2.2 M ETHODEN
2.2.1 Molekularbiologische Methoden
Die spezifischen Amplifikation von DNA-Molekülen erfolgte mittels Polymerase-Ketten-Reaktion. In diesem zyklischen Prozess wird eine doppelsträngige DNA-Matrize bei hoher Temperatur (95 – 98°C) zu Einzelsträngen aufgeschmolzen (Denaturierung) um die Bindung von sequenzspezifischen Oligonukleotiden in einem Anlagerungsschritt zu ermöglichen (Annealing). Die Kettenverlängerung (Elongation) findet am Temperaturoptimum der thermostabilen DNA-Polymerase statt (72°C). In jedem Zyklus wird die Kopienanzahl der vorhandenen DNA-Matrize verdoppelt.
Standard PCR mit der Phusion-Polymerase
Für die PCR-basierte Mutagenese des L-Proteins und für die Amplifikation von DNA-Matrizen für Klonierungen wurde die Phusion High Fidelity DNA-Polymerase verwendet.
Da sie über 3’-5’-Exonukleaseaktivität verfügt, können bei der Elongation fehlerhaft integrierte Nukleotide erkannt und korrigiert werden. Die Phusion-DNA-Polymerase hat dadurch im Vergleich zu herkömmlichen Polymerasen eine sehr niedrige Fehlerrate. In Tabelle 1 ist ein Standard-Ansatz gezeigt.
Tabelle 1: Standard-Ansatz für eine PCR mit der Phusion-DNA-Polymerase
Komponente Volumen [l]
H2O 32,5
5x PCR Puffer HF 10,0 dNTP`s (10 mmol/l) 1,0 Vorwärtsprimer (10 mol/l) 2,5 Rückwärtsprimer (10 mol/l) 2,5 Template DNA (10 ng) 1,0 Phusion-DNA-Polymerase (2 U/l) 0,5
Für die Reaktion wurde folgendes Temperaturprogramm gewählt.
1 min 98°C Denaturierung
1. 30 Zyklen: 5 s 98°C Schmelzen (Denaturierung) 10 s 60°C Anlagerung (Annealing) 2,5 min 72°C Polymerisierung (Elongation) 2. 10 min 72°C abschließende Verlängerung 3. bis zur weiteren Analyse Lagerung bei 4°C
PCR mit Taq-Polymerase
Zur Amplifikation kurzer DNA-Fragmente wurde die Taq-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus verwendet. Ein Standard-Ansatz ist in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2: PCR-Ansatz für eine PCR mit der Taq-Polymerase.
Komponente Volumen [l]
H2O 16,5
10x PCR Puffer (1,5 mM Mg2+) 2,5
dNTPs (2mmol/l) 2,5
DNA-Matrize (5ng/l) 1,0 Primer 1 (10 mol/l) 1,0 Primer 2 (10 mol/l) 1,0 Taq-DNA-Polymerase (5U/l) 0,2
Das Thermocyklerprogramm für die PCR mit der Taq-Polymerase sah folgendermaßen aus:
1. 2 min 95°C Denaturierung
2. 30 Zyklen: 20 s 95°C Schmelzen (Denaturierung) 1 min 58°C Anlagerung (Annealing) 1 min 72°C Polymerisation (Elongation) 3. 10 min 72°C abschließende Verlängerung 4. bis zur weiteren Analyse Lagerung bei 4°C
2.2.1.2 Agarose-Gelelektrophorese
Nukleinsäuren wurden durch horizontale Agarose-Gelelektrophorese in Abhängigkeit von ihrer Größe aufgetrennt. DNA-Proben wurden im Verhältnis 1:6 mit 6x Ladepuffer gemischt und in die Geltaschen eines 1-2%-igen Agarose-Gels gegeben. Zur Größenbestimmung wurden 5 l eines Größenstandards mit auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte für ca. 50 min bei 80 V in 1x TAE-Puffer. Anschließend wurde die
DNA mit dem interkalierenden Fluorophor Ethidiumbromid (1:10000 in 1x TAE), angefärbt und mit UV-Licht bei einer Wellenlänge von 245 nm visualisiert.
2.2.1.3 Aufreinigung von PCR-Produkten
Für die Aufreinigung von PCR-Produkten wurde das NukleoSpin Extract II-Kit verwendet.
Alternativ wurden Produkte durch eine Präzipitation mit Ethanol aufgereinigt. PCR-Reaktionen wurden dazu mit H2O auf 100 l aufgefüllt und mit 250 l 100% Ethanol und 10 l 3 M NaAc, pH 5,6 gemischt. Nach Zentrifugation des Ansatzes für 15 min bei 13.000 rpm und 4°C wurde die präzipitierte DNA mit 100 l 75% Ethanol gewaschen. Das DNA-Pellet wurde 5 min bei RT getrocknet und in 20-50 l H2O aufgenommen. Die DNA wurde auf einem 1%igen Agarose-Gel kontrolliert.
Zur Gelaufreinigung von PCR-Produkten z.B. nach einem Restriktionsverdau wurde ebenfalls das NukleoSpin Extrakt II-Kit verwendet. Dafür wurden die ausgeschnittenen Gelstücke in einem chaotropen Bindungspuffer bei 50°C aufgelöst. Die DNA wurde nach einem Waschschritt mit ethanolhaltigem Waschpuffer in 40-50 l H2O eluiert.
2.2.1.4 Restriktionsspaltung von DNA-Molekülen
DNA-Moleküle können mit spezifischen Restriktionsendonukleasen gespalten werden. Für die enzymatische Reaktion wurden die Enzyme nach Herstellerangaben mit den empfohlenen Reaktionspuffern verwendet.
Für die Berechnung der benötigten Enzym-Units (U) wurde folgende Formel angewendet:
Vektor: zu spaltendes Plasmid
Schnitte (Vektor): Anzahl der Schnittstellen des Enzyms im Plasmid
Referenz: je nach Enzym Lambda-DNA (48 kb), Adenovirus-DNA (36 kb), T7-DNA (40 kb)
Schnitte (Referenz): Anzahl der Schnittstellen des Enzyms in der Referenz-DNA (Herstellerangaben)
Die berechneten Einheiten aus dieser Gleichung gelten für eine Spaltung bei 37°C für 1 h.
2.2.1.5 Ligation von DNA
Ligation mit T4-Ligase
Die Ligation von DNA-Molekülen erfolgte mit dem Rapid-DNA-Ligation-Kit nach Herstellerangaben. Die T4-Ligase katalysiert die Entstehung von Phosphodiesterbindungen
zwischen einer 5’-Phosphat- und einer 3’-OH-Gruppe und kann so DNA-Moleküle miteinander verknüpfen.
Ligation von Vektor und PCR-Produkten durch die In-Fusion-Methode
Das Enzym für die In-Fusion-Reaktion ist eine DNA-Polymerase des Poxvirus mit 3’-5’-Exonuklease-Aktivität und katalysiert die Ligation von DNA-Molekülen über kurze homologe Sequenzabschnitte (82). Die dafür erforderlichen homologen Sequenzen wurden mittels PCR durch Primer, die diese Sequenzen kodieren, an das Fremdgen fusioniert.
Durch Inkubation des PCR-modifizierten linearisierten Vektors und Fremdgen mit dem Enzym, erzeugt es durch seine Exonuklease-Aktivität einzelsträngige Überhänge an beiden DNA-Molekülen. Diese werden dann nichtkovalent miteinander verknüpft. Das so entstandene Vektor-Fremdgen-Molekül kann anschließend zur Amplifikation in E.coli Bakterien transformiert werden.
Die PCRs zum Anfügen der sequenzspezifischen Überhänge an das Fremdgen wurden mit der Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase durchgeführt.
Die pOPIN-Vektoren wurden für die Klonierung mit den Enzymen KpnI und HindIII (pOPIN-F und J), NcoI und PmeI (pOPIN-E) und KpnI und PmeI (pOPIN-G) linearisiert.
Für eine Standard-Ligationsreaktion wurde die Hälfte eines In-Fusion Dry-Down-Ansatzes verwendet und mit 50 ng Insert und 50 ng Vektor in einem Gesamtvolumen von 5 l für 60 min bei 42°C inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wurden 20 l TE-Puffer zum Ansatz gegeben.
2.2.1.6 DNA-Sequenzierung
Sequenzierungen von DNA-Proben wurden von der Firma MWG durchgeführt.
Pro Sequenzreaktion wurden 20 ng DNA/100 bp eines PCR-Produktes bzw. 1 g Plasmid-DNA bei 37°C auf dem Heizblock eingedampft.
2.2.1.7 Transformation und Retransformation von E.coli
Zur Vervielfältigung von Plasmid-DNA wurde diese in E.coli-Bakterien transformiert.
Dazu wurde ein Aliquot chemischkompetenter E.coli-Zellen auf Eis aufgetaut und mit 1-2 l aufgereinigter Plasmid-DNA oder 2-5 l eines Ligationsansatzes gemischt und für 20-30 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 45 s bei 43,5°C wurden die Zellen auf Eis gestellt, 200 l LB-Medium hinzugefügt und bei 37°C auf dem Schüttler für 30 min zur Expression der Antibiotikaresistenz weiter inkubiert. Anschließend wurden 50 und 100 l des Transformationsansatzes auf LB-Agar-Platten, komplementiert mit dem
Selektionsantibiotikum Carbenicillin-Dinatriumsalz (100 mg/l), ausgestrichen und die Agar-Platte für 16 h bei 37°C inkubiert. In einigen Fällen konnte die Plasmid-Ausbeute erhöht werden, indem 50 l des Transformationsansatzes direkt in 100 ml LB-Carbenicillin-Medium gegeben wurden. Andere Bakterien-Stämme wurden nach Herstellerangaben transformiert.
2.2.1.8 Aufreinigung von Plasmid-DNA
Zur Aufreinigung von großen Mengen Plasmid-DNA (> 40 g) aus transformierten E.coli-Kulturen wurde das Nucleobond Xtra Midi Plus-Kit nach Herstellerangaben verwendet.
Dazu wurden 100 ml LB-Carbenicillin-Medium mit einer E.coli-Kolonie oder 100 ml eines Transformationsansatzes angeimpft und 16-20 h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 6000 rpm und 4°C für 15 min pelletiert. Die aufgereinigte Plasmid-DNA wurde in 50 - 200 l sterilem H2O aufgenommen.
Für Mini-Präparationen wurde das NucleoSpin Plasmid-Kit verwendet. Die Zellen von 3-5 ml einer ÜN-Kultur wurden durch Zentrifugation pelletiert und anschließend in Resuspensionspuffer aufgenommen. Nach der Lyse wurde die DNA über Silica-Säulen aufgereinigt und in 50 l H2O von der Säule eluiert.
2.2.1.9 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Konzentrationen von Nukleinsäuren in Lösung wurden photometrisch bei einer Wellenlängen von 260 nm gegen H2O als Referenzwert bestimmt.
Zur Vermessung wurden die Proben 1:30 mit H2O verdünnt.
2.2.1.10 In vitro-Transkription von DNA
Die Synthese von RNA-Sonden oder RNA-Matrizen z.B. für das Polymerase-Assay von einer DNA-Matrize wurde mit dem MEGAscript High Yield Transcription-Kit durchgeführt. Es wurde 1 g DNA-Matrize im Reaktionsgemisch eingesetzt.
Der Reaktionsansatz wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und im Anschluss mit 1 U RNase-freier DNaseI für 15 min verdaut. Wurde eine radioaktive Sonde hergestelle, wurden nichteingebaute Nukleotide durch Aufreinigung über G-50 Spinsäulen entfernt. Die radioaktive Strahlung der Sonde wurde in einem ß-Counter überprüft.
2.2.1.11 Isolierung von RNA mit Trizol
Für die Isolierung von RNA aus Zellen wurde eine Aufreinigung mit Trizol durchgeführt.
Die Zellen eines 24-Wells wurden in 500 l Trizol durch auf- und abpipettieren lysiert. Je zwei Wells wurden vereint und bei -70°C aufbewahrt oder direkt mit 200 l Chloroform überschichtet. Nach kräftigem Schütteln und einer Inkubation von 3 min bei RT wurden die Proben zur Phasentrennung für 15 min bei 12.000 rpm und 4°C zentrifugiert. Die obere RNA-haltige wässrige Phase wurde abgenommen, in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und mit 500 l Isopropanol überschichtet. Nach dem Durchmischen der Proben wurden sie 10 min bei RT inkubiert und anschließend für 10 min bei 12.000 rpm zentrifugiert, um die präzipitierte RNA zu pelletieren. Das RNA-Pellet wurde mit 1 ml 75% Ethanol gewaschen, abzentrifugiert und bei RT für 10 min getrocknet. Anschließend wurde das RNA-Pellet durch die Zugabe von 30 l H2O für 10 min bei 55°C gelöst.
2.2.1.12 Polyacrylamid-Gelelektrophorese von RNA (TBE-UREA-PAGE)
Für die Auftrennung von RNA wurden 6%- und 10%-ige Novex TBE-UREA-Gele und 1x TBE-Laufpuffer nach Herstellerangaben verwendet. RNA-Proben wurden mit Gelloadingbuffer II gemischt und für 10 min bei 95°C gekocht. Anschließend wurden 10 l Probe pro Geltasche geladen und die RNA bei 180 V für 60-90 min aufgetrennt.
2.2.1.13 Silberfärbung von Nukleinsäuren in Polyacrylamid-Gelen
Die Silberfärbung von Nukleinsäuren nach Auftrennung durch TBE-UREA-PAGE wurde mit dem DNA-Silver-Staining-Kit nach Herstellerangaben durchgeführt. Zur Fixierung der Nukleinsäuren im Polyacrylamid-Gel wurde es nach der Elektrophorese für 60 min in Fixierungslösung inkubiert, gefolgt von 30 min Inkubation in Impregnierlösung. Nach einem kurzem Waschschritt mit H2O wurde das Gel so lange in Entwicklerlösung inkubiert, bis die Nukleinsäurebanden gut zu erkennen waren. Die Entwicklungsreaktion wurde mit Stopplösung beendet.
2.2.2 Zellbiologische Methoden