Universitätskrankenhaus Hamburg-Eppendorf Direktorin Prof. Dr. rer. physiol. Dr. h.c. Ulrike Beisiegel
Fettsäure-induzierte Veränderungen in der Proteinexpression
von humanen Hepatomazellen
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von
Ingo Teudt aus Hamburg Hamburg 2005
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Universität Hamburg am: 16.02.2006
Veröffentlicht mit Genehmigung des Fachbereichs Medizin der Universität Hamburg: 13.06.2006
Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. U. Beisiegel Prüfungsausschuss: 2. Gutachter/in: Prof. Dr. F. U. Beil Prüfungsausschuss: 3. Gutachter/in: PD Dr. J. Heeren
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Lipoproteinmetabolismus 2
1.1.1 Der exogene Lipidstoffwechsel 4
1.1.2 Der endogene Lipidstoffwechsel 6
1.1.3 Der reverse Cholesterintransport 7
1.2 Fettsäuren und ihre Funktionen im Menschen 10
1.2.1 Fettsäuren und ihre Nomenklatur 11
1.2.2 Essentielle und nicht essentielle Fettsäuren 12
1.2.3 Der Stoffwechsel von Fettsäuren 14
1.3 Lipide und Genexpression 15
1.4 Ziel der Arbeit 20
2 Material und Methoden 21
2.1 Geräte 21
2.2 Chemikalien 21
2.3 Verbrauchsmaterial 22
2.4 Zell- und Probenherstellung 22
2.4.1 Zellzüchtung und Pflege 22
2.4.2 Herstellung von Fettsäure-Albuminkomplexen 23
2.4.3 Herstellung von Liposomen 23
2.4.4 Inkubation der Zellen 24
2.4.5 Probengewinnung 25
2.5 Zell- und Probencharakterisierung 25
2.5.1 Proteinbestimmung nach Bradford 25
2.5.2 Cholesterinbestimmung in der Probe 26
2.5.3 Triglyceridbestimmung in der Probe 26
Inhaltsverzeichnis
II
2.5.5 SDS-Page 27
2.5.6 Western Blot nach Neville 28
2.5.7 Antikörper und Filmentwicklung 29
2.5.8 Fettrot-Färbung 30
2.5.9 Immunfluoreszenz 31
3 Ergebnisse 32
3.1 Versuchsaufbau 32
3.1.1 Zusammensetzung der Liposomen 32
3.1.2 Verwendete Fettsäure/Albumin Komplexe 33
3.1.3 Versuchsablauf der Zellinkubation 33
3.2 Analytik der Zellen 37
3.2.1 Charakterisierung der Zellen nach Inkubation mit unterschiedlichen
Liposomen und Fettsäure/Albumin Komplexen 37
3.2.2 Charakterisierung der Zellen mit Konzentrationsreihen von
Trilinolen-Liposomen und Albumin/Linolensäure Komplexen 40
3.2.2.1 Visualisierung von Triglyceriden in den Zellen durch Fettrot-Färbung 43
3.3 Expressionsanalyse 45
3.3.1 Proteinexpression nach Inkubation mit verschiedenen Fettsäure- Albumin Komplexen und Triglycerid-Liposomen 45 3.3.2 Proteinexpression nach Inkubation mit Konzentrationsreihen von
Trilinolen-Liposomen und Albumin/Linolensäure Komplexen 46
3.3.2.1 Zelluläre Proteine 47 3.3.2.2 Sekretierte Proteine 51 3.3.2.3 Immunfluoreszenz 52 4 Diskussion 55 5 Zusammenfassung 69 6 Abkürzungsverzeichnis 70 7 Literaturverzeichnis 72
III
8 Danksagung 80
9 Lebenslauf 81
Einleitung
1
1 Einleitung
Die Nahrungsmittel, die der Mensch zu sich nimmt, um seinen täglichen Energiebedarf zu decken, lassen sich in drei wesentliche Hauptbestandteile unterteilen: Kohlenhydrate, Proteine und Fette. Nach einer Studie der World Health Organisation (WHO) verteilten sich im Jahr 2003 in Westeuropa 42% der mit der Nahrung aufgenommenen Energie auf die Kohlenhydrate, 15% auf Proteine und 38% der Energie auf das Fett. Damit fand sich bei den Bewohnern Westeuropas eine der höchsten Fettaufnahmen zur Deckung des Energiehaushaltes. Nur die baltischen Staaten verzeichneten mit 42% Nahrungsenergie aus Fett einen noch höheren Fettkonsum (WHO 2003). Diese Studie zeigt, dass das Fett als ein wesentlicher Bestandteil unserer täglichen Nahrung anzusehen ist.
Die Nahrungsfette werden auch als Lipide bezeichnet, was sich vom griechischen Wort lipos = Fett, Öl ableitet. Insgesamt stellen die Lipide das energiereichste Nahrungsmittel des Menschen dar. Der physiologische Brennwert von 1 g Nahrungslipiden liegt mit 39,1 KJ mehr als doppelt so hoch als der von Kohlehydraten und Proteinen mit je 17,2 KJ pro Gramm.
Lipide sind eine Sammelbezeichnung für eine heterogene Klasse von Verbindungen mit zwei Gemeinsamkeiten: Alle Lipide sind lipophil, das bedeutet, sie lassen sich in organischen Lösungsmitteln wie Hexan, Chloroform oder Ether lösen. Als zweite Gemeinsamkeit dient ihnen allen als Ausgangssubstanz bei ihrer Bildung das Acetyl-CoA. Man unterscheidet hydrolysierbare (verseifbare) und nicht-hydrolysierbare Lipide. Hydrolysierbare Lipide sind entweder einfache Ester wie Acylglycerole, Wachse und Sterolester oder gemischte Ester wie Phospholipide, Sphingolipide und Glykolipide (Cerebroside, Ganglioside). Nicht-hydrolysierbare Lipide sind in Isoprenoide (Carotinoide wie Vitamin A), Lipidalkohole (Alkanole, zyklische Sterole) und in Säuren (Fettsäuren, Eicosanoide) zu unterteilen.
Neben der Speicherung von Energie, wie oben bereits erwähnt, besitzen Lipide auch noch viele andere Funktionen, die für den menschlichen Organismus von größter Wichtigkeit sind. So dienen Lipide im Unterhautfettgewebe als Schutz vor äußerer Gewalteinwirkung und Kälteeinfluss. Im Säuglingsalter findet sich eine große Anzahl von Fettzellen, die „Braunes Fettgewebe“ genannt werden. Dieses Fett dient hauptsächlich zur Produktion von Körperwärme durch „Verbrennung“ und ist im Erwachsenenalter nur noch wenig vorhanden. Viele Körperorgane des Menschen wären ohne Fettgewebe ungeschützt oder in ihrer Funktion eingeschränkt. Hierbei sind vor allem die Augen, die Nieren und der Bauchraum zu erwähnen. Beide Augen sind in orbitales Fettgewebe eingelagert, was sie
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zum einen vor starken Erschütterungen schützt und zum anderen das mühelose Gleiten der Augäpfel beim Umherblicken ermöglicht. Auch die Nieren sitzen in einem Nierenlager, welches aus Fettzellen besteht. Neben der Schutzfunktion dient das Fett der Aufhängung der Nieren. Bei sehr ausgehungerten Menschen, wo sogar diese letzten Fettreserven zur Energiegewinnung verwendet werden müssen, kann es zum Absinken der Nieren aus ihrer Loge und dabei zu einem gefährlichen Volvulus (Drehung) der Niere kommen. Die Folge ist eine Abschnürung der zuführenden Blutgefäße und damit ein Absterben der Niere. Als letztes sind die meterlangen Darmschlingen zu erwähnen, welche dicht zusammengedrängt im Bauchraum, von einem großen Netz aus Fettgewebe bedeckt werden. Dieses kann bei einem frontalen Bauchtrauma vor lebensgefährlichen Darmbrüchen schützen.
Auf molekularer Ebene sind Lipide wichtiger Bestandteil von Biomembranen. Die zellulären Membranen bestehen, wie von Singer und Nicolson 1972 im „fluid mosaic“ Modell dargestellt, aus Phospholipiddoppelschichten, in die Membranproteine beweglich eingebettet sind (Singer und Nicolson 1972). In den Biomembranen finden sich als Hauptbestandteil Phospholipide, Glykolipide und Cholesterin. Dabei kann die Fluidität der Membran durch unterschiedliche Lipidkompositionen verändert werden.
Außer als Bausstoff dienen Lipide wie Steroide, Eicosanoide und bestimmte Phospholipide auch als Signaltransmitter und wirken als Hormone, Zellmediatoren und Second Messenger.
Es wird deutlich, wie wichtig Lipide für den Menschen sind, und dass eine gewisse Menge an Fett unverzichtbar ist. Ein zu hoher Gehalt an Lipiden jedoch besitzt im menschlichen Körper auch gesundheitsschädigende Wirkungen. Bevor auf die Funktion von Lipiden und dabei vor allem auf die der Fettsäuren eingegangen wird, soll zunächst die Aufnahme und der Transport von Lipiden im menschlichen Organismus beschrieben werden.
1.1 Lipoproteinmetabolismus
Lipide wie Triglyceride, Cholesterinester und Fettsäuren sind hydrophob. Das heißt, sie können nicht im wässrigen Milieu wie das der Lymphe oder das des Blutes im menschlichen Körper gelöst werden. Diese Tatsache macht einen Transport der Lipide zu unterschiedlichen Geweben im Menschen und damit deren Verteilung eigentlich unmöglich. Damit die Lipide trotzdem zu den nötigen Zielorganen gelangen, werden sie zusammen mit Transportproteinen zu Lipoproteinen komplexiert. Dabei bilden die Transportproteine, welche als Apolipoproteine bezeichnet werden, um die hydrophoben Lipide eine polare Hülle. Die Hülle dieser Lipoproteine ist zusätzlich mit Phospholipiden
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und freiem Cholesterin angereichert und ermöglicht den Transport der apolaren Lipide im wässrigen Milieu. Dabei sind die hydrophilen Phosphatgruppen der Phospholipide und die Hydroxylgruppen der Cholesterinmoleküle nach außen gelagert, wohingegen sich die hydrophoben Bestandteile der Phospholipide und Cholesterine zum Kern des Lipoproteins richten. Im Kern des Lipoproteins befinden sich Cholesterinester, Triglyceride und andere lipophile Substanzen wie zum Beispiel die fettlöslichen Vitamine A, D, E und K. Lipoproteine werden in fünf Gruppen unterteilt, die sich durch das Wanderungsverhalten der Lipoproteine in Dichtegradienten bei der Ultrazentrifugation ergeben haben. Anhand der Dichte unterscheidet man Chylomikronen, Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL), Lipoproteine geringer Dichte (LDL), Lipoproteine mittelgroßer Dichte (IDL) und Lipoproteine hoher Dichte (HDL). Die Dichteunterschiede der Lipoproteine resultieren aus einem unterschiedlichen Gehalt an Proteinen, Triglyceriden, Cholesterin und Phospholipiden. Auch bei den Apolipoproteinen findet man unterschiedliche Subtypen, welche sich nach einem bestimmten Muster auf die verschiedenen Lipoproteine verteilen. Mit ihrer Vielfalt und den unterschiedlichen Verteilungen dienen sie nicht nur dem Transport von hydrophoben Lipiden, sondern sind auch für die Erkennung und Aufnahme von Lipiden in die unterschiedlichen Körperzellen von größter Wichtigkeit.
Die fünf verschiedenen Lipoproteine sind mit ihren Zusammensetzungen und den jeweiligen sie enthaltenden Apolipoproteinen in der folgenden Tabelle 1 dargstellt.
Chylomikron VLDL IDL LDL HDL Dichte (g/ml) < 0,95 0,95-1,006 1,006-1,019 1,019-1,063 1,063-1,210 Durchmesser (nm) 75-1200 30-80 25-35 18-25 5-12 Bestandteile (% Trockengewicht) Proteine 1-2 10 18 25 33 Triglyceride 83 50 31 10 8
Cholesterin und Cholesterinester 8 22 29 46 30
Phospholipide 7 18 22 22 29
Apoprotein -Zusammensetzung A-I, A-II B-100 B-100 B-100 A-I, A-II B-48 C-I, C-II, C-III C-I, C-II, C-III C-I, C-II, C-III
C-I, C-II, C-III E E D
E E
Klassifizierung durch Elektrophorese Omega Prä-beta Zwischen beta und prä-beta
Beta Alpha
Tab.1: Zusammensetzung und Dichte der Lipoproteine beim Menschen (Zubay 1998)
In Tabelle 1 sind die fünf verschiedenen Lipoproteine als Chylomikron, VLDL, IDL, LDL und HDL bezeichnet. Zudem lassen sich die Dichte, Durchmesser, Zusammensetzung und Klassifizierung aus der Tabelle entnehmen.
Die fünf verschiedenen Lipoproteine sind bestimmten Abschnitten des Lipoproteinstoffwechsels zuzuordnen, von denen man drei wesentliche unterscheidet. Der Lipoproteinstoffwechsel wird in einen exogenen Weg, einen endogenen Weg und einen reversen Cholesterintransport unterteilt. Diese drei Abschnitte werden im folgenden
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Abschnitt näher erläutert und sind anschliessend zur besseren Übersicht auf Seite 9 als vereinfachende Grafik dargestellt.
1.1.1 Der exogene Lipidstoffwechsel
Nach der Nahrungsaufnahme werden Lipide über den Magen in den Dünndarm transportiert und dort in den Epithelzellen der Darmwand zu Chylomikronen komplexiert. Um die Aufnahme in die Enterozyten zu ermöglichen, werden die Lipide zunächst im Dünndarmlumen mit Gallensäuren emulgiert und durch Pankreasenzyme weiter gespalten. So werden Triglyceride durch die Pankreaslipase in freie Fettsäuren, Diacylglyceride, Monoacylglyceride und Glycerine zerlegt. Zusammen mit Cholesterin und Phospholipiden, sowie anderen Lipiden wie zum Beispiel den fettlöslichen Vitaminen, bilden diese Bestandteile dann mit Hilfe der Gallensäuren Mizellen, die von den Enterozyten aufgenommen werden können.
Der Aufnahmemechanismus der Lipide in den Enterozyten ist noch nicht vollständig verstanden. Die Gallensäuren im Enterozyt werden über den enterohepatischen Gallensäurekreislauf der Leber zugeführt, während intrazellulär zunächst eine Wiederzusammensetzung der Triglyceride aus den aufgenommenen Lipiden stattfindet. Die reveresterten Triglyceride, das durch die Acyl-CoA Cholesterin-Acyltransferase (ACAT) reveresterte Cholesterin, Phospholipide und Apolipoproteine (Apo) AI, AII sowie Apolipoprotein B48 werden zu Chylomikronen zusammengesetzt und durch die Enterozyten in die Lymphbahnen sekretiert. Von dort aus gelangen die Chylomikronen über den Ductus Thoracicus im linken Venenwinkel, unter Umgehung der Leber, in den Blutkreislauf. Im Blutkreislauf ändert sich die Apolipoproteinzusammensetzung der Chylomikronen. Über HDL nehmen die Chylomikronen Apo CII, CIII sowie Apo E auf und geben dafür Apo AI, AII und Phospholipide an HDL ab (Havel et al. 1973; Hussain et al. 1996).
In den Gefäßen von Muskeln und anderen extrahepatischen Geweben wie zum Beispiel dem Fettgewebe, werden die Triglyceride der Chylomikronen durch eine endothelständige Lipoproteinlipase (LPL) hydrolysiert. Die Lipoproteinlipase ist an Proteoglykanen von Endothelzellen lokalisiert und in der Lage, triglyceridreiche Lipoproteine zu binden. Dabei kommt es zu einem komplexen Wechselspiel zwischen Apo E, der an Heparansulfatproteoglykanen (HSPG) verankerten Lipase, sowie dem als Kofaktor für die Lipase benötigtem Apo CII (Ji et al. 1993; Mahley und Ji 1999).
Die dabei entstehenden Fettsäuren und Monoacylglyceride können über die Zellmembran aufgenommen werden und intrazellulär zur Energiegewinnung oder als Vorstufe für die
Einleitung
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Synthese körpereigener Lipide verwendet werden. Liegt kein Energiebedarf vor, können Fettsäuren und Monoacylglyceride wieder in Form von Triglyceriden reverestert und gespeichert werden.
Durch die Hydrolyse der Triglyceride aus den Chylomikronen werden diese in Chylomikronen-Remnants umgewandelt, welche dann nur noch wenig Triglyceride, dafür aber viel Cholesterin, Apo E und LPL enthalten (Heeren et al. 2002). Diese Chylomikronen-Remnants werden zuletzt durch die Leber aus dem Blutplasma entfernt. Hierbei ist Apo E für die Aufnahme der Remnants in die Leberzellen von größter Wichtigkeit. So konnten sowohl bei männlichen Patienten, als auch bei Mäusen beiden Geschlechts, denen als Gemeinsamkeit Apo E fehlte, vermehrte triglyceridreiche Lipoproteine im Blutplasma nachgewiesen werden, was das Risiko, eine Atherosklerose zu entwickeln, deutlich erhöht (Curtiss und Boisvert 2000). Zusammen mit der Lipoproteinlipase, welche nach der Hydrolyse in den extrahepatischen Geweben zum Teil an den Remnants verbleibt, bindet Apo E zuerst an die HSPG der Leberzellen und dann an den LDL-Rezeptor und das LDL-Rezeptor-related Protein 1 (LRP1) (Beisiegel et al. 1989; Kowal et al. 1989).
Das LRP1 verdankt seinen Namen der Tatsache, dass es aus 32 Domänen besteht, von denen einige starke Ähnlichkeit mit dem LDL-Rezeptor besitzen. Das LRP1 ist auch in der Zellmembran lokalisiert und besitzt eine große Affinität zu Chylomikronen-Remnants und VLDL. Diese werden in die Zelle aufgenommen, wenn sie Apolipoprotein E enthalten, da das LRP1 unter anderem einen Apo E Rezeptor darstellt (Beisiegel et al. 1989). Ein weiteres Protein, das vom LRP1 gebunden wird, ist das alpha-2-Makroglobulin, das im Plasma hauptsächlich Proteasen wie Thrombin inaktiviert. Das LRP1 ist damit ein Rezeptor, der multifunktionelle Aufgaben besitzt (Luley und Klör 1993).
Bei der Bindung von Chylomikronen-Remnants an das LRP1 konnte festgestellt werden, dass in Anwesenheit der Lipoproteinlipase das Bindungsverhalten zwischen Apo E und LRP1 stark zunimmt (Beisiegel et al. 1991; Willnow et al. 1994).
Für diese vermehrte Bindung von Apo E an LRP1 und damit auch den vermehrten Abbau von Chylomikronen-Remnants aus dem Blutplasma ist die katalytische Funktion der Lipoproteinlipase von keiner Bedeutung. Heeren et al. konnten in vivo nachweisen, dass es auch mit inaktivierter Lipoproteinlipase zu einer verstärkten hepatischen Eliminierung von triglyceridreichen Lipoproteinen aus dem Blutplasma kommt (Heeren et al. 2002). Nach der endozytotischen Aufnahme der Chylomikronen-Remnants in die Hepatozyten unterliegen einige Operflächenproteine wie zum Beispiel das Apo E einem Recycling,
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wohingegen die Lipide und Kernproteine weiter abgebaut werden (Heeren et al. 1999; Heeren et al. 2003).
1.1.2 Der endogene Lipidstoffwechsel
Im endogenen Lipidstoffwechsel werden in der Leber synthetisierte Cholesterine und Triglyceride hauptsächlich durch das VLDL zu den peripheren Geweben transportiert. Dieser Stoffwechselabschnitt ist vor allem im Hungerzustand wichtig, um die peripheren Gewebe mit Energiesubstraten und Lipidbausteinen zu versorgen.
Das VLDL wird dabei in seiner Struktur während des Stoffwechsels zu IDL oder LDL umgewandelt. Die VLDL sind in ihrer Zusammensetzung den Chylomikronen recht ähnlich, ausser dass sie in ihren Lipidkonzentrationen variieren, und Apo B 48 durch Apo B 100 ersetzt ist (siehe Tabelle 1). Nach ihrer Produktion in der Leber und erfolgter Sekretion in den Blutkreislauf erfolgt auch hier die Anreicherung der VLDL mit Apo CI, CII, CIII und Apo E aus den HDL im Blutplasma.
Der Abbau von Triglyceriden in VLDL funktioniert, wie auch bei den Chylomikronen, über die bereits erwähnte, endothelständige Lipoproteinlipase an den Gefäßwänden der peripheren Gewebe. Dabei wird Apo C und freies Cholesterin an HDL übertragen und das Cholesterin mit Hilfe der Lecithin-Cholesterinacyltransferase (LCAT) in den HDL verestert. Später können die Cholesterinester durch das Cholesterinester-Transferprotein (CETP) wieder auf Apo B100 haltiges LDL zurückübertragen werden (Lagrost 1994). Durch Lipolyse entstehen aus VLDL zunächst kleinere VLDL-Remnants und nach weiterer Lipolyse IDL (Griffin und Packard 1994). Die IDL und auch schon die VLDL-Remnants können über Apo E vermittelte Aufnahme an LDL-Rezeptoren und über das LRP1 von der Leber aufgenommen werden (Havel und Hamilton 1988). Zusätzlich kann die hepatische Lipase IDL weiter abbauen, so dass nach weiterer Hydrolyse von Triglyceriden und der Aufnahme von Cholesterinestern aus dem HDL zuletzt das LDL entsteht (Rubinstein et al. 1985). Während des Umbaus von VLDL zu LDL werden Apo CI, CII, E, Phospholipide und freies Cholesterin vom VLDL an das HDL abgegeben und Cholesterinester aus dem HDL aufgenommen. Der im Blutplasma stattfindende Austausch von Cholesterinestern zwischen den verschiedenen Lipoproteinen wird durch das CETP vermittelt (Tall 1993). Das entstandene LDL, welches reich an Cholesterinestern ist, wird durch eine Apo B100 vermittelte Aufnahme über den LDL-Rezeptor aus dem Blutplasma eliminiert. Damit ist der LDL-Rezeptor ein wichtiger Bestandteil für die Cholesterinhomöostase im menschlichen Körper. Menschen, die einen angeborenen LDL-Rezeptormangel oder sogar gar keinen LDL-Rezeptor besitzen, leiden unter einer so genannten familiären Hypercholesterinämie,
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die mit einem stark erhöhten Risiko für Atherosklerose und Koronarer Herzkrankheit einhergeht (Brown und Goldstein 1986).
Der LDL-Rezeptor kann sowohl in der Leber, als auch in peripheren Geweben an Zelloberflächen lokalisiert werden. Die Funktionsweise der Aufnahme von LDL über den LDL-Rezeptor wurde erstmals von Anderson und Brown 1977 an kultivierten menschlichen Fibroblasten beschrieben. Dabei bindet das Apolipoprotein B 100 vom LDL an den LDL-Rezeptor, welcher nur an besonderen Stellen der Zellmembran, auch coated pits (Stachelsaumbereich) genannt, gelegen ist. Durch Einstülpung der Zellmembran wird der LDL-Rezeptor-Komplex aufgenommen. Die dabei entstehenden Endosomen verschmelzen im Zellinneren mit Lysosomen, die zum Abbau des LDL notwendigen Enzyme enthalten. Proteasen und lysosomale saure Lipase spalten die LDL-Partikel wieder in freie Aminosäuren und hydrolysieren die enthaltenen Cholesterinester. Einige Proteine wie etwa der LDL-Rezeptor werden vor dem lysosomalen Prozess in kleinen Vesikeln von den Endosomen abgeschnürt und zurück zur Plasmamembran transportiert. Dort kann der „recycelte“ LDL-Rezeptor erneut LDL binden (Anderson et al. 1977).
In der Zelle ist durch diesen Mechanismus die Konzentration an freiem, nicht verestertem Cholesterin gestiegen. Dieses kann jetzt zur Plasmamembran oder zum Endoplasmatischen Retikulum transportiert werden, wo eine Veresterung durch die Acyl-CoA-Cholesterin-Transferase (ACAT) stattfindet (Chang et al. 1997; Chang et al. 2001). Die Cholesterinester können in der Zelle gespeichert werden oder für die Synthese von Steroiden, Gallensäuren und Lipopoteinen verwendet werden.
Ungefähr ein Drittel der LDL-Partikel werden beim gesunden Menschen unabhängig vom LDL-Rezeptor aufgenommen. Dieser Mechanismus wird „scavenger pathway“ genannt. scavenger-Rezeptoren sind auf Zellen des Retikulohistiozytären Systems (Makrophagen, Kupffer-Zellen) exprimiert. Als Unterschied zum LDL-Rezeptor, bei dem ab einer gewissen LDL-Konzentration die LDL-Aufnahme nicht mehr steigerbar ist, unterliegt der „Scavenger pathway“ keiner Sättigung. Das aus den LDL-Partikeln stammende Cholesterin kann also bei einem Überangebot massiv in die Zelle gelangen und sich dort ablagern. Durch die Aufnahme von Cholesterin in Makrophagen wandeln sich diese dann in Schaumzellen um und sind wesentlich an der Bildung atherosklerotischer Plaques beteiligt (Krieger und Herz 1994).
1.1.3 Der reverse Cholesterintransport
Außer der Haut, die durch Abschilferung Cholesterin abgibt, ist nur die Leber dazu befähigt, Cholesterin direkt oder in Form von Gallensäuren auszuscheiden. Für den
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Transport des Cholesterins aus den peripheren Geweben zur Leber steht das HDL zur Verfügung.
Das HDL kann in diverse Untergruppen geteilt werden, welche sich in Größe, Dichte, Apolipoproteingehalt und damit auch in ihrer genauen Funktion voneinander unterscheiden. Lipidarme HDL werden als diskoidale Partikel in der Leber synthetisiert oder sind mit ihren Apolipoproteinen intestinalen Ursprungs (Castle et al. 1991; Danielsen et al. 1993). Die HDL nehmen in den peripheren Geweben Cholesterin auf, das durch die Lecithin-Cholesterin-Acyl-Transferase (LCAT) verestert wird und sich im Kern der HDL ablagert. Dadurch gehen die HDL von ihrer ursprünglich diskoidalen in eine sphärische Form über. Bei diesem Prozess ist das Oberflächenassozierte Apo AI der HDL wesentlich an dem Erkennen und Funktionieren der LCAT beteiligt (Ishida et al. 1990). Mit Hilfe des ATP-Binding-Cassette-Transporter Typ AI (ABCAI) werden HDL-Vorstufen in extrahepatischen Geweben mit Phospholipiden und Cholesterin versorgt (Wang et al. 2000). Auch in diesem ABCAI-vermittelten Lipidefflux ist Apo E und Apo AI unverzichtbar (Castro und Fielding 1988; Huang et al. 1993). Die mit Cholesterinestern angereicherten HDL nehmen im Blutplasma Apo E auf und können im Hepatozyten Apo E- oder Apo AI-vermittelt abgebaut werden (Curtiss und Boisvert 2000; Tall et al. 2000).
Ein anderer Weg zur Eliminierung der Cholesterinester aus den HDL funktioniert über den Austausch auf Apo B haltige Lipoproteine wie VLDL und LDL durch das CETP. Die Funktion der LCAT und des CETP halten den Konzentrationsgradienten von Cholesterin zwischen der peripheren Zellmembran und dem HDL aufrecht. Dies wiederum sichert den gerichteten Fluss von Cholesterin aus der Zelle in das HDL.
Durch Inhibierung des CETP mit dem Medikament Torcetrapip konnte bei einigen Probanden ein 50 % bis 100% Anstieg des HDL beobachtet werden. Da ein erhöhtes HDL eine anti-atherosklerotische Wirkung besitzt, verspricht man sich von diesem Wirkstoff eine neue Waffe zur Prävention und Behandlung der Koronaren Herzerkrankung (Stein und Stein 2005).
Neben der Aufnahme von HDL in den Hepatozyten oder der Abgabe von Cholesterinester an andere Lipoproteine können Cholesterinester auch direkt über den Scavenger-Rezeptor Klasse B Typ I ( SR-BI) in hepatische oder extrahepatische Zellen aufgenommen werden (Krieger 1999).
Einleitung 9 CM Remnant B48 E C LpL CM B48 C E CM B48 A VLDL C E B100 IDL E B100 C LpL LDL B100 HDL C A E LRP LDL R LpL LpL LpL LDL R HPSG LRP SR LRP LDL R ABCA1 ABCA1 Gallensäuren Cholesterin CETP LCAT CETP LCAT PLTP HL extrahepatisches Gewebe Makrophage Leber FFS FFS Kapillarendothel Ka pi llarend ot hel FFS Nahrungslipide Enterozyt HDL-Vorläufer HDL-Vorläufer endogener Weg ex og ener W eg SR-BI
Abb.1 Schematische Übersicht des Lipoproteinstoffwechsel. Modifiziert und ergänzt aus (Kostner
und März 1995).
In der Übersichtszeichnung sind der endogene Weg (vertikaler Pfeil), der exogene Weg (horizontaler Pfeil) und der reverse Cholesterintransport (gestrichelte Pfeile) der Lipoproteine dargestellt. Im exogenen Weg werden Nahrungslipide von Darmzellen aufgenommen und zu triglyceridreichen Chylomikronen komplexiert. Nach ihrem lymphatischen Abtransport gelangen die Chylomikronen in die Blutbahn, wo durch LpL ihre Triglyceride hydrolysiert und somit Fettsäuren freigesetzt werden. Das verbleibende, cholesterinreiche Chylomikronen-Remnant wird über LDL R oder LRP1 in die Leber aufgenommen. In der Leber synthetisiertes VLDL wird im endogenen Weg durch LpL oder HL durch Hydrolyse der Triglyceride über IDL zu cholesterinreichen LDL umgebaut. Das LDL kann dann rezeptorvermittelt wieder in die Leber oder in extrahepatische Gewebe aufgenommen werden. LDL kann auch von Makrophagen aufgenommen werden, welche sich dann
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zu Schaumzellen umwandeln. Sowohl im endogenen als auch im exogenen Weg stehen die beteiligten Lipoproteine im Apolipoproteinaustausch mit HDL. Im reversen Cholesterintransport entstehen HDL-Vorläufer in Darm- oder Leberzellen und nehmen über ABCA1-Transporter aus extrahepatischen Geweben Cholesterin auf. Bevor sie als HDL über SR-BI in die Leber aufgenommen werden, können sie Lipide und Apolipoproteine mit anderen Lipoproteinen austauschen.
CM: Chylomikron, CM-Remnant: Chylomikronen-Remnant, LpL: Lipoproteinlipase, VLDL: Lipoprotein sehr geringer Dichte, IDL: Lipoprotein mittlerer Dichte, LDL: Lipoprotein geringer Dichte, LDL R: LDL-Rezeptor, LRP1: LDL-Rezeptor-related Protein, HL: hepatische Lipase, HSPG: Heparansulfatproteoglykan, PLTP: Phospholipid-Transferprotein, LCAT: Lecithin-Cholesterin-Acyl-Transferase, CETP: Cholesterinester-Transferprotein, ABCA1: ATP-binding Cassette Transporter 1, SR: Scavenger-Rezeptor, SR-BI: Scavenger-Rezeptor Klasse B Typ 1, HDL: Lipoprotein hoher Dichte, FFS: freie Fettsäuren
1.2 Fettsäuren und ihre Funktionen im Menschen
Freie, nicht veresterte Fettsäuren stellen einen wichtigen Bestandteil des Lipidstoffwechsels dar und sind eines der bedeutendsten Substrate für den Energiehaushalt der Körperzellen. Dabei muss innerhalb eines Organismus ein schneller Austausch und Transport von Fettsäuren zwischen den jeweiligen Geweben und Zellkompartimenten gegeben sein. Eine gut oxygenierte Herzmuskelzelle etwa benötigt für ihre Energieversorgung mehr Fettsäuren, als sie aus ihren eigenen Triglyceridreserven mobilisieren könnte. Daher werden aus anderen Zellen, wie zum Beispiel aus Adipozyten, Fettsäuren bereitgestellt, die dann der Herzmuskelzelle verstoffwechselt werden können. Die Fettsäuren verlassen dazu die Zellmembran der Adipozyten, passieren das Kapillarendothel und gelangen über den Blutkreislauf zur Herzmuskelzelle. An diesem schnellen und zielgerichteten Transport sind mehrere Transportproteine beteiligt, deren Funktionsweisen längst nicht alle verstanden sind (Hamilton 1998).
Langkettige Fettsäuren zirkulieren im Blut entweder an Albumin gebunden oder in Form von Triglyceriden in Chylomikronen und Lipoproteinen verpackt (Ring et al. 2002). In welchem Abschnitt des Lipoproteinstoffwechsels aus den Chylomikronen und Lipoproteinen durch endothelständige Lipoproteinlipasen oder der hepatischen Lipase, Fettsäuren freigesetzt werden, ist in Abbildung 1 zu erkennen. Diese Fettsäuren können dann direkt in Zellen aufgenommen oder an Albumin gebunden werden. Nur ein ganz geringer Anteil von Fettsäuren liegt dauerhaft in monomerischer Form vor und ist dabei an kein anderes Protein gebunden (McArthur et al. 1999).
Neben ihrer Funktion als Energiesubstrat sind Fettsäuren, und unter diesen vor allem die langkettigen Fettsäuren, auch als Vorstufe bei der Synthese von Membranlipiden und Zellmediatoren (Prostaglandine, Leukotriene, Thromboxane) unverzichtbar (Yamashita et
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al. 1997). Zusätzlich besitzen langkettige Fettsäuren Einfluss auf die Genexpression von Enzymen des Fett- und Glukosestoffwechsels (Grimaldi et al. 1999).
Bevor auf den Stoffwechsel und die Wirkungen von Fettsäuren auf die Genexpression genauer eingegangen wird, soll zum besseren Verständnis ihre Nomenklatur und ihr Transport in die Zelle erläutert werden.
1.2.1 Fettsäuren und ihre Nomenklatur
Fettsäuren (FA = fatty acid) sind im menschlichen Körper entweder in freier Form oder zum Beispiel in Acylglyceriden, Phosphoglyceriden, Sphingolipiden und Cholesterinestern zu finden. Die meisten Fettsäuren im Menschen bestehen aus einer Kette mit gerader Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in ihrer Länge gewöhnlich zwischen 14 und 24 C-Atomen liegt. Das eine Ende dieser Kette wird immer von einer Carboxylgruppe gebildet, während das andere eine Methylgruppe darstellt. Zwischen den einzelnen C-Atomen können keine, eine einzige oder mehrere Doppelbindungen vorliegen. Im ersten Fall spricht man von einer gesättigten Fettsäure (SFA = saturated FA), bei einer einzigen Doppelbindung von einer einfach ungesättigten Fettsäure (MUFA = monounsaturated FA) und bei mehreren Doppelbindungen von einer mehrfach ungesättigten Fettsäure (PUFA = polyunsaturated FA).
Für die Zählweise der einzelnen Doppelbindungen und C-Atome einer Fettsäure gibt es zwei Möglichkeiten. Bei der ersten werden die C-Atome von der Carboxylgruppe ausgehend mit steigenden Zahlen durchnummeriert. Die zweite Zählweise bezeichnet das nach der Carboxylgruppe folgenden C-Atom, also C-Atom 2, mit dem griechischen Buchstaben α und setzt diese Beschriftung dem griechischen Alphabet folgend bis zur Methylgruppe fort, die immer den Buchstaben ω trägt (siehe Abbildung 2).
Abb.2 Allgemeine Schreibweise von gesättigten Fettsäuren
Gezeigt sind die zwei Zählweisen der Kohlenstoffkette. Die C-Atome der Fettsäuren werden entweder vom Carboxylende aus, das hier in ionisierter Form vorliegt, durchnummeriert, oder sie werden ab dem zweiten Atom mit den Buchstaben des griechischen Alphabets gezählt. Das C-Atom der Methylgruppe erhält dabei immer den Buchstaben ω (Löffler 1996).
Die Lage der Doppelbindung in einer Fettsäure wird durch ein ∆ mit hochgestellter Zahl beschrieben. ∆12 entspricht einer Doppelbindung zwischen den C-Atomen 12 und 13 einer
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Fettsäure. Alle Doppelbindungen liegen in isolierter Form vor. Das bedeutet, dass die Doppelbindungen jeweils durch zwei C-C-Bindungen getrennt sind. Der Zusatz „Cis“ oder „Trans“ beschreibt die Lage der Wasserstoffatome bei einer Doppelbindung. Bei einer anderen Angabe der Stellung von Doppelbindungen zählt man von dem C-Atom aus, welches als ω bezeichnet wird. So findet sich bei einer ω–3-Fettsäure die erste Doppelbindung immer hinter dem dritten C-Atom von der Methylgruppe aus. Eine weitere Schreibweise bezeichnet die Lokalisation der ersten Doppelbindung mit n-3. Auch hier befindet sich wie bei der ω-Schreibweise die erste Doppelbindung stets hinter dem dritten C-Atom nach der Methylgruppe. Bei einer n-6 PUFA dagegen würde sich die erste Doppelbindung erst hinter dem sechsten Kohlenstoffatom von der Methylgruppe aus befinden.
a b
Abb.3a, b Darstellung einer ω–3-Fettsäure sowie einer SFA und einer MUFA
In Abbildung 3a wird gezeigt, wie die Bezeichnung „ω–3-Fettsäure“ entsteht. Die erste Doppelbindung ist hinter dem dritten C-Atom lokalisiert, wenn mann von dem grün dargestellten ω-Carbonatom der Methylgruppe aus zählt. Abbildung 3b zeigt die ionisierte Form der ungesättigten Fettsäure Palmitinsäure, sowie die ionisierte Form der einfach ungesättigten Fettsäure Oleinsäure (Löffler 1996).
Die Schreibweise 18:0 bedeutet, dass es sich um eine Fettsäure aus 18 C-Atomen handelt, in welcher keine Doppelbindung vorliegt. Bei der Bezeichnung 18:3 sind in der gleichen Kette drei Doppelbindungen eingebaut.
1.2.2 Essentielle und nicht essentielle Fettsäuren
Der menschliche Organismus kann bis auf die Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren alle Fettsäuren, die er benötigt, selbst herstellen. Um eine Omega-3- oder Omega-6-Fettsäure de novo herzustellen, wird jeweils der kürzeste Vertreter dieser Gruppen, nämlich die Linolensäure (18:3 n3) oder die Linolsäure (18:2 n6) benötigt. Diese Fettsäuren müssen mit der Nahrung zugeführt werden und werden daher als essentielle Fettsäuren
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bezeichnet. Sie dienen als Präkursoren für weitere Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren, ohne die der menschliche Organismus nicht lebensfähig wäre. Tabelle 2 zeigt die essentiellen und die daraus gewonnenen wichtigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren des Menschen.
Fettsäure Abkürzung Formel Synthese aus:
Omega-3 Fettsäuren
Linolensäure LNA 18:3 n-3 essentielle Aufnahme
Eicosapentaensäure EPA 20:5 n-3 LNA
Docosahexaensäure DHA 22:6 n-3 EPA
Omega-6 Fettsäuren
Linolsäure LA 18:2 n-6 essentielle Aufnahme
Arachidonsäure AA 20:4 n-6 LA
Docosapentaensäure DPA 22:5 n-6 AA
Tab.2: Darstellung der essentiellen Fettsäuren des Menschen und ihrer Präkursoren. Modifiziert
aus (Jumpsen und Clandinin 1995)
In Tabelle 2 sind die essentiellen Fettsäuren, sowie wichtige Fettsäuren welche aus diesen Synthetisiert werden mit Namen, Abkürzung und numerischer Formel dargestellt.
Aus der Gruppe der Fettsäuren mit 20 Kohlenstoffatomen, auch Eikosanoide genannt, werden im Menschen Prostaglandine, Prostazykline, Thromboxane und Leukotriene hergestellt. Diese Faktoren sind bei Entzündungen oder der Blutgerinnung unverzichtbar. Essentielle Fettsäuren und generell mehrfach ungesättigte Fettsäuren finden sich hauptsächlich in Korn-, Sojabohnen-, Distel-, oder Sonnenblumkernölen. Neben den pflanzlichen Ölen ist das Fleisch von Fischen sehr gehaltvoll an Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren. Allen mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist gemeinsam, dass sie zwei oder mehr Doppelbindungen enthalten und bei Raumtemperatur in einem flüssigen Zustand vorliegen.
Einfach ungesättigte Fettsäuren wie zum Beispiel die Oleinsäure (18:1) sind stark in Ölen aus Oliven, Erdnüssen, Canola, Nüssen und Avocado vertreten. Sie enthalten nur eine Doppelbindung und sind ebenfalls bei Raumtemperatur flüssig.
Die dritte Gruppe von Fettsäuren bilden die gesättigten Fettsäuren. Die Kohlenstoffketten enthalten keine Doppelbindung, weshalb solche Fettsäuren auch bei Raumtemperatur von fester Konsistenz sind. Gesättigte Fettsäuren finden sich vorwiegend in Fleisch, Geflügel, Milchprodukten sowie Kokosnuss- und Palmölen.
Die in dieser Arbeit verwendeten Fettsäuren sollten Vertreter aller verschiedenen Fettsäuregruppen sein und dadurch die verschiedenen Fettsäureangebote unserer westlichen Ernährung weitgehend abdecken. Ausgewählt wurden für den Versuchsaufbau
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daher die Stearin- und Palmitinsäure als gesättigte Fettsäuren und die Oleinsäure (auch Ölsäure genannt) als einfach ungesättigte Fettsäure. Für die Gruppe der essentiellen Fettsäuren wurde die Linolensäure eingesetzt.
1.2.3 Der Stoffwechsel von Fettsäuren
Die Aufnahme langer, mehrfach ungesättigter Fettsäuren in die Zellen wird durch membranassoziierte Fettsäure-Transporter ermöglicht. Für diese Aufgabe sind inzwischen mindestens fünf Transporter wie das fatty acid binding protein, fatty acid translocase, caveolin, 56-KDa kidney fatty acid binding protein und das fatty acid transport protein gefunden worden (Jump DB 1999).
Der Abbau von Fettsäuren erfolgt dann als ß-Oxidation in der inneren Mitochondrienmatrix der Zielzelle. Da Fettsäuren reaktionsträge Strukturen sind, werden sie zunächst an der äußeren Mitochondrienmembran durch die Acyl-CoA-Synthetase mit Coenzym A aktiviert. Damit die aktivierte Fettsäure anschließend in das Mitochondrium gelangt, bedarf es eines speziellen Enzym-Transportersystems, welches die Fettsäure als Carnitinester über die innere Mitochondrienmembran transportiert. Für kurz- und langkettige, ungeradzahlige oder ungesättigte Fettsäuren bestehen dort spezifische Enzymsysteme, die in der ß-Oxidation die Fettsäure zu Acetyl-CoA abbauen, welches dann im Citratzyklus unter ATP-Gewinn weiter verstoffwechselt wird.
Zur ß-Oxidation sind bis auf Zellen des Nervensystems, gewissen Zellen des Nierenmarks und den Erythrozyten alle Zellen des menschlichen Organismus befähigt. Bei einem Überschuss an Acetyl-CoA kann es in der Leber, die einen Großteil des Acetyl-CoA liefert, zur Bildung von Ketonkörpern (Acetoacetat, 3-Hydroxybutyrat und Aceton) kommen, wie zum Beispiel beim entgleisten Diabetes Mellitus Typ 1. Ketonkörper stellen eine wichtige Energiequelle speziell für den Herzmuskel und die Nierenrinde dar und liefern das Acetyl-CoA, das im Citratzyklus zur ATP-Gewinnung benötigt wird. Auch das Gehirn des Menschen ist im Hungerzustand in der Lage, Acetoacetat zur Energiegewinnung zu verwerten (McGarry und Foster 1980).
Werden dem Körper durch Nahrungsaufnahme mehr Fettsäuren angeboten als er zur Deckung des aktuellen Enegiebedarfs braucht, erfolgt die Speicherung der Fettsäuren in Form von Triglyceriden im Fettgewebe. Dazu werden die zu speichernden Fettsäuren von einem Triglycerid-Synthetase-Komplex, das am Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist, an die drei möglichen Bindungsstellen eines Glycerinmoleküls acyliert und stellen so das dichteste Energiespeichermedium des menschlichen Körpers da.
Einleitung
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Neben dem Abbau von Fettsäuren ist der Körper aber auch dazu fähig, bestimmte Fettsäuren de novo zu synthetisieren. Dies geschieht durch einen 260 KDa großen Multienzymkomplex, genannt FAS (fatty acid synthase), welcher im Zytosol der Zellen lokalisiert ist. Alle Körperzellen außer den Erythrozyten besitzen diesen Multienzymkomplex. Die stärkste Syntheseleistung findet sich dabei in den Leberzellen. Mit vorhandenem Acetyl-CoA als C2-Donator kann bei einem Mangel an Fettsäuren durch die FAS eine gesättigte Fettsäure bis zu einer Länge von 16 C-Atomen (Palmitinsäure) hergestellt werden. Die Verlängerung und das Einfügen von Doppelbindungen in die synthetisierte Fettsäure erfolgt durch weitere Enzyme, welche Desaturasen und Elongasen genannt werden. So kann Energie gespeichert werden oder Fettsäuren als Bausteine für Biomembranen und andere wichtige Lipide im menschlichen Körper hergestellt werden. Die Fluidität aller Biomembranen im Körper des Menschen ist unter anderem abhängig von der Anzahl und Art der enthaltenen Fettsäuren. So erhöhen lange und ungesättigte Fettsäuren die Fluidität von Membranen, während kurze und gesättigte Fettsäuren zu einer Versteifung von Membranen führen.
Neben dem Einfluss der verschiedenen Fettsäuren auf Membraneigenschaften im menschlichen Körper konnten gerade für die mehrfach ungesättigten Fettsäuren auch modulatorische Effekte auf das Immunsystem (de Pablo und Alvarez de Cienfuegos 2000), auf degenerative Hirnerkrankungen (Youdim et al. 2000; Yehuda et al. 2002), auf kardiovaskuläre Erkrankungen (Forsyth et al. 2003)Ascherio, 2002 #135} sowie auf Krebserkrankungen (Goodstine et al. 2003) nachgewiesen werden. Bei näheren Untersuchungen zeigte sich, dass einige Fettsäuren auf genetischer Ebene direkten Einfluss auf die Proteinexpression in Zellen besitzen (Grimaldi 2001; Ntambi und Bene 2001).
Da inzwischen viele modulatorische Effekte von Fettsäuren auf die Genexpression in Zellen beschrieben worden sind, werden im Folgenden zum besseren Verständnis nur die wichtigsten und für diese Arbeit relevanten Erkenntnisse dargestellt.
1.3 Lipide und Genexpression
Fettsäuren und besonders die mehrfach ungesättigten Fettsäuren besitzen neben den metabolischen und strukturellen Wirkungen bei einer Langzeitdiät auch nach kurzeitiger Aufnahme eine hormonähnliche Wirkung auf die Aktivität und das Vorhandensein wichtiger Transkriptionsfaktoren für Enzyme des Fett- und Glukosestoffwechsels. Dabei sind Zellproteine wie die Familie der PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors), der LXR (liver X receptor) und die SREBPs (sterol response element binding proteins) von
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besonderem Interesse und in den letzten Jahren Gegenstand vieler Forschungsarbeiten gewesen.
Die PPARs stellen ein Gruppe von Liganden-aktivierten Transkriptionsfaktoren dar, die zum einen durch Medikamente wie Fibrate und Thiazolidindione, aber auch durch n-3 PUFAs beeinflusst werden können (Jump 2002). Der PPAR wurde dazu das erstmalig von Gottlicher et al. im Zusammenhang mit regulatorischen Effekten von Fettsäuren beschrieben (Gottlicher et al. 1992). Diese Arbeit zeigte, dass die folgenden Medikamente und Fettsäuren PPARs in absteigender Stärke aktivieren. Die Fibrate WY 14,643 und Clofibrat > Linolsäure > Arachidonsäure > Oleinsäure = Stearinsäure > Laurinsäure = Kaproinsäure. Damit wurde erstmalig gezeigt, dass der Einfluss von bestimmten Fettsäuren auf die Proteinexpression von Zellen unter anderem durch einen nukleären Rezeptor wie PPAR vermittelt wird.
Seitdem sind in der Literatur drei Subtypen des PPAR beschrieben worden, die von drei separaten Genen kodiert werden und unterschiedlich stark auf bestimmte Gewebe verteilt sind. So findet man PPARα vorwiegend in Leberzellen und Herzmuskelzellen, PPARβ in fast allen Geweben und das PPARγ hauptsächlich im Fettgewebe, im Muskel und in der Milz. Ein aktivierter PPARα beeinflusst den Transport von Fettsäuren, das fatty acid binding Protein, fatty acid synthesis, die Synthese von Acyl-CoA, mikrosomale, peroxisomale und mitochondriale ß-Oxidation, die Ketogenese, die ∆5-, ∆6- und ∆9 -Desaturase und Apolipoproteine wie apo C2 und apo C3 (Jump und Clarke 1999). Da diese Wirkungen neben PUFAs vor allem von Fibraten ausgelöst werden, sind die Gruppe der Fibrate als Medikament zur Lipidsenkung im menschlichen Körper ubiquitär in der Medizin im Einsatz. Über die Funktion von PPARβ ist noch nicht viel bekannt (Kersten und Wahli 2000). Dafür wurden die Regelkreise, an denen das PPARγ beteiligt ist, in letzter Zeit mehr und mehr verstanden. Wird PPARγ durch Medikamente wie Thiazolidindione aktiviert, kommt es zu einer Steigerung der Aktivität der Lipoproteinlipase und der Fettsäuretransporter. Man beobachtet dadurch eine Abnahme der Lipide in Muskel- und Fettgewebe und zusätzlich eine verbesserte Insulinsensitivität (Guerre-Millo et al. 2000; Ye et al. 2001). Aus diesem Grund werden solche Medikamente bei nicht Insulinpflichtigen Diabetikern, die zudem meist übergewichtig sind, in der Medizin gerne als Erstmedikament verabreicht. Neben den stark wirkenden Thiazolidindionen wird auch für n-3 PUFAs ein solcher Effekt beschrieben, der ebenfalls PPARγ vermittelt ist, aber sich klinisch nicht ganz so stark bemerkbar macht. Dies erklärt unter anderem die antidiabetogene und anti-atherosklerotische Wirkung von PUFAs, die schon seit längerem in Nagetiermodellen beschrieben sind (Nicolosi et al. 1997; Houseknecht et al. 1998).
Einleitung
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Neben der Gruppe der PPARs wurden noch andere Transkriptionsfaktoren gefunden, die ein Ziel von Fettsäuren zur Genregulation darstellen. Der anfangs erwähnte LXR zum Beispiel, gehört zur Gruppe der nukleären Rezeptoren und liegt in zwei Isoformen, LXRα und LXRß vor (Guerre-Millo et al. 2000; Ou et al. 2001).
LXRα findet sich hauptsächlich in der Leber, dem Intestinum und den Nieren, wohingegen LXRß in allen Geweben zu finden ist. LXRs binden Oxysterole und regulieren die Expression von Genen, welche unter anderem an der Gallensäuresynthese beteiligt sind. PUFAs wirken als Antagonisten zu den Oxysterolen und supprimieren ihren aktivierenden Effekt auf LXRs. Oxysterole induzieren über LXR CYP7A1, ein für die Gallensäuresynthese bekanntes, geschwindigkeitsbestimmendes Enzym, und erhöhen damit die Ausscheidung von Cholesterin (Lu et al. 2001).
Eine weitere wichtige Rolle des LXR ergiebt sich durch die Steuerung der Transkription von SREBP-1c Genen. Da SREBP-1c maßgeblich an der Regulation des Glukose- und Lipidstoffwechsels beteiligt ist, besitzt LXR auch hier eine wichtige Funktion, die vor allem im Hinblick auf das Wechselspiel mit den PUFAs von großem Interesse ist.
SREBPs sind membrangebundene Transkriptionsfaktoren, die am Endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert sind. Um als Transkriptionsfaktor in den Zellkern der Zelle zu gelangen, wird SREBP mit Hilfe von SCAP (SREPB cleavage-activating Protein) aus der Membran des ER gelöst und in den Golgiapparat transportiert. Dort erfolgt durch die Site-1-und Site-2-Protease das Schneiden des SREBP in die Form, die es ihm ermöglicht in den Zellkern zu gelangen und sich dort an das sterol response element (SRE) zu binden. Das SRE ist an der Enhancer- bzw. Promoterregion von Genen gelegen, die für den Lipidstoffwechsel von großer Wichtigkeit sind. Die Regulation der SREBP Bildung und das Wirken als Transkriptionsfaktor im Zellkern werden zum einen durch LXR und zum anderen durch SCAP gesteuert (Goldstein et al. 2002). Eine Transkription von SREBP kann nur gestartet werden, wenn zuvor LXR zusammen mit anderen Faktoren im Beisein von Oxysterol an die SREBP-Promoterregion bindet. An dieser Stelle können PUFAs die Bildung von SREBP verhindern, da sie die Oxysterole aus ihrer Position verdrängen, den LXR-Komplex inhibieren und damit eine Transkription unterbinden (Hannah et al. 2001; Yoshikawa et al. 2002). So wurde zum Beispiel in Nagetieren nach einer PUFAreichen Diät eine auffällig reduzierte Expression von SREBP-1c-mRNA und eine verminderte Lipogenese in der Leber beobachtet (Xu et al. 1999).
Eine weitere Regulation des SREBP erfolgt transkriptional über SCAP. Das SCAP schleust SREBP nur dann in den Golgiapparat, wenn die Zelle nicht ausreichend Cholesterin besitzt. Bei steigendem intrazellulären Cholesterinspiegel wird der SCAP/SREBP-Komplex nicht
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mehr in ER-Transportvesikel verpackt und kann dadurch nicht mehr in den Golgiapparat gelangen (Horton et al. 2002). Die Forschungsgruppe um Joseph et al. weist allerdings darauf hin, dass nicht alle Gene des Lipidstoffwechsels ausschließlich über SREBPs reguliert werden. So wird ihrer Ansicht nach die für die Lipogenese wichtige FAS durch eine direkt inhibierende Wirkung des LXR an der FAS-Promotorregion herunterreguliert. Vor allem durch diese Affinität und nicht ausschließlich über das SREBP-1c kommt es dann zu einer verminderten Lipogenese (Joseph et al. 2002).
Zusammenfassend betrachtet erniedrigen sowohl intrazelluläre PUFAs als auch hohe intrazelluläre Cholesterolspiegel SREBPs und verringern hauptsächlich durch diesen Prozess die Transkription von SREBP-gesteuerten Genen (Shimano 2001). Welche Enzyme und Proteine dabei herunterreguliert werden, ist aus der folgenden Abbildung 4 ersichtlich. Dort sind die für den Lipidstoffwechsel relevanten Subtypen des SREBP dargestellt.
Enzymgene reguliert durch:
SREBP-2 SREBP-1c Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA Malonyl-CoA HMG-CoA Mevalonat Squalen Cholesterin Gesättigte Fettsäuren
Einfach ungesättigte Fettsäuren
Fettsäure Acyl-CoA Monoacylglycerol-3-phosphat Triglyceride Phospholipide Acetoacetyl-CoA-Thiolase HMG-CoA-Synthase HMG-CoA-Reduktase Mevalonat-Kinase und weitere Enzyme
und weitere Enzyme Squalen-Epoxidase
Acetyl-CoA-Carboxylase Fettsäuresynthase
Stearoyl-CoA-Desaturase
Glycerol-3-phosphat-Acyltransferase und weitere Enzyme
weitere Enzyme
Abb.4 Gene von Enzymen die durch SREBPs reguliert werden. Abbildung modifiziert (Horton et al.
2002)
Die Abbildung zeigt die wichtigsten Zwischenschritte in der Synthese von Cholesterin, Fettsäuren und Triglyceriden. SREBP-2 aktiviert bevorzugt Gene des Cholesterinstoffwechsels, während SREBP-1c eher auf Gene des Fettsäure- und des Triglyceridmetabolismus wirkt.
Es ist ersichtlich, dass PUFAs durch das Zusammenspiel von PPARs, LXRs und SREBPs starke Einflüsse auf den Lipidstoffwechsel von Säugern besitzen. PUFAs fungieren dabei
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über die SREBP Inhibierung wie eine Art Feedback-Regulator für die Synthese von Fettsäuren und Cholesterin. Verknüpft man dies mit der aktivierenden Eigenschaft von PUFAs auf PPARs und deren Zielgene, kommt es in der Leber und anderen Geweben zu einem Umschalten von der Lipidsynthese und Lipidspeicherung zu vermehrter Lipidoxidation und Lipidabbau. Diese Mechanismen wirken neben anderen als Schutz vor einer Verfettung des Organismus und allen daraus resultierenden, gesundheitsschädigenden Nebenwirkungen.
20 1.4 Ziel der Arbeit
Die Manifestation und der Verlauf von Krankheiten wie Diabetes und Atherosklerose wurden in vielen Untersuchungen in Zusammenhang mit der Aufnahme von speziellen, in der Nahrung enthaltenen Fettsäuren gebracht.
Es ist heute bekannt, dass viele dieser Effekte durch die direkte Bindung der Fettsäuren an nukleäre Rezeptoren vermittelt werden. Diese Interaktion führt zu einer veränderten Expression von Proteinen, die im Stoffwechsel wichtige regulatorische Funktionen ausüben. Viele dieser Studien wurden nicht in humanen Zellen, sondern in Nagermodellen durchgeführt und haben ebensowenig berücksichtigt, dass je nach Stoffwechselsituation und Fettsäurestruktur (kurz- oder langkettig) Fettsäuren an Albumin gebunden oder komplexiert als Triglyceride über Lipoproteine in die Zelle aufgenommen werden.
In dieser Arbeit sollen die Lipid-induzierten, zellulären Veränderungen in humanen Leberzellkulturen auf Proteinebene untersucht werden. Zu diesem Zweck soll zunächst die prä- und postprandiale Phase in humanen Hepatomazellen (HuH7 Zellen) experimentell nachgespielt werden, wobei einerseits Albumin-gebundene Fettsäuren und andererseits definierte triglyceridreiche Liposomen als Stimuli untersucht werden.
Nach den Inkubationen wird zunächst die Aufnahme der Albumin-gebundenen Fettsäuren und triglyceridhaltigen Liposomen durch die Analyse der zellulären Lipidzusammensetzung und mikroskopisch nach Anfärbung der Lipide bestimmt. Die Expression verschiedener Zielproteine soll mit Hilfe der Western Blot-Technik untersucht werden. Zu den Zielproteinen gehören Proteine, die im zellulären Lipid- und Lipoproteinstoffwechsel eine wichtige Funktion haben. Dazu gehören unter anderen die Lipoproteinrezeptoren (LDL R und LRP1), die Fettsäure-Synthase (FAS) und die Lipid-abhängigen Transkriptionsfaktoren (PPARα und SREBP-1c). Ebenfalls wird die Lipoproteinsekretion durch Detektion von Apolipoprotein B und Apolipoprotein E im Überstand der inkubierten Zellen bestimmt. Mit diesen Untersuchungen soll geklärt werden, ob der Weg der Fettsäureaufnahme die hepatische Proteinexpression entscheidend beeinflusst. Ferner sollen die Ergebnisse der Arbeit dazu beitragen, die molekularen Wirkmechanismen verschiedener Fettsäuren im zellulären Stoffwechsel zu verstehen und deren Einfluss auf physiologisch relevante Prozesse im Energiestoffwechsel aufzeigen.
Material und Methoden
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2 Material und Methoden
2.1 Geräte
Sonifier 450 (Branson) Wasserbad GFL 1083 (GFL) Brutschrank CB 210 (Binder) Werkbank Hera Safe (Heraeus) Lichtmikroskop Axiovert 25 (Zeiss)
Objektiv CP Achromat 10 x 0,25 Ph1 Var1 (Zeiss)
Mikroskop Axiovert 100 mit Fluoreszenzeinrichtung, Objektiv Ph3 Plan-apochromat 63x1,40 Oil, Kamera Axio Cam, Software Axio Vision Viewer (Zeiss)
Membranpumpe MZ2C (ABM) Zentrifuge Sigma 6k15 (Sigma) Tischzentrifuge Sigma 1-15k (Sigma)
Tischabsaugpumpe ECOM-P 4153 (Eppendorf) Thermomixer Compact (Eppendorf)
pH-Meter MP 220 (Mettler Toledo) Tischmixer Ikamag Reo (IKA) Vortexer Reax 1 DR (Heidolph)
Photometer Smart Spec 3000 (BioRad)
MRX Microplate Reader (Dynatech Laboratories)
Elektrophoresekammer und Zubehör für Minigele (BioRad) Blottingkammer und Zubehör (BioRad)
Netzgeräte 2301 Macrodrive 1 Power Supply (LKB Bromma) Folienschweißgerät Impuls Sealer (TEW)
Schwenkmixer IKA-Vibrax-VXR (IKA)
Filmentwicklungsmaschine X-Omat 1000 (Kodak) Konfokales Mikroskop (Zeiss)
2.2 Chemikalien
Alle nicht explizit aufgeführten Chemikalien wurden bei den Firmen Sigma (Steinheim), Serva (Heidelberg) und Merck (Darmstadt) in analytischer (p.A.) bzw. in HPLC-Reinheit eingekauft.
22 2.3 Verbrauchsmaterial
Alle Plastikwaren für die Zellkultur waren von Nunk oder Falcon Gel-Blotting-Papier Gb002 (Schleicher und Schuell)
Nitrocellulose Transfer Membran Protran 0,45 µm (Schleicher und Schuell) Tischmüllbeutel (Rudolf Franke Labortechnik)
Röntgenfilme Scientific Imaging Film Biomax MR (Kodak) Photokassette (Rego)
Coverslips/Objekträger (Roth) Pinzetten/Skalpelle/Scheren (Roth)
Sterilfilter FP Point 45 0,45 µm (Schleicher und Schuell) Faltenfilter 595½ (Schleicher und Schuell)
2.4 Zell- und Probenherstellung 2.4.1 Zellzüchtung und Pflege
Zur Zellverarbeitung werden humane Hepatomazellen 7 (HuH7) aus einer UKE eigenen Zellreihe benutzt. Die Zellen sind zur Lagerung zusammen mit DMSO (Dimethylsulfoxid; Sigma) in flüssigem Stickstoff eingefroren und werden langsam im Wasserbad bei 37°C aufgetaut. Anschließend erfolgt unter der Werkbank die keimarme Umsetzung der Zellen auf den Boden einer T75 Flasche (Nunk). In die Flasche werden 15 ml Nährmedium gegeben und die Zellen im Nährmedium durch horizontales und vertikales Schwenken der Flasche gleichmäßig verteilt. Das Nährmedium besteht aus Dulbecco`s Glutamax-1 (Gibco) mit 10% Dulbecco`s FCS (Gibco) und Penicillin-Streptomycin (Gibco) gegen Bakterienbefall. Nach 4 Stunden wird das Nährmedium gewechselt. Im weiteren Verlauf nur alle 72 Stunden. Die Flaschen werden im Wärmeschrank bei 37°C und 5% CO2-Gehalt gelagert. Es folgen mit dem Mikroskop tägliche Kontrollen auf den Zustand und die Dichte der Zellen in der Flasche.
Ist der Boden einer T75 Flasche dicht mit HuH7 Zellen bewachsen, werden die Zellen vom Boden der Flasche gelöst und auf 3 neue T75 Flaschen „gesplittet“. Hierzu wird unter keimarmen Bedingungen das Nährmedium abgesaugt und die Flasche mit 15 ml Dulbecco`s PBS (Gibco) gewaschen. Nach erneutem Absaugen der Flüssigkeit werden 8 ml Dulbecco`s Trypsin (Gibco) in die Flasche gegeben und gleichmäßig über die Zellen verteilt. Das Trypsin hat seine optimale Enzymaktivität bei höheren Temperaturen, weshalb die Flasche für 1 min im 37°C Wärmeschrank erwärmt wird. Anschließend werden die noch am Boden sitzenden Zellen durch Beklopfen der Flasche gelöst und das
Material und Methoden
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Trypsin mit 10 ml Nährmedium neutralisiert. Die Zellsuspension wird aufgenommen und kann auf drei neue T75 Flaschen verteilt werden.
2.4.2 Herstellung von Fettsäure-Albuminkomplexen Material
Bovines Albumin (essential fatty acid free; MW 66 kDa) 5 g A 8806 (Sigma) Linolensäure (C 18:3; [cis, cis, cis]-∆9,12,15; MW 278,4) 500 mg L 2376 (Sigma) Oleinsäure ( C 18:1; [cis]-∆`; MW 282,5) 1 g O 1383 (Sigma) Stearinsäure (C 18:0; MW 284,5) 1 g S 4751 (Sigma) BHT (Butylhydroxytoluene, 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol) 11,297-6 (Sigma) Ethanol
DMEM Dulbecco`s Glutamax-1 (Gibco)
Methode
Aus den Materialien werden folgende Lösungen hergestellt: BHT 100 mg/ml EtOH 10%
Albumin 33 mg/ml DMEM 0,5 mMol Linolensäure 27,85 mg/ml EtOH 100 mMol Oleinsäure 28,25 mg/ml EtOH 100 mMol Stearinsäure 28,45 mg/ml EtOH 100 mMol
Anschließend werden 10 ml von der Albumin-Lösung mit 100 µl BHT-Lösung und 200 µl Fettsäure-Lösung gemischt und eine Stunde bei 37°C erhitzt. Die fertige Lösung wird im Dunkeln bei 4°C unter Stickstoff gelagert und besteht aus 2mMol Fettsäure; 0,5 mMol Albumin sowie 0,1% BHT. Als Kontrolle wird die gleiche Lösung nur ohne Fettsäure hergestellt.
2.4.3 Herstellung von Liposomen Material Tripalmitat (MW 807,3) 1 g T 5888 (Sigma) Triolein (MW 885,4) 1 g O 1383 (Sigma) Trillinolen (MW 873,4) 500 mg 92118 (Fluka) BHT (100 mg/ml) 10% 11,297-6 (Sigma) Phosphatidylcholin 500 mg P 3556 (Sigma) Lysophosphatidylcholin 100 mg L 4129 (Sigma)
24 Methode
Zur Herstellung der Liposomensuspension werden 160 mg des jeweiligen Triglycerid eingewogen und mit 40 mg Phosphatidylcholin, 4 mg Lysophosphatidylcholin (als Emulgatoren) sowie 2 mg BHT (alle entsprechenden Stammlösungen in Chloroform gelöst) versetzt. Nach gründlichem Mischen wird das Chloroform unter Stickstoff abgedampft und der Rückstand in 4 ml Liposomenpuffer (200 mMol Tris pH 8.0) aufgenommen. Der Trilinolen- und der Trioleinmix werden dann im Eisbad mit dem Sonifier 3 mal 30 Sekunden, mit Pausen von je 1 Minute, behandelt. Die Einstellungen des Sonifiers sind dabei Out Cycle 50 und Output Control 8. Für den Tripalmitat-Ansatz werden höhere Einstellungen am Sonifier gewählt. 6 x 1 min mit je 1 min Pause bei einem Out Cycle von 90 und Output Control von 10. Dabei ordnen sich die Stoffe zu Liposomen an, weshalb anschließend nicht mehr gevortext werden darf. Die hergestellte Liposomensuspension hat eine Konzentration von 40 mg Triglycerid/ml und 0,1 % BHT. Die Lagerung erfolgt im Dunkeln bei 4°C und unter Stickstoff.
Um eine Kontrolle zu erlangen werden Liposomen wie bei den ersten beiden Fettsäuren hergestellt, nur dass in diesem Ansatz keine Fettsäure hinzu gegeben wird.
2.4.4 Inkubation der Zellen
Vor der Inkubation von HuH7 Zellen mit Fettsäure/Albumin Komplexen und Liposomen werden je 1.000.000 Zellen in 8ml Nährmedium auf acht 10 cm durchmessende Petrischalen ausgesetzt. Dazu werden die Zellen einer Zellkulturflasche wie beim „Splitting“ mit Trypsin vom Boden gelöst und die Zellzahl unter dem Mikroskop auf einer Neubauer Zählkammer bestimmt. 50 µl Zellsuspension werden hierfür mit 50 µl 10% Trypanblau in NaCL vermischt und auf die Neubauer Zählkammer gegeben. Als nächstes werden die Zellen aller vier Quadranten ausgezählt und die Zellzahl bestimmt. Die benötigte Menge an Zellsuspension, wird mit Nährmedium auf die 64 ml Gesamtlösung aufgefüllt und zu gleichen Teilen in die 8 Petrischalen gegeben. Diese werden 24 h bei 37°C und 5% CO2 im Wärmeschrank gelagert. Sind die Zellen alle vital und gleichmäßig dicht auf dem Boden der Petrischalen angewachsen, kann nach mikroskopischer Kontrolle die Inkubation beginnen.
Zur Inkubation werden in je 8 ml Dulbecco`s Glutamax-1 mit 5% Dulbecco`s FCS und 1% Dulbecco`s PS in acht Ansätzen vorbereitet und auf die Petrischalen aufgebracht. Das alte Medium in den Petrischalen wurde zuvor abgesaugt. Die inkubierten HuH7 Zellen werden für 24 h im Wärmeschrank bei 37°C und 5% CO2 gelagert und anschließend nach mikroskopischer Begutachtung geerntet.
Material und Methoden
25 2.4.5 Probengewinnung
Material
Zellysispuffer (50 mM Tris pH-8.0, 2 mMol CaCl2 , 80 mM NaCl sowie 1% Tx100) PIC (1mM Peptastin A, 10mM Chymostatin, 10mM Leupeptin, 10mM Antipain; alles
von Calbiochem) Methode
Von den inkubierten Zellen werden die Überstände abgenommen und für weitere Messungen bei 4°C gelagert. Als nächster Schritt werden die Petrischalen mit je 10 ml Dulbecco`s PBS gewaschen und weitere 4 ml PBS in den Schalen belassen. Die Zellen werden mit einem Zellschäler vom Boden der Petrischalen abgekratzt und die Zellsuspensionen jeweils in 15 ml Falcontubes auf Eis umgefüllt. Nachgespült werden die Schalen mit 1 ml PBS, die dann auch zu den entsprechenden Zellsuspensionen hinzugefügt werden. Anschließend folgt für 10 min eine Zentrifugation bei 4°C und 4000 rpm. Der entstandene Überstand wird abgesaugt und das Sediment aus HuH7 Zellen 30 min lang mit je 300 µl Zellysispuffer lysiert.
Um die freigesetzten Proteine vor zelleigenen Proteasen zu schützen wird dem Puffer noch ein Proteinaseinhibitorcocktail (PIC) im Verhältnis 1:1000 hinzugefügt. Das Zellysat wird in Eppendorf-Tubes umgefüllt und für 15 min bei 4°C und 13.000 rpm zentrifugiert. Durch vorsichtiges Abnehmen der Überstände erhält man die gewünschte Proteinlösung aus den jeweiligen Zellansätzen. Das Sediment wird verworfen.
2.5 Zell- und Probencharakterisierung 2.5.1 Proteinbestimmung nach Bradford
Zur Proteinbestimmung der gewonnenen Zellproben wird das Assay nach Bradford verwendet. Hierbei werden 5 µl der zu messenden Probe auf 95 µl 0,1 M NaOH gegeben und mit 700 µl Aqua bidest. aufgefüllt. Nach der Zugabe von 200 µl Bradford-Reagenz (BioRad), wird der Ansatz gründlich gevortext und anschließend 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit entsteht mit den Proteinen der Probe ein blauer Farbstoff, dessen Extinktion der Konzentration der Proteine proportional ist. Das Absorbtionsmaximum des Farbstoffes liegt bei einer Wellenlänge von 595 nm, so dass mit dieser Wellenlänge im Photometer die Extinktion gemessen wird. Anhand einer Standardreihe von 0,065 mg bis 2 mg BSA (bovine serum albumin), verdünnt in 0,9% NaCl, kann dann die Proteinkonzentration in mg/ml berechnet werden.
26 2.5.2 Cholesterinbestimmung in der Probe
Für die Cholesterinbestimmung in den Zellproben wird ein Enzymkitt der Firma Roche benutzt. Dazu werden 10 µl der zu untersuchenden Probe in eine 96well Microreaderplatte gegeben und mit 200 µl der Reagenzlösung für 10 min bei 37°C inkubiert. Es entsteht ein roter Farbstoff, dessen Extinktion bei 550 nm Wellenlänge im Microplate-Reader gemessen wird. Nach Multiplikation mit dem Faktor 853 erhält man die gesuchte Gesamtcholesterinkonzentration. Als Standardwerte werden Precipath und Precinorm bei jeder Messung mitbestimmt.
2.5.3 Triglyceridbestimmung in der Probe
Für die Messung der Triglyceride in den Proben, wird das Enzymkit der Firma Roche benutzt. Dabei werden wie bei der Cholesterinbestimmung 10 µl der Probe zusammen mit 200 µl des Enzymkits in eine 96 well Mikroreaderplatte gegeben. Dieser Ansatz wird für 10 min bei 37°C gelagert und kann dann zur Bestimmung der Extinktion bei 550 nm Wellenlänge im Microplate-Reader gemessen werden. Um die Triglyceridkonzentration der Probe zu erhalten, muss jetzt noch die Extinktion mit dem Faktor 1050 multipliziert werden. Als Standardwerte werden Precipath und Precinorm bei jeder Messung mitbestimmt
2.5.4 Bestimmung freier Fettsäuren in der Probe
Zur Bestimmung freier Fettsäuren in den Proben wurde von der Firma Wako der Enzymkit NEFA C benutzt. Durch das NEFA C werden die unveresterten Fettsäuren mit Hilfe einer Acyl-CoA-Synthetase zu Acyl-CoA umgewandelt. Durch die Einführung eines Sauersoffatoms in das Acyl-CoA entsteht als Nebenprodukt Wasserstoffperoxid, welches mit der Reagenzlösung B zu einem roten Farbstoff reagiert. Die Extinktion dieses Farbstoffes bei 550 nm Wellenlänge ist der Konzentration freier Fettsäuren in der Probe direkt proportional.
Für die Messung der unveresterten Fettsäuren werden 20 µl der Probe zu 100 µl Reagenzlösung A gegeben und auf dem Mixer 10 min bei 37°C inkubiert. Nach diesem Schritt werden 200 µl der Reagenzlösung B hinzugefügt und das Gemisch für weitere 10 min bei 37°C in dem Mixer belassen. Der Ansatz und die Messung bei 550 nm Wellenlänge erfolgt auf einer 96 well Mikroreaderplatte. Durch einen Oleinsäure-Standard kann die gemessene Extinktion auf mmol/l umgerechnet werden.
Material und Methoden
27 2.5.5 SDS-Page
Material
Trenngel:
1 2 mL Acrylamidlösung (40% N,N’-Methylenbisacrylamid; BioRad) 2 2 mL Untergelpuffer (1,7 M Tris-HCl; Invitrogen; pH 9,18 mit 18% HCl) 3 10 µL TEMED (Tetramethylethylendiamin; Serva)
4 40 µL APS-Lösung (10% Ammoniumpersulfat; Pharmacia Biotech; in Aqua bidest)
5 ad 8 mL Aqua bidest Sammelgel:
1 385 µL Acrylamidlösung (40% N,N’-Methylenbisacrylamid; BioRad)
2 1,25 mL Obergelpuffer (0,2 M Tris-HCl; Invitrogen; pH 6,15 mit 1 N H2SO4) 3 25 µL APS-Lösung (10% Ammoniumpersulfat; Pharmacia Biotech in Aqua
bidest)
4 µL TEMED (Tetramethylethylendiamin; Serva) 5 ad 3,4 mL Aqua bidest
Elektroden-Unterpuffer (0,42 M Tris-HCl; Invitrogen); pH 9,5
Elektroden-Oberpuffer (0,04 M Borsäure; 0,04 M Tris-HCl; Invitrogen; 0,1% SDS; pH 8,64)
β-Mercaptoethanol (Serva)
Blue Juice (Spatelspitze Bromphenolblau in Aqua bidest lösen, 87% Glycerin mit Bromphenolblaulösung auf 80% verdünnen)
SDS-Probenpuffer (10% Natriumdodecylsulphat in 50 mM Tris-HCl; Invitrogen; pH 8,0)
Proteinstandard Rainbow Marker RPN 800 (Amersham Bioscience) Alle anderen Materialien wie oben beschrieben
Methode
Um die Proteine in den verschiedenen Proben nach ihrer Größe aufzutrennen, werden je 10 µg Probenprotein in einem reduzierten und einem nicht reduzierten Ansatz mit 30 µl Gesamtvolumen auf ein SDS-Gel aufgebracht. Das Gel wird zuvor nach gewünschter Zusammensetzung und Taschengröße gegossen. In dieser Arbeit wurden Minigele gegossen deren Acrylamidgehalte im Sammelgel 3,5% und im Trenngel 10% Prozent betragen haben. Von den Proben wird die Menge in Eppendorf-Tubes pipettiert, die zum erreichen der gewünschten 10 µg Proteinmenge notwendig ist. Die unterschiedlichen
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Volumina werden mit Aqua bidest auf ein gleiches aufgefüllt und anschließend mit einem „Loadingbuffer“ versehen. Dieser besteht für den reduzierten Proteinansatz aus 50% SDS-Probenpuffer (versieht alle Proteine mit einer negativen Ladung), 25% Blue Juice (optische Kontrolle der Lauffront und Beschwerung beim Befüllen der Geltaschen) sowie 25% ß-Mercaptoethanol (Reduktion der Disulfidbrücken von den Proteinen). Für den nicht reduzierten Ansatz wird das Mercaptoethanol durch Aqua bidest ersetzt. Vor dem Befüllen der Geltaschen wird der reduzierte Ansatz 10 min bei 95°C und 1000 rpm im Thermomixer erhitzt und anschließend 30 sec bei 13.000 rpm anzentrifugiert. Die Minigele werden aus den oben genannten Materialien gegossen. Zuerst das Trenngel und nach dessen Polymerisierung das Sammelgel. In das Sammelgel wird ein Kamm eingefügt, welcher bei seiner Entfernung die Geltaschen entstehen lässt. Das Gel wird in die BioRad-Halterung eingespannt und mit den Laufpuffern nach Nevillle versehen (Neville 1971). Nun erfolgt die Beladung der Taschen mit je 30 µl Ansatz pro Probe. Als Orientierungshilfe laufen in einer Tasche 4 µl Rainbowmarker mit, welche über farblich markierte Proteine definierter Größe, die Größenbestimmung der aufgetragenen Probenproteine erlauben. Die Proben laufen im Sammelgel bei 15 mA und im Trenngel bei 30 mA konstanter Spannung. Aufgrund der negativen Ladung aller Proteine durch das SDS, werden die Proteine auf Ihrem Weg von der Kathode zur Annode nur der Größe nach aufgetrennt. 2.5.6 Western Blot nach Neville
Material
Blotting-Puffer (150 mM Glycin; 20 mM Tris, 20% Methanol) Ponceau-Färbelösung 0,2% in 3% Trichloressigsäure (Serva)
Waschpuffer A (154 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween 20, pH 7,4)
Waschpuffer B (154 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween 20, 0,25% Natrium-desoxycholat, 0,1% SDS, pH 7,4)
Methode
Das fertige SDS-Gel wird blasenfrei auf eine Nitrozellulosemembran gebracht und beidseitig mit Papieren sowie Schwammkissen in die Blotthalterung eingeklemmt. Diese wird dann in die mit Blotting-Puffer gefüllte Kammer gesteckt, wobei darauf zu achten ist, dass sich die Nitrozellulosemembran auf der Seite der Annode befindet. In einem elektrischen Feld von 200 mA/h wandern die negativ geladenen Proteine aus dem Gel in Richtung Annode und damit in die Nitrozellulosemembran. Das „Blotten“ erfolgt bei 4°C, was durch ein Kühlkreissystem der das mehrfache Einlegen von Kühlaggregaten erreicht wird.
Material und Methoden
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Nach dem Blotten wird die Nitrozellulosemembran für 10 min auf dem Schwenkmixer in Ponceau-Färbelösung eingelegt. Dabei färben sich alle Proteine auf der Membran rot. Durch vorsichtiges Abspülen der überschüssigen Färbelösung mit Aqua bidest, lassen sich die Lauflinien der Proben optisch auf gleiche Konzentrationen und ihre Unversehrtheit überprüfen. Jetzt können Rainbowmarker und Lauflinien beschriftet und je nach Wunsch die Membran für unterschiedliche Antikörper zerschnitten werden. Zur Dokumentation werden die gefärbten Membranen am Computer eingescannt.
2.5.7 Antikörper und Filmentwicklung Material
Blocklösung (10% Milchpulver Blotting Grade Non-Fat Dry Milk; BioRad; 5% BSA Fraction V; PAA Laboratories; in Waschpuffer A)
Primäre Antikörperlösung (5% BSA Fraction V; PAA Laboratories; in Waschpuffer A)
Sekundäre Antikörperlösung (Zusammensetzung wie Blocklösung) ECL Detection Reagenz (Amersham Bioscience)
Methode
Nach dem Einscannen werden die Membranen mit PBS wieder entfärbt und anschließend für eine Stunde bei 4°C in Blocklösung eingelegt. Dies geschieht durch Einschweißen der Membranen in Folie. Nach einem Waschschritt von 5 min auf dem Schwenktisch bei Raumtemperatur, kann dann der gewünschte primäre Antikörper in primärer Antikörperlösung angesetzt und mit der Membran zusammen eingeschweißt werden. Je nach Antikörper erfolgt die Lagerung für 12 Stunden bei 4°C, oder bei Raumtemperatur. Nach verstrichener Zeit erfolgt ein weiterer Waschschritt in dem die Membran für 5 min in Waschpuffer A, 2 x 10 min in Waschpuffer B und 1 min in PBS gewaschen wird. Dann kann der sekundäre Antikörper, gekoppelt an eine Peroxidase, in der sekundären Antikörperlösung angesetzt werden und für 2 h bei 4°C mit der Membran zusammen, eingeschweißt werden. Es folgt der gleiche Waschschritt wie nach dem primären Antikörper.
Anschließend kann die Membran in eine Fotokassette gelegt und vollständig mit ECL-Detection Reagenz benetzt werden. Nach 1 min wird die ECL-Lösung wieder mit Blottingpapier abgesaugt und es kann in der Dunkelkammer ein Röntgenfilm zur Belichtung aufgelegt werden. Die an den zweiten Antikörper gekoppelte Peroxidase reagiert mit dem Luminol der Entwicklungslösung und der als Enhancer fungierenden Cumarinsäure unter Bildung eines Chemilumineszenzsignals (ECL= Enhanced
