Prozessierung von LPHβ initial in CHO-Zellen mit und ohne Einwirkung der Proregion

LPHβinitial LPHα +LPHβinitial

Enzymaktivität [IU]( [µmol/min] ) 0,0034 ± 0,0005 0,0235 ±0,0035

Tab. III: Einfluss der Proregion auf die enzymatische Aktivität von LPHβinitial.

4.2 Prozessierung von LPHβ_initial in CHO-Zellen mit und ohne Einwirkung der Proregion

4.2.1 Herstellung einer stabil LPHα exprimierenden CHO-Zelllinie

Um die Auswirkung der als unabhängiges Polypeptid vorliegenden Proregion LPHα auf die Faltung von LPHβinitial zu bestätigen, sollte diese auch anhand einer anderen Zelllinie nachgewiesen werden. Hierzu wurden Chinese Hamster Ovary-Zellen (CHO-Zellen) verwendet, die unpolar sind, selber keine Laktase-Phlorizin Hydrolase produzieren und transfizierte DNA stark exprimieren (PUCK et al. 1958).

Zunächst sollte eine Zelllinie hergestellt werden, die LPHα stabil exprimiert, so dass bei einer transienten Transfektion mit LPHβinitial alle Moleküle unter dem Einfluss der Proregion wären. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pcDNA3-LPHα verwendet, das ein Neomycin-Resistenzgen besitzt, wodurch die Selektion transfizierter Zellen ermöglicht wird. Es wurde mit der Polybren-Methode in CHO-Zellen transfiziert und nach 14-tägiger Selektion in Kulturmedium, das mit Geneticin (G418) versetzt war, konnten die Klone auf Expression von LPHα untersucht werden. Hierzu wurden die Klone für 4 bis 6 Stunden biosynthetisch mit L-[³⁵S]-Methionin markiert. Anschließend wurden die Zellen lysiert und es erfolgte eine Immunpräzipitation von LPHα mit Hilfe des polyklonalen Antikörpers V496. Bei der folgenden Analyse der Proteine anhand von SDS-PAGE konnte aber kein Zellklon detektiert werden, der LPHα exprimierte. Dieses Versuchsergebnis ließ einen Abbau des Proteins innerhalb der Zelle bei stabiler Transfektion vermuten.

4.2.2 Herstellung einer stabil LPHβinitial exprimierenden CHO-Zelllinie

Da die Untersuchung der Expression der beiden Untereinheiten der LPH in trans nicht mit Hilfe von stabil LPHα exprimierenden Zellen möglich war, sollte nun eine CHO-Zelllinie hergestellt werden, die LPHβinitial stabil exprimierte. Hierfür wurde das Plasmid pJB20-LPHβinitial verwendet, das wie pcDNA3-LPHα ein Resistenzgen für Neomycin zur Selektion stabil transfizierter Zellen besitzt.

Die Durchführung der Transfektion erfolgte analog zu 4.2.1. Nach der Selektion von Zellklonen erfolgte eine biosynthetische Markierung mit L-[³⁵S]-Methionin über 6 Stunden.

Im Anschluss an die Zelllyse wurden die Überstände mit einer Kombination der monoklonalen Antikörper mAb anti-LPH, mLac2 und mLac 8 präzipitiert und die immunpräzipitierten Proteine wurden durch SDS-PAGE analysiert. Für die weiteren Experimente wurde ein Zellklon mit hoher Expression von LPHβinitial verwendet, der als CHO-LPHβinitial bezeichnet wurde.

4.2.3 Die Biosynthese von LPHβinitial in CHO-LPHβinitial-Zellen

Eine biosynthetische Markierung von CHO-LPHβinitial für 4 Stunden und eine nachfolgende Immunpräzipitation der Zelllysate mit mAb anti-LPH, mLac2 und mLac8 zeigte die Synthese einer Proteinform von LPHβinitial mit einem Molekulargewicht von 150 kDa (Abb. 11, Spur 1). Durch die Behandlung des immunpräzipitierten Proteins mit Endo H und Endo F/FG wurde das Glykosylierungsmuster des Polypeptids überprüft (Abb. 11, Spuren 2 und 3). Das Protein war sowohl Endo H- als auch Endo F/FG-sensitiv und zeigte nach der Behandlung eine Molekulargewichtsänderung um 20 kDa zu einem Protein mit einer Größe von 130 kDa.

Aufgrund der Änderung des Molekulargewichts bei beiden Endoglykosidasen, handelt es sich bei dem exprimierten Protein um die mannosereich glykosylierte Form (LPHβinitial/h) von LPHβinitial.

4.2.4 Kotransfektion von CHO-LPHβ_initial mit LPHα

Um den Einfluss der Proregion LPHα auf die Faltung des Proteins LPHβinitial auch in CHO-Zellen nachzuweisen, wurde die stabil LPHβinitial exprimierende Zelllinie CHO-LPHβinitial

Abb. 11: Identifikation molekularer Formen von LPHβinitial in CHO-LPHβinitial.

CHO-LPHβinitial-Zellen wurden über 4 Stunden mit [³⁵S]-Methionin biosynthetisch markiert. Das Zelllysat wurde mit der anti-LPH-Antikörpermischung inkubiert und die Immunpräzipitate wurden anschließend in drei Proben aufgeteilt, die nicht (Spur 1), mit Endo H (Spur 2) oder mit Endo F (Spur 3) behandelt wurden. Die Proteine wurden in einem 6%igen SDS-PAA-Gel aufgetrennt und fluorometrisch analysiert.

verwendet. In diese Zelllinie wurde die cDNA der Proregion LPHα durch transiente Transfektion nach der DEAE-Dextran Methode eingebracht, so dass eine Expression beider Untereinheiten der LPH in trans vorlag. 48 Stunden nach der Transfektion wurden diese Zellen und nicht mit LPHα transfizierte CHO-LPHβinitial-Zellen über 6 Stunden biosynthetisch mit L-[³⁵S]-Methionin markiert. Nach der Lysierung wurden die Überstände zunächst mit mAb anti-LPH, mLac 2 und mLac 8 und im Anschluss daran mit V496 immunpräzipitiert. Die immunpräzipitierten Proteine wurden dann durch SDS-PAGE analysiert.

Sowohl bei der Kontrolle der nicht transfizierten CHO-LPHβinitial-Zellen, als auch bei den mit LPHα transfizierten Zellen, wurden zwei Proteinformen mit einem Molekulargewicht von 150 kDa und 170 kDa detektiert (Spuren 1 und 3), wobei die 150 kDa-große Form das mannosereich glykosylierte Protein darstellt (LPHβinitial/h), während die Bande bei 170 kDa die komplex glykosylierte Form von LPHβinitial repräsentiert (LPHβinitial/c). Die anschließende Präzipitation mit dem Antikörper gegen die Proregion erbrachte nur bei den doppelt transfizierten Zellen eine schwache, diffuse Bande bei 100 kDa (Spur 4), die LPHα entspricht.

Die quantitative Analyse des Verhältnisses der komplex glykosylierten Bande zur mannosereich glykosylierten Bande mit und ohne Einwirkung der Proregion LPHα erbrachte die in Tabelle IV aufgeführte Relation.

Wie in Abb. 11 und in Abb. 12 ersichtlich unterscheidet sich die Prozessierung von LPHβinitial

in CHO-Zellen von der in COS-1 Zellen, da diese Untereinheit in Abwesenheit der Proregion fast nicht komplex glykosyliert wird. Durch den Kontakt der beiden Untereinheiten findet aber auch in dieser Zellart eine Steigerung der komplexen Glykosylierung um ca. 8 % statt, so dass auch hier auf einen positiven Einfluss von LPHα auf die Faltung des Proteins geschlossen werden kann.

LPHβinitial LPHβinitial

+ LPHα

170 150

100 kDa

Abb. 12: Expression von LPHβinitial und LPHα in trans in CHO-LPHβinitial.

CHO-LPHβinitial-Zellen wurden nicht (Spuren 1 und 2) oder mit LPHα (Spuren 3 und 4) transfiziert. Nach der biosynthetischen Markierung der Zellen mit L-[³⁵S]-Methionin über 6 Stunden wurden die Zelllysate mit der anti-LPH-Antikörpermischung (Spuren 1 und 3) und anschließend mit dem polyklonalen Antikörper V496 (Spuren 2 und 4) immunpräzipitiert. Die Proteine wurden dann auf einem 6%igem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und fluorometrisch analysiert.

Tabelle IV: Verhältnis der verschiedenen Glykosylierungsformen von LPHβinitial in %.

n = 2

LPHβinitial LPHβinitial + LPHα

mannosereich glykosyliert (%) 75,9 ± 1,8 67,7 ± 1,6 komplex glykosyliert (%) 24,1 ± 1,8 32,3 ± 1,6

Anteil an LPHßinitial (%)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

mannosereich glykosylierte Form komplex glykosylierte Form

Abb. 13: Relation der mannosereich glykosylierten zur komplex glykosylierten Form von LPHβinitial in CHO-Zellen.