Identifizierung eines intramolekularen Chaperons in der intestinalen Laktase-Phlorizin Hydrolase
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N Zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Karen Peters aus Kamp-Lintfort
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H. Y. Naim
1. Gutachter: Prof. Dr. H.Y.Naim 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. B. Tümmler
Tag der mündlichen Prüfung 04. Juni 2002
Meinen Eltern und Daniel
2.2 Proteinfaltung in der Zelle __________________________________________ 13 2.3 Molekulare Chaperone und Qualitätskontrolle im Endoplasmatischen
Retikulum________________________________________________________ 14 2.4 Propeptide als intramolekulare Chaperone bei der Proteinfaltung_________ 16 2.5 Glykosylierung von Proteinen _______________________________________ 17 2.6 Gerichteter Proteintransport in polarisierten Epithelzellen_______________ 18 2.7 Laktase-Phlorizin Hydrolase (LPH), ein in der apikalen
Bürstensaummembran lokalisiertes Dünndarmenzym ___________________ 20 2.8 Expression der LPH _______________________________________________ 21 2.9 Strukturelle Eigenschaften der humanen LPH _________________________ 23 2.10 Biosynthese der Laktase-Phlorizin Hydrolase __________________________ 25 3 Material und Methoden _________________________________________________ 29 3.1 Material _________________________________________________________ 29
3.1.1 Chemikalien __________________________________________________ 29 3.1.2 Enzyme ______________________________________________________ 30 3.1.3 Zellkulturutensilien _____________________________________________ 30 3.1.4 Plasmide _____________________________________________________ 31 3.1.5 Reagenzien für die PCR _________________________________________ 33 3.1.6 Oligonukleotide________________________________________________ 33 3.1.7 Bakterienstämme_______________________________________________ 33 3.1.8 Medien für Bakterien ___________________________________________ 34 3.1.9 Zelllinien _____________________________________________________ 34 3.1.10 Kulturmedien für Zelllinien ______________________________________ 35 3.1.11 Molekulargewichtsstandard ______________________________________ 35 3.1.12 Antikörper ____________________________________________________ 36 3.2 Methoden ________________________________________________________ 37
3.2.1 Transformation von Escherichia coli _______________________________ 37 3.2.2 Plasmid-DNA-Präparation aus E. coli ______________________________ 37 3.2.3 Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration ________________________ 37 3.2.4 Restriktion der DNA ____________________________________________ 38 3.2.5 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten__________________________ 38 3.2.6 Auffüllung überhängender DNA-Enden zu glatten Enden _______________ 38 3.2.7 Ligation der DNA-Fragmente _____________________________________ 39 3.2.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) _________________________________ 39 3.2.9 Auftrennung von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese____________ 40 3.2.10 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ___________________ 40
3.2.15 Selektion stabil transfizierter Zellen ________________________________ 43 3.2.16 Radioaktive Markierung von Proteinen _____________________________ 43 3.2.17 Lyse der Zellen und Immunpräzipitation der Proteine __________________ 44 3.2.18 Endo H- und Endo F/FG-Behandlung_______________________________ 44 3.2.19 Trypsin-Behandlung ____________________________________________ 44 3.2.20 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese _____________________________ 45 3.2.21 Bestimmung der Laktaseaktivität __________________________________ 45 3.2.22 Beobachtung des Proteintransportes in vivo__________________________ 46 4 Ergebnisse____________________________________________________________ 47 4.1 Expression von LPHβinitial und LPHα in trans__________________________ 47 4.1.1 Konstruktion von pIRESα/β______________________________________ 47 4.1.2 Transfektion von COS-1 Zellen mit pIRES-LPHα/β___________________ 48 4.1.3 Kotransfektion von COS-1 Zellen mit pcDNA3-LPHα und
pJB20-LPHβinitial______________________________________________ 50 4.1.4 Faltungsanalyse der LPHβinitial durch Trypsinbehandlung _______________ 52 4.1.5 Messung der Enzymaktivität______________________________________ 55 4.2 Prozessierung von LPHβinitial in CHO-Zellen mit und ohne Einwirkung der Proregion ________________________________________________________ 56
4.2.1 Herstellung einer stabil LPHα exprimierenden CHO-Zelllinie ___________ 56 4.2.2 Herstellung einer stabil LPHβinitial exprimierenden CHO-Zelllinie ________ 57 4.2.3 Die Biosynthese von LPHβinitial in CHO-LPHβinitial-Zellen ______________ 58 4.2.4 Kotransfektion von CHO-LPHβinitial mit LPHα _______________________ 58 4.3 Lokalisation und Transport in lebenden COS-1 Zellen __________________ 61 4.3.1 Konstruktion von pLPHα-YFP ____________________________________ 61 4.3.2 Expression von LPHα-YFP in COS-1 Zellen_________________________ 63 4.3.3 Konfokale Analyse der Koexpression von LPHα-YFP und
LPHβinitial-CFP in COS-1 Zellen ___________________________________ 64
4.4 Transport von LPHβinitial-YFP in MDCK-Zellen________________________ 66 4.4.1 Herstellung einer Zelllinie mit stabiler LPHβinitial-YFP-Expression________ 66 4.4.2 Biosynthese von LPHβinitial-YFP in MDCK-LPHβinitial-YFP _____________ 66 4.4.3 Lokalisation von LPHβinitial-YFP in MDCK–LPHβinitial-YFP-Zellen in vivo_ 68 5 Diskussion____________________________________________________________ 70 5.1 Einfluss des Profragmentes LPHα auf die Faltung von LPHβinitial _________ 70 5.2 Prozessierung der LPHβinitial-Untereinheit in lebenden Zellen_____________ 73 6 Zusammenfassung _____________________________________________________ 77 7 Summary_____________________________________________________________ 79
9.1.2 Puffer für DNA-Arbeiten _______________________________________ 104 9.1.3 Puffer für Protein-Biochemische Arbeiten __________________________ 105 9.2 Abbildungsverzeichnis ____________________________________________ 107 9.3 Tabellenverzeichnis_______________________________________________ 109
al. alii, andere
amp Ampicillin
APS Ammoniumperoxydisulfat
ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaare
C Cytosin (bei der Angabe von Nukleotidsequenzen)
°C Grad Celsius
cDNA complementary DNA, komplementäre DNA
Ci Curie
CMV Cytomegalie-Virus
dATP Desoxyadenosintriphosphat
dCTP Desoxycytidintriphosphat
dGTP Desoxyguanosintriphosphat
dTTP Desoxytymidintriphosphat
DEAE Diethylaminoethyl
DMEM Dulbecco’s Modifiziertes Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA deoxyribonucleinacid, Desoxyribonukleinsäure
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz Endo H Endo-β-N-acetylglucosaminidase H aus Streptomyces Endo F/FG Endo-β-N-acetylglucosaminidase F/N-Glucosidase F
ER Endoplasmatisches Retikulum
FKS fetales Kälberserum
G Guanin (bei der Angabe von Nukleotidsequenzen)
g Gramm
h hora, Stunde
l Liter
LPH Laktase-Phlorizin Hydrolase
LPHα rekombinantes Konstrukt der Proregion der LPH
LPHβinitial rekombinantes Konstrukt der LPH ohne das Profragment
LPHβfinal rekombinantes Konstrukt der reifen Form der LPH
M Molar
mA Milliampere
MEM Modifiziertes Eagle Medium
min. Minuten
ml Milliliter
mRNA messenger RNA
MW molecular weight, Molekulargewicht
neo Neomycin
„ori“ origin of replication, Replikationsursprung
PBS phosphate buffered saline,Phosphat gepufferte Salzlösung
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PNGase F N-Glukosidase F (Peptide-N4-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl)- asparagin-amidase von Flavobacterium meningosepticum) Pro-LPH Vorläufermolekül der Laktase
RNA ribonucleinacid, Ribonukleinsäure RNAse Ribonuklease
rpm rounds per minute, Umdrehungen pro Minute sec. Sekunde
SDS sodiumdodecylsulfat, Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
SV40 Simian Virus 40
T Thymin (bei der Angabe von Nukleotidsequenzen)
TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
V Volt
1 Einleitung
Für einen Organismus ist die Funktion der einzelnen Organsysteme zum Überleben unerlässlich. Hierbei unterscheiden sich die verschiedenen Organe durch bestimmte Zellarten, die je nach Aufgabe verschiedene Proteine exprimieren. Innerhalb der zell- und molekularbiologischen Forschung stellt die Aufklärung der Prozesse beim intrazellulären Proteintransport ein wichtiges Gebiet dar. Während des Transportes durchlaufen Proteine bzw. ihre Vorstufen verschiedene Kompartimente der Zelle, in denen unterschiedliche Kontrollmechanismen lokalisiert sind, die über den weiteren Transport des Moleküls entscheiden. Liegt bei der Faltung, dem Transport oder der Sortierung dieser Proteine ein Defekt vor, so kann das zu verschiedenen Erkrankungen führen, deren Symptomatik in ihrem Ausmaß stark differiert. Die congenitale Saccharase-Isomaltase Defizienz (CSID), bei der sowohl Transportblockaden als auch Veränderungen in der Sortierung der SI vorliegen können, weist relativ milde Symptome wie osmotische Diarrhöe durch im Darmlumen vorhandene, ungespaltene Disaccharide auf. Bei Morbus Gaucher hingegen kann der Defekt der β-Glykosylcerebrosidase bis zum Tode führen. Zur Aufklärung der Faltungs-, Transport- und Sortiermechanismen auf biochemischer Ebene werden daher verschiedene Modellproteine verwendet.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Transport und speziell mit der Faltung der humanen Laktase-Phlorizin-Hydrolase (hLPH), bei der es sich um ein Membranprotein handelt. Diese beiden Vorgänge werden anhand von molekular- und zellbiologischen Analysen unter Betrachtung unterschiedlicher Proteindomänen innerhalb des Proteins und in verschiedenen Säugetierzellsystemen untersucht.
2 Literaturübersicht
2.1 Proteinbiosynthese von Membranproteinen und Prozessierung in der Zelle
Die Proteinbiosynthese von Membranproteinen beginnt an freien Ribosomen innerhalb des Zytoplasmas. Aufgrund einer kurzen und typischerweise N-terminal lokalisierten Signalsequenz von 16 bis 30 Aminosäuren, in der 6 bis 12 hydrophobe Aminosäuren einer oder mehreren positiv geladenen Aminosäure folgen, werden die Ribosomen zur Membran des rauen Endoplasmatischen Retikulums (rER) geleitet, durch die das wachsende Peptid in das Lumen gelangt. Der hydrophobe Kern der Signalsequenz bildet eine Bindungsstelle für den zytosolischen „signal recognition particle“ (SRP), der wiederum auch an die große ribosomale Einheit und an den SRP-Rezeptor der ER-Membran bindet (GILMORE 1993).
Hierdurch wird der Transfer der Ribosomen zusammen mit dem Peptid zum Translocon initiiert. Bei dem Translocon handelt es sich um ein Transmembranprotein aus verschiedenen Untereinheiten, welches einen Kanal ausbildet, der sich durch Bindung von Ribosomen öffnet, (MATLACK et al. 1998). Durch diesen Kanal gelangt die wachsende Peptidkette in das Lumen des ER. Hier wird die Signalsequenz durch eine Signalpeptidase abgespalten und degradiert (DALBEY u. VON HEIJNE 1992). Handelt es sich bei den synthetisierten Proteinen um integrale Membranproteine, so können diese auf unterschiedliche Weise in der Membran verankert werden. Man unterscheidet hierbei die Verankerung über einen in den Phospholipid-Bilayer eingebetteten Glykosylphosphatidylinositol-Anker (GPI-Anker) (ENGLUND 1993), über eine oder über mehrere Transmembrandomänen. Viele integrale Membranproteine haben nur eine einzige membranüberspannende Domäne, die durch eine Sequenz von 20 bis 25 hydrophoben Aminosäuren eine α-helicale Struktur ausbildet, über die das Protein in der Membran verankert wird. Diese topogene Sequenz ist auch für die richtige Orientierung der Membranproteine verantwortlich. Bei einigen dieser Proteine, den Typ-II- Membranproteinen mit intrazellulärem N-Terminus und luminalem C-Terminus wie z.B.
Saccharase-Isomaltase, ist die ER-Signalsequenz mit der Transmembrandomäne identisch und wird somit nicht abgespalten. Das C-terminale Ende des Proteins gelangt erst nach abgeschlossener Biosynthese in das ER-Lumen. Typ-I-Membranproteine wie die LPH haben
die entgegengesetzte Orientierung, also einen intrazellulären C-Terminus und einen extrazellulären N-Terminus. Bei ihrer Biosynthese gelangt der N-Terminus durch das Translocon in das ER-Lumen, die Signalsequenz wird abgespalten und die Peptidkette verlängert. Die Transmembrandomäne verbleibt nach ihrer Synthese im Translocon und die Assoziation zwischen Ribosomen und Translocon wird aufgehoben, so dass die Proteinsynthese im Zytosol beendet wird. Ko- und posttranslational durchlaufen die Proteine auch noch verschiedene andere Modifikationen, wie Disulfidbrückenbildung, Faltung, proteolytische Spaltung und Assemblierung von Untereinheiten bei multimeren Proteinen.
Glykoproteine erhalten zusätzlich noch Kohlenhydratketten, die ebenfalls einer Prozessierung unterliegen.
2.2 Proteinfaltung in der Zelle
Damit ein Protein seine volle Funktionsfähigkeit erlangt, muss es korrekt gefaltet sein.
Obwohl die Struktur vieler Proteine bereits bekannt ist, konnte der Weg zum fertigen Protein bisher nur teilweise geklärt werden. In vitro-Versuche haben gezeigt, dass einige kleine Polypeptide mit nur einer Domäne und auch einige komplexere Proteine sich nach Denaturierung wieder korrekt falten können (ANFINSEN 1973). Diese Versuche spiegeln allerdings nicht die Realität wieder, da für andere Proteine, wie IgG (BERGMAN u. KUEHL 1979), Serum-Albumin (PETERS, Jr. u. DAVIDSON 1982), Influenza-Hämagglutinin (HA) (BRAAKMAN et al. 1992b; BRAAKMAN et al. 1992a) und die Luziferase der Feuerfliege (KOLB et al. 1994) gezeigt werden konnte, dass die Faltung und Disulfidbrückenbildung bereits kotranslational während der Proteinbiosynthese stattfindet.
Die Disulfidbrücken, die in vielen sekretorischen und membrangebundenen Proteinen zu finden sind, können hierbei sowohl innerhalb als auch zwischen Polypeptidketten ausgebildet werden. Dieser Vorgang läuft im ER ab, das ein ausreichend oxidativ wirkendes Milieu besitzt und in dem das für diesen Prozess notwendige Enzym, die Proteindisulfidisomerase (PDI), lokalisiert ist (BULLEID u. FREEDMAN 1988; FREEDMAN 1989). Die Ausbildung der Disulfidbrücken ist häufig für die Funktion und Stabilität der gefalteten Proteine, deren Reifung und intrazellulären Transport notwendig.
Auch die Faltungsprozesse laufen überwiegend im ER ab (GETHING u. SAMBROOK 1992).
Die Polypeptidketten werden hierbei so angeordnet, dass hydrophobe Domänen wasserlöslicher Proteine sich im Kern befinden, während die hydrophilen Abschnitte zur Oberfläche hin ausgerichtet sind. Während der Faltung bilden die Polypeptide verschiedene Zwischenprodukte, mit hydrophoberer Oberfläche als das Endprodukt (GETHING u.
SAMBROOK 1992), die zu stabilen Sekundärstrukturen führen, aus denen durch räumliche Anordnung die durch Disulfidbrücken stabilisierte Tertiärstruktur entsteht. Bei einigen Proteinen entsteht durch die Zusammenlagerung – die sogenannte Assemblierung - von mehreren Polypeptiden, die identisch und/oder unterschiedlich sein können, ein oligomerer Proteinkomplex, dessen Anordnung als Quartärstruktur bezeichnet wird.
2.3 Molekulare Chaperone und Qualitätskontrolle im Endoplasmatischen Retikulum
Auf dem Weg zu ihrem Bestimmungsort durchlaufen sekretorische Proteine und Plasmamembranproteine das ER, die Zisternen des Golgi-Apparates, das trans-Golgi- Netzwerk (TGN) und schließlich Transportvesikel, durch die sie an die Plasmamembran gelangen (GRIFFITHS u. SIMONS 1986). Können die Proteine auf diesem Weg nicht richtig gefaltet oder assembliert werden, so werden sie im ER zurückgehalten und eventuell degradiert (HURTLEY u. HELENIUS 1989).
Wie bereits erwähnt, können einige Proteine auch nach einer Denaturierung in vitro in Abwesenheit von anderen Proteinen renaturiert werden (ANFINSEN 1973). Die Faltung in vitro verläuft allerdings nicht so effizient und es sind Proteinkonzentrationen und physikochemische Bedingungen notwendig, die sich von denen innerhalb der Zelle deutlich unterscheiden (GETHING u. SAMBROOK 1992). Die Effizienz der Faltung in vivo wird dadurch bedingt, dass die Polypeptidkette bereits kotranslational modifiziert werden kann (GETHING u. SAMBROOK 1992). Es konnten außerdem verschiedenen zelluläre Proteine identifiziert werden, die sogenannten molekularen Chaperone, welche vorübergehend an die entstehenden Polypeptidketten oder partiell gefaltete Zwischenprodukte binden und hierdurch
falsche Faltung, Aggregation und vorzeitige Assemblierung verhindern (ELLIS u.
HEMMINGSEN 1989).
Wichtige ER-Chaperone sind hierbei BiP (grp78), Calnexin und Calreticulin. Beim ersteren handelt es sich um ein Protein aus der Familie der 70kDa-„heat shock“-Proteine (hsp70) mit einem Molekulargewicht von 78 kDa. Es wurde in Säugerzellen ursprünglich unabhängig voneinander als „immunglobulin heavy chain binding protein (HAAS u. WABL 1983;
MORRISON u. SCHARFF 1975) und „glucose-regulated protein“ (grp78) (POUYSSEGUR u. YAMADA 1978) beschrieben. Es wird unter normalen Wachstumsbedingungen konstitutiv synthetisiert und macht ungefähr 5 % des luminalen Anteils an ER-Proteinen aus. Die Synthese wird durch die Akkumulation von Proteinvorläufern (NORMINGTON et al. 1989) oder mutanten Proteinen (KOZUTSUMI et al. 1988) im ER induziert. Die Substratbindungsstelle von BiP interagiert mit einer Sequenz aus fünf aufeinanderfolgenden AS in komplett ausgestreckter Konformation (WANG et al. 1998; ZHU et al. 1996). Obwohl keine hohe Sequenzspezifität vorliegt (BLOND-ELGUINDI et al. 1993; FLYNN et al. 1989;
RUDIGER et al. 1997), werden Peptide mit zwei bis vier hydrophoben AS im Zentrum favorisiert (RUDIGER et al. 1997).
Calnexin, ein integrales Membranprotein von ungefähr 60 kDa, ist hingegen ein Glykoprotein-spezifisches ER-Chaperon (OU et al. 1993), dessen lösliches Analog durch Calreticulin vertreten wird (PETERSON et al. 1995). Beide wurden zunächst als molekulare Chaperone beschrieben, da sie transient mit vielen neu synthetisierten Glykoproteinen assoziieren. Später konnte aber gezeigt werden, dass der entscheidende Faktor für die Bindung der Glykoproteine die Struktur der Kohlenhydratseitenketten und nicht die des Polypeptids ist (RODAN et al. 1996; ZAPUN et al. 1999), so dass die beiden Proteine genauer als ER-Lektine beschrieben werden können (TROMBETTA u. HELENIUS 1998;
ZAPUN et al. 1999).
Sie sind Bestandteil des Qualitätskontrollsystems im ER, das die Faltung der Proteine überprüft (HAMMOND et al. 1994; HAMMOND u. HELENIUS 1994; HELENIUS et al.
1997). Fast alle im ER synthetisierten Proteine werden glykosyliert und die angefügten Oligosaccharide enthalten einen Ast mit drei Glukoseresten, von denen zunächst zwei im ER- Lumen durch die Glukosidase I und II abgespalten werden. Das daraus entstandene monoglukosylierte Protein wird dann von Calnexin und Calreticulin, die bei der
Proteinfaltung helfen und eine Aggregation verhindern, erkannt und gebunden (HEBERT et al. 1997; VASSILAKOS et al. 1996). Die beiden Lektine bilden einen Komplex mit ERp57, bei dem es sich um eine Proteindisulfidisomerase handelt, so dass die Ausbildung nativer Disulfidbrücken gefördert wird (ZAPUN et al. 1998). Nach der Abspaltung des letzten Glukoserestes durch die Glukosidase II wird das Glykoprotein wieder freigegeben.
Zum Qualitätskontrollsystem gehört auch die UDP-Glukose:Glykoprotein- Glukosyltransferase (GT), welche spezifisch nur Proteindomänen mit nicht nativer Konformation erkennt (RITTER u. HELENIUS 2000). Falls das von den Lektinen dissoziierte Protein noch immer nicht oder falsch gefaltet ist, so wird es von der GT reglukosyliert, so dass eine erneute Bindung an Calnexin und Calreticulin möglich ist. Ein Glykoprotein kann mehrere solcher Faltungszyklen durchlaufen, bis es entweder die korrekte Faltung erlangt und weitertransportiert wird (GANAN et al. 1991) oder ins Zytosol gelangt, wo nach Deglykosylierung und Ubiquitinylierung die Degradierung im Proteasom stattfindet (PLEMPER u. WOLF 1999).
2.4 Propeptide als intramolekulare Chaperone bei der Proteinfaltung
Einige Proteine werden als Vorläufer, sogenannte Pre-Pro-Proteine, synthetisiert. Außer dem Prepeptid, das der Signalsequenz des Proteins entspricht, enthalten diese Vorläufermoleküle an ihrem N-Terminus noch ein Propeptid, welches während oder nach der Reifung des Proteins abgespalten wird. Häufig ist diese Abspaltung für die Aktivierung des Proteins notwendig (BARR 1991), wie anhand von Zymogen (GORELICK u. JAMIESON 1987), Neuropeptiden und Prohormonen (STEINER et al. 1984) gezeigt werden konnte.
Die Untersuchung des aus Bacillus subtilis isolierten Subtilisin E, einer alkalischen Serinprotease, hat aber gezeigt, dass ein Propeptid auch in einem intramolekularen Prozess die Faltung des Vorläufermoleküls regulieren und unterstützen kann. Das Propeptid aus 77 Aminosäuren ist für die Faltung der übrigen 275 Aminosäuren zum reifen und aktiven Protein entscheidend, da reifes Subtilisin E nach Denaturierung nur in Anwesenheit des Propeptids renaturiert werden kann (ZHU et al. 1989). Anhand dieser und weiterer Ergebnisse wurde das Konzept des intramolekularen Chaperons (IMC) formuliert (INOUYE 1991). Ein intramolekulares Chaperon ist im Unterschied zum molekularen Chaperon ein Bestandteil des
Proteins selbst, für das es hochspezifisch ist, und das nach der Faltung durch Autoprozessierung oder andere Endopeptidasen abgespalten wird. Es funktioniert nicht als Katalysator, sondern ein IMC kann nur ein Peptid bei der Faltung unterstützen. Inzwischen konnte auch bei verschiedenen anderen Proteinen gezeigt werden, dass das Propeptid die Funktion eines IMCs erfüllt, hierzu zählen auch die α-lytische Protease (SILEN u. AGARD 1989), Aqualysin (LEE et al. 1992) Thermolysin (MARIE-CLAIRE et al. 1998), Membran- Typ-I-Matrixmetalloproteinase (CAO et al. 2000) und Cathepsin C (CIGIC et al. 2000).
Bei den beiden Proteinen α-lytische Protease (BAKER et al. 1992) und Subtilisin E (EDER et al. 1993) konnte gezeigt werden, dass das Protein in vitro ein Zwischenprodukt bildet, das sich in einem „molten globule“-ähnlichen Zustand befindet und erst durch Zugabe des Propeptids zum aktiven Enzym wird. In vitro verläuft die Faltung des Proteins sequentiell, das Propeptid wird zuerst gefaltet und kann dann die Faltung der Protease-Domäne katalysieren (ANDERSON et al. 1999). Dieses Modell ist auch auf die Faltung in vivo zu übertragen, da sich die einzelnen Domänen bereits kotranslational falten können, wie man es bereits für IgG (BERGMAN u. KUEHL 1979), Serum-Albumin (PETERS, Jr. u. DAVIDSON 1982), Influenza-Hämagglutinin (HA) (BRAAKMAN et al. 1992a; BRAAKMAN et al. 1992b) und die Luziferase der Feuerfliege (KOLB et al. 1994) zeigen konnte.
2.5 Glykosylierung von Proteinen
Bei den meisten sekretorischen und membrangebundenen Proteinen handelt es sich um Glykoproteine. Bei diesen Proteinen werden im rER und in den verschiedenen Abteilungen des Golgi-Apparates Zuckerreste an Hydroxyl- oder Aminogruppen, also O- oder N- glykosidisch, gebunden und prozessiert. Bei der O-Glykosylierung werden nur ein bis vier Zuckerreste einzeln durch verschiedene Glykosyltransferasen auf ein Serin, Threonin oder Hydroxylysin des Proteins übertragen, während bei der N-Glykosylierung zunächst im rER eine ganze Kohlenhydratkette von einem Dolichol auf die Aminosäure Asparagin in der Sequenz Asn-X-Thr/Ser (ABEIJON u. HIRSCHBERG 1992) übertragen wird. Dieser Kette werden dann im Golgi-Apparat weitere Zuckerreste hinzugefügt oder entfernt (KORNFELD u. KORNFELD 1985). Aufgrund der verschiedenen Modifikationen, denen die N-
glykosidisch gebundenen Zuckerketten unterliegen, unterscheidet man hierbei die mannosereich glykosylierte und die komplex glykosylierte Form eines Glykoproteins. Bei dem mannosereich glykosylierten Protein handelt es sich um die Form, die sich im ER befindet und hauptsächlich Mannosereste enthält. Hier wird auch durch die GT der Glukoserest an falsch oder nicht gefaltete Proteine wieder angehängt, der für die Qualitätskontrolle entscheidend ist. Im Golgi-Apparat werden dann Zuckerreste abgespalten und hinzugefügt, so dass eine Zuckerkette mit unterschiedlichen Zuckerresten entsteht, deren Molekulargewicht höher liegt als das der Kette im ER, wodurch eine Unterscheidung der beiden Formen in der SDS-PAGE möglich ist. Die Glykosylierung von Proteinen hat verschiedene Funktionen, so dient sie einerseits dem Schutz vor einem proteolytischen Abbau der Proteine, andererseits ist die Aktivität mancher Hormone und Enzyme davon abhängig.
Auch eine Wechselwirkung mit Lektinen wird dadurch ermöglicht (RODAN et al. 1996;
ZAPUN et al. 1997), die einerseits für die Faltung und die Qualitätskontrolle und andererseits auch für die Wanderung und Verteilung bestimmter Zellen im Organismus wie z.B.
Lymphozyten von Bedeutung ist (COLOMBO et al. 1973; KOBATA 1992; SCHLEGEL- HAUETER et al. 1972; SKOVBJERG et al. 1981).
2.6 Gerichteter Proteintransport in polarisierten Epithelzellen
Innerhalb eines Epithels bilden die hieran beteiligten Zellen eine polare Struktur aus. Die durch „tight junctions“ voneinander getrennten Domänen, welche man in eine zum Lumen des jeweiligen Organs ausgerichtete apikale und eine an die Basalmembran oder andere Zellen grenzende basolaterale Membran unterteilt, unterscheiden sich deutlich in ihrer Lipid- und Proteinzusammensetzung (CAPLAN et al. 1987; MASSEY-HARROCHE 2000;
SIMONS u. WANDINGER-NESS 1990).
Die Ausbildung und Erhaltung dieser asymmetrischen Zelloberfläche ist für die physiologischen Funktionen der Zelle, wie Signalübermittlung, Absorption oder Sekretion von essentieller Bedeutung.
Zur Aufklärung der für die Sortierung verantwortlichen Mechanismen werden verschiedene Modellproteine verwendet. Anhand dieser Studien wurden ein direkter und ein indirekter Weg
über die andere Membrandomäne der vom trans-Golgi-Netzwerk (TGN) abgeschnürten Transportvesikel identifiziert (BURDICK et al. 1996).
Bei Proteinen, die über einen GPI-Membrananker in der Plasmamembran der Zelle inserieren, stellt dieser gleichzeitig das Sortiersignal dar (LISANTI et al. 1989; LISANTI u.
RODRIGUEZ-BOULAN 1990). Bei den meisten Epithelzellen handelt es sich hierbei um eine Sortierung nach apikal, wohingegen Proteine mit GPI-Membrananker in Schilddrüsenzellen nach basolateral transportiert werden.
Für den Transport zur basolateralen Oberfläche der Zelle, konnten Signale innerhalb des zytoplasmatischen Anteils basolateral sortierter Proteine nachgewiesen werden (BREWER u.
ROTH 1991; CASANOVA et al. 1991; MATTER et al. 1992). Aufgrund von Ähnlichkeiten zwischen Signalen, welche die Endozytose vermitteln und denen für eine basolaterale Sortierung, wird eine Verbindung dieser Vorgänge vermutet (LE GALL et al. 1995).
Die Deletion der zytoplasmatischen Domäne eines Proteins führt nicht zu einer zufälligen Verteilung sondern zum apikalen Transport, was die Existenz von apikalen Sortiersignalen in der Transmembrandomäne oder dem extrazellulären Anteil des Proteins vermuten lässt. Ein Erkennungssignal für die apikale Sortierung könnten die O-Glykane in der Stabregion von membranverankerten Proteinen darstellen, da für die Saccharase-Isomaltase gezeigt werden konnte, dass nur die Anwesenheit dieser Region und des Membranankers zur richtigen Sortierung des Enzyms führen (JACOB et al. 2000a).
Obwohl nach Deletion basolateraler Signale bei ursprünglich basolateralen Proteinen eine Sortierung nach apikal erfolgt (BREWER u. ROTH 1991; CASANOVA et al. 1991;
MATTER et al. 1992), sind diese nicht grundsätzlich dominant über apikale Sortiersignale, wie anhand von Fusionsversuchen der LPH mit verschiedenen basolateral sortierten Mutanten der zytoplasmatischen Domäne des Influenza Hämagglutinins (HA), einem apikalen Protein, gezeigt werden konnte (JACOB et al. 1999).
Auch die Sortierung von Proteinen in vivo wird zurzeit durch die Erstellung von Fusionsproteinen mit verschiedenen Farbvarianten des Reportergens GFP intensiv untersucht.
So konnte gezeigt werden, dass apikal sortierte Proteine verschiedene Transportmechanismen verwenden, da das Fusionsprotein der Saccharase-Isomaltase innerhalb der Transportvesikel an Mikrodomänen bindet, während die LPH dieses Verhalten nicht zeigt (JACOB u. NAIM 2001).
2.7 Laktase-Phlorizin Hydrolase (LPH), ein in der apikalen Bürstensaummembran lokalisiertes Dünndarmenzym
Zur Aufklärung molekularer Mechanismen des intrazellulären Proteintransportes, der Proteinfaltung und der Beteiligung verschiedener Proteindomänen daran werden verschiedene Glykoproteine der apikalen Bürstensaummembran von Dünndarmepithelzellen als Modellproteine verwendet. Hierzu zählt auch die Laktase-Phlorizin Hydrolase (LPH), die zusammen mit der Saccharase-Isomaltase, der Maltase-Glykoamylase und der Trehalase die Gruppe der intestinalen Disaccharidasen bildet.
Bei der LPH handelt es sich um ein integrales Membranprotein, das in der apikalen Bürstensaummembran von Dünndarmenterozyten lokalisiert ist. Das unter den Säugetieren fast ubiquitär vorkommende Enzym besitzt zwei verschiedene hydrolytische Aktivitäten (COLOMBO et al. 1973; SCHLEGEL-HAUETER et al. 1972; SKOVBJERG et al. 1981):
Die Laktase (β-D-Galaktosid-Galaktohydrolase) spaltet das Disaccharid Laktose zu den Monosacchariden Glukose und Galaktose, während die Phlorizin Hydrolase (Glykosyl-N- Acylsphingosin-Glukohydrolase), die sich auf der gleichen Polypeptidkette befindet wie die Laktase (MANTEI et al. 1988), β-Glykosylceramide, die in der Nahrung der meisten Vertebraten zu finden sind, hydrolysiert. Die katalytisch aktiven Zentren der LPH konnten durch den Einsatz eines Inhibitors, der kovalent an Glutamatreste bindet, lokalisiert werden, wobei die Laktase-Aktivität bei Glutamat1273 und die Phlorizin Hydrolase-Aktivität bei Glutamat1749 (WACKER et al. 1992) liegt.
Laktose wird in der Milchdrüse fast aller Säugetiere, mit Ausnahme der Seelöwen (KRETCHMER u. SUNSHINE 1967) während der Trächtigkeit und Laktation als organspezifisches Sekret des Golgi-Apparates synthetisiert und kommt nur hier als freies Molekül vor. Der Laktosegehalt der Milch unterscheidet sich bei den unterschiedlichen Spezies erheblich und weist beim Menschen mit 7 % den höchsten Anteil auf. Die Laktose kann nicht als ungespaltenes Molekül resorbiert werden, sondern muss zunächst in ihre Monosaccharidbestandteile Glukose und Galaktose zerlegt werden, um in den Enterozyten zu gelangen. Bleibt die Hydrolyse aus, so übt die Laktose eine osmotische Wirkung im Dünndarmlumen aus, im Dickdarm erfolgt dann durch die bakterielle Darmflora der Abbau
zu CO2, H2 und kurzkettigen Fettsäuren (Butyrat, Propionat, Laktat und Acetat), was zu Übelkeit, Krämpfen und Diarrhöe führen kann (PHILLIPS 1980) .
Aufgrund der im Gegensatz zu anderen Disaccharidasen bedeutend niedrigeren Laktase- Aktivität stellt nicht die Resorption, sondern die Hydrolyse den limitierenden Faktor bei der Laktoseverdauung dar (HENNING 1987). Die Resorption der hydrolytischen Spaltprodukte Glukose und Galaktose erfolgt über einen für Galaktose hochspezifischen, membrangebundenen und energieabhängigen Glukose/Galaktose-Transporter (GRAY 1981).
Bei der primären Monosaccharid-Malabsorption, einer autosomal-rezessiv vererbten Erkrankung fehlt dieser (MEEUWISSE u. LINDQUIST 1970), so dass postnatal innerhalb weniger Tage hochgradige Diarrhöen einsetzen (WALKER-SMITH u. MILLA 1984).
2.8 Expression der LPH
Die Aktivität der Laktase ist während der Saugphase eines Tieres besonders hoch, da die Laktose für die meisten Jungtiere das einzige Nahrungskohlenhydrat von Bedeutung darstellt.
Bei ausschließlicher Ernährung mit Milch zeigen die Expression und die Aktivität der LPH ein Verlaufsmuster, das in zeitlichem Zusammenhang mit der Geburt und der Säugezeit steht.
So konnte gezeigt werden, dass Rattenembryonen am Ende der Trächtigkeitsperiode eine hohe Laktase-Aktivität aufweisen, die zum Geburtstermin oder kurz darauf das Maximum erreicht und nach dem Absetzen auf einen niedrigen Wert abfällt, der dann lebenslang konstant bleibt (DOELL u. KRETCHMER 1962). Andere intestinale Disaccharidasen, wie die Saccharase-Isomaltase oder die Maltase-Glykoamylase unterscheiden sich hierin deutlich von der Laktase, da sie während der Saugphase eine niedrige Aktivität zeigen, die erst beim erwachsenen Individuum ihr Maximum erreicht, das lebenslang erhalten bleibt (DOELL u.
KRETCHMER 1962).
Die Aktivitätsänderungen der Laktase können auf alle Säugetiere übertragen werden (FLATZ 1987; HENNING 1981) und auch der Großteil der Menschen weist einen abrupten Abfall der Laktase-Aktivität während der Kindheit auf einen minimalen Wert auf (LEBENTHAL 1975;
SIMOONS et al. 1977). Kaukasier, deren Nachkommen und einige isolierte afrikanische Stämme bilden allerdings eine Ausnahme von diesem Expressionsmuster, da hier kein
Rückgang der Laktase-Aktivität stattfindet, sondern zeitlebens ein hohes Niveau bestehen bleibt (SCRIMSHAW u. MURRAY 1988; WELSH et al. 1978).
Es wurden zwei verschiedene Hypothesen über die Ursache für die unterschiedliche Aktivität der Laktase bei erwachsenen Menschen aufgestellt. Zum einen wurde eine Substratabhängigkeit des Expressionsniveaus vermutet, was die niedrige Laktase-Aktivität in Gebieten mit Laktose-armer oder –freier Ernährung, wie Asien und Afrika erklären würde (BOLIN u. DAVIS 1970). Da die Laktaseaktivität durch regelmäßige Milchzuckergaben weder bei Tieren noch beim Menschen induziert werden konnte (FLATZ 1987), wurde diese Annahme zugunsten der Theorie über die genetische Determination wiederlegt. Die Hypothese, dass der Laktase-Defizienz oder Hypolactasia die Existenz eines autosomal- rezessiven Gens zugrunde liegt (FLATZ 1987), wurde durch eine Familienstudie über das Vererbungsmuster der Hypolactasie bestätigt (SAHI et al. 1973). Hierin konnte gezeigt werden, dass die Laktase-Persistenz mit hohem Aktivitätsniveau im Erwachsenenalter autosomal-dominant vererbt wird, wohingegen die bei adulten Säugern und den meisten Menschen auftretende Laktase-Defizienz eine autosomal-rezessive Form des gleichen Genlocus darstellt (SAHI et al. 1973).
Die Regulationsmechanismen der adulten Hypolactasie sind noch nicht vollständig aufgeklärt.
Die Feststellung, dass die LPH sich bei Laktase-defizienten Patienten nicht von dem Protein bei Menschen mit Laktase-Persistenz unterscheidet (POTTER et al. 1985), erbrachte einen Hinweis auf die Expressionsregulation über quantitative Mechanismen.
Die gleichzeitig mit hoher Laktase-mRNA-Expression auftretende hohe spezifische Laktaseaktivität in humanen Dünndarmbiopsien ließen eine Regulierung auf der Transkriptionsebene vermuten (MONTGOMERY et al. 1991). Mittlerweile konnte gezeigt werden, dass die Expression der LPH hauptsächlich auf der Ebene der Transkription reguliert wird, wie es auch bei der Saccharase-Isomaltase der Fall ist (HECHT et al. 1997;
TROELSEN et al. 1994).
Durch Untersuchungen des porcinen LPH-Gen konnte die Bindungsstelle für einen Transkriptionsfaktor, den intestinalen Kernfaktor (NF-LPH1), innerhalb einer konservierten Promotorsequenz identifiziert und die Korrelation der altersabhängigen Konzentration dieses Faktors mit der Laktase-Aktivität des Individuums gezeigt werden (TROELSEN et al. 1992).
Die Erniedrigung der Genexpression des β-Globins des Kaninchens durch Koppelung der
porcinen LPH-Promotorsequenz mit der cDNA des β-Globingens ist ein weiterer Hinweis auf die transkriptionelle Regulation der LPH.
Auch für Glukokortikoide konnte ein Einfluss auf die Laktase-Aktivität nachgewiesen werden. Bei Ratten kommt es während der ersten Lebenswochen durch ihre Verabreichung zu einer Erhöhung der Enzymaktivität der LPH und auch die humane LPH wird über Glukokortikoide reguliert (FREUND et al. 1991; YEH et al. 1991). Die Identifizierung von Glukokortikoid-empfindlichen Elementen innerhalb der 5’-flankierenden Region des Gens ist bislang aber nicht gelungen.
Bei der adulten Hypolactasia ist aber auch eine post-translationale Regulation in Erwägung zu ziehen, da bei adulten Kaninchen die Verminderung der Laktase-Aktivität nicht mit einer Reduktion der mRNA-Konzentration korreliert ist (SEBASTIO et al. 1989). Als Ursache hierfür kommt möglicherweise eine verzögerte proteolytische Spaltung der Pro-LPH zur reifen Form des Enzyms in Frage, so dass noch innerhalb des Golgi-Apparates die Degradation des Proteins anstelle des Transportes zur Zelloberfläche stattfindet (STERCHI et al. 1990).
Die Glykosylierung der LPH scheint die posttranslationale Regulation der enzymatischen Aktivität ebenfalls zu beeinflussen. In der apikalen Membran von Enterozyten konnten zwei verschiedene Formen der LPH detektiert werden, die sich sowohl durch ihr Glykosylierungsmuster als auch durch die enzymatische Aktivität des Moleküls voneinander unterscheiden: eine ausschließlich N-glykosylierte Form und das fast viermal so aktive sowohl N- als auch O-glykosylierte Protein (NAIM u. LENTZE 1992).
2.9 Strukturelle Eigenschaften der humanen LPH
Das Gen der humanen LPH ist auf dem Chromosom 2 lokalisiert (KRUSE et al. 1988) und setzt sich aus 17 Exons zusammen (BOLL et al. 1991). Die 5’-flankierende Region des humanen und des Rattengens beinhaltet potentielle Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren CTF/NF-1 und AP2 (TROELSEN et al. 1994). Die LPH-cDNA umfasst 6274 Nukleotide und kodiert für die 1927 Aminosäuren umfassende Pre-Pro-LPH (MANTEI et al. 1988), die sich aus unterschiedlichen Proteindomänen zusammensetzt. Das Translationsprodukt beginnt aminoterminal mit einem Signalpeptid aus 19 Aminosäuren (SS,
Met1-Gly19), das für die Translokation der wachsenden Peptidkette ins Lumen des ER verantwortlich ist und hier abgespalten wird (VON HEIJNE 1986). Daran anschließend befindet sich die Ektodomäne des Proteins (Ser20-Thr1882), die aus der LPH-Prodomäne (LPH α, Ser20-Arg734) und LPHβinitial (Leu735-Thr1882) besteht, letzteres wird durch luminale Trypsinspaltung zu LPHβfinal (Ala869-Thr1882) (JACOB et al. 1996; WUTHRICH et al. 1996).
Der Ektodomäne folgt die hydrophobe Membranankersequenz aus 19 AS (MA, Ala1883- Leu1901), die das Protein in der Lipiddoppelschicht befestigt (MANTEI et al. 1988). Das C- terminale Ende wird dann durch einen hydrophilen zytoplasmatischen Bereich aus 26 Aminosäuren gebildet (CT, Ser1902-Phe1927). Aufgrund des extrazellulär gelegenen N- Terminus und des intrazellulär lokalisierten C-Terminus zählt die LPH zu den Typ-I- Membranproteinen (BLOBEL 1980), während andere Disaccharidasen wie die Saccharase- Isomaltase (HUNZIKER et al. 1986; SEMENZA 1979) und die Maltase-Glukoamylase (NOREN et al. 1986) aufgrund der entgegengesetzten Orientierung zu den Typ-II- Membranproteinen gezählt werden.
Bei der LPH handelt es sich um ein stark glykosyliertes Membranprotein, das beim Menschen und der Ratte 15 potentielle N-Glykosylierungsstellen enthält.
Die Laktase-Aktivität ist am Glutamin1273 lokalisiert, während die der Phlorizin Hydrolase sich bei Glutamin1749 befindet (NEELE et al. 1995; WACKER et al. 1992; ZECCA et al.
1998).
Die Pro-LPH kann in vier hochkonservierte strukturelle und funktionelle Regionen unterteilt werden (Region I-IV), die eine Homologie von 38-55 % aufweisen, so dass zwei aufeinanderfolgende evolutionäre Genduplikationen anzunehmen sind (MANTEI et al. 1988).
Diese Vermutung wird durch die Sequenzähnlichkeiten zwischen den einzelnen Regionen der LPH und prokaryontischen β-Glukosidasen und β-Galaktosidasen und die Größe der prokaryontischen Enzyme, die mit ca. 50 kDa einer Region bzw. einem Viertel der gesamten LPH entsprechen, unterstützt.
Pro-LPH
I. Arg734/Leu735 II.Arg868/Ala869
SS LPHα Profragment MA CT
LPHβinitial, 160 kDa LPHβfinal, 145 kDa
C N
Abb. 1: Schematische Darstellung der Pro-LPH in humanen Dünndarmzellen.
Die Spaltungsstellen sind durch Pfeile gekennzeichnet. I. Intrazelluläre Abspaltung des Profragmentes LPHα. II. Extrazelluläre Spaltung von LPHβinitial zu LPHβfinal im intestinalen Lumen durch das Pankreasenzym Trypsin.
2.10 Biosynthese der Laktase-Phlorizin Hydrolase
Die LPH ist ein Protein, das im Dünndarm synthetisiert wird. In diesem befinden sich hauptsächlich Enterozyten, bei denen es sich um Zellen handelt, die ein einschichtiges, hochprismatisches Epithel ausbilden. Eine charakteristische Eigenschaft ist hierbei die ausgeprägte Polarität der Zellen, welche durch „tight junctions“ in eine apikale und eine basolaterale Oberfläche unterteilt werden, deren Protein- und Lipidzusammensetzung sich deutlich voneinander unterscheidet (SIMONS u. WANDINGER-NESS 1990).
Die Biosynthese der LPH wurde schon in verschiedenen Spezies untersucht, und der posttranslationale Weg und die Prozessierung konnten so aufgeklärt werden (BULLER et al.
1987; DANIELSEN et al. 1984; NAIM et al. 1987). LPH wird in den Dünndarmepithelzellen als 215-kDa-Pro-LPH-Vorläufer synthetisiert, welcher ein mannosereich N-glykosyliertes Einzelkettenmolekül darstellt (Pro-LPHh) (NAIM 1992). Innerhalb der Aminosäuresequenz
dieses Peptids befinden sich 15 potentielle N-Glykosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr), an die bereits kotranslationell Zuckerketten angefügt werden. Vor dem Weitertransport aus dem ER in den Golgi-Apparat werden nach erfolgter Faltung zwei gleiche monomere Polypeptidketten zu einem Homodimer zusammengelagert, wobei die Transmembrandomänen direkt in die Dimerisierung einbezogen sind (NAIM u. NAIM 1996), wie durch fehlende Assemblierung entsprechender Deletionsmutanten gezeigt werden konnte. Bleibt die Zusammenlagerung zu Dimeren aus, so werden die Monomere im ER zurückgehalten und degradiert, und die LPH erlangt zudem keine enzymatische Aktivität (NAIM u. NAIM 1996). Im Golgi-Apparat erfolgt die Modifikation der N-glykosidisch gebundenen Zuckerketten, wodurch die komplex glykosylierte Form des Proteins (Pro-LPHc) mit einem Molekulargewicht von 230 kDa entsteht (HAURI et al. 1985; NAIM et al. 1991). Zusätzlich erfolgt in diesem Kompartiment auch die O-Glykosylierung an mehreren Serin- und Threonin-Resten, wodurch die Hydrolyse der Laktose durch die LPH beschleunigt wird (NAIM u. LENTZE 1992).
Die weitere Prozessierung des Proteins wird durch zwei proteolytische Spaltungsschritte charakterisiert (JACOB et al. 1996; WUTHRICH et al. 1996). Die erste Spaltung erfolgt intrazellulär an der dibasischen Sequenz Arg734-Leu735 und führt zur Entfernung des Profragmentes LPHα, wodurch das membrangebundene 160-kDa-Intermediat LPHβinitial
entsteht. Diese Form wird zur Zelloberfläche transportiert, wo es durch das im Darmlumen befindliche, pankreatische Trypsin zwischen Arg868 und Ala869 zu der reifen 145-kDa-Form LPHβfinal gespalten wird (NAIM et al. 1991).
Die Expression der LPH cDNA in COS-1 Zellen führt zu einem Pro-LPH-Polypeptid, das ungespalten an die Zelloberfläche transportiert wird und die gleichen enzymatischen Eigenschaften aufweist wie die gespaltene, reife Form. Diese Ergebnisse zeigen, dass es sich bei der Abspaltung des Profragmentes der LPH nicht um eine Aktivierung des Enzyms handelt, wie sie bei manchen als Pre-Pro-Form synthetisierten Proteinen, wie Zymogenen (GORELICK u. JAMIESO 1987), Neuropeptiden und Prohormonen (STEINER et al. 1984) notwendig ist.
COOH NH2
COOH NH2
NH2
COOH
Pro-LPH LPHβinitial LPHβfinal
Profragment LPHα
ER/Cis-Golgi TGN Darmlumen
Arg734
Leu735
Arg869
Ala869
Abb. 2: Schematische Darstellung der Biosynthese der LPH.
Nach Translokation der entstehenden Peptidkette zum ER und Abspaltung der Signalsequenz, erfolgt hier die mannosereiche N-Glykosylierung der Pro-LPH. Nach dem Transport ins Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) erfolgt durch komplexe Glykosylierung und Abspaltung des Profragmentes LPHα zwischen Arg734 und Leu735 die Prozessierung des Proteins zu
LPHβinitial. An der Oberfläche des Enterozyten entsteht schließlich das reife Enzym LPHβfinal
aufgrund der Spaltung des Proteins zwischen Arg868 und Ala869 durch das im Darmlumen vorhandene, pankreatische Trypsin.
Aufgrund des hohen Anteils des Profragmentes an der gesamten Pro-LPH (ca. 45 %), muss eine wichtige Rolle für LPHα angenommen werden. Die signifikante Homologie zur reifen
LPHβfinal führte zunächst zu der Annahme, dass es sich bei LPHα ebenfalls um eine
Glukosidase handelt, die jedoch in ein anderes Zellkompartiment transportiert wird (MANTEI et al. 1988). Durch die identische enzymatische Aktivität von Pro-LPH und LPHβfinal (NAIM et al. 1991) und die Identifizierung der katalytisch aktiven Zentren an den Glutamatresten Glu1271 und Glu1747 (WACKER et al. 1992) wurde diese Annahme aber widerlegt.
Trotz fünf potentieller N-Glykosylierungsstellen weist das Profragment LPHα weder eine N- noch O-Glykosylierung auf. Es besitzt einen hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren, so
dass es dazu neigt, direkt nach der Translation eine kompakte, rigide und Trypsin-resistente Konformation einzunehmen, wodurch die Glykosylierungsstellen vermutlich im inneren des Moleküls liegen und so nicht für Glykosyltransferasen erreichbar sind (NAIM et al. 1994).
Die alleinige Expression der für die reife LPHβfinal kodierenden cDNA in COS-1 Zellen erzeugt ein Protein, dessen Transportkompetenz geringer ist als die des Wildtyps und das zudem keine detektierbare enzymatische Aktivität aufweist (NAIM et al. 1994;
OBERHOLZER et al. 1993).
Die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen zeigen, dass LPHα nur im Zusammenhang mit der Faltung der Pro-LPH zum reifen Enzym von Bedeutung ist und daher vermutlich die Rolle eines intramolekularen Chaperons einnimmt, wie es für die Proregionen verschiedener anderer Proteine wie Subtilisin E (ZHU et al. 1989), α-lytische Protease (SILEN u. AGARD 1989), Aqualysin (LEE et al. 1992) gezeigt werden konnte
Ziel dieser Dissertation war es, die Wechselwirkung zwischen der Proregion LPHα und
LPHβinitial während des Faltungsvorgangs und somit die Bedeutung von LPHα für die Faltung
und die Funktion zu klären. Verschiedene Versuche konnten zeigen, dass durch Expression der beiden Untereinheiten der LPH in trans, also als voneinander unabhängige Proteine, ein größerer Anteil des Proteins komplex glykosyliert wird und somit besser gefaltet ist und zu einem höheren Anteil weitertransportiert wird. Die bessere Faltung konnte auch durch die erhöhte Trypsinresistenz der LPHβinitial-Untereinheit unter dem Einfluss des Profragmentes gezeigt werden.
Die kaum vorhandene enzymatische Aktivität von LPHβinitial in Abwesenheit der Proregion wurde durch Koexpression in trans mit LPHα deutlich gesteigert.
Durch die Konstruktion von Fusionsproteinen der Untereinheiten mit unterschiedlichen Varianten des Reportergens GFP konnte der Transport der verschiedenen Untereinheiten der LPH in vivo untersucht werden. Durch Transfektion der cDNA dieser Konstrukte konnte sowohl in transient transfizierten COS-1 Zellen als auch in stabil exprimierenden MDCK- Zellen eine Verbesserung des Transportes unter dem Einfluss der Proregion gezeigt werden.
3 Material und Methoden
3.1 Material
Die verwendeten Utensilien aus Kunststoff und verschiedene Lösungen wurden vor dem Gebrauch autoklaviert. Glaskolben, Glaspipetten, Reagenzgläser und Pasteurpipetten wurden sterilisiert.
3.1.1 Chemikalien
Acrylamid rotiphorese Gel 30 (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) Agarose, Elektrophoresegrad (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) Ampicillin (D[-]-α-Aminobenzylpenicillin) (Sigma, Deysenhofen)
APS (Ammoniumperoxydisulfat) (Merck, Darmstadt)
Bacto Tryptone (DIFCO Laboratories, Detroit, USA) Bacto Yeast Extract (DIFCO Laboratories, Detroit, USA)
Bacto Agar (DIFCO Laboratories, Detroit, USA)
Bromphenolblau (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg)
Chloroform (Sigma, Deysenhofen)
Chloroquin (Sigma, Deysenhofen)
Coomassie Brillant Blue (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg)
DEAE-Dextran (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)
DTT (Dithiothreitol) (Merck, Darmstadt)
Ethidiumbromid (Merck, Darmstadt)
FKS (fetales Kälberserum) (Sigma, Deysenhofen)
Geniticin (G 418) (Gibco Life Technologies, Eggenstein) Gluco-quant Glukose/HK (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)
Glycerol (Carl Roth GmbH, Karlsruhe)
Kanamycin (Sigma, Deysenhofen)
L-[35S]-Methionin (> 1000 Ci/mmol) (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) Phenol/Chloroform für DNA-Aufreinigung (Carl Roth GmbH, Karlsruhe)
PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)
Polybren (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)
Protein-A-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) SDS (Natriumdodecylsulfat) (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) Sojabohnen-Trypsininhibitor (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylendiamin) (Carl Roth GmbH, Karlsruhe)
Triton X-100 (Merck, Darmstadt)
Trypsin (Sigma, Deysenhofen)
Trypsin-EDTA (0,5 g/l Trypsin, 0,2 g/l EDTA) (Gibco Life Technologies, Eggenstein)
3.1.2 Enzyme
Restriktionsenzyme 1 U/µl
Klenow-Fragment (DNA Polymerase I Large Fragment) 10 U/µl Alkalische Phophatase aus Kälberdarm 1 U/µl
T4-DNA-Ligase 5 U/µl
(MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot)
Endo-β-acetylglucosaminidase H (Endo H) 500 U/µl Endo-β-N-acetylglucosaminidase F/N-Glucosidase F (Endo F/FG) 500 U/µl
(New England Biolabs, Frankfurt)
3.1.3 Zellkulturutensilien
Zellkulturschalen, Falcon Tubes und Einmalpipetten wurden von Greiner, Hamburg bezogen.
3.1.4 Plasmide
pIRESneo
(Clontech Laboratories Inc., Heidelberg/Deutschland)
Hierbei handelt es sich um einen Vektor, der die Synthese einer bicistronischen mRNA erlaubt (JANG et al. 1988; REES et al. 1996).
pcDNA3-LPHα
Das Plasmid enthält die Nukleotide 1 bis 2220 der LPH cDNA, die dem Profragment LPHα einschließlich der Signalsequenz entsprechen und über die Restriktionsschnittstellen EcoRI und XbaI in den Vektor pcDNA3 (Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe) eingefügt wurden (JACOB et al. 2002).
XbaI
SmaI ScaI
HindIIIKpnI Asp718EcoRI
LPHα
Sp6-prom BGH polyA
SV40-prom NeoR
SV40 polyA AmpR
CMV-prom T7-prom
pJB20-LPHβinitial
Der Expressionsvektor pJB20 wurde durch Einfügen einer EcoRI-Schnittstelle in pCB6 erzeugt (BREWER u. ROTH 1991). Das Plasmid pJB20-LPHβinitial enthält die mit der Signalsequenz der LPH fusionierte, für LPHβinitial kodierende cDNA, die über EcoRI inseriert wurde. 1
1 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Dr. Ralf Jacob, Hannover am 08. November 2001
Abb. 3: pcDNA3 LPHα, 7621 bps.
Die 2,2 kb große, für LPHα codierende cDNA wurde in die Klonierungsregion des Expressions- vektors pcDNA3 eingefügt.
EcoRI,
EcoRV HindIII
ScaI
EcoRI LPH
LPHβinitial
NeoR AmpR
CMV-Promotor
pECFP-N1, pEYFP-N1, pDsRED1-N1
(Clontech Laboratories Inc., Heidelberg/Deutschland)
Aufgrund der Erzeugung eines Fusionsproteins aus dem Protein von Interesse und einer Variante des aus der Qualle Aequorea victoria isolierten Green Fluorescent Protein (GFP), wird die Untersuchung des Proteintransportes in vivo ermöglicht.
pLPHβinitial-YFP
Durch eine PCR mit dem Plasmid pJB20-LPHβinitial wurden an die für LPHβinitial kodierende cDNA neue Schnittstellen angefügt, so dass die Ligation mit dem Vektor pEYFP-N1 die Synthese eines Fusionsproteins ermöglicht. Die DNA wurde über die Schnittstellen EcoRI und ScaI in den Vektor eingefügt.2 Diese Strategie wurde bereits für die Fusion der für die gesamte LPH kodierenden cDNA mit dem Reportergen verwendet (JACOB et al. 2000b;
JACOB u. NAIM 2001).
2 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Dr. Ralf Jacob, Hannover am 15. November 2001
Abb. 4: Schematische Darstellung des Plasmids pJB20-LPHβinitial, 9946 bps Die für LPHβinitial codierende cDNA wurde in die Klonierungsregion des Expressionsvektors pJB20 in der richtigen Orientierung inseriert.
3.1.5 Reagenzien für die PCR
dNTPs
25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP Taq-DNA-Polymerase
10 U/µl (Eppendorf, Hamburg).
3.1.6 Oligonukleotide
LPHalphaSalI
5’-CCT CGT CGA CCT CCT TAT CCC CCA GGG-3’ (MWG Biotech AG, Ebersberg) 100 pM, für PCR verdünnt auf 25 pM
LPH1HindIII
5’-AAA AGC TTC CTA GAA AAT GGA GCT G-3’ (MWG Biotech AG, Ebersberg) 100 pM, für PCR verdünnt auf 25 pM
3.1.7 Bakterienstämme
E.coli TOP 10:
F-mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74recA1 deoR araD139 ∆(ara- leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
E.coli TOP 10F´:
F- {lacIqTn10 (TetR)} mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74recA1 deoR araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
3.1.8 Medien für Bakterien
Vollmedium (Luria-Bertani Medium)
10 g/l Bacto Trypton, 5 g/l Bacto Hefeextrakt, 10 g/l NaCl
Durch die Zugabe von 15 g/l Bacto Agar zum flüssigen Nährmedium wurden feste Nährböden hergestellt.
Zur Selektion transformierter Bakterienzellen wurde dem Medium bzw. dem festen Nährboden 100 µg/ml Ampicillin oder 50 µg/ml Kanamycin zugesetzt.
3.1.9 Zelllinien
COS-1-Zellen
(American Type Culture Collection; Rockeville, USA)
COS-1-Zellen sind fibroblastenähnliche, unpolare Zellen, die durch Transformation von CV-1 Nierenzellen der Affenart Cercopithecus aethiops mit einer „origin“-defekten Mutante des SV 40-Virus, die das Wildtyp T-Antigen enthält, hergestellt wurden (GLUZMAN 1981).
MDCK-II-Zellen
(American Type Culture Collection; Rockeville, USA)
Bei dieser Zelllinie handelt es sich um Nierenepithelzellen, die in der Zellkultur eine
„Monolayer“-schicht aus polarisierten Zellen ausbilden (RICHARDSON et al. 1981). Sie wurden von S.H. Madin und N.B. Darby aus einem adulten weiblichen Cockerspaniel isoliert.
CHO-Zellen
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig)
Bei CHO-Zellen handelt es sich um fibroblastenähnliche, unpolare Zellen, die 1957 aus dem Ovar eines adulten chinesischen Hamsters isoliert wurden (PUCK et al. 1958).
3.1.10 Kulturmedien für Zelllinien
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)
1000 mg/l Glukose, 10 % fetales Kälberserum (FKS), 872 mg/l L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (von Gibco Life Technologies, Eggenstein/Deutschland, FKS von Sigma, Deysenhofen/Deutschland).
Minimum Essential Medium (MEM) ohne Methionin
1000 mg/l Glucose, 292 µg/ml L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (alle Produkte von Gibco Life Technologies, Eggenstein/Deutschland).
RPMI-Medium 1640
10 % FKS, 292 µg/ml L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (von Gibco Life Technologies, Eggenstein/Deutschland, FKS von Sigma, Deysenhofen/Deutschland).
3.1.11 Molekulargewichtsstandard
DNA-Standard
(MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
Die λ-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut, wodurch die folgenden Fragmente entstehen (in bp): 21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564, 125.
Proteinstandard
(High Molecular Weight Standard Mixture for SDS Gel Electrophoresis; Sigma, Deysenhofen/Deutschland)
Protein Molekulargewicht in kDa
Myosin, Kaninchenmuskel 205
β-Galaktosidase, E.coli 116 Phosphorylase B, Kaninchenmuskel 97,4
Albumin, Rind 66
Albumin, Huhn 45
Carboanhydrase, bovine Erythrozyten 29
3.1.12 Antikörper
Die Immunpräzipitation wurde mit den Antikörpern mAb anti-LPH, mLac 2, mLac 8 und V496 durchgeführt. Bei den ersten drei Antikörpern handelt es sich um monoklonale Mausantikörper gegen die humane Laktase-Phlorizin Hydrolase, die freundlicherweise von Prof. H.-P. Hauri (Biozentrum, Abteilung Pharmakologie/Neurobiologie, Universität Basel, Schweiz) und Dr. D. Swallow (The Galton Laboratory, University College, London, Großbritannien) zur Verfügung gestellt wurden. Der Antikörper HBB 1/909/34/74 (Mab anti- LPH) (HAURI et al. 1985) erkennt native Formen der mannosereich und der komplex glykosylierten LPH, mLac 2 und mLac 8 detektieren ebenfalls das native Laktase-Polypeptid (MAIURI et al. 1991).
Bei V496 handelt es sich um einen polyklonalen Kaninchen-Antikörper, der gegen die zwölf Aminosäurereste, die der Signalpeptid-Spaltungsstelle der Pro-LPH folgen, gerichtet ist (NAIM et al. 1994).
Für die Immunpräzipitation wurden 0,3 µl Mab anti-LPH Ascites-Flüssigkeit (HBB 1/909/34/74) und 0,2 µl der Zellkultur-Überstände mLac2 und mLac 8 beziehungsweise 0,5 µl V496 verwendet.
3.2 Methoden
3.2.1 Transformation von Escherichia coli
Die Transformation von E. coli wurde durch Hitzeschock der Bakterienzellen durchgeführt (HANAHAN 1983).
Hierfür wurden 4 µl des Ligationsansatzes zu 50 µl Bakteriensuspension gegeben und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wurden die Bakterien für 90 Sekunden auf 42°C erhitzt und erneut für 2-3 Minuten auf Eis gestellt. Nachfolgend wurden die transformierten Bakterien mit 200 µl LB-Medium versetzt, 1 Stunde bei 37°C im Schüttler inkubiert, auf festem Nährboden mit Antibiotikum ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
3.2.2 Plasmid-DNA-Präparation aus E. coli
Zur Isolierung der Plasmid-DNA aus transformierten Bakterien wurde die modifizierte Methode der alkalischen Lyse verwendet (BIRNBOIM u. DOLY 1979).
Für die Präparation geringer DNA-Mengen zur Untersuchung von Bakterienkolonien auf positive Klone wurden 3-ml-Kulturen angelegt, von denen die Hälfte für die DNA-Isolierung verwendet wurde. Zur Präparation größerer Mengen des Plasmides wurden Kulturen mit einem Volumen von 100 ml verwendet.
3.2.3 Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration
Die Menge der DNA konnte durch den Vergleich einer Probe mit bekannter DNA- Konzentration im Agarosegel grob abgeschätzt werden.
Zur genauen Bestimmung der DNA-Konzentration wird die Absorption der Lösung bei 260 nm im Spektralphotometer bestimmt (SAMBROOK et al. 1989).
Bei hochmolekularer DNA entspricht die optische Dichte (OD) von 1 einer Konzentration von 50 µg/ml
Durch Berechnung des Verhältnisses der Absorption der DNA-Lösung bei 260 nm zu der bei 280 nm kann die Reinheit der Lösung bestimmt werden, wobei bei einer sauber präparierten DNA das Verhältnis ≥ 1,8 sein sollte.
3.2.4 Restriktion der DNA
Für die sequenzspezifische Restriktion der DNA wurde 1 U Restriktionsenzym für 1 µg Plasmid-DNA verwendet. Der Ansatz wurde bei der vom Hersteller empfohlenen enzymspezifischen Temperatur für 1 Stunde inkubiert. Bei gleichzeitiger Inkubation mit zwei verschiedenen Enzymen wurde die Zeit auf 1,5 Stunden verlängert. Die Restriktion erfolgte im Normalfall mit dem MBI-Puffersystem, nur bei problematischen Enzymkombinationen wurde das Puffersystem von Roche verwendet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim).
3.2.5 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten
Bei Blunt-end-Ligationen wurden die DNA-Fragmente der Vektor-DNA mit aus Kälberdarm isolierter alkalischer Phosphatase nach Anweisung des Herstellers dephosphoryliert. Das Enzym wurde nach erfolgter Dephosphorylierung für 30 min bei 65°C inaktiviert. Die Aufreinigung der DNA erfolgte durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion und Fällung mit 3 M Natriumacetat (NaAc) und Isopropanol.
3.2.6 Auffüllung überhängender DNA-Enden zu glatten Enden
Wiesen die DNA-Fragmente, die ligiert werden sollten, keine übereinstimmenden Restriktionsschnittstellen auf, so musste bei überhängenden Enden (sticky-ends) ein glattes Ende (blunt-end) erzeugt werden. Hierzu wurde das entsprechende DNA-Fragment für 30 Minuten mit 1 U Klenow-Fragment (DNA-Polymerase I Large Fragment) und 2 µl 25mM dNTPs bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Inaktivierung des Enzyms durch Erhitzen auf 95°C für 5 Minuten.
3.2.7 Ligation der DNA-Fragmente
Zur Ligation von DNA-Fragmenten sowohl mit überhängenden als auch mit glatten Enden wurden 100 ng bis 200 ng der Vektor-DNA mit der dreifachen Menge Insert-DNA in 20 µl Ligasepuffer unter Zugabe von 5 U T4-DNA-Ligase aufgenommen und über Nacht bei 16°C inkubiert.
3.2.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Zur Herstellung eines Fusionsproteins der Proregion LPHα mit YFP/CFP/DsRed wurden zunächst über eine PCR mit dem Plasmid pcDNA3-LPHα Schnittstellen für die Enzyme HindIII und SalI an die für das Profragment kodierende Region angefügt, so dass die Insertion in die verschiedenen Varianten des Reportergens GFP innerhalb des Leserahmens ermöglicht wurde.
Die PC-Reaktion wurde in einem Thermocycler (BIO-RAD Laboratories GmbH, München) durchgeführt. Es wurden folgende Komponenten für die PCR verwendet:
Reaktionsansatz (100 µl): 10 x PCR-Puffer 10 µl
25 mM dNTPs 2 µl
Primer LPH1HindIII (25 pmol/µl) 5 µl Primer LPHalphaSalI (25 pmol/µl) 5 µl Plasmid pcDNA3-LPH (0,1µg/µl) 2 µl Taq-Polymerase (10 U/µl) 0,5 µl dH2O 75,5 µl
Zyklus Wiederholungen Temperatur Dauer Vorgang I 1 95° C 60 s Denaturierung 55° C 60 s Annealing 72° C 60 s Extension II 16 95° C 45 s Denaturierung 55° C 60 s Annealing 72° C 60 s Extension III 1 72 ° C 10 min Extension
3.2.9 Auftrennung von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese
Native Agarosegele
DNA-Fragmente von 0,5 bis 20 kb wurden in 0,8 %igen Agarosegelen aufgetrennt. Zur Herstellung der Agarosegele und als Laufpuffer für die Elektrophorese wurde einfacher TAE- Puffer verwendet. Zum Anfärben der DNA wurden 100 ml Gelpuffer 50 µg Ethidiumbromid zugesetzt (SHARP et al. 1973). Die DNA-Proben wurden vor dem Auftragen mit 0,1 Volumen Probenpuffer versetzt und bei einer Spannung von 80-100 V aufgetrennt.
Als Längenstandard wurden 0,5 µg mit EcoRI und HindIII geschnittener λ-DNA verwendet.
3.2.10 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Um die geschnittenen DNA-Fragmente wieder aus dem Agarosegel zu extrahieren, wurden die entsprechenden Banden ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt. Die DNA wurde mit der „Freeze Squeeze“-Methode aus dem Agarosegel isoliert (THURING et al.
1975). Hierzu wurde das Agarosegelstück mit der entsprechenden Bande für 5 Minuten in flüssigem Stickstoff gelagert. Das gefrorene Agarosegelstück wurde anschließend zwischen zwei Lagen Parafilm M (Pechiney Plastic Packaging, Inc., Neenah, USA) gebracht, die Flüssigkeit durch Ausübung von Druck herausgepresst und mit der Pipette in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Nach Präzipitation der DNA mit einem Zehntel Volumen 3 M
NaAc, pH-Wert 5,2 und 2 Volumen 96 %igem Ethanol und einmaligem Waschen mit 70
%igem Ethanol, wurde diese getrocknet und in 20 µl TE-Puffer aufgenommen.
3.2.11 Anzucht und Aufbewahrung der verwendeten Zelllinien
Die verschiedenen Zelllinien wurden in 10 ml Kulturmedium bei 37°C, 5 % CO2 und
95 % relative Luftfeuchtigkeit in 100-mm-Zellkulturschalen (Greiner, Hamburg/Deutschland) kultiviert.
Alle 3-4 Tage wurden die in Kultur gehaltenen Zellen verdünnt, um ein gleichmäßiges Wachstum sicherzustellen. Hierfür wurden die Zellen einer Kulturschale mit Trypsin/EDTA- Lösung (0,05 % Trypsin, 0,02 % EDTA in modifizierter Puck’s Salzlösung A; Gibco Life Technologies, Eggenstein/Deutschland) vom Boden der Schale abgelöst, in 10 ml DMEM- /RPMI-Medium aufgenommen und entsprechend der gewünschten Zelldichte auf 4 bis 10 neue Zellkulturschalen verteilt.
Zur längerfristigen Lagerung wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Hierzu wurden sie bei einer Konfluenz von 60 – 80 % mit Trypsin/EDTA-Lösung vom Boden der Kulturschale gelöst, in 10 ml DMEM aufgenommen und für 5 min. bei 1500 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wurde dann in 1,5 ml vorgekühltes Einfriermedium (90 % DMEM/RPMI-Medium, 10 % DMSO) aufgenommen, in Einfriergefäßen bei –80°C eingefroren und am folgenden Tag in flüssigen Stickstoff überführt.
Das Auftauen der Zellen erfolgte im Wasserbad bei 37°C. Die Zellsuspension wurde in 10 ml Kulturmedium aufgenommen und in einem kleinen Falcon Tube für 5 min. bei 1500 rpm abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde dann in 10 ml Kulturmedium aufgenommen und auf Kulturschalen überführt.
3.2.12 Transfektion von COS-1 Zellen nach der DEAE-Dextran-Methode
Die Transfektion der Zellen erfolgte bei einer Konfluenz von 60 – 80 % (Sambrook et al.
1989). Nach zweimaligem Waschen mit 4 ml DMEM wurden die Zellen mit einer Mischung aus 1,5 ml Transfektionsmedium, 500 µg DEAE-Dextran und 5 µg DNA für 1,5 h bei 37°C
