Mutagenese-Studie zur Untersuchung potentieller Interdomänlinker

3.1.2 Mutagenese-Studie zur Untersuchung potentieller Interdomänlinker

Im ersten Schritt wurden 5 Aminosäuren mit der Sequenz GDGSG in das L-Protein eingefügt (Abbildung 18.2). Die Insertionssequenz wurde nach den Kriterien ausgewählt, dass sie möglichst flexibel ist und kaum Interaktionen mit anderen AS-Resten eingeht, um die natürliche Position des Interdomänlinkers so wenig wie möglich zu beeinflussen. Im nächsten Mutationsschritt wurde die Länge der inserierten Sequenz von 5 auf 10 Aminosäuren mit der Sequenz GDGSG-GKADG verlängert (Abbildung 18.3), um den Abstand zwischen den potentiellen Domänen zu vergrößern. Im letzten Mutationsschritt wurde das L-Gen an ausgewählten Positionen in individuell exprimierte N- und C-terminale Domänen geteilt (Abbildung 18.4), um die Domänen vollständig voneinander zu trennen. Zur funktionellen Testung wurden die N- und C-terminale Domänen ko-transfiziert.

Abbildung 18: Schematische Darstellung der schrittweisen Mutation des Proteins 1): Wild-Typ L-Protein, 2): L-Protein mit 5 AS-Insertion, 3) L-Protein mit 10 AS-Insertion, 4): In N- und C-terminale Domänen zerteiltes L-Protein (X repräsentiert die Aminosäure nach der die Insertion eingefügt wurde). Diese Aminosäure wurde nach der eingefügten Sequenz dupliziert. : eingefügtes Stop-Codon zur Herstellung der N-terminalen Domäne. M: Eingefügtes Start-Codon zur Herstellung der C-terminalen Domäne.

Als Positivkontrolle wurde das pCite-L Plasmid mit den Vektor-Primern pUC-fwd und pUC-rev und unmodifizierten internen Primern in jedem PCR-Schritt mit amplifiziert. Als Negativkontrolle diente eine inaktive Mutante des L-Gens die durch die D N-Mutation an Position 1334 im katalytischen Zentrum der RNA-Polymerase hergestellt wurde.

Die mutierten L-Gene wurden anschließend zusammen mit den Kontrollen im Replikonsystem getestet. Dafür wurden sie zusammen mit dem Plasmid für NP und dem Minigenom in BSRT7/5-Zellen transfiziert. Nach 24 h wurde die Aktivität des Reporterproteins Renilla-Luciferase bestimmt. Um zelluläre Schwankungen auszugleichen, wurden 10 ng des Expressionsplasmids pCite-FFluc für die Expression der Firefly-Luciferase mittransfiziert und die Renilla-Werte mit den Firefly-Werten korrigiert. Die Aktivität der mutierten L-Gene wurde zur Aktivität des Wildtyp L-Proteins ins Verhältnis gesetzt.

3.1.2.1 Insertion von 5 Aminosäuren

Die Ergebnisse der Mutations-Studie sind in Tabelle 5 tabellarisch und in zusammengefasster Form in Abbildung 16 dargestellt.

Die Insertion von 5 Aminosäuren führte an den Positionen Y583, G738, L1546, N1722 und G1865 zum vollständigen Verlust der Aktivität des L-Proteins im Replikonsystem wodurch sie als potentielle Interdomänlinker im L-Protein ausscheiden. Wie erwartet, führte auch die Mutation an Position V1113 zum Aktivitätsverlust, was bestätigt, dass domänen-interne Loop-Regionen durch die Mutations-Studie ausselektioniert werden und nicht fälschlicherweise als Interdomänlinker identifiziert werden. Obwohl die Interdomänlinker-Vorhersage für die Position N1722 von allen vorhergesagten Positionen am stärksten ausfiel, führte auch hier die Insertion von 5 AS zum Aktivitätsverlust. Um dieses Ergebnis abzusichern, wurden auch die benachbarten Positionen A1712 und Y1726 mutiert, was jedoch zum gleichen Ergebnis führte.

Tabelle 5: Ergebnisse der Mutagenese-Studie des Lassa-Virus L-Proteins zur Identifizierung von Interdomänlinkern. Die Ergebnisse der nachträglich getesteten Positionen G446, A1712 und Y1726 sind ebenfalls gezeigt.

Um sicherzustellen, dass der Aktivitätsverlust im Replikonsystem nicht auf eine mangelnde Expression der mutierten Proteine zurückzuführen ist, wurden Expressions-Kontrollen für alle inaktiven Proteine durchgeführt. Dafür wurde auf PCR-Basis ein HA-Tag an alle mutierten L-Proteine und Domänen fusioniert. Die PCR-Produkte wurden zur Expression in BHK-J-Zellen transfiziert, die zuvor mit dem rekombinanten MVA-T7-Virus infiziert worden waren, um die T7-Polymerase in den Zellen bereitzustellen. Die Zellen wurden 24 h nach der Transfektion lysiert, die Lysate durch SDS-PAGE aufgetrennt und die Proteine im Westerblot mit einem -HA-Antikörper detektiert (Abbildung 19).

Dabei zeigte sich, dass die mutierten L-Proteine Y583_5AS (L-Protein mit 5 AS-Insertion

5 AS-Insertion 10 AS-Insertion N- und C-terminale Domäne (PCR)

N- und C-terminale Domäne (Plasmid)

Position % Wildtyp L

S/N-Ratio % Wildtyp L

S/N-Ratio % Wildtyp L

S/N-Ratio % Wildtyp L

S/N-Ratio S407 80 130 106 145 16 30 – –

G446 42 144 11 71 0 1 – – G467 112 222 93 116 37 141 218 153

Y583 0.3 1 – – – – – – G738 3 7 – – – – – –

G774 170 326 148 197 2 4 – – G939 80 149 138 194 11 11 33 35

V1113 0 1 – – – – – –

L1546 2 8 – – 2 1 – –

A1712 1 – – – – – – –

N1722 1 2 – – 2 2 – –

Y1726 1 – – – – – – –

G1865 1 1 – – – – – –

S1952 48 208 23 99 0 1 – – V2074 24 81 17 62 0 1 – –

an Position Y583), G738_5AS und L1546_5AS im Vergleich zum Wildtyp Protein schwächer exprimiert werden. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die geringe Reduktion des Expressionsniveaus alleine zum vollständigen Verlust der gesamten Replikonaktivität führt.

Abbildung 19: Expressionskontrolle der inaktiven L-Protein-Mutanten und N- und C-terminalen Domänen des geteilten L-Proteins. MVA: MVA-infizierte Zellen, die nicht transfiziert wurden. Mock:

unbehandelte Zellen.

An den verbleibenden 6 Positionen S407, G467, G774, G939, S1952 und V2074 wurde die Insertion von 5 Aminosäuren ohne Aktivitätsverlust tolerierte. Da die Positionen S407 und G467 sehr eng beieinander liegen, und die Annahme nahe liegt, dass beide Positionen zu einer größeren Interdomänlinker-Region gehören, wurde eine weitere Insertion an der Position G446 getestet. Auch an dieser Position wurde die Insertion ohne Aktivitätsverlust toleriert.

3.1.2.2 Verlängerung der Insertionssequenz von 5 auf 10 Aminosäuren

Als nächster Schritt in der Mutations-Studie wurden die 5 AS-Insertionen der 7 aktiven mutieren L-Proteinen, und als Kontrolle auch von der inaktiven Mutante N1722, um 5 AS auf insgesamt 10 AS mit der Sequenz GDGSG-GKADG verlängert (Abbildung 18.3). Die Herstellung der Mutanten mit 10 zusätzlichen AS erfolgte nach dem gleichen PCR-Schema wie die Insertion der 5 AS. Als Matrize für den ersten PCR-Schritt wurden jedoch die N- und C-terminalen PCR-Produkte der 5 AS-Insertion verwendet. Die Überhänge der N- und

C-terminalen Fragmente wurden im ersten PCR-Schritt verlängert und in einer Fusions-PCR nach Aufreinigung fusioniert.

Die Testung der L-Proteine mit 10 zusätzlichen AS im Replikonsystem zeigte, dass die Verlängerung der Insertionssequenz an den Positionen S407, G467, G774, G939, S1952 und V2074 keinen Einfluss auf die Replikonaktivität der L-Proteine hatte (Tabelle 5, 10 AS-Insertion und Abbildung 16). Nur die Position G446 zeigt eine Reduktion der Replikonaktivität auf 11% im Vergleich zum Wildtyp L-Protein, trotz guter Expression (Abbildung 19, 446_10AS). Die Kontrollposition N1722 war auch mit der 10-AS-Insertion inaktiv. Bis zu diesem Punkt konnten demnach 6 Positionen im L-Protein identifiziert werden, die eine Insertion von bis zu 10 AS ohne Aktivitätsverlust tolerieren können.

Obwohl die Positionen S407, G446 und G467 wahrscheinlich zu der gleichen Linker-Region gehören, wurden sie im nächsten Teil der Mutagenese-Studie einzeln untersucht.

3.1.2.3 Teilung des L-Proteins in N- und C-terminale Domänen

Um die Mutagenese-Studie noch einen Schritt weiter zu führen, wurde das L-Protein an den 7 Positionen S407, G446, G467, G774, G939, S1952 und V2074 in jeweils eine N- und eine C-terminale Domäne zerteilt. Die N-terminalen Domänen wurden in einem einzigen PCR-Schritt durch Verwendung eines Mutagenese-Primers hergestellt, der an die gewünschte Position im L-Protein bindet und ein artifizielles Stop-Codon enthält. Für die Synthese der C-terminalen Domänen waren zwei PCR-Schritte notwendig, da der T7-Promotor und die IRES-Sequenz über Fusions-PCRs versetzt und ein Start-Codon an den N-Terminus der C-terminalen Domäne gesetzt werden mussten (siehe Abbildung 18.4).

Für die Aktivitätstestung der geteilten L-Proteine im Replikonsystem wurden die jeweils korrespondierenden N- und C-terminalen Domänen ko-transfiziert. Die Zerteilung des L-Proteins an den Positionen G446, G774, S1952 und V2074 führte zum Verlust der Replikonaktivität (Abbildung 16 und Tabelle 5, N- und C-terminale Domänen [PCR]). Die Expressionskontrolle zeigte eine deutlich reduzierte Expression der N-terminalen Domänen der Schnittpositionen S1952 und V2074, sowie der C-terminalen Domäne von G446 (Abbildung 19). Die L-Proteine, die an den Positionen S407, G469 und G939 zerteilt wurden, vermittelten hingegen eine Replikonaktivität von 16%, 37% bzw. 11% im Vergleich zum Wildtyp L-Protein (Tabelle 5, N- und C-terminale Domäne [PCR]), was darauf schließen lässt, dass diese Positionen echte Interdomänlinker im L-Protein repräsentieren. Diese Ergebnisse weisen ausserdem auf eine Interaktion zwischen den individuell exprimierten N- und C-terminalen Domänen des L-Proteins hin, die zu einer Wiederherstellung der Funktionalität des L-Proteins im Replikonsystem führt.

Als Kontrolle wurde jede Domäne einzeln transfiziert. Keine der Domänen war alleine im Replikonsystem aktiv, was bedeutet, dass die Gesamtheit des L-Proteins für die Aktivität im Replikonsystem essentiell ist (Daten nicht gezeigt). Dafür spricht auch, dass die Ko-Transfektion der N-terminalen Domäne, die aus dem Schnitt an Position S407 entsteht und aus den AS 1-407 besteht zusammen mit dem C-Terminus des Schnittortes G467 der die AS 467-2220 abdeckt, d.h. AS 408-466 fehlen, ebenfalls keine Replikonaktivität ergibt (Daten nicht gezeigt). Im Folgenden wurden die N- und C-terminalen Domänen aus der Teilung des L-Proteins an den Positionen G467 und G939 in den Expressionsvektor pCite-2a kloniert und als Domänen L-N1 und L-C1 (Schnitt G467) sowie L-N2 und L-C2 (Schnitt G939) bezeichnet. Durch Ko-Transfektion der N- und C-terminalen Domänen auf Plasmid-Basis wurden Replikonaktivitäten von 218% für L-N1 und L-C1 sowie 33% für L-N2 und L-C2 erreicht. Da Positionen S407 und G467 wahrscheinlich zu der gleichen Linker-Region gehören, wurde die Schnittposition S407 nicht weiter untersucht.

Somit konnten durch Kombination von bioinformatischer Analyse und funktioneller Mutagenese-Studie zwei echte Interdomänlinker an den Positionen G467 und G939 im L-Protein des Lassa-Virus identifiziert werden.

3.1.3 Interaktions-Studien mit N- und C-terminalen Domänen des L-Proteins