E
XPRESSION UND BIOCHEMISCHE UND
STRUKTURELLE
C
HARAKTERISIERUNG DER
RNA-
ABHÄNGIGEN
RNA-P
OLYMERASE DES
L
ASSA
-V
IRUS
Dissertation
vorgelegt dem Fachbereich 2 (Biologie/Chemie) der
Universität Bremen
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr.rer.nat.)
angefertigt in der Abteilung Virologie am Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg vorgelegt von Linda Brunotte aus Hannover Hamburg, 2010
Tag des öffentlichen Kolloquiums: 16. Juni 2010 (Universität Bremen)
Gutachter der Dissertation:
1. Prof. Dr. rer. nat. Andreas Dotzauer Universität Bremen, FB 2 2. Prof. Dr. med. Stephan Günther
Inhalt
1 EINLEITUNG ...1
1.1 DAS LASSA-VIRUS...1
1.1.1 Familie der Arenaviren...1
1.1.2 Epidemiologie...2
1.1.3 Klinik und Diagnostik des Lassa-Fiebers...4
1.1.4 Pathogenese des Lassa-Fiebers ...5
1.1.5 Therapie gegen Lassa-Fieber...6
1.1.6 Impfstoff gegen Lassa-Virus ...7
1.1.7 Morphologie und Replikation der Arenaviren ...7
1.1.8 Die viralen Proteine GP, NP und Z und ihre Funktionen ...10
1.1.8.1 Das Nukleoprotein (NP) ... 10
1.1.8.2 Das Z-Protein... 10
1.1.8.3 Das Glykoprotein (GP) ... 11
1.1.9 Der zelluläre Rezeptor ...13
1.2 DAS LASSA-VIRUS REPLIKONSYSTEM...14
1.3 RNA-ABHÄNGIGE RNA POLYMERASEN (RDRP) ...16
1.4 DAS L-PROTEIN DES LASSA-VIRUS...18
1.5 VORHERSAGE VON INTERDOMÄNLINKERN IN PROTEINEN...19
1.6 ZIELSETZUNG...21
2 MATERIAL UND METHODEN ...22
2.1 MATERIALIEN...22 2.1.1 Nukleinsäuren...22 2.1.1.1 Plasmide ... 22 2.1.1.2 Oligonukleotide ... 22 2.1.1.2.1 Klonierungs-Primer ... 22 2.1.1.2.2 Vektor-Primer ... 26 2.1.1.2.3 Mutagenese-Primer... 26 2.1.1.2.4 Sonstige Primer... 31 2.1.1.3 Andere Nukleinsäuren... 32 2.1.1.4 Radionukleotide... 32
2.1.2 Zelllinien und Bakterienstämme...32
2.1.3 Viren...33
2.1.4 Antikörper ...34
2.1.5 Zellkulturmedien ...34
2.1.6 Enzyme ...35
2.1.7 Chemikalien und Reagenzien ...36
2.1.8 Lösungen und Puffer ...38
2.1.9 Kits ...42
2.1.10 Software ...43
2.1.11 Geräte ...43
2.2 METHODEN...45
2.2.1 Molekularbiologische Methoden...45
2.2.1.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ... 45
2.2.1.2 Agarose-Gelelektrophorese ... 46
2.2.1.3 Aufreinigung von PCR-Produkten ... 47
2.2.1.4 Restriktionsspaltung von DNA-Molekülen ... 47
2.2.1.5 Ligation von DNA... 47
2.2.1.6 DNA-Sequenzierung ... 48
2.2.1.7 Transformation und Retransformation von E.coli... 48
2.2.1.8 Aufreinigung von Plasmid-DNA ... 49
2.2.1.9 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ... 49
2.2.1.10 In vitro-Transkription von DNA ... 49
2.2.1.11 Isolierung von RNA mit Trizol ... 49
2.2.1.12 Polyacrylamid-Gelelektrophorese von RNA (TBE-UREA-PAGE) ... 50
2.2.1.13 Silberfärbung von Nukleinsäuren in Polyacrylamid-Gelen... 50
2.2.2 Zellbiologische Methoden ...50
2.2.2.1 Insektenzellen ... 50
2.2.2.1.1 Auftauen, Einfrieren und Kultivieren von Insektenzellen ... 50
2.2.2.2 Adhärente Säugetierzellen ... 51
2.2.2.2.1 Auftauen, Einfrieren und Kultivieren von adhärenten Säugetierzellen ... 51
2.2.2.3 Transfektion von adhärenten Säugetierzellen ... 51
2.2.3 Virologische Methoden ...52
2.2.3.1 Anzucht und Vermessung von rekombinantem MVA-T7-Virusstocks... 52
2.2.3.1.1 Virustiterbestimmung mittels X-Gal-Assay ... 52
2.2.3.1.2 Austitration von MVA-T7-Virusstocks mittels Luciferase-Assay... 53
2.2.3.2 Infektion von Zellen mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus MVA-T7... 53
2.2.3.3 Herstellung und Amplifikation rekombinanter Bakuloviren... 53
2.2.4 Proteinbiochemische Methoden ...54
2.2.4.1 Proteinexpression in Insektenzellen ... 54
2.2.4.2 Proteinexpression in Bakterienzellen... 54
2.2.4.2.1 Induktion mit IPTG ... 54
2.2.4.2.2 Autoinduktion ... 55
2.2.4.3 Transiente Proteinexpression in HeLa-Zellen ... 55
2.2.4.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ... 55
2.2.4.5 Westernblot... 55
2.2.4.6 Silberfärbung von Proteinen ... 56
2.2.4.7 Affinitätsaufreinigung von Proteinen mit Ni-NTA (His-Aufreinigung) ... 56
2.2.4.8 Affinitätsaufreinigung von Proteinen mit Strep-Tactin ... 57
2.2.4.9 Duales Luciferase-Assay ... 58
2.2.4.10 Bestimmung von Proteinkonzentrationen nach Bradford... 59
2.2.4.11 Polymerase-Aktivitäts-Assay ... 59 2.2.4.12 Terminales-Nukleotidyl-Transferase-Assay (TNTase-Assay)... 60 2.2.4.13 Ribonuclease-Protection-Assay (RPA)... 60 2.2.4.14 Ko-Immunpräzipitation ... 61 2.2.4.15 Indirekte Immunfluoreszenz... 61 3 ERGEBNISSE ...63
3.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR DOMÄNENSTRUKTUR DES L-PROTEINS DES LASSA-VIRUS...63
3.1.1 Vorhersage von Interdomänlinkern im Lassa-Virus L-Protein ...63
3.1.2 Mutagenese-Studie zur Untersuchung potentieller Interdomänlinker ...66
3.1.2.1 Insertion von 5 Aminosäuren ... 68
3.1.2.2 Verlängerung der Insertionssequenz von 5 auf 10 Aminosäuren ... 69
3.1.2.3 Teilung des L-Proteins in N- und C-terminale Domänen... 70
3.1.3 Interaktions-Studien mit N- und C-terminalen Domänen des L-Proteins ...71
3.1.3.1 Nachweis der Interaktion zwischen L-N1 und L-C1 sowie L-N2 und L-C2 durch Ko-Immunpräzipitation (CoIP)... 71
3.1.3.2 Ko-Lokalisation von N- und C-terminalen Domänen des L-Proteins ... 74
3.1.3.3 Weitere Untersuchungen zur L-L-Interaktion ... 75
3.1.3.3.1 Untersuchungen zum dominant-negativen Effekt ... 77
3.2 EXPRESSION UND AUFREINIGUNG DES L-PROTEINS...78
3.2.1 Herstellung der Expressions-Plasmide...79
3.2.2 Expressionsscreening der L-Proteine...80
3.2.2.1 Expression in E.coli ... 80
3.2.2.2 Expressionsscreening in Insektenzellen... 81
3.2.2.2.1 Expression von L-Proteinen mit N- und C-terminalem His-Tag ... 81
3.2.2.2.2 Expression der L-Proteine als GST- und MBP-Fusionsproteine... 84
3.2.2.3 Transiente Expression des L-Proteins in HeLa-Zellen ... 84
3.2.2.3.1 Affinitätsaufreinigung der His-getaggten Proteinen mit Ni-NTA... 85
3.2.2.3.2 Affinitätsaufreinigung Strep-getaggter Proteine mit Strep-Tactin ... 86
3.3 NACHWEIS VON RNA-POLYMERASE-AKTIVITÄT IM L-PROTEIN...87
3.3.1 Polymerase-Aktivitäts-Assay ...87
3.3.2 Ribonuclease-Protection-Assay (RPA) ...91
3.3.3 Terminales-Nukleotidyl-Transferase-Assay (TNTase-Assay) ...93
4 DISKUSSION ...96
4.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR DOMÄNENSTRUKTUR DES L-PROTEINS DES LASSA-VIRUS...96
4.2 EXPRESSION UND AKTIVITÄTSTESTUNG DES L-PROTEINS...99
5 ZUSAMMENFASSUNG ...103
6 LITERATURVERZEICHNIS ...104
7 ANHANG...117
7.1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...117
7.2 EINBUCHSTABENCODE DER AMINOSÄUREN...119
7.3 LEBENSLAUF...120
7.4 VERÖFFENTLICHUNGEN...121
1 Einleitung
1.1 Das Lassa-Virus
1.1.1 Familie der Arenaviren
Das Lassa-Virus ist ein humanpathogener Vertreter der Familie der Arenaviridae, einer Virusfamilie, die sich durch ein segmentiertes, einzelsträngiges RNA-Genom mit negativer Polarität auszeichnet. Der Name Arenavirus leitet sich von dem lateinischen Begriff für Sand ab (arenosus = sandig) und beschreibt das sandige und körnige Erscheinungsbild der Arenaviren unter dem Elektronenmikroskop (Abbildung 1), das wahrscheinlich durch die Inkorporation von zellulären Ribosomen in die Viruspartikel entsteht (63, 165).
Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme von Arenaviruspartikeln (CDC, Goldsmith, S. and Auperin, D.). Die körnige Struktur wird vermutlich durch inkorporierte zelluläre Ribosomen verursacht.
Aufgrund ihrer charakteristischen Genomstruktur sind Arenaviren eng mit anderen segmentierten Negativstrang RNA-Viren, wie den Bunyaviridae und Orthomyxoviridae verwandt, zu deren bekanntesten Vertretern das Hanta-Virus und das Influenza-Virus zählen (192). Bisher gibt es 23 klassifizierte Spezies in der Familie der Arenaviridae. Dazu kommen 3 vorläufige Spezies, zu denen das Rio-Cacarana-Virus (Argentinien), das Pampa-Virus (Argentinien) und das Lujo-Virus (Südafrika) gehören (18, 32, 40, 55) . Die Mitglieder dieser Virusfamilie werden anhand ihrer geographischen Verbreitung, serologischen Merkmale und phylogenetischen Unterschiede in Altwelt- (Afrika und Europa) und Neuwelt- (Südamerika) Arenaviren eingeteilt (Abbildung 2) (16, 167, 200). Die bekanntesten Vertreter der Altwelt-Arenaviren sind das Lassa-Virus, Mopeia-Virus und das prototypische Arenavirus Lymphozytäres Choriomeningitis Virus (LCMV). Zu den Neuwelt-Arenaviren gehören unter anderem das Tacaribe-Virus, Pichinde-Virus, Junin-Virus und Sabia-Virus.
Die geographische Verbreitung der einzelnen Virusspezies ist regional sehr begrenzt, was wahrscheinlich auf das eingeschränkte regionale Vorkommen der jeweiligen Nagetierspezies zurückzuführen ist, die das natürlich Reservoir der Arenaviren bilden (168).
Abbildung 2: Geographische Verteilung der 23 bekannten Altwelt- und Neuwelt-Arenaviren.
Zwei Ausnahmen sind das weltweit verbreitete LCMV, dessen natürlicher Wirt die ubiquitär vorkommende Hausmaus Mus musculus ist, und das Tacaribe-Virus, dessen natürliches Reservoir Fledermäuse der Gattung Artibeus sind (158).
Aufgrund der Übertragung von Tier zu Mensch gehören die Arenaviren zu den zoonotischen Viren, aber nicht alle Arenaviren sind mit einer Erkrankung des Menschen assoziiert. Zu den humanpathogenen Arenaviren werden die Altwelt-Arenaviren Lassa-Virus und LCMV, sowie die Neuwelt-Arenaviren Junin-Lassa-Virus, Machupo-Lassa-Virus, Guanarito-Virus und Sabia-Guanarito-Virus gezählt. Erst kürzlich wurde das Lujo-Guanarito-Virus als Erreger eines hämorrhagischen Fieberausbruchs in Südafrika entdeckt (18, 156). Wegen der hohen Ansteckungsgefahr und der möglichen Übertragung von Mensch zu Mensch sind diese Viren als hochpathogen klassifiziert und experimentelle Arbeiten müssen in einem Labor der Biosicherheitsstufe 4 durchgeführt werden.
1.1.2 Epidemiologie
Namensgeber für das Lassa-Virus ist die nigerianische Stadt Lassa. Dort wurde das Virus 1969 erstmals mit einer hämorrhagischen Fiebererkrankung von drei amerikanischen
Missions-Krankenschwestern in Verbindung gebracht und konnte sogar aus ihrem Blut isoliert werden (23, 24, 63, 110, 177). Seit dem wurde das Virus in mehreren Ländern West-Afrikas nachgewiesen, darunter Sierra Leone, Guinea, Liberia und Nigeria, und gilt dort als endemisch (10, 12, 29, 60, 64, 66, 118, 134, 138, 139, 142, 185-187, 189, 199, 203). Es gibt Hinweise darauf, dass sich das Endemiegebiet des Lassa-Virus auch auf andere Länder erstreckt, da sich im Jahr 2000 ein Tourist auf Reisen durch Ghana, Cote D’Ivoire und Burkina Faso mit dem Lassa-Virus infizierte (79).
Der natürliche Wirt des Lassa-Virus ist die Vielzitzenratte Mastomys natalensis, die in engem Kontakt zur afrikanischen Bevölkerung lebt (140). Das Virus löst in der Ratte keine Erkrankung aus, wird aber ein Leben lang über den Urin ausgeschieden. Durch Kontakt mit dem virushaltigen Urin kann es leicht zur Kontamination von ungeschützten Nahrungsmitteln kommen, welches die wahrscheinlich häufigste Transmissionsroute des Virus vom Tier auf den Menschen ist (44, 102, 195). Darüber hinaus dienen die Tiere auch als zusätzliche Nahrungsquelle, wobei während der Jagd und Zubereitung ein hohes Transmissionsrisiko besteht (186).
Die Antikörperprevalenz gegen das Lassa-Virus ist in der Bevölkerung sehr variabel und kann in den Endemiegebieten bis zu 55% erreichen. In Langzeitstudien in der Bevölkerung von Sierra Leone konnte gezeigt werden, dass die Rate der Serokonversion pro Jahr bei 5-20% liegt, wobei die meisten Neuinfektionen nicht zu einer Erkrankung führen. Es wird geschätzt, dass sich pro Jahr 100,000 – 300,000 Menschen mit dem Lassa-Virus infizieren, von denen 1% - 2% auch daran sterben (12, 80, 102, 118, 134, 187, 203). In afrikanischen Krankenhäusern hat es mehrfach nosokomiale Lassa-Fieber Ausbrüche gegeben, was deutlich macht, dass das Virus auch von Mensch zu Mensch übertragen werden kann. Grund für nosokomiale Ausbrüche sind meistens schlechte hygienische Verhältnisse und das Nichtbefolgen von Schutzmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen, Kitteln und Mundschutz, um den Kontakt mit den Körperflüssigkeiten der infizierten Patienten zu verhindern (29, 60, 139). Bei nosokomialen Lassa-Fieber Ausbrüchen in den Endemiegebieten kann sich die Sterblichkeitsrate auf bis zu 65% der hospitalisierten Patienten erhöhen.
Aufgrund des starken weltweiten Reiseverkehrs und der langen Inkubationszeit von bis zu 3 Wochen ist es schon mehrfach zum Import von Lassa-Virus durch infizierte Personen in andere Teile der Welt gekommen. Es sind insgesamt 26 Fälle weltweit bekannt, von denen 6 Fälle nach Europa importiert wurden. Trotz intensivmedizinischer Behandlung hat keiner der nach Europa importierten Fälle die Erkrankung überlebt (3, 4, 36, 81, 88, 90, 99, 125, 172, 201, 208).
1.1.3 Klinik und Diagnostik des Lassa-Fiebers
Das Lassa-Fieber ist mit einem großen Spektrum klinischer Symptome assoziiert und kann nur schwer von anderen febrilen Erkrankungen wie z.B. Malaria unterschieden werden. Detaillierte Kenntnisse über Herkunft oder Reiseroute eines Patienten, sind bei importierten Fällen eine große Hilfe für die Diagnostizierung des Lassa-Fiebers.
Die Inkubationszeit der Erkrankung kann bis zu 3 Wochen betragen, liegt jedoch im Durchschnitt bei 10 Tagen. Die Krankheit beginnt meist mit grippeähnlichen Symptomen wie Unwohlsein, Kopf-, Muskel- und Gliederschmerzen sowie Fieber. Im weiteren Verlauf kommen oft Bauchschmerzen, Erbrechen, Durchfall und Halsschmerzen dazu. Eine Erhöhung der Aspartat-Aminotransferase (AST)-Werte in Verbindung mit einem hohen AST/Alanin-Aminotransferase (ALA)-Wert lässt auf eine Schädigung der Leber während der Erkrankung schließen. Bei besonders schweren Verläufen entwickeln Patienten häufig Nacken- und Gesichtsödeme oder Hämorrhagien und sie können einen hypovolämischen Schock erleiden. Auch neurologische Störungen wie Verwirrtheit, Enzephalopathie, Tremor und Koma können auftreten. Bei einem schweren Verlauf tritt der Tod im Durchschnitt nach 12 Tagen ein. Uni- oder bilateraler Hörverlust wurden bei überlebenden Patienten als Spätfolge der Lassa-Fieber-Erkrankung beobachtet (12, 41, 42, 105, 130, 133, 135, 138, 198, 199).
Neben den klinischen Symptomen ist die Höhe der Virämie, die ab dem dritten Tag einsetzt, ein wichtiges Kriterium für die Prognose des Krankheitsverlaufs, wobei die Höhe der Virämie negativ mit der Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten korreliert. Bei
einer Virämie von 103 TCID50/ml, in Verbindung mit einem erhöhten AST-Wert (>150
U/l), ist die Überlebensrate signifikant reduziert. Bei Patienten, die eine Lassa-Fieber Erkrankung überleben, erreicht die Virämie an Tag 4-9 ihren Höhepunkt und flacht danach ab bis das Virus ganz aus dem Blutkreislauf entfernt ist. Insgesamt dauert die Erkrankung 2 bis 3 Wochen. Der tödliche Verlauf ist durch eine durchgehend hohe oder bis zum Tod
ansteigende Virämie charakterisiert (103 – 108 TCID50/ml) (43, 98, 131, 135, 172, 188).
Bei Kindern manifestiert sich die Krankheit meist durch das „swollen baby syndrome“, wobei es zur Ausbildung ausgedehnter Ödeme und Blutungen kommt (141). Während einer Schwangerschaft führt das Lassa-Fieber in 90% der Fälle zu dem Verlust des Fötus (159, 194).
Für die Labordiagnose des Lassa-Fiebers wird eine Kombination aus serologischen und molekular diagnostischen Methoden angewendet. Akutes Lassa-Fieber wird vor allem durch den Nachweis der viralen RNA durch RT-PCR und die Detektion von Lassa-Virus spezifischen IgM- und IgG-Antikörpern im Patientenserum unter Verwendung von
Virusantigenen mittels Immunfluoreszenz diagnostiziert. Der klassische Virusnachweis erfolgt über eine Anzucht des Virus aus Urin, Serum, Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), Pleura-Erguss und Rachenabstrichen auf Vero-Zellen (23, 87, 95, 98, 138).
1.1.4 Pathogenese des Lassa-Fiebers
Die Pathogenese des Lassa-Virus ist bis heute weitgehend unbekannt. Aufgrund der
ubiquitären Expression des zellulären Rezeptors alpha-Dystroglycan (-DG), kommt es
zur Infektion von nahezu allen Organen, wie Leber, Lunge, Niere und Nebenniere, Milz, Pankreas und Herz, wobei die niedrigsten Virustiter im Zentralnervensystem (ZNS) zu finden sind (48, 96, 97, 193-196). Im allgemeinen gilt ein hoher Virustiter dabei als indikativ für einen akuten Krankheitsverlauf, was auf einen Einfluss der Virusreplikation auf die Pathogenese hindeutet. Patienten sterben oft ohne innere Blutungen oder pathologische und histopathologische Veränderungen, die den Tod erklären würden. Histopathologische Befunde und die Erhöhung der AST und ALT-Werte im Serum von Menschen und Affen belegen, dass die Leber das am häufigsten betroffene Organ ist. Es wird jedoch vermutet, dass der Anstieg der Leberenzymkonzentration nicht alleine durch eine Schädigung der Leberzellen hervorgerufen wird, da die Erhöhung des ALT-Wertes im Vergleich zum AST-Wert geringer ist (27, 59, 133, 194).
Das Lassa-Virus ist auch in der Lage die Immunzellen des Körpers zu infizieren und ihre Immunantwort zu beeinflussen (9, 124). Dabei werden zwei unterschiedliche Mechanismen diskutiert. Zum einen wurde in einer Langzeit-Zytokin-Messung bei einem importierten Lassa-Fall im Jahr 2000 ein Anstieg der proinflammatorischen Zytokine
Tumor Nekrose Faktor-Alpha (TNF-) und Interferon-Gamma (IFN-) vor dem Tod durch
Organversagen und hämorrhagischem Schock festgestellt, was auf eine Deregulation der Zytokinexpression ähnlich wie in einer Sepsis hindeutet. In einer zweiten Publikation wurde jedoch eher eine Suppression der Immunantwort durch eine Lassa-Virus Infektion vermutet, da nur sehr geringe Konzentrationen von Interleukin 8 (IL-8) und interleukin induzierbarem Protein 10 im Patientenserum nachgewiesen wurden. Diese Ergebnisse konnten in in vitro-Versuchen reproduziert werden, bei denen Endothelzellen mit Virus und dem apathogenen Mopeia-Virus infiziert wurden. Im Vergleich zu den Lassa-Virus infizierten Zellen, zeigten die Mopeia-Lassa-Virus infizierten Zellen eine normale IL-8 Sekretion (120, 123, 172).
Die geringe Suszeptibilität von Lassa-Virus gegenüber den Mediatoren der angeborenen
Immunantwort, IFN- und IFN-, deutet auf einen IFN-Antagonismus hin, der eine Rolle
LCMV diese Resistenz zeigt, ist es unwahrscheinlich, dass dies der ausschlaggebende Faktor für die Pathogenität des Lassa-Virus ist, sondern eher einen generellen Patho-Mechanismus von Arenaviren reflektiert (5).
Die Transmissionsroute scheint ebenfalls ein einflussreicher Faktor bei der Pathogenese zu sein, da sich in Versuchen mit Rhesusaffen zeigte, dass intravenös infizierte Tiere deutliche Anzeichen eines akuten Lassa-Fiebers entwickelten, während gastrointestinal infizierte Tiere nur eine schwache Infektion aufwiesen und symptomfrei blieben (119).
1.1.5 Therapie gegen Lassa-Fieber
Das Breitband-Nukleosidanalogon Ribavirin (1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide) hat sich als effektiver Wirkstoff gegen dass Lassa-Fieber im Menschen erwiesen und steht als einziges Medikament für die spezifische Therapie zur Verfügung. Wird es in der frühen Phase (innerhalb der ersten 6 Tage) verabreicht, kann es den Krankheitsverlauf positiv beeinflussen. In einer klinischen Studie in Sierra Leone konnte die Sterblichkeitsrate bei Patienten mit akutem Lassa-Fieber (AST-Wert >150) durch die Gabe von Ribavirin von 55% auf 5% gesenkt werden. Auch bei Patienten mit hoher
Virämie (>103.6 TCID50/ml) konnte die Sterblichkeitsrate von 76% auf 9% durch Ribavirin
gesenkt werden (131). In Tierversuchen zeigte sich, dass Ribavirin die Replikation des Lassa-Virus reduziert. Die genaue Wirkweise von Ribavirin gegen das Virus ist jedoch nicht bekannt. (96, 179). Es wird vermutet, dass es als Adenosin- oder Guanosin-Analogon während der Virusreplikation in die virale RNA integriert wird und zu einer „error catastrophe“, einer letalen Mutagenese führt, die letztendlich zum „Aussterben“ der Viruspopulation führt. Für LCMV konnte dieser Wirkmechanismus aber nicht bestätigt werden (38, 39, 76). Es werden noch zwei andere Wirkweisen von Ribavirin diskutiert. Zum einen könnte es die Absenkung des GTP-Reservoirs in der Zelle durch Inhibition der Inosinmonophosphat-Dehydrogenase, die für die Herstellung von Guanosin-Monophosphat, dem Grundbaustein für GTP, verantwortlich ist, bewirken (115). Zum anderen ist es denkbar, dass Ribavirin als 5’-Cap-Analogon in viralen mRNAs eingebaut wird und diese untranslatierbar macht. Da das Lassa-Virus aber vermutlich in einem Prozess, der cap-snatching genannt wird, Cap-Strukturen von zellulären mRNAs stiehlt und für die Translation der eigenen Transkripte nutzt, ist dieser Mechanismus unwahrscheinlich.
Abbildung 3: Strukturformel des Nukleosidanalogon Ribavirin (Triphosphat).
Neben Ribavirin hat sich auch der Einsatz von Rekonvaleszenzseren, die neutralisierende Antikörper gegen Lassa-Virus enthalten, als effektive Therapie erwiesen (65, 110). Nachteile dieser Therapie sind die geringe Kreuzreaktivität der neutralisierenden Antikörper gegen andere Lassa-Stämme und die Schwierigkeit der Beschaffung von wirksamen Seren, da nur wenige Patienten neutralisierende Antikörper nach einem Lassa-Fieber entwickeln (94).
1.1.6 Impfstoff gegen Lassa-Virus
Es wurden schon viele Anstrengungen unternommen, um einen Impfstoff gegen Lassa-Fieber zu entwickeln. In Tierversuchen konnte ein hoher Schutz durch die Vaccinia-Virus-basierte Expression des Nukleoproteins und der Glykoproteine erreicht werden. Nichthumane Primaten konnten durch die kombinierte rekombinante Expression von NP und den Glykoproteinen zu 90% vor einer Infektion mit Lassa-Virus geschützt werden (7, 34, 57, 58, 143). Auch eine Infektion mit dem apathogenen Mopeia-Virus konnte einen wirksamen Impfschutz vermitteln. Wohingegen die Verwendung von inaktiviertem Lassa-Virus, trotz Antikörperbildung, keine Wirkung als Impfstoff zeigte (132). Ein Impfstoff gegen Lassa-Virus für die Verwendung im Menschen steht bis heute nicht zur Verfügung.
1.1.7 Morphologie und Replikation der Arenaviren
Arenaviren sind von einer Lipidmembran umgeben, die sie während der Knospung aus der Wirtszelle aquirieren. Sie haben eine sphärische Form und einen Durchmesser von 90-110 nm (Abbildung 4). In die Hüllmembran des Virus sind die Glykoproteine GP1 und GP2 integriert. GP2 ist ein Membranprotein und durchspannt die Lipidhülle, während GP1 ein peripheres Membranprotein ist und mit dem zellulären Rezeptor interagiert. Beide Proteine bilden durch nichtkovalente Bindung Homotetramere und sind im Elektronenmikroskop als „Spikes“ auf der Virusoberfläche zu erkennen (22). Das bisegmentierte virale Genom liegt im Inneren des Viruspartikel in Form von replikationskompetenten
Ribonukleoprotein-(RNP)-Komplexen vor. Diese bestehen aus den beiden genomischen RNA-Segmenten, umhüllt von Molekülen des Nukleoproteins (NP) und dem L-Protein, welches die RNA-abhängige RNA-Polymerase des Virus ist. Die genaue Art der Interaktion und die Stöchiometrie der einzelnen Komponenten der RNPs ist noch nicht bekannt. Die Lokalisation des Z-Proteins im Virion ist noch unklar, es ist jedoch nicht mit den RNP-Komplexen assoziiert.
Darüber hinaus sind Wirtszell-Ribosomen im Inneren der Viruspartikel zu finden, die aus noch ungeklärten Gründen während der Virusreifung mitaquiriert werden, jedoch keine essentielle Rolle für die Replikation des Virus spielen (114).
Abbildung 4: Schematische Darstellung eines Arenaviruspartikels (137). G1- und G2-Protein: Glykoproteine, NP: Nukleoprotein, S: S-RNA, L: L-RNA
Das Genom der Arenaviren besteht aus zwei einzelsträngigen RNA-Segmenten mit negativer Polarität (-ss RNA). Auf beiden Segmenten sind jeweils zwei Gene lokalisiert. Die Orientierung der Gene ist auf beiden Segmenten gegenläufig, was als ambisense-Kodierung bezeichnet wird und sonst nur noch bei Bunyaviren zu finden ist (8).
Das kleine S-Segment (small) hat eine Größe von 3,4 kB und kodiert für den Glykoproteinvorläufer (pre-GP-C) in sense und das Nukleoprotein (NP) in antisense Orientierung. Das L-Segment (large) ist 7 kB groß und kodiert für das Z-Protein in sense und das L-Protein in antisense Orientierung (Abbildung 6). Die Gene sind jeweils von einer GC-reichen Intergen-Region (IGR), die eine stabile Haarnadelstruktur ausbildet und als Terminationssignal bei der Transkription der viralen mRNAs fungiert, voneinander getrennt (Abbildung 5A) (84, 121, 162, 170).
An den 5´- und 3´-Enden der Segmente befinden sich nichttranslatierte Regionen (UTRs), deren terminale 19 nt hochkonserviert und komplementär zueinander sind. Es wurde
gezeigt, dass die terminalen Sequenzen miteinander hybridisieren und als doppelsträngiger Promotor für die Replikation und Transkription fungieren (6, 154). Durch die Hybridisierung der terminalen Sequenzen erhalten die Genomsegmente eine pfannenstiel-artige, zirkuläre Form, die im Elektronenmikroskop erkennbar ist (205).
Virale mRNAs der 3’ kodierten Gene NP und L werden direkt von der genomischen RNA transkribiert, während mRNAs für die 5’ kodierten Gene GPC und Z vom vorher synthetisierten Antigenom transkribiert werden müssen (Abbildung 5B). Das Antigenom wird auch als Matrize für die Replikation neuer genomischer RNA verwendet. Sowohl Replikation als auch Transkription finden im Zytoplasma der Wirtszelle statt (71).
Die viralen mRNAs haben am 5’-Ende eine Cap-Struktur sind aber nicht polyadenyliert (136). Die Cap-Strukturen sind über 4 - 7 nicht viruskodierte Nukleotide mit den viralen Transkripten verbunden. Es wird vermutet, dass das Lassa-Virus die Cap-Strukturen zellulärer mRNAs abschneidet und für die Initiation der Transkription der eigenen mRNAs verwendet. Dieser Mechanismus wird als Cap-snatching bezeichnet und ist auch bei Bunyaviren und Influenza-Virus zu beobachten (15, 191).
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Genomsegmente und der ambisense-Kodierungs-Strategie von Arenaviren. A) Genomsegmente L und S. B) Replikationsschema des S-Segments. Die mRNAs der 3’-kodierten Gene NP und L werden vom Genom transkribiert während die 5’-kodierten Gene für pre-GPC und Z vom Antigenom transkribiert werden. Genomische RNA wird ebenfalls vom Antigenom synthetisiert.
1.1.8 Die viralen Proteine GP, NP und Z und ihre Funktionen
1.1.8.1 Das Nukleoprotein (NP)
Das Nukleoprotein (NP) ist das am häufigsten vorkommende Protein im Viruspartikel, mit einem Verhältnis von 1:50 zum L-Protein und ca. 1:3,3 zum Z-Protein (169). Es hat eine Größe von 63 kDa und ist essentieller Bestandteil der replikationskompetenten RNP-Komplexe. Bis heute konnte keine enzymatische Aktivität mit NP assoziiert werden. Es ist jedoch an der Immunmodulation in der Wirtszelle während einer Infektion beteiligt und
fungiert als Antagonist der Typ I Interferonantwort indem es die Produktion von IFN-
und die Aktivierung des IFR-3-Signaltransduktionswegs inhibiert. Eine Ausnahme bildet
das Nukleoprotein des Tacaribe-Virus, dass keine inhibitorische Wirkung auf IFN- und
IFR-3 zeigt, dafür jedoch wahrscheinlich am Knospungsprozess neuer Viren aus der Wirtszelle beteiligt ist (77, 127-129).
1.1.8.2 Das Z-Protein
Das Strukturprotein Z ist mit einer Größe von ca. 11 kDa das kleinste Protein der Arenaviren und hat die Funktion eines Matrixproteins. Es ist für die Freisetzung neuer Viren aus der infizierten Zelle verantwortlich und sorgt für die Rekrutierung der übrigen viralen Komponenten zur Zellmembran (28, 52). Es interagiert mit den anderen viralen Proteinen und mit Proteinen der Wirtszellmembran, wofür die posttranslationale Modifikation durch Myristoylierung Vorraussetzung ist (155, 180). Obwohl Z kein Bestandteil der RNP-Komplexe ist, hat es im Replikonsystem einen dosisabhängigen inhibitorischen Effekt auf die Replikation und Transkription, wobei unklar ist, ob dieser Effekt durch eine direkte Interaktion mit anderen viralen Proteinen hervorgerufen wird. In Zellkultur kann die Expression von Z sogar eine Infektion mit Lassa-Virus oder LCMV verhindern, was ebenfalls auf einen inhibitorischen Effekt von Z auf die Virusreplikation hinweist (37, 93, 116). Wird Z alleine in eukaryotischen Zellen exprimiert, führt es zur Knospung und Freisetzung von umhüllten, nichtinfektiösen Partikeln, die als virus like particles (VLPs) bezeichnet werden (Abbildung 6).
Abbildung 6: Bildung von Lassa-Virus virus like particles (VLPs) durch die Expression des Lassa-Virus Z-Proteins in COS-7-Zellen.
Das Z-Protein verfügt über eine zentrale RING-Domäne, die zwei Zinkatome binden kann. RING-Domänen sind im allgemeinen an Protein-Protein Interaktionen beteiligt und es wird vermutet, dass sie für die Interaktion sowohl zwischen Z-Proteinen zur Ausbildung von makromolekularen Strukturen wie VLPs, als auch für die vielseitigen Interaktionen mit den zellulären Proteinen, promyelocytic leukemia protein (PML), dem ribosomalen Protein P0 und dem eukaryotischen Initiations Faktor 4E (eIF4E), wichtig ist.
Die Interaktionen zwischen Z-Protein und dem ribosomalen Protein P0 bzw. eIF4E könnten eine Erklärung für die bisher ungeklärte Verpackung von Ribosomen in virale Partikel sein und einen Mechanismus darstellen, wie Z-Protein die Translation bestimmter zellulärer mRNAs unterdrückt. Wie wichtig eine intakte RING-Domäne für die Funktionalität des Z-Proteins ist, zeigte sich in einem Mutationsversuch, bei dem die Mutation verschiedener Aminosäuren in der RING-Domänen zu einer Inhibition der Virusfreisetzung führte (14, 103, 153).
Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass das Z-Protein der Neuwelt Arenaviren Guanarito-Virus, Machupo-Virus, Sabia-Virus und Junin-Virus, aber nicht der Altwelt Arenaviren Lassa-Virus und LCMV, direkt mit RIG-I interagiert und so die Produktion
von IFN- unterdrückt (54).
1.1.8.3 Das Glykoprotein (GP)
Die Glykoproteine GP1 (44 kDa) und GP2 (36 kDa), die als Spikes in die virale Lipidmembran eingebettet sind, entstehen aus der proteolytischen Spaltung des 75 kDa großen Glykoproteinvorläufers pre-GP-C (Glycoproteinprecursor) durch die zelluläre Protease SKI-1/S1P (Abbildung 7) (50, 112). Die N-Glykosylierung von pre-GP-C spielt eine wichtige Rolle für den Reifungsprozess und die Membranassoziation von GP-1 und GP-2 wobei aber nicht alle der 11 potentiellen Glykosylierungsstellen genutzt werden (49, 202).
Abbildung 7: Schematische Darstellung des Glykoproteinvorläufers pre-GP-C mit dem Signalpeptid SP und den Proteaseschnittstellen (durch Pfeile markiert). Potentielle N-Glykosylierungsstellen sind markiert (Y). Modifiziert von (50).
GP1 und GP2 bilden jeweils Homotetramere und sind über elektrostatische Interaktionen miteinander verbunden. GP2 ist als Transmembranprotein in die Lipidhülle des Virus integriert und gehört zur Familie der viralen Klasse I Membranfusionsproteine, zu der auch die Fusionsproteine von Retroviren, Coronaviren, Paramyxoviren, Filoviren und Orthomyxoviren zählen. GP1 ist ein peripheres Membranprotein und interagiert mit dem zellulären Rezeptor (25, 53, 112).
Abbildung 8: Schematische Darstellung des Glykoproteins, das aus den Glykoproteinen GP-1, GP2 und dem Signalpeptid (SP) besteht (1).
Erst in den letzten Jahren ist viel Aufmerksamkeit auf das ungewöhnlich lange (58 AS) und langlebige Signalpeptid (SP) im pre-GP-C gerichtet worden (51, 67). Die Abspaltung des SP ist für die Reifung des Glykoproteins, d.h. die Spaltung in GP-1 und GP-2, sowie für die Infektiösität der neuen Viruspopulation essentiell. Auch nach seiner Abspaltung bleibt das SP mit dem Glykoprotein assoziiert. Es ist mit zwei Transmembrandomänen in der Lipidmembran verankert, wobei beide Termini in das Zytosol zeigen (Abbildung 8). Der N-Terminus des SP liegt im Zytosol myristoyliert vor. Der C-Terminus kann mit GP-2 interagieren, was für die Membranfusion wichtig zu sein scheint. Auch die kurze
SP GP-1
extrazelluläre Ekto-Domäne des SP ist in die pH-abhängige Membranfusion involviert (1, 204).
1.1.9 Der zelluläre Rezeptor
Der zelluläre Rezeptor für Lassa-Virus, LCMV und einige Neuwelt-Arenaviren ist das
ubiquitär exprimierte Protein -Dystroglycan (-DG). Zusammen mit dem
Membran-protein -Dystroglycan, bildet es den Membran-Komplex Dystroglycan, der als
transmembrane Verbindung zwischen Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM), wie z.B. Laminin und dem Aktin-Zytoskelett, sowie dem Signaltransduktions-netzwerk innerhalb der Zelle fungiert (Abbildung 9) (107).
Abbildung 9: Schematische Darstellung von Alpha-Dystroglycan (modifiziert) (164).
Alpha-DG unterliegt einer für Säugetierzellen ungewöhnlichen posttranslationalen Glykosylierung durch O-Mannosylierung und anderen Modifikationen, die sowohl für die Interaktion mit Proteinen der EZM, als auch für die Funktion als viraler Rezeptor wichtig sind. Es konnte gezeigt werden, dass Zellen mit einer fehlerhaften O-Mannosylierung weniger suszeptibel für eine Infektion mit LCMV sind (92, 108). Beide, Lassa-Virus und
LCMV, konkurrieren mit Laminin um die Bindestelle auf -DG, da die Bindestellen
teilweise überlappen. Es wird vermutet, dass es so zu einer Verdrängung von Komponenten der EZM kommt, was eine Erklärung für die physiologischen Komplikationen bei hämorrhagischen Fieber-Erkrankungen bieten könnte.
Nicht alle LCMV-Stämme haben das gleiche Bindepotential zu ihrem Rezeptor. In
Tierexperimenten konnte gezeigt werden, dass LCMV-Stämme mit hoher Affinität zu
-DG eine immunsuppressive Wirkung haben und zu persistierenden Infektionen führen. Dagegen werden LCMV-Stämme mit niedriger Affinität schnell eliminiert. Eine direkte
Korrelation zwischen der Affinität zu -DG und der Pathogenität von Arenaviren konnte jedoch nicht festgestellt werden (176, 178).
Erst kürzlich wurde der Transferrin-Rezeptor-1 (TfR1) als weiterer zellulärer Rezeptor für die pathogenen Neuwelt-Arenaviren Guanarito-Virus, Junin-Virus und Machupo-Virus identifiziert. Lassa-Virus und LCMV zeigen keine Affinität zu TfR1. Das Molekül wird stark auf Endothelzellen sowie aktivierten Makrophagen und Lymphozyten exprimiert und konstitutiv durch clathrin-abhängige Endozytose in angesäuerten Kompartimenten in die Zelle aufgenommen. Auch Arenaviren gelangen durch Endozytose in die Wirtszelle und es ist möglich, dass TfR1 als Transportvehikel für Arenaviren in die Zelle funktioniert (160).
1.2 Das Lassa-Virus Replikonsystem
Die replikative Einheit der Arenaviren ist der RNP-Komplex. Dieser besteht aus allen notwendigen Komponenten, die für eine direkte Transkription und Replikation der viralen Gene bzw. des Genoms im Zytoplasma der Zelle benötigt werden.
Im Lassa-Virus Replikonsystem wird diese replikationskompetente Einheit nach Transfektion von BSRT7/5-Zellen mit den Expressionsplasmiden für NP und L sowie einem Genom-Analogon, dem Minigenom (MG), in der Zelle hergestellt. Alle Komponenten des Replikonsystems stehen unter der Kontrolle des T7-Promotors, der die Proteinexpression im Zytoplasma unterstützt. Das entspricht dem natürlichen Replikationsvorgang, da das Lassa-Virus im Zytoplasma repliziert. BSRT7/5-Zellen zeichnen sich durch eine stabile Expression der T7-Polymerase aus (Abbildung 11A) (21).
Abbildung 10: Schematische Darstellung des Lassa-Virus Minigenoms. Die nichttranslatierten Regionen (UTRs) und die Intergen-Region (IGR) sind als cis-aktive Elemente vorhanden. Die viralen Gene für GPC und NP wurden gegen die Reporter-Gene für die Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) und Renilla-Luciferase (Renilla-Luc) ausgetauscht.
Das Minigenom basiert auf dem S-Segment des Lassa-Virus und verfügt über alle cis-aktiven Elemente. Dazu gehören die konservierten Promotorenden, die nichttranslatierten Regionen (UTRs) und die Intergen-Region (IGR). Die viralen Gene wurden durch Reporter-Gene ersetzt. Anstelle des NP wird im MG die Renilla-Luciferase in
antisense-Orientierung kodiert, während das GPC-Gen gegen das Gen der Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) in sense-Orientierung ausgetauscht wurde (Abbildung 10).
Werden nach Transfektion aller Komponenten funktionelle RNPs in der Zelle gebildet erfolgt die Transkription der Reporterproteine durch das intakte L-Protein und die Translation der viralen mRNAs an zellulären Ribosomen. Die Expression der Renilla-Luciferase wird anschließend in einem Renilla-Luciferase-Assay gemessen und dient als Maß für die transkriptionelle Aktivität des Replikonsystems (Abbildung 11B). Die replikative Aktivität kann durch die Messung der CAT-Aktivität, z.B. in einem CAT-ELISA, zusätzlich bestimmt werden, da für die Synthese der CAT-mRNA die Herstellung des Antigenoms Vorraussetzung ist.
Da die Gene für Z und GP-C nicht im Replikonsystem enthalten sind, können keine infektiösen Viruspartikel gebildet werden. Somit bietet das Replikonsystem eine Möglichkeit, Transkriptions- und Replikationsvorgänge des humanpathogenen Lassa-Virus ausserhalb des S4-Labors zu studieren. Es eignet sich vorallem gut für Mutationsanalysen der einzelnen viralen Komponenten, wobei die Aussagekraft eines artifiziellen Systems nicht die Komplexität aller Vorgänge während der viralen Replikation in einer Zelle widerspiegeln kann.
Abbildung 11: Schematische Darstellung des Lassa-Virus Replikonsystems. A) Die Expressions-Plasmide für NP und L werden zusammen mit dem Minigenom in BSRT7-Zellen transfiziert. NP, L-Protein und Minigenom-RNA bilden in der Zelle replikationskompetente RNP-Komplexe. B) Die Expression des Reporterproteins Renilla-Luciferase wird durch ein biochemisches Aktivitäts-Assay bestimmt. NP und L sind als trans-aktive Faktoren für die Funktionalität des Replikonsystems essentiell (modifiziert nach Hass et al. ) (85).
Minigenom
1.3 RNA-abhängige RNA Polymerasen (RdRP)
Eine Gemeinsamkeit von Viren ist die Expression einer abhängigen RNA-Polymerase (RdRP), die für die Transkription und Replikation des viralen Genoms in der Wirtszelle verantwortlich ist.
In RdRPs findet man 6 charakteristische Polymerase-Motive, die als pre-A (F), A, B, C, D und E bezeichnet werden. Sie enthalten hochkonservierte Aminosäuren, die für die Polymerase-Aktivität essentiell sind (19, 83, 100, 144, 150, 157). Bisher gibt es mehrere Kristallstrukturen viraler RdRPs von Positivstrang RNA-Viren der Familien Picornaviridae (Poliovirus, Human-Rhino-Virus; HRV, Foot-and-Mouth-Disease-Virus; FMDV), Caliciviridae (Rabbit-Hemorrhagic- Disease-Virus; RHDV, Norwalk-Virus; NV), Flaviviridae (Hepatitis-C-Virus; HCV) und den Doppelstrang RNA-Viren Cystoviridae (Phage 6) und Reoviridae (Reovirus) (2, 17, 26, 56, 83, 113, 117, 147, 148, 184). In den Strukturmodellen zeigte sich, dass die sechs Polymerase-Motive in der zentralen Kavität der Polymerasen liegen und an der Substratbindung, Interaktion mit Ko-Faktoren und der katalytischen Nukleotidyl-Transferase-Aktivität beteiligt sind.
Abbildung 12: Schematische Darstellung des Zwei-Metallionen-Mechanismus für den Transfer von Nukleotiden bei Polymerasen. Die Mg2+-Ionen werden von Aspartat-Resten in den Motiven A und C koordiniert. Sie positionieren das Triphosphat des neuen Nukleotids im katalytischen Zentrum und aktivieren die 3-OH-Gruppe des wachsenden Stranges für den nukleophilen Angriff. (146).
Drei konservierte Aminosäuren in den Motiven A und C sind für die Koordination von
zwei Mg2+-Ionen verantwortlich, die für den Zwei-Metallionen-Mechanismus zur Bildung
einer Phosphodiesterbindung zwischen der 3`-Hydroxylgruppe des wachsenden RNA-Stranges und dem Triphosphat des eintretenden Nukleotids notwendig sind (Abbildung 12). Die Metallionen spielen dabei eine strukturelle und katalytische Rolle, indem sie für die korrekte Positionierung des Triphosphats des eintretenden NTPs sorgen und
gleichzeitig den nukleophilen Angriff der 3’-OH-Gruppe auf die
Phosphorsäureanhydrid-Bindung zwischen dem - und dem -Phosphat stabilisieren.
Eine weitere charakteristische Eigenschaft von RdRPs ist ihr struktureller Aufbau, der der Form einer rechten Hand mit Fingern-, Handfläche- und Daumen-Domäne ähnelt und auch in DNA-abhängigen RNA-Polymerasen (DdRPs), DNA-abhängigen DNA-Polymerasen (DdDPs) und RNA-abhängigen DNA-Polymerasen (RdDPs) wiederzufinden ist (33, 152). Die katalytisch relevanten Sequenzmotive A, B und C liegen in der Handflächen-Domäne. RdRPs unterscheiden sich durch eine so genannte „Geschlossene Hand“-Konformation von anderen Polymerasen, die eine „Offene Hand“-Konformation haben. Die „Geschlossene Hand“-Konformation wird durch die Verbindung von der Finger- mit der Daumen-Domäne erreicht, wodurch im Zentrum der Polymerase ein Tunnel entsteht, der für die korrekte Platzierung der RNA-Matrize am Initiationsort im katalytischen Zentrum sorgt. Ein zweiter, positiv geladener Tunnel wird durch die geschlossene Fingerspitzen-Domäne gebildet und stellt wahrscheinlich die Eintrittspforte für negativ geladene NTPs in das katalytisch Zentrum dar, wie die Kristallstruktur der RdRP von HCV im Komplex mit Nukleotiden zeigte (149). Für die Funktion der RdRPs von Positiv- sowie Negativstrang RNA-Viren scheint die Bildung von Homooligomeren durch eine direkte Interaktion der Proteine untereinander eine wichtige Rolle zu spielen (89, 171, 175, 197, 206). Es ist jedoch nicht bekannt, ob es sich dabei um die Ausbildung von Dimeren, oder höheren Oligomeren handelt. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass durch die multiplen Interaktionen zwischen einzelnen RdRP-Monomeren des Polio-Virus ein planares Gitterwerk entsteht (Abbildung 13) (122).
Abbildung 13: Schematische Darstellung der Interaktion zwischen RdRP-Monomeren des Poliovirus. Die vier Monomere (blau, violett, grün, orange) interagieren über die zwei Verbindungsstellen (Interfaces) Int. I und Int. II in der Daumen- (T) und Finger-Domäne (F) und bilden ein planares Gitterwerk (122).
1.4 Das L-Protein des Lassa-Virus
Das L-Protein hat eine Größe von 2220 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von ca. 200 kDa, womit es das größte Protein des Lassa-Virus ist. Sequenzvergleiche zu anderen RNA-abhängigen RNA-Polymerasen haben gezeigt, dass auch das Lassa L-Protein über die sechs charakteristischen Polymerase-Motive von RdRPs verfügt (Aminosäuren 1040-1540) (192). Dass Arenaviren über ein Enzym mit RNA-abhängiger RNA-Polymerase-Aktivität verfügen, konnte mit aufgereinigten RNP-Komplexen nachgewiesen werden. In Replikonsystemen für LCMV und Tacaribe-Virus konnte die RNA-Polymerase-Aktivität dem L-Protein zugeordnet werden, da es für die Genomreplikation und Transkription essentiell ist (68, 72, 109, 116).
Anhand der Kristallstruktur der Polymerase-Domäne von HCV konnte ein hypothetisches Strukturmodell für die Polymerase-Domäne des Arenavirus L-Proteins erstellt werden. Darin zeigte sich, dass Arenaviren und andere segmentierte Negativstrang RNA-Viren eine zusätzliche helikale Struktur (Helix G und F) über der Finger- und Daumen-Domäne besitzen, die eventuell für die Interaktion mit der RNA-Matrize oder mit Nukleotiden wichtig sein könnte (Abbildung 14).
Abbildung 14: Hypothetisches Strukturmodell für die Polymerase-Domäne von Arenaviren basierend auf der Kristallstruktur der Polymerase-Domäne von HCV. Helix G und F sind nur in Polymerasen von segmentierten Negativstrang RNA-Viren zu finden (192).
Neben der Polymerase-Domäne, die aufgrund der Sequenzhomologie zu anderen Polymerasen leicht identifiziert werden konnte, sind für die N- und C-terminalen Bereiche im L-Protein kaum weitere funktionelle Details bekannt.
Sequenzentropie-Studien zeigten, dass es insgesamt vier konservierte Bereiche im L-Protein der Arenaviren gibt. Der erste konservierte Bereich erstreckt sich vom N-Terminus bis Position 250, der zweite Bereich liegt zwischen den Aminosäuren 500-900, der dritte Bereich, der die RdRP-Domäne enthält, liegt zwischen Position 1000- 1650 und der vierte Bereich bei AS 1750-1900 (Abbildung 15). Erst kürzlich konnte durch Alaninaustausche von konservierten Aminosäuren im N-Terminus des L-Proteins gezeigt werden, dass es eine zweite enzymatische Funktion im L-Protein gibt. So wurden Aminosäuren identifiziert, deren Mutation einen Einfluss auf die Transkriptions- aber nicht die Repklikationsaktivität des L-Proteins hat. Es wird vermutet, dass es sich dabei um die Funktion einer Endonuklease handelt, die für das Abspalten von Cap-Strukturen von zellulären mRNAs, die als Initiations-Primer für die virale Transkription benötigt werden, verantwortlich ist (111).
Wie bei anderen RdRPs ist die Oligomerisierung des L-Proteins vermutlich eine Vorraussetzung für die Polymerase-Aktivität. Über die Organisationsform der Oligomere sind jedoch keine Details bekannt (171).
Abbildung 15: Identifizierung von vier konservierten Bereichen im L-Protein des Lassa-Virus durch Sequenzentropie-Studien (192).
1.5 Vorhersage von Interdomänlinkern in Proteinen
Multidomänen- und Multifunktions-Proteine bestehen aus mehreren globulär gefalteten Domänen, die durch variable Bereiche, den Interdomänlinkern, voneinander getrennt sind. Interdomänlinker sind helikale oder nicht-helikale Sequenzen, die für die korrekte Positionierung von funktionellen Domänen zueinander eine wichtige Rolle spielen. Sie
können die Faltungsrate von globulären Domänen beeinflussen und zur Stabilisierung der gesamten Proteinstruktur beitragen. Sie zeichnen sich meist durch eine hohe Aminosäurevariabilität und eine wenig komplexe Sekundärstruktur aus, die dem Protein eine flexible Struktur verleiht. (190).
Die Zuordnung von globulären Domänen in multifunktionalen und Multidomänen-Proteinen ist als Grundlage für funktionelle und strukturelle Analysen von großer Bedeutung. Sie bietet die Möglichkeit, einzelne Funktionen des Proteins getrennt voneinander zu studieren oder besonders flexible Bereiche eines Proteins, die bei Kristallisationsversuchen oft Schwierigkeiten bereiten, zu umgehen. Für die Identifizierung von Domänen gibt es verschiedene bioinformatische Programme, die, basierend auf Sequenz- und Struktur-Homologien zu bekannten Proteinen, Domänen in unbekannten Proteinen vorhersagen können (126). Bei unbekannten Proteinen, deren Domänen keine Homologien zu bekannten Proteinen oder konservierten Sequenzmotiven aufweisen, ist die Vorhersage der strukturellen Unterteilung jedoch oft schwieriger. Bei der Untersuchung von bekannten Domänen und Interdomänlinkern in existierenden Proteinstrukturen ist aufgefallen, dass sich die Aminosäurekomposition von Domänen und Linkern unterscheidet. So treten einige Aminosäuren wie Prolin, Arginin, Phenylalanin, Threonin, Glutamin und Glutamat gehäuft in Interdomänlinkern auf (75). Prolin ist dabei die am häufigsten vertretene Aminosäure in Interdomänlinkern, was vermutlich damit zusammenhängt, dass Prolin aufgrund seiner sekundären Aminogruppe keine Wasserstoffbrückenbindungen eingehen kann und wenig mit anderen AS interagiert. Es wird ausserdem als „Helixbrecher“ bezeichnet, da es durch seinen starren Pyrrolidinring
einen eingeschränkten Rotationswinkel hat und oft als Begrenzung von -Helices, oder in
-Schleifen zu finden ist (62, 78, 163).
Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden Algorithmen zur Vorhersage von Domänengrenzen und Interdomänlinkern alleine anhand der Aminosäuresequenz von Proteinen entwickelt. Auch diese Vorhersage-Programme greifen auf bekannte Proteinstrukturen zurück, indem sie die Aminosäurezusammensetzung ihrer Domänen und Interdomänlinkern analysieren und so einen Domain-Linker-Index erstellen, der jeder Aminosäure einen Wert für ihre Auftrittsfrequenz in Linkern zuordnet. Es wird aber nicht nach direkten Sequenzhomologien gesucht.
Da auch das L-Protein des Lassa-Virus neben der RdRP-Domäne keine Sequenzhomologien zu anderen bekannten Proteinen aufweist, soll in dieser Arbeit mit verschiedenen bioinformatischen Vorhersage-Programmen die Domänenstruktur des
L-Proteins analysiert werden. Es sollen Positionen für Interdomänlinker identifiziert werden, die in einer anschließenden Mutagenese-Studie genauer untersucht werden.
1.6 Zielsetzung
Das 200 kDa große L-Protein, des humanpathogenen Lassa-Virus ist vermutlich ein Multidomänen- und Multifunktionsprotein. Bisher gibt es keine Kristallstruktur des Proteins und es ist nur wenig über seine Domänenstruktur bekannt. Als einzige funktionelle Domäne konnte die RNA-abhängige RNA-Polymerase-Domäne im Zentrum des Proteins identifiziert werden. Darüber hinaus ist bekannt, dass die Oligomerisierung des L-Proteins für seine Aktivität im Replikonsystem von großer Bedeutung ist.
Diese Arbeit zur Untersuchung des Lassa-Virus L-Proteins gliedert sich in zwei Themenbereiche. Zum einen sollte die Domänenstruktur des L-Proteins des Lassa-Virus untersucht werden und Interdomänlinker durch die Kombination von bioinformatischer Analyse und funktioneller Mutagenese identifiziert werden. Ziel sollte die Einteilung des L-Proteins in unabhängige Domänen und die Untersuchung ihres Zusammenwirkens im Replikonsystem sein. Basierend auf den Ergebnissen sollten Interaktionsstudien durchgeführt werden, die Aufschluss geben über die Interaktion von L-Proteinen untereinander.
Ein zweites Ziel dieser Arbeit war die Expression des L-Proteins in pro- und eukaryotischen Expressionssystemen und die anschließende Untersuchung seiner RNA-Polymerase-Aktivität. Dafür sollte ein Polymerase-Aktivitäts-Assay aufgebaut werden. Für die Expression des L-Proteins als His-, MBP- und GST-Fusionsprotein sowohl in E.coli als auch im Bakulovirus-Expressionssystem sollte ein Expressionsscreening im Hochdurchsatzverfahren angewendet werden. Zusätzlich sollte das L-Protein mit verschiedenen Affinitätstags – zum Vergleich unterschiedlicher Aufreinigungsverfahren – transient in HeLa-Zellen exprimiert werden.
2 Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Nukleinsäuren
2.1.1.1 Plasmide
pCite-2a Novagen
pLAS-MG BNI, Virologie,
pCite-NP BNI, Virologie
pCite-BA-L BNI, Virologie
pCite-MO-L BNI, Virologie
pCite-LA-L BNI, Virologie
pCite-L-FLAG-Strep BNI, Virologie
pCite-L-Strep-His BNI, Virologie
pCite-L-FLAG-His BNI, Virologie
pCite-L-C-FLAG BNI, Virologie
pCite-FFluc BNI, Virologie
pOPIN-E OPPF, Oxford, UK
pOPIN-F OPPF, Oxford, UK
pOPIN-M OPPF, Oxford, UK
pOPIN-J OPPF, Oxford, UK
2.1.1.2 Oligonukleotide
Die verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma MWG Biotech bezogen.
Die Sequenz der Primer ist in 5' 3'-Richtung angegeben.
2.1.1.2.1 Klonierungs-Primer
Full-length L-Gene pCite-L-C-HA
L-C-HA_fwd GTCCCGGACTACGCGTAGGTCGACTCTA- GAGGATCCCCGGGTA;
der Anteil des HA-Tags ist unterstrichen; das neue Stop-Codon ist fett gedruckt.
L-C-HA_rev GTCGTACGGGTACCCCTCAATGTCCTCA- ACCTCCTCCTCC;
der Anteil des HA-Tags ist unterstrichen; das Codon des
zusätzlichen Glycin-Restes zwischen HA-Tag und L-Protein ist
fett gedruckt
pCite-L-D1334N und pCite-L-D1334N-FLAG-His
LVLav_4014+ TCTTTTTAACCAGGACTTAACAGACC; der Primer ist 3’-phosphoryliert D1334N- GATATTTGATCATTACTTGAAGTGT; Mutation ist unterstrichen
pCite-L-FLAG-His
pCite-LVLav-FLAG-His_rev GCCTAGTGATGGTGGTGATGATGACCGT- CATGGTCTTTGTAGTCCTCAATGTCCTCA-ACCTCCTCCTCC;
die Sequenz des His-Tags ist kursiv gedruckt, der FLAG-Tag ist unterstrichen; das artifizielle Stop-Codon ist fett gedruckt
Klonierung von N- und C-terminalen Domänen des L-Proteins pCite-L-N1
pCite+P_fwd GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTA; der Primer ist 3’-phosphoryliert
L-T469-rev CGCTAAGTCACTCCAGTGACATCGAAGTTC; das neue Stop-Codon ist fett gedruckt
pCite-L-N1-HA
L-T469-HA_rev CGCTACGCGTAGTCCGGGACGTCGTAC- GGGTACCCAGTCACTCCAGTGACAT;
die HA-Tag-Sequenz ist unterstrichen das Stop-Codon ist fett gedruckt; das Glycin-Codon ist fett und kursiv gedruckt
pCite-L-N1-3xFLAG
C-term-3xFLAG+ GACTACAAGGATGACGATGACAAGTAG- CGGTCGACTCTAGAGGATCCC;
die Sequenz des FLAG-Tags ist unterstrichen; das neue Stop-Codon ist fett gedruckt
C-term-3xFLAG+P- GATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCA- TGGTCTTTGTAGTCCCC;
die Sequenz des FLAG-Tags ist unterstrichen; das Glycin-Codon ist fett gedruckt; das 5’-Ende ist phosphoryliert
pCite-L-N2
pCite+P_fwd GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTA; der Primer ist 3’-phosphoryliert
L-N941+cg_rev CGCTAATTCCCTCCCTTCATTGAGCCTAAAC; das Stop-Codon ist fett gedruckt
pCite-L-N2-HA
pCite+P_fwd GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTA L-N941-HA-Tag-rev CGCTACGCGTAGTCCGGGACGTCGTACG-
GGTACCCATTCCCTCCCTTCATTGAGCCTAAAC;
der HA-Tag ist unterstrichen, das neue Stop-Codon ist fett gedruckt; das Glycin-Codon ist fett und kursiv gedruckt
p-Cite-L-N2-3xFLAG
C-term-3xFLAG+ GACTACAAGGATGACGATGACAAGTAGC- GGTCGACTCTAGAGGATCCC;
der FLAG-Tag-Anteil ist unterstrichen; das neue Stop-Codon ist fett gedruckt
C-term-3xFLAG+P- ATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCAT- GGTCTTTGTAGTCCCC;
der FLAG-Tag Anteil ist unterstrichen; das Glycin-Codon ist fett gedruckt; der Primer ist 5’-phosphoryliert
pCite-L-C1 und pCite-L-C1-HA
L-V465_fwd CCATGGTCACTGGAGTGACTCCCACAATCA; das neue Start-Codon ist fett gedruckt
pCite-L-C1-3xFLAG
N-term-V465-3xFLAG+ ACAAGGATGACGATGACAAGGGGGTCAC- TGGAGTGACTCCCACAAT;
der FLAG-Tag ist unterstrichen; das Glycin-Codon ist fett gedruckt
N-term-3xFLAG+P- AGTCGATGTCATGATCTTTATAATCCCCG- TCATGGTCTTTGTAGTCCATG;
der FLAG-Tag-Anteil ist unterstrichen; das neue Start-Codon ist fett gedruckt; der Primer ist 5’-phosphoryliert
pCite-L-C2 und pCite-L-C2-HA
L-cc-M937_fwd CCATGAAGGGAGGGAATAGTGAACCAT; das neue Start-Codon ist fett gedruckt
pCite+P-2_rev TATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGA; der Primer ist 5’-phosphoryliert
pCite-L-C2-3xFLAG
N-term-M937-3xFLAG+ ACAAGGATGACGATGACAAGGGGAAGG- GAGGGAATAGTGAACCATCAA;
der FLAG-Tag ist unterstrichen; das Glycin-Codon ist fett gedruckt
N-term-3xFLAG+P- AGTCGATGTCATGATCTTTATAATCCCC- GTCATGGTCTTTGTAGTCCATG;
der FLAG-Tag-Anteil ist unterstrichen; das neue Start-Codon ist fett gedruckt
In-Fusion-Klonierung von L-Genen in die pOPIN-Vektoren Die homologen Sequenz-Überhänge sind unterstrichen.
pOPINE-LA-L und pOPINM-LA-L
pOPE-LV1-fwd AGGAGATATACCATGGAGGAGGACATAGCCTA
pOPE-LV1-rev GTGATGGTGATGTTTCTCAATGTCCTCAACCTCCT
pOPINF-LA-L und pOPINJ-LA-L
pOPF-LV1-fwd AAGTTCTGTTTCAGGGCCCGATGGAGGA- GGACATAGCCTA
pOPF-LV1-rev ATGGTCTAGAAAGCTTTACTCAATGTCCTCAACCTCCT
pOPINE-BA-L und pOPINM-BA-L
pOPE-BA1-fwd AGGAGATATACCATGGAAGATGACATGGCTTG pOPE-BA1-rev GTGATGGTGATGTTTCTCAATGTCCTCAATGCCCT
pOPINF-BA-L und pOPINJ-BA-L
pOPE-BA1-fwd AAGTTCTGTTTCAGGGCCCGATGGAAGA- TGACATGGCTTG
pOPE-BA1-rev ATGGTCTAGAAAGCTTTACTCAATGTCCTCAATGCCCT
pOPINE-MO-L und pOPINM-MO-L
pOPE-MO1-fwd AGGAGATATACCATGGAGGAGTTGCTGTCCGA pOPE-MO1-rev GTGATGGTGATGTTTCTCAATGTCGAGGGGAGGCC
pOPINF-MO-L und pOPINJ-MO-L
pOPF-MO1-fwd AAGTTCTGTTTCAGGGCCCGATGGAGGAG- TTGCTGTCCGA
Klonierung von Minigenomvarianten zur Synthese von RNA-Matrizen für das Polymerase-Aktivitäts-Assay
pCite-MG-Ren100 (T2)
MG-Ren100_fwd TGAAGGAGTCCAGCACGTTCATTTGC MG-Ren100_rev GGTGTGAAAGAAGCCTGAATTGC; der Primer ist 5’-phosphoryliert
pCite-MG-UTRs+loop (T1)
5’UTR_fwd+(P) GCGCAATCCAATAGCCTAGGATCC; der Primer ist 3’-phosphoryliert
3’UTR+loop_rev TCTCTTGAAGCGCAACCAAAATGCCTAGGATCC;
die integrierte Loop-Sequenz ist fett gedruckt
2.1.1.2.2 Vektor-Primer pAcSG2_fwd TGAGACGCACAAACTAATATCACA pAcSG2_rev TAATACGCCGGACCAGTGAACAGA pUC_fwd(-47)+ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC pUC_rev(-48)- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA pUC_fwd(-110)+ TGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCA pUC_rev(-123)- TGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCA pX12_3640+ AGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACA pOPIN-fwd GGATCGGACCGAAATTAATACG pOPIN-rev CATATGTCCTTCCGAGTGAGA pCite+P-2_rev TATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGA 2.1.1.2.3 Mutagenese-Primer
Die Insertions-Sequenz in den Mutagenese-Primern ist fett gedruckt. Insertion von fünf Aminosäuren
S407 L_S407_ins5+ GTCTGGAGACGGGTCTGGTTCT- ACAGCACCTTCCCAGTGTTT L_S407_ins5- TAGAACCAGACCCGTCTCCAGA- CTTAGAACTCTCAACTTGCT G446 L_446_Ins5+ GGTGGAGACGGGTCTGGTGGTGT- TGACATGAGTGTAATTGGTCTT L_446_Ins5- ACCACCAGACCCGTCTCCACCAA- AGTGATTCATGTTTATCCCAAC
G467 L_467_Ins5+ TGGAGGAGACGGGTCTGGTGGA- GTGACTCCCACAATCAGTTA L_467_Ins5- CTCCACCAGACCCGTCTCCTCCA- GTGACATCGAAGTTCATAA Y583 L_Y583_Ins5+neu GGTACGGAGACGGGTCTGGTTACT- TCCCTGCAATCTTTTCAGCTGAAG L_Y583_Ins5-neu GAAGTAACCAGACCCGTCTCCGTA- CCTTTTAGGATCAGCATAAAAAGA G738 L_G738_Ins5+ne GGTGGAGACGGGTCTGGTGGTCAT- GTGAGTGTGAACCCTGCAGACAT L_G738_Ins5-ne CATGACCACCAGACCCGTCTCCAC- CAAACTCTATTTTAGGCTCAAGA G774 L_774_Ins5+ GGGAGGAGACGGGTCTGGTGGA- CCAGAGTACAAAAAGCCTGG L_774_Ins5- GTCCACCAGACCCGTCTCCTCCC- CTAGGGGCTGTGCATCCTT G939 L_939_Ins5+ GGGAGGAGACGGGTCTGGTGGA- GGGAATAGTGAACCATCAAT L_939_Ins5- CTCCACCAGACCCGTCTCCTCCC- TTCATTGAGCCTAAACCAG V1113 L_V1113_Ins5+neu CAGTGGGAGACGGGTCTGGTGTGG- GGCCTGATACAGGGCGATTAAAGT L_V1113_Ins5-neu GCCCCACACCAGACCCGTCTCCCAC- TGAATTGTAGGATTGTGGTGAC L1546 L_L1605_Ins5+ TTAGGAGACGGGTCTGGTTTAGAGT- TCTCATGGCTGAACCTGGCTGC L_L1605_Ins5- ACTCTAAACCAGACCCGTCTCCTAA- GTCAGATTCTGATGGGGGGTCA A1712 L_1712_Ins5+ GCAGGAGACGGGTCTGGTGCAGCC- AAACCATTAGAGTTTTTTAAG L_A1712_Ins5- GGCTGCACCAGACCCGTCTCCTGCC- TTGGGTTCCCCCAAGACCCA
N1722 L_1722_Ins5+ TAATGGAGACGGGTCTGGTAATC- CTTGTGATTATTTCCCTTT L_1722_Ins5- GATTACCAGACCCGTCTCCATTATGCTT- AAAAAACTCTAATG Y1726 L_1726_Ins5+ TATGGAGACGGGTCTGGTTATTTCCCTT- TGAAGCCGACCGCATCA L_Y1726_Ins5- GAAATAACCAGACCCGTCTCCATAATCA- CAAGGATTATGCTTAAA G1865 L_G1930_Ins5+ GGGGGAGACGGGTCTGGTGGGTCATTC- ACATGGTTCCCTCACAAGAT L_G1930_Ins5- ATGACCCACCAGACCCGTCTCCCCCCA- AAGTCCTAGTTGTAGCCACA S2019 L_S2019_Ins5+ TCAGGAGACGGGTCTGGTTCACTACCC- CCAGGATCCGTAAAGTTAAG L_S2019_Ins5- GGTAGTGAACCAGACCCGTCTCCTGAC- TCAATGGCATCAAAGAAGTCT V2074 L_V2155_Ins5+ GTGGGAGACGGGTCTGGTGTGGGCCCC- TGCTCTGAGGCGATTCCTCTG L_V2155_Ins5- GGGCCCACACCAGACCCGTCTCCCACCA- AGACAAAATCATGTTCTACA
Insertion von zehn Aminosäuren (Verlängerung der 5-Aminosäure-Insertionen) Die neu eingefügte Sequenz ist unterstrichen.
S407 L_407_Ins10+ GGGTCTGGTGGGAAAGCTGACGGGTCTAC- AGCACCTTCCCAGTGT L_407_Ins10- TGTAGACCCGTCAGCTTTCCCACCAGACCC- GTCTCCAGACTTAGA G446 L_446_Ins10+ GGGTCTGGTGGCAAAGCTGACGGGGGTGT- TGACATGAGTGTAATTGG L_446_Ins10- ACCCCCGTCAGCTTTGCCACCAGACCCGTC- TCCACCAAAGTGATTCAT
G467 L_467_Ins10+ GGGTCTGGTGGCAAAGCTGACGGGGGAGT- GACTCCCACAATCAGT L_467_Ins10- CACTCCCCCGTCAGCTTTGCCACCAGACCC- GTCTCCTCCAGTGAC G774 L_747_Ins10+ GGGTCTGGTGGCAAAGCTGACGGGGGACC- AGAGTACAAAAAGCCT L_747_Ins10- TGGTCCCCCGTCAGCTTTGCCACCAGACCC- GTCTCCTCCCCTAGG G939 L_939_Ins10+ GGGTCTGGTGGCAAAGCTGACGGGGGAGG- GAATAGTGAACCATCA L_939_Ins10- CCCTCCCCCGTCAGCTTTGCCACCAGACCC- GTCTCCTCCCTTCAT N1722 L_1722_Ins10+ GGGTCTGGTGGCAAAGCTGACGGGAATCC- TTGTGATTATTTCCCT L_1722_Ins10- AGGATTCCCGTCAGCTTTGCCACCAGACCC- GTCTCCATTATGCTT S1952 L_1952_Ins10+ CTGGTGGCAAAGCTGACGGGTCACTACCCC- CAGGATCCGTAAAGTTAA L_1952_Ins10- GGTAGTGACCCGTCAGCTTTGCCACCAGAC- CCGTCTCCTGACTCAATG V2074 L_2074_Ins10+ GTCTGGTGGCAAAGCTGACGGGGTGGGCCC- CTGCTCTGAGGCGATT L_2074_Ins10- GCCCACCCCGTCAGCTTTGCCACCAGACCCG- TCTCCCACCAAGACA
PCR-basierte Teilung des L-Proteins in N- und C-terminale Domänen
Der Anteil der CITE-Region in den Primern ist unterstrichen, artifizielle Start-Codons sind fett gedruckt, artifizielle Stop-Codons sind fett und kursiv gedruckt.
L-407
CITE-L_M421-fwd TGAAAAACACGATGATAATACCATGAAGTCT- ACAGCACCTTCCCAGTGTT
CITE-L_M421-rev AACACTGGGAAGGTGCTGTAGACTTCATGGT- ATTATCATCGTGTTTTTCA
L-M421-stop-tail-rev AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAC- CTATGCTGTAGACTTAGAACTCTCAACTT L-446 CITE-L_H444-fwd CTTTGAAAAACACGATGATAATACCATGCACT- TTGGTGTTGACATGAGTG CITE-L_H444-rev CACTCATGTCAACACCAAAGTGCATGGTATT- ATCATCGTGTTTTTCAAAG L-D448-stop-tail-rev AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGA- CCTAGTCAACACCAAAGTGATTCATGTTT L-467 CITE-L_G486-fwd TGAAAAACACGATGATAATACCATGACTGGA- GTGACTCCCACAATCAGTT CITE-L_G486-rev AACTGATTGTGGGAGTCACTCCAGTCATGGT- ATTATCATCGTGTTTTTCA L-G488-stop-tail-rev AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGA- CCTAAGTCACTCCAGTGACATCGAAGTTCA L-774 CITE-LM811-fwd TGAAAAACACGATGATAATACCATGAGGGGA- CCAGAGTACAAAAAGCCTG CITE-LM811-rev CAGGCTTTTTGTACTCTGGTCCCCTCATGGTAT- TATCATCGTGTTTTTCA L-E815-stop-tail-rev AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAC- CTACTCTGGTCCCCTAGGGGCTGTGCATC L-L1546 CITE-L_L1605-fwd TGAAAAACACGATGATAATACCATGTCTGACT- TAGAGTTCTCATGGCTGA CITE-L_L1605-rev TCAGCCATGAGAACTCTAAGTCAGACATGGTA- TTATCATCGTGTTTTTCA L-L1605-stop-tail-rev AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAC- CTAGAACTCTAAGTCAGATTCTGATGGGG L-N1722 CITE-L_N1722-fwd TGAAAAACACGATGATAATACCATGAAGCATA- ATCCTTGTGATTATTTCC CITE-L_N1722-rev GGAAATAATCACAAGGATTATGCTTCATGGTA- TTATCATCGTGTTTTTCA L-N1722-stop-tail-rev AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAC- CTAACAAGGATTATGCTTAAAAAACTCTA L-1952 CITE-L_I1950-fwd CTTTGAAAAACACGATGATAATACCATGATTG- AGTCACTACCCCCAGGAT
CITE-L_I1950-rev ATCCTGGGGGTAGTGACTCAATCATGGTATTA- TCATCGTGTTTTTCAAAG L-P1954-stop-tail-rev AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAC- CTAGGGTAGTGACTCAATGGCATCAAAG L-2074 CITE-L_V2072-fwd CTTTGAAAAACACGATGATAATACCATGGTCT- TGGTGGGCCCCTGCTCTG CITE-L_V2072-rev CAGAGCAGGGGCCCACCAAGACCATGGTATTA- TCATCGTGTTTTTCAAAG L-P2076-stop-tail-rev AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAC- CTAGGGGCCCACCAAGACAAAATCATGT
Primer für die Fusion eines terminalen HA-Tags an die PCR-basierten N- und C-terminalen Domänen
Die Sequenz des HA-Tags ist unterstrichen. Das neue Stop-Codon ist kursiv und fett gedruckt. L-CtermHA-LB TTTCTACGCGTAGTCCGGGACGTCGTACGGG- TACCCCTCAATGTCCTCAACCTCCTCCTCCTTTTC L-G448-C-HA-Stop_rev CTACGCGTAGTCCGGGACGTCGTACGGGTAC- CCGTCAACACCAAAGTGATTCATG L-E815-C-HA-Stop_rev CTACGCGTAGTCCGGGACGTCGTACGGGTAC- CCCTCTGGTCCCCTAGGGGCTGTG L-P1954-C-HA-Stop_rev CTACGCGTAGTCCGGGACGTCGTACGGGTAC- CCGGGTAGTGACTCAATGGCATCA L-P2076-C-HA-stop_rev CTACGCGTAGTCCGGGACGTCGTACGGGTAC- CCGGGGCCCACCAAGACAAAATCA 2.1.1.2.4 Sonstige Primer LVSav34000- CGCACAGTGGATCCTAGGCTATTGGA; der konservierte 3’-Terminus ist unterstrichen Ren_001-plus ATGGCTTCCAAGGTGTACGACCCCG
RPA-T7-renilla_fwd GATAATACGACTCACTATAGGGGGAAGGTTCAG- CAGCTCGAACCAAGC;
der T7-Promotor ist unterstrichen
Ren100(-5’-UTR)+ GATAATACGACTCACTATAGGGTGAAGGAG- TCCAGCACGTTCATTTG
FF+3’UTR_rev AGCGGATAGAATGGCGCCGGGCCTTTCTTTA- TGTTTTTGGCGTCTTCCATGGATCCGATAACC-
TAACGCG;
die Sequenz der Firefly-Luciferase ist fett gedruckt T7+5’UTR_fwd TAATACGACTCACTATAGGGAGGATCCGT-
AAAACCAACGCG;
der T7-Promotor ist unterstrichen
2.1.1.3 Andere Nukleinsäuren
Mouse Liver Poly A+RNA Clontech
RNA CenturyMarker Templates Ambion
CpG Sigma-Aldrich
GpC Sigma-Aldrich
2.1.1.4 Radionukleotide
-P32
-ATP 110 TBq/mmol Hartmann Analytic
-P32
-CTP 110 TBq/mmol Hartmann Analytic
-P32
-GTP 110 TBq/mmol Hartmann Analytic
-P32
-UTP 110 TBq/mmol Hartmann Analytic
2.1.2 Zelllinien und Bakterienstämme Insektenzelllinien
Spodoptera frugiperda 9 Zellen (Sf9-Zellen) Invitrogen
Andere Zelllinien
BHK-J-Zellen BNI, Virologie
(Baby Hamster Kidney Zellen)
BSR-T7/5-Zellen Prof. Conzelmann,
(BHK-21 Abkömmlinge, Universität München
stabile T7-Polymerse Expression)
HeLa-Zellen BNI, Virologie
Bakterienstämme
One ShotTop10F’ chemischkompetente Zellen Invitrogen
F´ lacIq Tn10 (TetR)
mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 araD139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG
E.cloni 10G chemischkompetente Bakterien Lucigen
F- mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC)
80dlacZM15 lacX74 endA1 recA1araD139 (ara, leu)7697
galU galK rpsL nupG - tonA
Rosetta(DE3)LysS F- ompT hsdSB(rB-mB-) OPPF, Oxford, UK
gal dcm (DE3)
pLysSRARE2 (CamR)
B834(DE3) F-ompT gal hsdSB(rB-mB-)
met dcm lon DE3
Fusion-Blue chemischkompetente E.coli Bakterien Clontech
recA1, endA1 hsdR17 (rK12-,mK12+), supE44, thi-1, gyrA96, relA1, lacF’
[proA+
Bb+,lacIq1Z M15:: Tn10(tetR)]
2.1.3 Viren
Modifizierters Vaccinia Ankara Virus (MVA-T7) Prof. Sutter,
Universität München
Bakulo-AV-L BNI, Virologie
2.1.4 Antikörper
-Maus peroxidase-gekoppelter AffiPure Schaf IgG Jackson Immuno
Research Laboratories
-Rabbit peroxidase-gekoppelter AffiPure Schaf IgG Jackson Immuno
Research Laboratories
-FLAG monoklonaler Maus-Antikörper Sigma-Aldrich
-FLAG monoklonaler Kaninchen-Antikörper Sigma-Aldrich
-FLAG M2 Antikörper, Peroxidase-gekoppelt Sigma-Aldrich
-HA Kaninchen-Antikörper Sigma-Aldrich
-polyHistidin monoklonaler Antikörper R&D Systems
-Kaninchen IgG, FITC-konjugiert SIFIN
-Kaninchen IgG, Rhodamin-konjugiert Dianova
-Maus AffiPure Schaf IgG, Rhodamin-konjugiert Jackson Immuno
Research Laboratories 2.1.5 Zellkulturmedien Insekten-Zellkulturmedium Sf-900 SFM (1x) Gibco 1000 ml Sf-900 SFM 10 ml 100x Penicillin/Streptomycin PAA Andere Zellkulturmedien
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) PAA
500 ml DMEM 50 ml FKS PAA 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 5 ml L-Glutamin (100x) PAA 5 ml 100x Nicht-essentielle Aminosäuren PAA 5 ml 100x Pyruvat PAA
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) PAA
500 ml GMEM
25 ml FKS PAA
5 ml 100x Nicht-essentielle
Aminosäuren PAA
20 ml Tryptosephosphat Broth Sigma-Aldrich
(5ml Geniticin G418) PAA
Bakterienkulturmedien
LB Broth Base Invitrogen
20 g/l
- autoklavieren, 15 min, 121 °C
LB Agar (Lennox L Agar) Invitrogen
32 g/l
- autoklavieren, 15 min, 121 °C - 100 g/ml Carbenicillin
- für Blau-Weiß-Screening wurden die Agar-Platten nachträglich mit 40 l X-Gal (20 mg/ml) und 4 l IPTG (200 mM) behandelt.
Overnight ExpressInstant TB Novagen
60 g/L 10 ml/L Glycerin PowerBroth Athena ES 52 g/L 1% Glukose 4 ml/L Glycerin 2.1.6 Enzyme Restriktionsendonukleasen AatII NEB DpnI NEB
EcoRI MBI HindIII MBI KpnI MBI NcoI NEB PmeI NEB PstI MBI SalI MBI SapI NEB Andere Enzyme
Benzonase Nuklease Novagen
MolTaq (Taq-DNA-Polymerase) Molzym
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase Finnzymes
Proteinase K Roche
RNase A Qiagen
RNase-freie DNaseI Promega
T7-RNA-Polymerase MBI
2.1.7 Chemikalien und Reagenzien
Agarose, GTQ ultra pure Roth
Aqua ad iniectabilia Baxter
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-
D-galactopyranoside (X-Gal) Roth
Carbenicillin Roth
Complete Proteaseinhibitor Cocktail Sigma-Aldrich
4’,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Boehringer Ingelheim
Dinatriumhydrogenphosphat Roth
DNA-Marker, 1kb Fermentas
Dithiothreitol (DTT) Serva und
Boehringer Ingelheim Entwicklerlösung A G153 Agfa Entwicklerlösung B G153 Agfa Essigsäure Roth Ethanol Roth Ethidiumbromid Roth
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Roth
Fast Green FCF Serva
Formaldehyd Roth
Formamid Roth
Fugene HD Transfection Reagent Promega
Glycerin Roth Imidazol Roth Isopropanol Roth Lipofectamine 2000 Invitrogen Magnesiumchlorid Roth Milchpulver Roth Natriumchlorid Roth
Natriumdodecylsulfat (SDS) Ultra Pure Roth
Natriumhydrogenphosphat Roth
Neutralrot in Lösung Sigma-Aldrich
NuPAGE MOPS SDS-Running Buffer (20 x) Invitrogen
NuPAGE Tris Acetat Running Buffer (20x) Invitrogen
NuPAGEAntioxidant Invitrogen
Novex TBE Running Buffer (5x) Invitrogen
Prolong Gold Antifade reagent Invitrogen
Protease Inhibitor Cocktail for
Histidine-tagged proteins Sigma-Aldrich
Protein G Sepharose GE Healthcare
Protein A Sepharose GE Healthcare
Rapid Fixer Fixierlösung G354 Agfa
Roti-Block Roth
Roti-Quant Roth
Strep-Tactin Sepharose IBA
SupersignalWest Pico Chemiluminescent Substrate Pierce
SupersignalWest Femto Chemiluminescent Substrate Pierce
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain Roche
Triton X-100 ICN
Trizol Invitrogen
Tween 20 Roth
