Trennung von Ionen im elektrischen Feld

Elektrophorese

Elektrophorese

Allgemein:

Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld Analytische Chemie:

Trennung von Ionen im elektrischen Feld

(Elektrophoretische Trenntechniken zählen

im Allgemeinen nicht zur Chromatographie)

„Chromatographie-Check“

Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:

• Trenntechnik

• Zwei nicht mischbare Phasen

• Eine mobile und eine stationäre Phase

• Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen

• Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen

Übersicht Elektrophorese:

• Gel-Elektrophorese

• Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

• Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)

• Kapillarelektrophorese (CE)

• Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

Gel-Elektrophorese

Gel-Elektrophorese

Gel-Elektrophorese: http://www.youtube.com/watch?v=qMxQ-65qYDk

Agarose-Gelelektrophorese

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

• Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld

• Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung

• Kleine Moleküle wandern schneller als grosse

• Detektion: chemische Anfärbemethoden (z.B. Fluoreszenz)

• Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse

• z.B. Auftrennung von DNA-Fragmenten (z.B. „Genetischer Fingerabdruck)

–

+

Standard Probe

Probe: DNA-Fragment mit 522 Basenpaaren (bp)

Probenauftragung

Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE)

Z.B.: DNA fingerprinting

• Trennung nach

Ladung und Grösse

• Grösse:

hydrodynamischer Durchmesser

• Proteine werden also nach Ladung, Molekulargewicht und Faltung getrennt

• Bei Proteinen wird häufig die SDS-PAGE angewandt

SDS-PAGE

Tensid, Detergent =

Herabsetzen der Grenzflächenspannung zwischen zwei Phasen

z.b.: Öl und Wasser fein vermengbar

SDS bildet Mizellen

SDS denaturiert Proteine SDS bildet negativ geladene

Komplexe mit Proteinen

SDS-PAGE

• Trennung von negativ geladenen Komplexen

von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen

• Faltung beeinflusst nicht die Trennung

• Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom

Molekulargewicht ab,

Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle

• Trennung von Proteinen nur aufgrund des

Molekulargewichts

SDS-PAGE

• Trennung von negativ geladenen Komplexen

von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen

• Faltung beeinflusst nicht die Trennung

• Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom Molekulargewicht ab,

Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle

• Trennung von Proteinen nur aufgrund des

Molekulargewichts

SDS-PAGE-Trennung verschiedener Proteine (1-8) gemäss ihres Molekulargewichts.

Links: Gemisch von Proteinen bekannter Grösse als Molekulargewichtsstandard (14–97 kDa)

Übersicht Elektrophorese:

• Gel-Elektrophorese

• Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

• Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)

• Kapillarelektrophorese (CE)

• Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

Kapillarelektrophorese

(capillary electrophoresis = CE)

Migration eines Ions im elektrischen Feld E

Analyten müssen „geladen“ sein (basische oder acide Analyten) Elektrophorese ist keine

Chromatographie!

Adenosine Triphosphate Neuraminsäuren

CE: Theoretische Grundlagen

µ

= v

E = Geschwindigkeit eines Ions

Elektrische Feldstärke = e 6 π ^⋅

1 η ^⋅

z r

e ... Elementarladung

η ... Viskosität der Pufferlösung z ... Ladung des Ions

r ... Hydrodynamischer Durchmesser des Ions

Elektrophoretische Mobilität µ_EP eines Ions im elektrischen Feld E

Konstante Pufferlösung Ion (Analyt)

Trennung

aufgrund von Ladung und

CE: Theoretische Grundlagen

Migration der Ionen im elektrischen Feld

+ –

Anode Kathode

Nach dem Probeneinlass wird Spannung angelegt (bis zu 30.000V) Analytionen trennen sich nach Ladung (und Grösse)

Analyt

-

⁺

Analyt

-

Analyt

+

Analyt

+

Analyt

-

µ_EP = v

E =Geschwindigkeit eines Ions Elektrische Feldstärke = e

6π⋅ 1 η⋅ z

r

Anionen wandern in Richtung Anode und

Kationen in Richtung Kathode

Man würde in diesem Fall nur die Kationen detektieren…

Probeneinlass

Analyt

-

Detektor

CE: Theoretische Grundlagen

Elektroosmotischer Fluss (EOF) bei Quartzkapillaren

+ –

Anode Kathode

EOF

Aufgrund der negativ geladenen Innenwand der Quarzkapillare bildet sich ein Fluss der Pufferlösung in Richtung Kathode aus, der elektroosmotische Fluss (EOF).

Quarzkapillare (SiO₂)

Quarzkapillare (SiO₂)

Analyt

-

⁺

Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

Kationen Neutrale Moleküle (ungetrennt) Anionen

• Trennung von

Kationen und Anionen

• Neutrale Moleküle verlassen ungetrennt mit dem EOF die Kapillare

• Detektor wegen EOF

kathodenseitig angebracht

• Nur Anionen, die schneller als der EOF wandern, erreichen den Detektor nicht

Aufbau eines CE Systems:

Fused silica capillaries High voltage power supply

(with platin electrodes)

2 x glass vials

A) B) C)

A

B B

C

D)

D) Detector

Detektion:

In der Regel UV Detektoren Kopplung an Massen-

Spektrometrie ist schwierig

Trennung:

Spannung (+/-) Kapillarlänge Puffer

Trennung von Metaboliten:

75cm Kapillare

Voltage: -15/-20/-25/-30 Ammonia bicarbonate EOF block, pumping

CE: Beispiel

Elektropherogram

Detektion:

In der Regel UV Detektoren Kopplung an Massen-

Spektrometrie ist schwierig

CE: Beispiel

Zusammenfassung Elektrophorese

Elektrophorese

• Gel-Elektrophorese

• Agarose-Gelelektrophorese,

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

• Natriumdodecylsulfat-PAGE

• Kapillarelektrophorese

• Kapillarzonenelektrophorese

• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie

Übersicht

• Gel-Elektrophorese

• Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

• Trennung geladener Makromoleküle (z.B. DNA-Fragmente)

• Trennung aufgrund von Ladung und Grösse (Faltungszustand)

• Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)

• Trennung von Proteinen (als SDS-Protein-Komplex)

• Trennung nur aufgrund des Molekulargewichts

• Kapillarelektrophorese (CE)

• Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

• Trennung geladener, kleiner Moleküle (z.B. Aminosäuren, Ionen)

• Trennung von Kationen und Anionen (wegen EOF)

• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

• Trennung ungeladener, kleiner Moleküle

• Trennung aufgrund der Polarität (Elutionsreihenfolge analog RP-HPLC)

Agarose-Gelelektrophorese

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

• Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld

• Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung

• Kleine Moleküle wandern schneller als grosse

• Detektion: chemische Anfärbemethoden (z.B. Fluoreszenz)

• Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse

z.B.: Auftrennung von DNA-Fragmenten („Genetischer Fingerabdruck“)

–

+

Standard Probe

Probe: DNA-Fragment

Proben Aufbringung

SDS-PAGE

Tensid, Detergent =

Herabsetzen der Grenzflächenspannung zwischen zwei Phasen

z.b.: Öl und Wasser fein vermengbar

SDS bildet Mizellen

SDS denaturiert Proteine SDS bildet negativ geladene

Komplexe mit Proteinen

SDS-PAGE

• Trennung von negativ geladenen Komplexen

von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen

• Faltung beeinflusst nicht die Trennung

• Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom

Molekulargewicht ab,

Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle

• Trennung von Proteinen nur aufgrund des

Molekulargewichts

Kapillarelektrophorese

(capillary electrophoresis = CE)

Migration eines Ions im elektrischen Feld E

z.b.: Kapillarzonenelektrophorese Analyten müssen „geladen“ sein (basische oder acide Analyten) Elektrophorese ist keine

Chromatographie!

Adenosin Triphosphat Neuraminsäure

Detektion:

In der Regel UV Detektoren Kopplung an Massen-

Spektrometrie ist schwierig Trennung:

Spannung (+/-) Kapillarlänge Puffer

75cm Kapillare

Voltage: -15/-20/-25/-30 Ammonia bicarbonate EOF block, pumping

àTrennung von Metaboliten

CE: Beispiel

Elektropherogramm

Herbstsemester 2015 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Badertscher, martin.badertscher@org.chem.ethz.ch

Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

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Dem Puffer wird ein Tensid (z.B. SDS) zugegeben, welches Mizellen bildet.

siehe SDS-PAGE!

Abhängig von ihrer Polarität halten sich die Analyten v.a.

in der Pufferlösung (polar) oder in den Mizellen (unpolar) auf.

• Trennung ungeladener Analyten (keine Ionen)

• Chromatographie

• Mobile Phase: Pufferlösung (polar)

• Pseudo-stationäre Phase: Mizellen (unpolar)

Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)

• Trennung von

ungeladenen Analyten

• Pufferlösung (mobile Phase) bewegt sich wegen EOF in Richtung Kathode

• Mizellen (pseudo-stationäre

Phase) bewegen sich langsamer

• Elutionsreihenfolge wie in RP-HPLC: polare Moleküle eluieren vor unpolaren

• Detektor wegen EOF

kathodenseitig angebracht

hoch gering