Polymerase-Aktivitäts-Assay

Da L und NP interagieren und zusammen mit der viralen RNA die replikationskompetenten RNP-Komplexe bilden, sollte versucht werden, L-NP-Komplexe durch Ko-Expression von NP-FLAG-His mit L-FLAG-Strep über den Strep-Tag aufzureinigen.

Dafür wurden HeLa-Zellen mit den Plasmiden im Verhältnis 1:1 ko-transfiziert. Die Strep-Aufreinigung der ko-exprimierten Proteine ist in Abbildung 30B zu sehen. Beide Proteine werden exprimiert, wobei NP nur sehr schwach zu erkennen ist. Die NP-Bande in der Pelletfraktion deutet auf eine partiell unlösliche Expression von NP hin. Trotzdem sind beide Proteine im Eluat nach Coomassie-Färbung sichtbar. Die ungleiche Konzentration von L und NP im Eluat ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass bei der Strep-Aufreinigung sowohl freies L-Protein als auch in L-NP-Komplexen integriertes L-Protein aufgereinigt wird, während vom NP lediglich der gebundene, ko-aufgereinigte Anteil im Eluat zu sehen ist. Als Negativ-Kontrolle für ein Polymerase-Assay wurden Proteine aus nichttransfizierten MVA-T7-infizierten HeLa-Zellen aufgereinigt (Daten nicht gezeigt).

intern an die Positionen +2 und +3 des 3’-Genomendes und initiiert die Bildung der ersten Phosphodiesterbindung. Anschließend rutscht es rückwärts auf die Positionen +1 und +2 wobei ein pppG-Überhang entsteht (Position -1), der schon mehrfach am Genom bei Arenaviren nachgewiesen wurde (71). Auch für Influenza-Virus ist eine Stimulierung der Replikation durch Dinukleotide beschrieben (91). Für den Fall, dass GpC und CpG für die RNA-Synthese essentiell sind, wurden die Dinukleotide im Assay eingesetzt.

Falls die Initiation der RNA-Synthese in einem in vitro-Assay beim Lassa-Virus primerabhängig ist, wurde zusätzlich zu den Dinukleotiden entweder PolyA⁺-RNA aus der Mäuseleber oder Trizol-aufgereinigte Gesamt-RNA aus BSRT7/5-Zellen als Quelle für gecappte zelluläre mRNAs hinzugefügt (siehe 2.2.4.11).

Abbildung 31: Schematische Darstellung der RNA-Matrizen für das Polymerase-Assay. Die konservierten Promotorenden sind als Vierecke, die nichttranslatierten Regionen (UTRs) als fette Linien und der Loop bzw. die Renilla-Sequenz ist als gestrichelte Linie dargestellt.

Als RNA-Matrizen wurden fünf verschiedene RNA-Konstrukte, basierend auf dem Minigenom hergestellt (Abbildung 31). Die kleinste Matrize (T1) ist nur 71 nt groß und besteht aus jeweils 31 Nukleotiden der 3’- und 5’-UTRs und einem Loop aus 9 Nukleotiden (TTCAAGAGA), so dass sich eine enge Haarnadelschleife ausbilden kann und die Genomenden zur Bildung des doppelsträngigen Promotors hybridisieren können.

Die zweite Matrize (T2) enthält anstelle des kurzen Loops die ersten 100 Nukleotide der Renilla-Luciferase. Die dritte Matrize (T3) ist mit T2 identisch, es wurde jedoch die 3’-UTR deletiert. Bei der vierten Matrize (T4) wurde die 5’-3’-UTR entfernt. Somit können beide Matrizen keinen doppelsträngigen Promotor mehr bilden und es kann untersucht werden, inwieweit die Promotorenden für die Polymerase-Aktivität eine Rolle spielen. Die fünfte Matrize (T5) besteht nur aus den 100 ersten Nukleotiden der Renilla-Luciferase und

5‘-UTR

T3 141 nt

3‘-UTR

T4 190 nt

T5 100 nt

5‘-UTR 3‘-UTR

T1 71 nt

T2 242 5‘-UTR 3‘-UTR nt

besitzt keine viralen Elemente. Mit diesen verschiedenen Matrizen soll untersucht werden, ob die RNA-Polymerase auf virale Elemente angewiesen ist oder ob sie jede beliebige RNA verwenden kann. Da unklar war, ob NP als Ko-Faktor für die Polymerase-Aktivität des L-Proteins in einem in vitro-Assay benötigt wird, wurde es ebenfalls sowohl in HeLa-, als auch in Insekten-Zellen mit C-terminalem FLAG-His-Tag exprimiert. Es sollte getestet werden, ob die Zugabe von NP einen Einfluss auf die Aktivität der RNA-Polymerase hat.

Außerdem wurden NP und L in beiden Systemen ko-exprimiert, um zu untersuchen ob die Ko-Translation beider Proteine eine Rolle spielt. Alleine eingesetzt, wurde NP als eine Negativkontrolle verwendet. Weitere Negativkontrollen waren das im Bakulovirussystem exprimierte GFP und ein inaktives L-Protein, in dem die gesamte Polymerase-Domäne deletiert ist (AV-L ) (20). Da die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford aufgrund der zu geringen Konzentration nicht möglich war, wurde je nach Bandenstärke der Proteine im Coomassie-Gel 1-5 l der Proteine pro Ansatz eingesetzt.

Es konnte keine spezifische Polymerase-Aktivität der im Bakulovirus-System exprimierten L-Proteine im Polymerase-Assay festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Das bedeutet, dass die aufgereinigten L-Proteine entweder nicht aktiv sind oder die Zusammensetzung des Assays für die RNA-Polymerase nicht optimal ist.

Da die Aktivitätstestung der Bakulo-exprimierten L-Proteine nicht erfolgreich war, sollten als nächstes die aufgereinigten Proteine aus der transienten Expression in HeLa-Zellen im Polymerase-Assay untersucht werden. Als zusätzliche Negativkontrolle wurden HeLa-Zellen mit dem MVA-T7-Virus infiziert und parallel zu den rekombinanten Proteinen über Ni-NTA aufgereinigt (Mock-Kontrolle). Im Polymerase-Assay zeigte sich, dass in den Ansätzen mit dem AV-L-Protein radioaktiv markierte RNA-Produkte mit der jeweiligen Matrizengröße entstanden waren (Abbildung 32A und B). Sehr schwache Banden auf gleicher Höhe waren in den Ansätzen mit NP zu sehen, was auf eine geringe Hintergrundaktivität schließen läst. Da aber in der Mock-Kontrolle keine Banden zu erkennen waren und die Signalstärken der Banden in den Ansätzen mit AV-L deutlich über den Hintergrundbanden lagen, deuteten diese Ergebnisse auf eine Polymerase-Aktivität des L-Proteins hin.

Abbildung 32: Polymerase-Assay mit rekombinanten Proteinen aus MVA-T7-infizierten HeLa-Zellen.

Aufgereinigtes NP und Lysate von MVA-T7-infizierten aber nichttransfizierte HeLa-Zellen (Mock) wurden als Negativkontrollen verwendet. A) Polymerase-Assay mit den Matrizen T1 und T2. B) Polymerase-Assay mit den Matrizen T3, T4 und T5. C) Polymerase-Assay mit Matrize T3. Als Negativkontrolle wurde das inaktive L-Protein L-D1334N verwendet, das eine letale Mutation an der Position 1334 im katalytischen Zentrum der Polymerase hat.

In anschließenden Polymerase-Assays wurde das neusynthetisierte Produkt detaillierter charakterisiert und es konnte gezeigt werden, dass es durch Inkubation mit RNase, aber nicht mit DNase, vollständig verdaut wird. Des Weiteren war die Entstehung des Produktes von der Zugabe einer RNA-Matrize abhängig, da kein Polymerase-Produkt in Anwesenheit einer DNA-Matrize produziert wurde (Daten nicht gezeigt). Insgesamt sprachen diese Ergebnisse für die Präsenz einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase im L-Protein.

Um eine weitere Kontrolle in das Assay zu integrieren, wurde die inaktive Mutante L-D1334N-FLAG-His, mit der letalen Mutation im katalytischen Zentrum der RNA-Polymerase-Domäne, in den pCite2a-Vektor kloniert und das Protein im Replikonsystem getestet. Es konnte keine Replikonaktivität des mutierten Proteins gemessen werden. Das inaktive Protein wurde ebenfalls in HeLa-Zellen exprimiert und über den His-Tag aufgereinigt. In Abbildung 32C ist das Polymerase-Assay mit L-D1334N im Vergleich zu zwei Ansätzen mit dem AV-L-Protein gezeigt. Es ist zu sehen, dass die inaktive L-Mutante D1334N ebenfalls ein radioaktives Produkt auf Höhe der Matrize erzeugte. Somit muss davon ausgegangen werden, dass die erzeugten radioaktiven Produkte nicht durch die Polymerase-Aktivität des AV-L-Proteins entstanden sind. Wahrscheinlicher ist, dass ein

zelluläres Protein oder ein von MVA-T7 exprimiertes Protein mit RNA-Polymerase- oder Terminaler-Nukleotidyl-Transferase-Aktivität, mit dem L-Protein und in geringerem Maße auch mit NP spezifisch ko-aufgereinigt wurde. Eine Ko-Aufreinigung der Kontamination durch Interaktion mit der Ni-NTA ist unwahrscheinlich, da die Mock-Kontrolle, die ebenfalls über Ni-NTA aufgereinigt wurde, keine Aktivität zeigte.