. Das Mikroskop war mit einem beheizbaren Kreuztisch und einer separaten, beheizten Arbeitsplatte (HT 300, Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) ausgestattet.

Zwei Milliliter des verdünnten Spermas wurden in ein Eppendorfgefäß gefüllt und für 10 Minuten in einem Wärmeblock bei 37 °C inkubiert. Mit einer variablen 10 μm Pipette (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) wurde ein Aliquot von 2,4 μl zum Befüllen einer LEJA-Messkammer (LEJA Products B.V., Nieuw-Vennep, Nieder- lande) entnommen. Diese besitzt eine standardisierte Kammerhöhe von 20 μm. Der Tropfen wurde durch Kapillarkräfte in die Messkammer eingezogen. Der Vorgang wurde bei unvollständiger Befüllung oder sichtbaren Luftblasen in der Kammer wiederholt. Bei jeder Messung wurden 10 aufeinander folgende Messpositionen auf der zentralen Längsachse einer LEJA-Messkammer ausgewertet. Sie wurden durch den fahrbaren Kreuztisch von der Software automatisch angesteuert. Dabei wurden 1600 bis 2000 Spermien erfasst. Die verwendeten Kammern entstammten der gleichen Charge. Es wurde die progressive Motilität (PMOT) der Spermien mittels SpermVision®-Software 3.5 erfasst. Nur Spermien mit DSL (distance straight-line)- Werten von mindestens 4,5 µm wurden als progressiv motil bezeichnet.

(36)

3.3.2 Durchflusszytometrische Beurteilung der Integrität der Plasmamembran und des Akrosoms

Die Überprüfung der Integrität der Plasmamembran und des Akrosoms der Spermien wurde durchflusszytometrisch unter Verwendung der FITC-PNA / PI-Färbung durch- geführt.

Die Spermaproben wurden mit dem Durchflusszytometer Epics XL (Fa. Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) gemessen. Das Gerät arbeitet mit einem luftgekühlten Argonionlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm. Für die Messungen wurden zwei verschiedene Filter eingesetzt, ein Bandpassfilter mit einer Wellenlänge von 530 ± 30 nm für die grüne Fluoreszenz (FL1) und ein Langpassfilter mit einer Wellen- länge von 650 nm für die rote Fluoreszenz (FL3). Die Bearbeitung und Auswertung der Messdaten erfolgte mit den Software-Programmen EXPO 32 ADC XL 4 Color und Expo 32 Analysis (Fa. Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland). Das Durchfluss- zytometer wurde an den Messtagen zweimal mit einer Cleanse-Lösung (Coulter Clenz, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) und zweimal mit bidestilliertem Wasser gespült. Nach der Spülung wurde die Fluoreszenzintensität des Gerätes mit Flow-Check-Flüssigkeit (Fa. Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) kalibriert. Bei jeder Messung wurden 10.000 Spermien analysiert.

Der rotfluoreszierende Farbstoff PI (Propidiumiodid; Fa. Sigma-Aldrich, München, Deutschland) kann nur geschädigte Plasmamembranen durchdringen. Er fügt sich in die Doppelhelixstruktur der DNA ein. Der grünfluoreszierende Farbstoff Fluoreszein- Isothiocyanat (FITC) ist an das Arachis hypogaea-Lektin (PNA: peanut agglutinin) gekoppelt (Fa. Sigma-Aldrich, München, Deutschland), welches sich selektiv an die geschädigte äußere Akrosomenmembran bindet. Liegt eine Akrosomenreaktion bzw.

eine akrosomale Schädigung vor, bindet sich das Lektin an das Akrosom.

Für die Analyse der kryokonservierten Spermaproben wurden jeweils 4 Pailletten aufgetaut und in einem Eppendorfgefäß gepoolt. Mit einem TRIS-Medium (200 mM TRIS, 65 mM Zitronensäure, 96 mM Fructose, 0,05 g/l Gentamicin-Sulfate, pH 7, 300 - 310 mOsm/kg) wurde das Sperma auf eine Endkonzentration von 5 × 10⁶ Spermien/ml verdünnt. Für die Messung wurden 492 μl der verdünnten Spermien- suspension mit 3 μl 3 mM PI und 5 μl 0,30 mM FITC-PNA versetzt und mit einem

(37)

Vortexer (Lab Dancer Orbital Shaker, Fa. IKA, Staufen, Deutschland) ca. 5 Sekunden gemischt. Anschließend wurde die Probe für 15 Minuten in einem Wärmeblock bei 37 °C inkubiert und kurz vor der Messung ein zweites Mal kurz auf den Vortexer gestellt.

3.4 Versuchsansätze

In den vorliegenden Studien wurden die Effekte

von Liposomen, die sich aus ungesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen Kopfgruppen zusammensetzen (EPC oder DOPC mit DOPX; PX: PC, PS, PG oder PE)

von Liposomen, die sich aus gesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen Kohlenstoffkettenlängen (DLPC, DMPC, DPPC und DSPC) zusammensetzen

von DMPC Liposomen mit 100 nm und 200 nm Größe

auf die Motilität und die Integrität der Plasmamembran und des Akrosoms boviner Spermien vor und nach der Kryokonservierung untersucht.

3.4.1 Effekte von EPC Liposomen auf die Spermaqualität vor und nach dem Tiefgefrieren

Im Rahmen dieses Vorversuchs wurden die Effekte von EPC Liposomen mit einem Durchmesser von 100 nm in den Konzentrationen 0,2 mg, 0,4 mg, 2,0 mg und 4,0 mg je Milliliter TRIS-GLY-Verdünner auf die Spermaqualität getestet.

Von fünf Bullen der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover wurden hierzu neun Ejakulate gewonnen, verdünnt und 6 bzw. 24 Stunden bei 4 °C vor dem Tiefgefrieren inkubiert. Der prozentuale Anteil plasmamembran- und akrosomintakter (PMAI) Spermien wurden nach dem Verdünnungsprozess sowie nach 6 bzw. 24 Stunden Äquilibrierung und nach dem Auftauen bestimmt (Abb. 3.4).

(38)

PMAI- und PMOT-Messung: 1. 2. 3. 4.

Äquilibrierung in Stunden: 0 6 24 Nach dem Auftauen 4 °C Kühltemperatur Tiefgefrierung

PMAI- und PMOT-Messung: 1. 2. 3. 4.

Äquilibrierung in Stunden: 0 6 24 Nach dem Auftauen 4 °C Kühltemperatur Tiefgefrierung

Abb. 3.5: Schematische Darstellung der zeitlichen Abfolge der Bestimmungen der Plasmamembran und Akrosomintegrität (PMAI) und der progressiven Motilität (PMOT) im Rahmen der Prüfung der Effekte verschiedener Konzentrationen von EPC Liposomen auf die Spermaqualität.

3.4.2 Effekte von Liposomen aus ungesättigten Fettsäuren mit unter- schiedlichen Kopfgruppen auf die Spermaqualität

Die Untersuchungen wurden an je vier Ejakulaten von sechs Bullen der Besamungs- bullenstation Neustadt a. d. Aisch e.V. (BVN) durchgeführt. Die Ejakulate wurden in Kontrollverdünnern mit bzw. ohne Eigelb und Liposomenverdünnern mit EPC bzw.

DOPC und DOPC, DOPS, DOPG oder DOPE Lipiden verdünnt (Abb. 3.6 und 3.7).

Die Zusammensetzung der verwendeten Kontroll- und Liposomenverdünner ist im Anhang aufgeführt (Tabelle 11.1 und 11.2).

(39)

24 Ejakulate von 6 Bullen je Versuchsserie

TRIS-Liposomenansätze TRIS-

Kontrollansätze Versuchs-

serie

DSPC DPPC

DMPC DLPC

- EY + EY

3

DOPC:

DOPE DOPC:

DOPG DOPC:

DOPS DOPC:

- EY DOPC + EY

2

+ EY - EY EPC:

DOPE EPC:

DOPG EPC:

DOPS EPC:

1 DOPC

24 Ejakulate von 6 Bullen je Versuchsserie

TRIS-Liposomenansätze TRIS-

Kontrollansätze Versuchs-

serie

DSPC DPPC

DMPC DLPC

- EY + EY

3

DOPC:

DOPE DOPC:

DOPG DOPC:

DOPS DOPC:

- EY DOPC + EY

2

+ EY - EY EPC:

DOPE EPC:

DOPG EPC:

DOPS EPC:

1 DOPC

Abb. 3.6: Schematische Darstellung der Aufteilung der Ejakulate in Kontroll- (mit (+ EY) und ohne Eigelb (- EY)) und Testverdünner mit Liposomen aus gesättigten (DLPC, DMPC, DPPC oder DSPC) und ungesättigten (EPC/DOPC:DOPX) Lipiden in einer Konzentration von 2 mg/ml Verdünner. PX steht für PC, PS, PG oder PE. Dazu ist die zeitliche Abfolge der Bestimmungen der Plasmamembran und Akrosomintegrität (PMAI) und der progressiven Motilität (PMOT) dargestellt.

PMAI- und PMOT- Messung: 1. 2. 3.

Äquilibrierung in Stunden: 0 24 Nach dem Auftauen 4 °C Kühltemperatur Tiefgefrierung

PMAI- und PMOT- Messung: 1. 2. 3.

Äquilibrierung in Stunden: 0 24 Nach dem Auftauen 4 °C Kühltemperatur Tiefgefrierung

Abb. 3.7: Schematische Darstellung der zeitlichen Abfolge der Bestimmungen der Plasmamembran- und Akrosomintegrität (PMAI) und der progressiven Motilität (PMOT).

3.4.3 Effekte synthetischer Liposomen aus gesättigten Fettsäuren auf die Spermaqualität.

Das Versuchsdesign entsprach grundsätzlich dem unter 3.4.2 beschriebenen Ansatz.

(40)

Liposomenverdünnern mit DLPC, DMPC, DPPC oder DSPC Lipiden verdünnt (Abb.

3.6 und 3.7). Die Zusammensetzung der verwendeten Kontroll- und Liposomen- verdünner ist im Anhang aufgeführt (Tabelle 11.1 und 11.3).

Bei der Herstellung von Liposomen aus DLPC, DPPC und DSPC Lipiden wurde die LMV-Suspension durch eine 200 nm Membran gefiltert. Um Unterschiede in der Wirkung verschiedener Liposomengrößen auf den Anteil plasmamembran- und akrosomintakter (PMAI) sowie progressiv motiler (PMOT) Spermien festzustellen, wurden DMPC Lipide durch eine 100 sowie 200 nm Polycarbonatmembran geformt.

3.4.4 Statistische Auswertung

Die Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms Microsoft®

Excel® 2003 (Microsoft Corporation, USA) und des Statistikprogramms Statview Version 5.0 (SAS Institute Inc., Cary, MC, USA). Die graphische Darstellung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm Microsoft® Excel 2003. Die PMOT- und PMAI-Daten wurden durch den Mittelwert und die Standardabweichung beschrieben.

Alle Merkmale wurden mit dem Shapiro-Wilk-Test auf eine Normalverteilung hin überprüft. Die Untersuchung auf Unterschiede innerhalb der Verdünnergruppen und der Messzeitpunkte geschah mittels ANOVA-Test. Zur Klärung der Frage, ob die Verdünner einen Einfluss auf die Ausprägung der Parameter zu den einzelnen Untersuchungszeitpunkten hatten, wurde der Fisher`s PLSD-Test durchgeführt. Die Prüfung ob nach fortgeschrittener Lagerung eine Veränderung der prozentualen Anteile von PMOT- und PMAI-Spermien vorlag, erfolgte ebenfalls mit dem Fisher`s PLSD-Test. Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 wurden als signifikant bezeichnet.

(41)

ERGEBNISSE

4 ERGEBNISSE

4.1 Effekte unterschiedlicher Konzentrationen von EPC Liposomen und Äquilibrierungszeiten auf die Spermaqualität

In Abbildung 4.1 ist der Effekt des TRIS-GLY-Verdünners mit unterschiedlichen Konzentrationen von EPC Liposomen vor und nach dem Tiefgefrieren auf den Anteil plasmamembran- und akrosomintakter Spermien (PMAI) dargestellt.

Die PMAI-Werte der Spermien waren unmittelbar nach der Verdünnung am höchsten und nach dem Einfrieren und Auftauen der Spermien am niedrigsten. Es waren keine Unterschiede in den PMAI-Werten zwischen den Spermien nach einer 6- bzw 24- stündigen Äquilibrierung festzustellen. Nach dem Auftauen bei vorhergehender 6- stündiger Lagerung vor dem Tiefgefrieren, wurden PMAI-Werte von 14,2 ± 4,2% im Verdünner ohne Zusatz von Liposomen, 33,0 ± 8,2% bei einer Konzentration von 2,0 mg/ml und 39,0 ± 6,9% bei einer Konzentration von 4,0 mg/ml ermittelt. Bei einer Äquilibrierungsdauer von 24 Stunden wurde ein PMAI-Wert von 16,3 ± 4,9% im Verdünner ohne Zusatz von Liposomen ermittelt, im Vergleich zu PMAI-Werten von 40,5 ± 7,5% und 38,9 ± 8,4% bei EPC Konzentrationen von 2,0 bzw. 4,0 mg/ml. Dies bedeutet, dass bei einer 24-stündigen Äquilibrierung in TRIS-GLY-Verdünner die PMAI-Werte der Spermien nach dem Auftauen ab einer Liposomenkonzentration von 2,0 mg/ml Höchstwerte erreichten.

(42)

ERGEBNISSE

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

EPC Konzentration (mg/ml) in TRIS + GLY Verdünner

PMAI (%)

0h bei RT

6h bei 4°C

24h bei 4°C

6h bei 4°C, aufgetaut

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

EPC Konzentration (mg/ml) in TRIS + GLY Verdünner

PMAI (%)

0h bei RT

6h bei 4°C

24h bei 4°C

Abb. 4.1: Prozentualer Anteil plasmamembran- und akrosomintakter Spermien (PMAI) in TRIS-GLY-Verdünner in Abhängigkeit von der EPC-Konzen- tration. Die PMAI-Werte wurden vor dem Einfrieren unmittelbar nach dem Verdünnen bei Raumtemperatur (0 h bei RT), nach 6 Stunden (6 h bei 4 °C) und 24 Stunden Äquilibrierung (24 h bei 4 °C) sowie nach dem Einfrieren und Auftauen (6 h / 24 h bei 4 °C, aufgetaut) untersucht. Es sind Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt (n = 9 Ejakulate von 5 Bullen).

(43)

ERGEBNISSE

In Abbildung 4.2 sind die Effekte verschiedener Äquilibrierungszeiten bei 4 °C bei Verwendung verschiedener TRIS-GLY-Verdünner (mit Eigelb, ohne Eingelb, mit 2,0 mg/ml EPC) auf die PMAI-Werte vor und nach dem Tiefgefrieren dargestellt.

Im TRIS-GLY-Verdünner ohne Zusätze von Eidotter bzw. Liposomen war der Anteil an PMAI-Spermien bereits nach der Äquilibrierung deutlich abgefallen (p < 0,05). Vor dem Einfrieren war bei keinem der Verdünner ein Effekt der unterschiedlichen Äquilibrierungsdauer auf die PMAI-Werte festzustellen (p > 0,05). Dagegen hatte die Veränderung der Äquilibrierungsdauer von 6 auf 24 Stunden bei allen Verdünnern nach dem Einfrieren und Auftauen positive Auswirkungen auf die PMAI-Werte (p < 0,05).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

TRIS + EY + GLY TRIS - EY + GLY TRIS + 2,0 mg/ml EPC + GLY

PMAI (%)

0h bei RT 6h bei 4°C 24h bei 4°C

6h bei 4°C, aufgetaut (0h) 24h bei 4°C, aufgetaut (0h) 6h bei 4°C, aufgetaut (3h) 24h bei 4°C, aufgetaut (3h)

*

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

TRIS + EY + GLY TRIS - EY + GLY TRIS + 2,0 mg/ml EPC + GLY

PMAI (%)

0h bei RT 6h bei 4°C 24h bei 4°C

6h bei 4°C, aufgetaut (0h) 24h bei 4°C, aufgetaut (0h) 6h bei 4°C, aufgetaut (3h) 24h bei 4°C, aufgetaut (3h)

*

Abb. 4.2: Plasmamembran- und akrosomintakte (PMAI) Spermien nach Verdün- nung in TRIS-GLY-Verdünner mit und ohne Zusatz von Eigelb (EY) bzw. 2,0 mg/ml EPC Liposomen. Die Analysen erfolgten unmittelbar nach dem Verdünnen (0 h bei RT), nach 6 Stunden Äquilibrierung (6 h bei 4 °C), nach 24 Stunden Äquilibrierung (24 h bei 4 °C), unmittelbar nach dem Auftauen (6 h / 24 h bei 4 °C, aufgetaut) und nach dreistündiger Inkubation bei 37 °C (6 h / 24 h bei 4 °C, aufgetaut (3 h)).

Es sind Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. (n = 9 Ejakulate von 5 Bullen). Eine zwei Werte miteinander verbindende Klammer mit einem * zeigt einen signifikanten Unterschied (p < 0,05).

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ERGEBNISSE

4.2 Effekte von Liposomen aus EPC und Fettsäuren mit unterschiedlichen Kopfgruppen auf die Spermaqualität

Um zu untersuchen, ob der Zusatz von Lipiden mit anderen Kopfgruppen als EPC die Überlebensfähigkeit der Spermien verbessert, wurden EPC Liposomen mit DOPX Lipiden (PX steht für PC, PS, PG oder PE) hergestellt. In Abbildung 4.3 sind die Anteile plasmamembran- und akrosomintakter (PMAI; A) sowie progressiv motiler (PMOT; B) Spermien nach Verdünnung mit TRIS-GLY-Verdünnern mit bzw. ohne Eigelb oder EPC:DOPX Liposomen dargestellt.

Zu allen Untersuchungszeitpunkte zeigten die Spermien, die mit dem herkömmlichen TRIS-GLY-Verdünner mit Eigelb versetzt wurden, die höchsten (p < 0,05) und die Spermien, die mit dem herkömmlichen TRIS-GLY-Verdünner konserviert worden waren, die niedrigsten (p < 0,05) PMAI- und PMOT-Werte. Von den Spermien, denen Liposomen-Verdünner zugegeben wurden, wiesen nach der Äquilibrierung und nach dem Auftauen diejenigen die höchsten (p < 0,05) PMAI- und PMOT-Werte auf, bei denen EPC:DOPG Liposomen zur Herstelllung des Verdünners verwendet worden waren.