Abflutung verschiedener Glucocorticoide aus dem Fesselgelenk des isoliert perfundierten Pferdebeines und deren
antiinflammatorische Wirkung auf equine Synoviozyten
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Katrin Schwanse
Dresden
Hannover 2015
Hannover
1. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. K. Feige Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2015
Für meine Familie
DGPT-Kongress Kiel 10-12.3.2015 mit dem Thema: „Efflux of three common glucocorticoids in the model of the isolated perfused equine distal limb and their dose dependent antiinflammatory effects on cultured synoviocytes“
Pharmakologisches Kolloquium 29.4.2015 mit dem Titel: „Die Abflutung der Glucocorticoide Flumethason, Dexamethasonphosphat und Triamcinolonacetonid nach intraartikulärer Applikation in das Fesselgelenk am Modell des isoliert perfundierten Pferdebeins“
EAVPT Congress Nantes 19-23.7.2015: „Distribution of three common glucocorticoids in the model of the isolated perfused equine distal limb and their dose dependent antiinflammatory effects on cultured equine synoviocytes“
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ... 15
2 LITERATURÜBERSICHT ... 17
2.1 Doping im Pferdesport ... 17
2.1.1 Grundlagen des Dopingverbots ... 17
2.1.2 Regularien der Reitsportverbände ... 18
2.1.3 Ermittlung von Nachweiszeiten und Absetzfristen ... 19
2.1.4 Karenzzeiten ... 21
2.1.5 Einflüsse auf individuelle Schwankungen der Nachweiszeiten ... 23
2.2 Zur intraartikulären-Injektion bei Pferden verwendete Glucocorticoide ... 24
2.3 Anatomie und Physiologie synovialer Gelenke ... 27
2.3.1 Funktion der Synoviozyten ... 29
2.3.2 Aufbau des Karpalgelenks mit Gefäßversorgung ... 30
2.3.3 Aufbau des Fesselgelenks ... 32
2.4 Corticosteroide ... 36
2.4.1 Allgemeine Pharmakologie ... 36
2.4.2 Metabolisierung und Elimination der Glucocorticoide ... 41
2.4.3 Entzündungsmediatoren (PGE2, Zytokine) ... 42
2.4.4 Dexamethason ... 44
2.4.5 Triamcinolonacetonid ... 48
2.4.6 Flumethason ... 51
2.5 Modell zur Testung des Abflutungsverhaltens von Glucocorticoiden ... 52
2.5.1 Isoliert perfundierte Organe ... 53
2.5.2 Perfusion ... 54
2.5.3 Vitalität ... 55
2.6 Modell der equinen Synoviozyten-Kultur zur Ermittlung der antiinflammatorischen Wirkung verschiedener Glucocorticoidkonzentrationen ... 56
3 MATERIAL UND METHODEN... 60
3.1 Equine Synoviozyten-Kultur zur Testung des antiinflammatorischen Potenzials verschiedener Glucocorticoide ... 60
3.1.1 Material ... 60
3.1.2 Kultivierung primärer equiner Synoviozyten ... 64
3.1.3 Konzentrations- und Zeitabhängigkeit der Wirkung von LPS ... 66
3.1.4 Hemmung der LPS-Induzierten PGE2-Freisetzung ... 67
3.1.5 Vitalitätstest ... 68
3.1.6 Prostaglandin E2-ELISA ... 69
3.2 Isoliert perfundiertes Pferdebein ... 71
3.2.1 Material ... 71
3.2.2 Versuchsaufbau ... 72
3.2.3 Probennahme und Durchführung ... 73
3.2.4 Nachweis der Testsubstanzen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ... 75
3.3 Validierung der HPLC ... 78
3.3.1 Selektivität ... 79
3.3.2 Linearität ... 82
3.3.3 Detektions- und Quantifizierungsgrenze ... 82
3.3.4 Richtigkeit ... 83
3.3.5 Präzision ... 85
3.3.6 Stabilität ... 85
4 ERGEBNISSE ... 87
4.1 Abflutung der intraartikulär applizierten Glucocorticoide ... 87
4.1.1 Abflutung von Flumethason ... 87
4.1.2 Abflutung von Triamcinolonacetonid ... 89
4.1.3 Abflutung von Dexamethason ... 91
4.1.4 Abflutung von Dexamethasonpalmitat ... 93
4.1.5 Vitalitätsparameter des isoliert perfundierten Pferdebeins ... 94
4.2 Antiinflammatorische Wirkung der Glucocorticoide in der equinen Synoviozyten- Kultur ... 96
4.2.1 Konzentrations- und zeitabhängige Wirkung von LPS ... 96
4.2.2 PGE2-Inhibition im Zellkultur-Modell nach Glucocorticoidgabe ... 97
4.2.3 Zellvitalität ... 99
5 DISKUSSION ... 101
5.1 Glucocorticoid-Abflutung aus dem Fesselgelenk im isoliert perfundierten Pferdebein ... 101
5.2 Nachweiszeiten und Karenzzeiten der Glucocorticoide ... 102
5.3 Isoliert perfundiertes Pferdebein-Modell ... 109
5.4 Pharmakotherapeutisches Potenzial der Glucocorticoide in der equinen Synoviozytenkultur ... 110
5.5 Schlussfolgerung ... 120
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 121
7 SUMMARY ... 123
LITERATURVERZEICHNIS ... 125
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 148
TABELLENVERZEICHNIS ... 151
ANHANG ... 153
DANKSAGUNG ... 155
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
° Grad
°C Grad Celsius
® Eingetragenes Warenzeichen
% Prozent
§ Paragraph
λz Eliminationskonstante Lambda z
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
A. Arteria
Abb. Abbildung
ACTH Adrenocorticotropes Hormon ADC Anti Doping Code
ADMR Anti-Doping- und Medikamentenkontrollregeln für den Pferdesport der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e.V.
AP-1 Aktivator Protein-1
AUC Area Under the Curve, Fläche unter der Konzentrationszeitkurve bzw. beziehungsweise
c Konzentration
ca. circa
CBP cyclisches Adenosinmonophosphat response Element binding Protein
Cmax maximale Plasmakonzentration
CL Clearance
CLOD Plasmakonzentration an der Nachweisgrenze Conc. Konzentration
COX Cyclooxygenase
CRH Corticotropin Releasing Hormon d.h. das heißt
DIN Deutsche Industrie Norm
Dexa Dexamethason
DMEM Dulbecco`s modified Eagle`s medium DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DOKR Deutsches Olympiade Komitee für Reiterei DVR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen
EADCM Equine Anti Doping and Controlled Medication Regulation EBLC effektive lokale Biophasenkonzentration
EC50 effektive Konzentration 50
EHSLC European Horserace Scientific Liaison Comittee ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
EPC effektive Plasmakonzentration et al. et alii
FEI Fédération Equestre Internationale FKS Fetales Kälberserum
Flu Flumethason
FN Fédération Equestre Nationale, Deutsche Reiterliche Vereinigung e.V.
g Gramm
GAG Glykosaminoglykane
GILZ Glucocorticoid induziertes Leucin Zipper Protein GR Glucocorticoidrezeptor
GRE Glucocorticoid responsive element HAT Histon Acetyltransferase
HDAC Histon Deacetylase
HPLC High Performance Liquid Chromatography Hsp 90 Hitzeschockprotein 90
HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V.
HWZ Halbwertszeit i.a. intraartikulär
IκB-α Inhibitor von Nuklear Faktor-κB IU International Units
IGF Insulin-like growth factor IL Interleukin
IMPC ineffektive Marker Plasmakonzentration IMUP ineffektive Marker Urinkonzentration IPC ineffektive Plasmakonzentration ISL International Screening Limit
ISO Internationale Organisation für Normung IUC ineffektive Urinkonzentration
i.v. intravenös kDa Kilo Dalton
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
l Liter
LDH Laktatdehydrogenase ln natürlicher Logarithmus
LOD Limit of Detection, Nachweisgrenze
LOQ Limit of Quantification, Quantifizierungsgrenze LPO Leistungs Prüfungs Ordnung
LPS Lipopolysaccharide max maximal
mg Milligramm
MHK Minimale Hemmstoffkonzentration min Minute
ml Milliliter mm Millimeter mM Millimol
mmHg Millimeter-Quecksilbersäule MMP Matrixmetalloproteinase MPC Marker Plasmakonzentration MUC Marker Urinkonzentration
n Anzahl
N. Nervus
NADA Nationale Anti Doping Agentur
NADPH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat NF-κB Nuklear Faktor-κB
ng Nanogramm
NNR Nebennierenrinde
NSAIDs Nicht steroidale Antiphlogistika NSB Non specific binding
OPG Osteoprotegerin PBS Phosphatpuffer PES Phenazinethosulfat
pg picogramm
PGE2 Prostaglandin RIA Radioimmunoassay RRA Relative Rezeptoraffinität s Standardabweichung SF Sicherheitsfaktor t1/2 Halbwertszeit
tA LOD Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der Nachweiszeit TA Triamcinolonacetonid
TGF Transforming growth factor TLR-4 Toll-like receptor-4
Tmax Zeit nach intraartikulärer Applikation bis zum Erreichen der maximalen Plasmakonzentration
TNF-α Tumornekrosefaktor-α
Vss Verteilungsvolumen im Steady State
V. Vena
WADA Welt Anti-Doping Agentur
̅ Mittelwert
Die chemischen Elemente werden gemäß dem internationalen Periodensystem abgekürzt.
15 1 EINLEITUNG
Glucocorticoide sind nach den nicht steroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) die Arzneimittel, die bei einer Medikationskontrolle („Dopingprobe“) am häufigsten gefunden werden (WITZMANN 2010). Ihr Einsatz spielt vor allem bei der Therapie der gelenksbedingten Lahmheit beim Pferd eine entscheidende Rolle (CARON 2005). Die wohl häufigste Ursache des Befundes „unerlaubte Medikation“ beruht jedoch nach KLUGE u. UNGEMACH (2005) auf der Unkenntnis von Ausscheidungszeiten und ist somit eher unabsichtliches „Doping“.
Aufgrund dieser Tatsache ist das Wissen über die Ausscheidungszeiten für den behandelnden Tierarzt essentiell, um nach erfolgter Therapie eines Pferdes Wartezeiten für das jeweilige Arzneimittel auszusprechen. Bei der Abschätzung der Wartezeit gilt zum einen, dass die Gesundheit des Pferdes in diesem Zeitraum wieder vollkommen hergestellt sein muss, und zum anderen, dass die Substanz mit hoher Sicherheit vollständig (unnachweisbar) ausgeschieden wurde. Gerade letzterer Aspekt stellt ein Problem für den behandelnden Tierarzt dar, da durch die immer sensitiver werdende Analytik der Doping-Labore auch kleinste Mengen eines Pharmakons nachgewiesen werden können. Zudem unterliegen die Ausscheidungszeiten starken interindividuellen Schwankungen (LÖWENICH 2012), so dass eine ausreichende Sicherheitsspanne auf eine Nachweiszeit aufgeschlagen werden muss, um nach Möglichkeit allgemein für alle Pferde gültig zu sein.
In den verschiedenen Regularien der Reitsportverbände finden sich unvollständige Angaben zu den Nachweiszeiten. Aktuelle Studien zu Ausscheidungszeiten auch im Hinblick auf die sensitiver werdende Analytik sind daher wichtig, um positive Fälle unerlaubter Medikation zu vermeiden.
Das Ex-vivo-Modell des isoliert perfundierten Pferdebeines (FRIEBE et al. 2013b) erwies sich zur Untersuchung der Ausscheidungszeiten von Bethamethason nach intraartikulärer Applikation als geeignet. Es wird daher in diesen Versuchen für die Ermittlung der Nachweiszeiten von Flumethason, Dexamethasonphosphat, Dexamethasonpalmitat (Lipotalon®) und Triamcinolonacetonid verwendet und stellt nicht nur eine kostengünstige, sondern auch tierschutzgerechte Alternative zu In-vivo-Studien dar. Zusätzlich wird das antiinflammatorische Potenzial der Glucocorticoide an kultivierten equinen Synoviozyten
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getestet, um abzuschätzen, ob die Testsubstanzen nach Erreichen ihrer Nachweisgrenze noch wirksam sind.
17 2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Doping im Pferdesport
Das mediale Interesse am Doping im Pferdesport hat seit den Olympischen Spielen 2004 in Athen immer mehr zugenommen. Bei den Olympischen Spielen 2008 in Honkong wurden bei sechs Pferden verbotene Substanzen nachgewiesen (SCHLATTERER 2010). Es fallen Äußerungen von Reitern, die die Anwendung unerlaubter Medikation als notwendige Unterstützung für ihre Pferde sehen, da die Tiere sonst nicht durch die Wettkampfphase kommen würden, und Behauptungen, dass alles erlaubt sei, was nicht gefunden werde. Dabei stellt sich die Frage, ob den Pferden zu viel abverlangt wird (ATOCK u. WILLIAMS 1994).
Durch schlechte Bodenverhältnisse des Turnierplatzes, spektakuläre Hindernisse und enge Wendungen in anspruchsvollen Parcours wird das Zuschauerinteresse aufrecht erhalten.
Hierbei könnten auch der Siegeswille oder finanzielle Aspekte treibende Kraft sein.
Durch Doping soll die Leistungsfähigkeit erweitert werden, jedoch wird dabei ein Bereich körperlichen Leistungsvermögens erschlossen, der normalerweise eine Reserve darstellt.
40 % der Leistung stehen dem untrainierten Körper zur Verfügung, weitere 20 % lassen sich durch Training erschließen. Die restliche Kapazität dient als Reserve und Schutz und führt bei Beanspruchung durch Fluchtsituationen oder Doping zur Überbelastung (KLUGE u.
UNGEMACH 2005).
2.1.1 Grundlagen des Dopingverbots
Nach DÜE (1999) beruhen Anforderungen und Regeln des pferdesportlichen Vergleiches auf den Handlungsmaximen Fairness, Gleichbehandlung, Unfallverhütung und Tierschutz.
Letzterer Aspekt hat den wichtigsten Stellenwert, so ist im Tierschutzgesetz § 3 Abschnitt 2 Satz 1-1b das Verbot des Dopings, Verdecken eines leistungsmindernden Zustandes durch Maßnahmen und dem Abverlangen von Leistung, der ein Tier nicht gewachsen ist, explizit geregelt. „Es ist verboten einem Tier […] Leistungen abzuverlangen, denen es wegen seines Zustandes offensichtlich nicht gewachsen ist oder die offensichtlich seine Kräfte übersteigen“
und es ist verboten „an einem Tier im Training oder bei sportlichen Wettkämpfen […] die mit erheblichen Schmerzen, Leiden oder Schäden verbunden sind und die Leistungsfähigkeit von
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Tieren beeinflussen können, sowie an einem Tier bei sportlichen Wettkämpfen Dopingmittel anzuwenden“ (TIERSCHUTZGESETZ 2014)
2.1.2 Regularien der Reitsportverbände
Früher waren die Richtlinien der deutschen Reitsportverbände so gefasst, dass zum Zeitpunkt des Wettkampfes das Vorhandensein jeglicher Substanzen, die in irgendeiner Weise auf den Organismus des Pferdes einwirken, verboten war (SEINSCH u. SCHÄNZER 1999). Seit 2012 werden sporadisch Trainingskontrollen unter den Bundeskaderpferden durch das Deutsche Olympiade Komitee für Reiterei (DOKR) in Zusammenarbeit mit der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e.V. (FN) und in Vereinbarung mit der Nationalen Anti Doping Agentur (NADA) durchgeführt (NADA 2012).
Die World Anti-Doping Agency (WADA) hat seit dem 1. Januar 2009 ein verbindliches Regelwerk, den World-Anti-Doping-Code (ADC), zur Feststellung und Ahndung von Verstößen gegen Fairness und Ehrlichkeit erlassen. Dieser stellt die Grundlage für die Harmonisierung der Anti-Doping-Bemühungen dar und wurde bereits von den meisten Nationen anerkannt und in nationale Regelwerke übernommen (SCHLATTERER 2010). Bei den Regularien der Pferdesportverbände unterscheidet man zwischen den nationalen Regelwerken, z.B. der Leistungs-Prüfungs-Ordnung (LPO) der FN, welche die Anti-Doping- und Medikamentenkontrollregeln (ADMR) beinhalten und auf den Vorgaben der NADA basieren, und der internationalen Equine Anti-Doping and Controlled Medication Regulation (EADCM), z.B. der Fédération Equestre Internationale (FEI), basierend auf den Vorgaben der WADA (FEI 2015). Weiterhin gibt es neben dem Regelwerk der FN nationale Regelwerke des Hauptverbandes für Traber-Zucht und -Rennen (HVT) und des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen (DVT). Die nationalen Regelwerke listen Wirkstoffgruppen auf, die internationalen nur Substanznamen. Auf nationalen FN-Reitturnieren in Deutschland finden die ADMR Anwendung, die nach WEINBERGER (2009) enger gefasst sind als die internationalen Regularien. So liegt der Grenzwert für Salicylsäure im Urin nach dem Regelwerk der FN bei 625 µg/ml und bei der FEI bei 750 µg/ml. Internationale Turniere, auch in Deutschland, fallen hingegen unter die EADCM der FEI. Letzteres Regelwerk orientiert sich auch an durchgeführten Studien des European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC). Die durchgeführten Untersuchungen zur Länge der Nachweisbarkeit von
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verbotenen Substanzen des EHSLC ergaben eine Liste (International Screening Limit, ISL) mit Ausscheidungszeiten (Detection Times). Die FN war hieran maßgeblich beteiligt (WEINBERGER 2009). Ein vereinheitlichtes, weltweites Regelwerk im Pferdesport gibt es jedoch nicht. Auch die Übernahme der Anti-Doping-Regelungen der FEI, als Ersatz für die ADMR der FN, wurde von der FN aufgrund des Druckes durch die Öffentlichkeit (z.B.
Tierschutzorganisationen, Bundestierärztekammer) abgelehnt (BUNDESTIERÄRZTEKAMMER 2015).
2.1.3 Ermittlung von Nachweiszeiten und Absetzfristen
Das EHSLC hat für einzelne Substanzen die Berechnung der Detection Time auf der Basis einer Publikation von TOUTAIN u. LASSOURD (2002) durchgeführt. Ziel war ein Modell zur Berechnung, ab welchem irrelevanten Wert im Urin und Plasma die jeweilige Substanz zwar noch nachweisbar war, aber keine Wirkung mehr verursachte (WEINBERGER 2009).
Die folgende Formel (1) stellt die Berechnung der Ineffektiven Urinkonzentration [µg/ml]
nach TOUTAIN u. LASSOURD (2002) dar:
=
=
= × ss
= ℎ ℎ ℎ
ℎ ℎ ℎ
EPC= effektive Plasmakonzentration IPC= ineffektive Plasmakonzentration SF=Sicherheitsfaktor=500
IUC=ineffektive Urinkonzentration Rss=Urin-Plasma Quotient
Formel (1)
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Die Berechnung der IUC gilt nur für systemisch applizierte Substanzen, die keine protrahierte Wirkung entfalten. Für Substanzen, die eine protrahierte Wirkung haben (z. B.
Glucocorticoide) und lokal (z. B. intraartikulär) verabreicht werden, verwendet TOUTAIN (2011) ein anderes Modell, bei dem von einer Marker Plasma Concentration (MPC) statt einer EPC ausgegangen wird. Die MPC ist die Konzentration, die nach lokaler Applikation einer Substanz im Plasma messbar ist und mit der lokalen Wirksamkeit des Arzneimittels in Verbindung gebracht werden kann. Sie ist kein pharmakodynamischer Parameter und abhängig von der Formulierung der Substanz (Phosphat- oder Acetatester). Für die Ermittlung der MPC muss jedoch zunächst eine Effective Lokale Biophase Concentration (ELBC) bestimmt werden. Die ELBC ist die Konzentration des Arzneimittels, z. B. in der Synovialflüssigkeit, bei der ein pharmakologischer Effekt der Substanz beobachtet wird. Die MPC ist von der ELBC abhängig und wird zu dem Zeitpunkt bestimmt, wenn die Arzneimittel-Konzentration im Gelenk unterhalb der ELBC sinkt. Daher reicht hier auch ein Sicherheitsfaktor von 10 statt 500 aus, um aus der MPC eine ineffektive MPC (IMPC) zu berechnen. Es müssen allerdings simultan Synovia-, Plasma- und Urinproben gewonnen werden, um diesen Zeitpunkt zu ermitteln. Analog zur IPC kann aus der IMPC über einen Rss eine Ineffective Marker Urine Concentration (IMUP) bestimmt werden (TOUTAIN 2011).
Die Hauptursachen für Schwankungen der Karenzzeiten sind biologischen Ursprungs und unterliegen somit einer interindividuellen Variabilität (TOUTAIN 2010). Dies muss der behandelnde Tierarzt nach Applikation von Medikamenten berücksichtigen, wenn er Empfehlungen ausspricht, wann das Pferd frühestens auf dem Turnier wieder einsatzbereit ist.
TOUTAIN (2010) empfiehlt daher allgemein eine Sicherheitsspanne für die Wartezeit, die ca.
die doppelte Zeit der Detection Time betragen sollte.
Fasst man über die Jahre die Nachweisbarkeit von Betamethason im Pferdeplasma im Labor für Dopinganalytik der Sporthochschule Köln von 2006 bis 2012 zusammen, wird der Fortschritt in der Analytik durch die zunehmende Sensitivität ersichtlich. Während 2006 die Quantifizierungsgrenze für Betamethason bei 250 pg/ml und die Nachweisgrenze bei 120 pg/ml lagen (MILEWSKI 2006), wurden 2012 bereits 10 pg/ml (Quantifizierungsgrenze) und sogar 4 pg/ml Nachweisgrenze erreicht (LÖWENICH 2012).
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Eine weitere Berechnung zur Abschätzung der Absetzfristen nach KLUGE u. UNGEMACH (2005) ist die Multiplikation der Eliminationshalbwertszeit mit dem Faktor 70-80, die in der Literatur häufig für einzelne Substanzen beschrieben wurde. Allerdings ist dies stark vereinfacht und schwierig bei Substanzen, die sich in tiefen Kompartimenten anreichern.
2.1.4 Karenzzeiten
Die DEUTSCHE REITERLICHE VEREINIGUNG (2013) definiert in ihrer Broschüre Fairer Sport die Nachweiszeit als die Dauer der Nachweisbarkeit der Medikamente nach Applikation. Nach MACHNIK et al. (2007) ist es die Zeit, die vom Absetzen des Medikamentes bis zum Erreichen der Urin-Konzentration vergeht, in der die Substanz mit der verwendeten analytischen Methode nicht mehr detektiert werden kann.
Die Karenzzeit laut FN ist die „[…] Zeit, von der Gabe der Substanz bis zum Einsatz auf dem Turnier […]“ (DEUTSCHE REITERLICHE VEREINIGUNG 2013). Die Nachweiszeit wird zum Berechnen der Karenzzeit mit einem Sicherheitszuschlag versehen. Karenzzeiten beruhen auf pharmakologischen und veterinärmedizinischen Erkenntnissen und lassen sich aus der Nachweiszeit statistisch errechnen (s. Formel 1), dennoch sind sie bloß Empfehlungen und beinhalten ein Restrisiko (DEUTSCHE REITERLICHE VEREINIGUNG 2013). Die verschiedenen Verbände (mit Ausnahme der FN) geben keine Karenzzeiten an, da zwischen den Tieren starke interindividuelle Schwankungen herrschen und die Leistungsfähigkeit der Labore immer höher wird (WEINBERGER 2009). Die Empfehlung, wann ein Pferd nach medikamenteller Therapie am Wettkampf teilnehmen darf, obliegt letzten Endes dem behandelnden Tierarzt. Ein Gerichtsurteil von 2009 ergab, dass das Rennpferd Old Cat, das mit Metamizol nach einer Kolik behandelt worden war, disqualifiziert wurde, als die Dopingprobe positiv war. Die damals empfohlene Karenzzeit lag bei 5 Tagen, das Abbauprodukt war jedoch nach 6 Tagen (Turniertag) noch nachweisbar. Die Empfehlungen der Fachliteratur wurden vor Gericht nicht anerkannt, so dass Tierarzt und Tierhalter sich nicht darauf berufen konnten (WANNER 2009).
Dennoch veröffentlicht die DEUTSCHE REITERLICHE VEREINIGUNG (2013) in ihrer Broschüre, im Internet und als App Listen, die Karenzzeiten (ohne Garantie) enthalten. Dabei werden in Liste I der ADMR Substanzen aufgelistet, die unter den Begriff Doping fallen und am Wettkampftag verboten sind. Dazu zählen Sedativa, anabole Substanzen, etc. In Liste III stehen ebenfalls dopingrelevante Substanzen, die nicht nur am Wettkampftag sondern auch im
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Training verboten sind. Liste II enthält die verbotenen Substanzen, die unter den Begriff
„unerlaubte Medikation“ fallen und nach SEINSCH u. SCHÄNZER (1999) die wohl häufigsten Verstöße am Wettkampftag ausmachen (Glucocorticoide, NSAIDs, etc.). Für viele Substanzen gilt mit wenigen Ausnahmen die „Nulllösung“. Darunter versteht man, dass der Nachweis der kleinsten Menge einer verbotenen oder unerlaubten Substanz am Wettkampftag bereits einen Verstoß darstellt, unabhängig von der Konzentration. Genau genommen bedeutet dies, dass der jeweilige Stoff mit der verwendeten analytischen Methode nicht mehr nachgewiesen werden kann, auch wenn noch Wirkstoffreste im Organismus sein können (KIETZMANN et al. 2006b). KIETZMANN et al. (2006a) stellen pharmakokinetische Überlegungen zur möglichen Etablierung eines Grenzwertes statt der Nulllösung an. Für eine Grenzwert-Regelung wird jedoch statt des rein qualitativen Nachweises (Nulltoleranz) ein quantitativer Nachweis erforderlich, bei dem man sicherstellen muss, dass die Substanz nicht mehr wirkt, auch wenn sie noch nachweisbar ist (s. IUC nach TOUTAIN u. LASSOURD (2002)). Für einen quantitativen Nachweis ist eine weitergehende Validierung der Messergebnisse erforderlich, damit diese nicht angefochten werden können. Außerdem muss man sicherstellen, dass die Substanz unterhalb des Grenzwertes keine pharmakologische Wirksamkeit mehr hat. Für Romifidin z.B. zeigte sich, dass auch nach Erreichen der Nachweisgrenze durch Errechnung der IUC nach TOUTAIN u. LASSOURD (2002) noch wirksame Restkonzentrationen im Organismus vorhanden waren und ein Grenzwert für diese Substanz folglich der Nulltoleranz entsprochen hätte (HAMMER 2004).
Bisher werden nur wenige endogen vorkommende Substanzen (z.B. Testosteron) oder potentiell alimentär über die Nahrung aufgenommene Substanzen (z.B. Salicylsäure) mit Grenzwerten belegt. Für Cortisol gibt es untere Grenzwerte (s.2.4.1). Die Grenzwerte für Salicylsäure liegen im Plasma bei 6,5 µ g/ml nach FEI Vorgaben (bei der FN 5,4 µ g/ml). Eine Untersuchung am isoliert perfundierten Pferdebein zeigte, dass bei diesem erlaubten Plasmawert eine Akkumulation von Acetylsalicylsäure und Salicylsäure im Gelenk des Ex- vivo-Modells des Pferdes stattfindet und Konzentrationen im Gelenk erreicht werden, die einen entzündungshemmenden Effekt haben (FRIEBE et al. 2013a).
Betrachtet man nun, wovon die Dauer der Nachweisbarkeit einer Substanz abhängig ist, sind die Eliminationshalbwertszeit der Substanz, Dosis und Dauer der Anwendung, die galenische Formulierung (ein Acetatrest z. B. sorgt für wesentlich längere Halbwertszeiten), die Analytik
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und das Individuum Pferd zu nennen. Zudem sind Substanzen im Urin, als Ultrafiltrat des Blutes, wesentlich länger nachweisbar, da sie in höheren Konzentrationen vorliegen (SEINSCH u. SCHÄNZER 1999). Daher ist bei der Dopingprobe die Urinprobe der Blutprobe vorzuziehen.
2.1.5 Einflüsse auf individuelle Schwankungen der Nachweiszeiten
Betrachtet man das Individuum Pferd, sind die hohen Schwankungen in den Nachweiszeiten z. B. auf Schwitzen oder den Harn-pH zurückzuführen. Dieser schwankt beim Pferd stark zwischen 4,5-9. Im basischen Bereich liegen saure Arzneimittel (NSAIDs) überwiegend protoniert vor und werden folglich tubulär schlechter rückresorbiert (SEINSCH u.
SCHÄNZER 1999). Der Harn-pH des Pferdes sinkt nach Belastungssituationen durch Elektrolytverluste über den Schweiß. Metabolisierung der Substanzen und mögliche Wechselwirkungen mit anderen Pharmaka, sowie Enzymaktivität (gesteigert durch Steroide, gehemmt durch Antiparasitika) und Durchblutung der Leber unterliegen ebenfalls starken Schwankungen. Die Substanz an sich kann auch in der Lage sein, die Exkretion zu verlangsamen. So behindern 17-α-alkylierte Steroide die biliäre Exkretion (KLUGE u.
UNGEMACH 2005). Um diese biologische Variabilität bei der Festlegung von Karenzzeiten zu berücksichtigen, muss man eine ausreichende Sicherheitsspanne auf die Nachweiszeit aufschlagen. Die Stichprobenzahl für pharmakokinetische Untersuchungen über Ausscheidungszeiten ist meist beschränkt, daher kann man mit Konfidenzintervallen, welche die Streuung der Stichproben berücksichtigen, arbeiten, um eine ausreichende Sicherheitsspanne zu ermitteln. Geht man z. B. von einer Standardabweichung um 50 % vom Mittelwert der Probenergebnisse aus, verdoppelt sich die Nachweiszeit bei einer Sicherheit von 95 % und verdreifacht sich nahezu bei einer Sicherheit von 99,9 % (KIETZMANN et al.
2006b).
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2.2 Zur intraartikulären-Injektion bei Pferden verwendete Glucocorticoide
Zur Behandlung häufig vorkommender Lahmheiten bei Sportpferden werden als medikamentöse Schmerzausschaltung neben NSAIDs und Lokalanästhetika (LA) vorwiegend Glucocorticoide eingesetzt (KLUGE u. UNGEMACH 2005). Die intraartikuläre Medikation spielt dabei eine prominente Rolle im Management von gelenksbedingten Lahmheiten bei Sportpferden (CARON 2005). Glucocorticoide sind besonders potent im Hinblick auf ihre antiinflammatorischen Eigenschaften, aber auch umstritten, da sie corticosteroidinduzierte Arthropathien verursachen können, was jedoch auch auf hohe, wiederholte Dosen und zu frühe Trainigsaufnahme zurückzuführen sein kann (CARON 2005). Ein chondrotoxischer Effekt wurde z. B. in einer In-vitro-Studie mit Chondrozyten als Monolayer-Kultur, die mit verschiedenen Glucocorticoiden behandelt wurden, vor allem bei Betamethasonnatriumphosphat- und acetat beobachtet (DRAGOO et al. 2012). In einer anderen Studie hingegen, die auf einem In-vivo-osteochondral fragment exercise model basierte, konnten für Triamcinolonacetonid therapeutische Vorteile und chondroprotektive Eigenschaften dieser Substanz festgestellt werden (FRISBIE et al. 1997). Hierbei wurde Pferden mit einem Knochen-Fragment Triamcinolonacetonid intraartikulär injiziert. Im Vergleich zu einer Placebo-Gruppe waren eine Abnahme der Lahmheit, des Gesamtproteins und des Entzündungszellinfiltrates sowie eine Zunahme von Hyaluron und Glukosaminoglykanen feststellbar. Zudem entdeckten FRISBIE et al. (1997), dass histomorphologisch signifikante Verbesserungen des Gelenkknorpels im Vergleich zur Placebo-Gruppe vorzufinden waren und die subintimale Hyperplasie und Fibrose geringer waren.
Nach FRISBIE (2011) sind Ziele des Einsatzes von Glucocorticoiden bei der Osteoarthritis des Pferdes die Reduktion von Schmerz und das Minimieren der progressiven Gelenkserkrankung. Bei der Therapie muss nicht nur das richtige Präparat in ausreichender Dosis gewählt werden, sondern auch die Wartezeit bis zur Wiederherstellung des Gelenks und zum Wettkampf richtig bemessen werden (FRISBIE 2011). Um die Nachweiszeiten zu bestimmen und zu verhindern, dass es zu unbeabsichtigten, positiven Dopingfällen kommt, wurden bereits In-vivo-Versuche mit verschiedenen Glucocorticoiden nach intraartikulärer Applikation (z. B. Triamcinolonacetonid, Betamethason, Methylprednisolon und Dexamethason) durchgeführt (SOMA et al. 2006; SOMA et al. 2011; LÖWENICH 2012;
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KNYCH et al. 2013; SOMA et al. 2013) (s.2.4.4; 2.4.5; 2.4.6). Auch unter Verwendung des Ex-vivo-Modells des isoliert perfundierten Pferdebeines wurde die intraartikuläre Applikation von Betamethason in Form einer Lösung in Hinsicht auf die Abflutungsrate untersucht (FRIEBE et al. 2013b). Dieses Modell erwies sich als geeignet für die Untersuchung von Abflutungsgeschwindigkeiten und zeigte durch Extrapolation der Ergebnisse im Vergleich zu den In-vivo-Studien von LÖWENICH (2012) vergleichbare Ergebnisse (s.2.4.5). Daher wurde in dieser Arbeit das Modell des isoliert perfundierten Pferdebeines für die Untersuchung von Flumethason, Dexamethasonphosphat, Dexamethasonpalmitat und Triamcinolonacetonid gewählt, um die Abflutungszeiten dieser Substanzen zu untersuchen.
Dexamethasonnatriumphosphat (Dexamethason-Injektionslösung ad us vet. 2 mg/ml von CP Pharma) ist für die intraartikuläre Anwendung beim Pferd zur Behandlung akuter, nicht- entzündlicher Gelenkserkrankungen zugelassen (VETIDATA 2015). Daher ist eine intraartikuläre Anwendung möglich. Der Tierarzt braucht verlässliche Karenzzeiten, die er dem Tierhalter empfehlen kann.
Es gibt derzeit laut VETIDATA (2015) kein zugelassenes Triamcinolonacetonid-haltiges Präparat für Pferde. Triamcinolonacetonid wird neben seinen glucocorticoiden Effekten ein chondroprotektiver Effekt zugeschrieben (FRISBIE et al. 1997). LÖWENICH (2012) untersuchte in einer In-vivo-Studie eine Formulierung von Triamcinolonacetonid in unterschiedlichen Dosierungen, wobei die Nachweiszeit unabhängig von der injizierte Menge war und starke interindividuelle Schwankungen zwischen den Pferden beobachtet werden konnten (s. 2.4.5). Obwohl die Substanz derzeit keine Marktzulassung hat, wird sie dennoch in der Praxis eingesetzt. Dies zeigte eine Statistik von WITZMANN (2010), bei der dargestellt wurde, dass Triamcinolonacetonid 2010 zu den positiven Befunden während einer Medikationskontrolle gehörte (WITZMANN 2010).
Lipotalon® (Dexamethasonpalmitat) ist eine Formulierung, die in der Humanmedizin verwendet wird. Das Arzneimittel wird von Pferdepraktikern häufig in unerlaubter Weise (kein Therapienotstand) zur intraartikulären Injektion verwendet, auch wenn hierfür keine Zulassung besteht. Hinweise für diesen Einsatz liefern zahlreiche Forumsbeiträge von
26
Pferdebesitzern, die über die Therapie mit Lipotalon® durch ihren Haustierarzt berichten (ANONYM 2003, 2009). Daher ist diese Substanz für Ausscheidungsversuche im Hinblick auf unerlaubte Medikation am Wettkampftag interessant.
Flumethason gibt es seit Dezember 2009 nicht mehr als zugelassenes Präparat in der Tiermedizin in Deutschland (VETIDATA 2015); auch in der Humanmedizin ist kein entsprechendes Präparat zu finden, das für die intraartikulären Injektion geeignet wäre (ROTE LISTE 2015). Die damals zugelassene Formulierung Acutol® wurde nach i.v Applikation beim Pferd noch 36 bis 48 Stunden im Urin wiedergefunden (MACHNIK et al. 2007).
Flumethason ist ein sehr potenter Entzündungshemmer und vermag bereits nach 2 Tagen die klinischen Symptome einer Lahmheit zu unterdrücken (TRUSSEL 1965). Es ist in der Lage, schnell und effektiv eine Lahmheit zu kaschieren, auch wenn die Funktionalität des Gelenkes vielleicht noch nicht wieder hergestellt ist. Aus Gründen des Tierschutzes ist das Wissen über die Ausscheidungsgeschwindigkeit von Flumethason daher wichtig.
27 2.3 Anatomie und Physiologie synovialer Gelenke
Der anatomische Aufbau vom Fessel- und Karpalgelenk des Pferdes ist für das Verständnis des Versuchsaufbaus und die Interpretation der Ergebnisse des isoliert perfundierten Pferdebeines von Bedeutung. Des Weiteren sind das Wissen über den histologischen Aufbau der Synovialmembran und der Funktion der Synoviozyten wichtig für die Deutung der Ergebnisse der Zellkultur-Versuche mit equinen Synoviozyten.
Die Verbindungen von Knorpel bzw. knöchernen Skelettstücken sind ursprünglich spaltfrei.
Nur wenn eine größere Bewegungsfreiheit benötigt wird, verschwindet das Zwischengewebe (Binde- und Knorpelgewebe) und es entsteht ein Gelenk. Dabei artikulieren die jeweiligen Gelenkflächen als einfaches Gelenk (zwei beteiligte Knochen) oder als zusammengesetztes Gelenk (bei mehr als zwei artikulierenden Knochen) miteinander. Die artikulierenden Knochenflächen sind mit glattem, hyalinen Gelenkknorpel, Cartilago articularis überzogen und durch eine schmale, verkalkte Zone fest auf dem Knochen verankert. Das Cavum articulare wird von der Capsula articularis, die aus dem Periost hervorgeht, begrenzt. Die Gelenkkapsel besteht aus zwei Schichten. Einer äußeren, derben Membrana fibrosa und der innen anliegenden Membrana synovialis, von der Synovialzotten in die Gelenkhöle vorspringen können. Weiterhin gibt es sehnige Gelenksbänder, die als Ligamenta capsularia, Ligamenta extra- und intracapsularia verlaufen (NICKEL et al. 2004b). In Abbildung 1 (a) ist ein intaktes Synovialgelenk dargestellt und daneben Veränderungen, wie sie bei einer Osteoarthritis vorzufinden sind (b), modifiziert nach FRISBIE (2006).
28
Abbildung 1: Normales synovial Gelenk (a) und Veränderungen, die bei einer Osteoarthritis zu beobachten sind (b). Modifiziert nach FRISBIE (2006)
Die Synovialmembram (Synovium, Stratum synoviale) setzt sich aus einer Lamina propria und einem ein- bis mehrschichtigen Epithel aus Synoviozyten, das sich ohne Basalmembran anschließt, zusammen. Die Lamina propria besteht aus einem faser- und fettzellhaltigen Bindegewebe (je nach auf das Gelenk einwirkender Druckbelastung) und ist gut durchblutet und innerviert. Die von den Synoviozyten gebildete Synovialflüssigkeit ist ein Ultrafiltrat des Plasmas und repräsentiert die meisten Bestandteile, die auch im Plasma vorzufinden sind, außer Hyaluron, welches in der Synovialflüssigkeit in hohen Konzentrationen vorkommt und von den Synoviozyten gebildet wird. Weitere Bestandteile der Synovialflüssigkeit sind mononukleare Zellen wie Synovialzellen, Monozyten, und Lymphozyten, die zusammen 90 % ausmachen, den Rest stellen polymorphkernige Leukozyten dar. Unveränderte Synovialflüssigkeit enthält dabei 500 kernhaltige Zellen/µl (TODHUNTER 1996). Das Fehlen der Basalmembran hat einen entscheidenden Einfluss auf die Zusammensetzung der Synovialflüssigkeit (FRISBIE 2006). Substanzen, deren Molekülmasse weniger als 10 kDa (z.B. Glucose, CO2 und Sauerstoff) beträgt, gelangen durch das Endothelium der Subintima.
29
Von den Synoviozyten gebildetes Hyaluron und Lubricin sind in der Lage, die Synovialfüssigkeit zu regulieren, indem sie sterisch große Moleküle ausschließen können und gleichzeitig als Gelenksschmiere dienen (FRISBIE 2006). Der pH-Wert nach Synoviaanalyse verschiedener Gelenke des Pferdes lag in einer Studie bei 7,67 (± 0,29) (MARXEN 2001).
Ein Abfall des pH-Wertes ist bei entzündlichen Prozessen zu erwarten, da es zu Lactatproduktion durch vermehrte Glykolyse durch Leukozyten kommt (HENDERSON u.
PETTIPHER 1985). Der Wert ist entscheidend für die Abflutung intraartikulär verabreichter Arzneimittel, da nur undissoziierte, lipophile Arzneimittel in der Lage sind, die Synovialmembran durch Diffusion zu verlassen.
FRISBIE (2006) beschreibt detailliert den Aufbau des hyalinen Gelenkknorpels. Dieser ist 1-4 mm dick und ermöglicht die reibungslose Bewegung synovialer Gelenke. An seinem Zustand wird häufig die Gelenksgesundheit beurteilt, da seine Degeneration und langsame Heilung das Level der Gelenkserkrankung repräsentiert. Der Knorpel wird durch die Synovialflüssigkeit ernährt. Der Chondrozyten-Anteil beträgt im Gelenkknorpel 1-12 %, den Rest stellt die Extrazellularmatrix, bestehend aus Kollagenen (hauptsächlich Typ II Kollagen), Proteoglykanen und Wasser dar. Die Extrazellularmatrix ist wie ein Gitternetz aufgebaut, indem sich mitunter Kollagen II, Hyaluronsäure und Aggrecan (ein Proteoglycan, das Chondroitinsulfat und Keratansulfat bindet) organisieren. Die Proteoglycane verhelfen dem Knorpel zu seiner Druckfestigkeit (FRISBIE 2006). Zusammenfassend erfüllen die Strukturen, die an der Bildung eines synovialen Gelenkes beteiligt sind, zwei Hauptaufgaben.
Erstere Aufgabe ist die Gewährleistung der reibungslosen, schmerzfreien Bewegung.
Zweitere ist die Lastverteilung zur Unterstützung des muskoloskeletalen Systems und die effiziente Übertragung der Bewegungsenergie durch den Körper in den Boden (TODHUNTER 1996).
2.3.1 Funktion der Synoviozyten
Bei den Synoviozyten unterscheidet man Typ A- und Typ B-Synoviozyten (FRISBIE 2006).
Erstere dienen der Phago- und Pinozytose (HENDERSON u. PETTIPHER 1985). Die Typ B- Synoviozyten sind für die Synthese von Polypeptiden zuständig (LINCK u. PORTE 1978).
Synoviozyten synthetisieren Hyaluron und sezernieren dies und andere Komponenten der Extrazellularmatrix in die Synovialflüssigkeit. Die Synoviozyten sind verantwortlich für die
30
Produktion von einer Vielzahl von Proteinen, die für die Zusammensetzung der Synovialflüssigkeit entscheidend sind. Dazu gehören zum Beispiel neben Hyaluron auch Kollagen, Lubricin, Matrix-pro-Metalloproteinase, Interleukine und Eicosanoide (z.B. PGE2) (FRISBIE 2006).
2.3.2 Aufbau des Karpalgelenks mit Gefäßversorgung
Beim Vorderfußwurzelgelenk (Karpalgelenk) handelt es sich beim Pferd um ein zusammengesetztes Gelenk mit drei Gelenksspalten. Die proximale Gelenksebene stellt das Unterarm-Vorderfußwurzelgelenk (Articulatio antebrachiocarpea), die mittlere Ebene das Articulatio mediocarpea und distal das mit der mittleren Gelenkshöhle über einen Gelenksspalt zwischen CIII und CIV kommunizierende Articulatio carpometacarpea dar.
Weiterhin gibt es gelenkige Verbindungen zwischen dem Sesambein des Karpalknochens (Articulatio ossis carpi accessorii) und straffe Gelenke zwischen den Karpalknochen einer Reihe. Die beiden proximalen Gelenke ermöglichen die größte Beweglichkeit, wobei das Articulatio antebrachiocarpea mit 95° eine weit höhere Beweglichkeit als das Articulatio mediocarpea (45°) aufweist. Die restlichen Gelenke sind straffe Gelenke (NICKEL et al.
2004b; WISSDORF et al. 2010). Stabilisiert wird das Karpalgelenk durch straffe Gelenkbänder, den Scheiteldruck durch die Endsehne des Musculus extensor carpi radialis und einen Kehlzug, der von den palmar verlaufenden Beugesehnen und dem Musculus interosseus ausgeht (BUDRAS et al. 1991).
Die Kenntnis über den Aufbau der Gelenksebenen des Karpalgelenkes ist für den Versuch mit dem isoliert perfundierten Pferdebein insofern von Bedeutung, da die Beine in der mittleren Gelenksebene abgesetzt werden mussten. Eröffnet man das Wechselgelenk der mittleren Gelenksebene so, dass die proximale Reihe der Ossa carpi radiale, intermedium, ulnare und accessorium von den distal gelegenen Karpalknochen getrennt werden, ergibt sich eine Aufsicht auf die in Abbildung 2 dargestellten Strukturen.
Der Karpaltunnel ist ein Bereich
den Metakarpalknochen und lateral vom
Bindegewebe umfasst, das die Karpalbeugesehnenscheide, welche die Oberflächliche und Tiefe Beugesehne umschließt, beinhaltet. Neben der
medialis. Geraten die A. mediana
Veränderungen in diesem Bereich (z.B. vermehrte Füllung der Karpalbeugesehnenscheide) kommt es zum Karpaltunne
palmaris) außerhalb des Retinaculum flexorium weit oberflächlich zum Os carpi accessorium
außerhalb des Karpaltunnels verlaufen der Ramus palmaris der radialis und parallel, die sich aus der
radialis (WISSDORF et al. 2010
Das Wissen über den Verlauf der Gefäße im Bereich der mittleren Gelenksebene des Karpalgelenkes ist für den Versuch
mediana wurde zum Anschluss an das Perfusionssy
des Perfusats gewählt. Durch Verschluss der anderen Gefäße l diese beiden Gefäße, um die distale Gliedmaße zu versorgen.
31
Der Karpaltunnel ist ein Bereich, der von den Unterarm-, Karpalknochen und proximal von den Metakarpalknochen und lateral vom Os carpi accessorium begrenzt wird und Bindegewebe umfasst, das die Karpalbeugesehnenscheide, welche die Oberflächliche und Tiefe Beugesehne umschließt, beinhaltet. Neben der A. mediana verläuft der
A. mediana und der benachbarte Nerv unt
Veränderungen in diesem Bereich (z.B. vermehrte Füllung der Karpalbeugesehnenscheide) kommt es zum Karpaltunnelsyndrom. Neben der A. mediana verläuft ihr Ast (
Retinaculum flexorium (also außerhalb des Karpaltunn
Os carpi accessorium ziehend. Ebenfalls recht oberflächlich und außerhalb des Karpaltunnels verlaufen der Ramus palmaris der V. mediana
die sich aus der V. digitalis palmaris communis II WISSDORF et al. 2010).
Das Wissen über den Verlauf der Gefäße im Bereich der mittleren Gelenksebene des den Versuch der perfundierten Pferdebeine ebenfalls
zum Anschluss an das Perfusionssystem und die V. radialis
des Perfusats gewählt. Durch Verschluss der anderen Gefäße lief der Kreislauf folglich um die distale Gliedmaße zu versorgen.
Abbildung 2: Querschnitt durch
Karpus. Die Schnittführung ist proximal der Karpalknochen (A-D) angesetzt und es wird der Bereich des Karpaltunnels mit mediana (3), dem N. medianus
unmittelbarer Nachbarschaft zur oberflächlichen (l) und tiefen Beugesehne (m) und deren Karpalbeugesehnenscheide (n) liegen, dargestellt. 4
mediana, 5 A. radialis, 6 mediana, 7 V. radialis flexorium
Aus: WISSDORF et al. (2010)
, Karpalknochen und proximal von begrenzt wird und Bindegewebe umfasst, das die Karpalbeugesehnenscheide, welche die Oberflächliche und verläuft der Nervus palmaris und der benachbarte Nerv unter Druck durch Veränderungen in diesem Bereich (z.B. vermehrte Füllung der Karpalbeugesehnenscheide) verläuft ihr Ast (Ramus (also außerhalb des Karpaltunnels) relativ ziehend. Ebenfalls recht oberflächlich und V. mediana, medial die A.
s II fortsetzende V.
Das Wissen über den Verlauf der Gefäße im Bereich der mittleren Gelenksebene des ebenfalls essentiell. Die A.
V. radialis zum Auffangen der Kreislauf folglich über
: Querschnitt durch den linken Karpus. Die Schnittführung ist proximal D) angesetzt und es wird der Bereich des Karpaltunnels mit A.
N. medianus (1), welche in unmittelbarer Nachbarschaft zur oberflächlichen (l) und tiefen Beugesehne und deren Karpalbeugesehnenscheide (n) liegen, dargestellt. 4 R. palmaris der A.
, 6 R. palmaris der V.
V. radialis, E Retinaculum WISSDORF et al. (2010)
2.3.3 Aufbau des Fesselgelenk
Beim Pferd befindet sich das Fesselgelenk bei Belastung im Zustand der Hyperextension (Dorsoflexion) und wird durch Druck des Fesselträgers u
plantar gehalten, um einer übermäßigen Hyperextension vorzubeugen Das Fesselgelenk (Articulatio
des Hauptmittelfußknochens, der grubenförmige in das Ligamentum metacarpointersesamoideum
Scharniergelenk gebildet. Durch die Fesselgelenkskapsel entsteht eine Gelenkshöhle dorsal und palmar einen
Gelenksinjektion der Testsubstanzen herangezogen wurde. Er erstreckt sich 4 proximal zwischen Mittelfußknochen und Endsehne des
dorsal der palmar liegenden Sehnenscheide der (BUDRAS et al. 1991; NICKEL et al. 2004b vereinfacht dargestellt.
Abbildung 3: Darstellung der Gelenk Kronbein (C), Hufbein (D) und Stra
wurde für die intraartikuläre Injektion verwendet.
Der palmare Anteil der Gelenkskapsel ist d dem verdickten Teil der
32 Aufbau des Fesselgelenks
Beim Pferd befindet sich das Fesselgelenk bei Belastung im Zustand der Hyperextension (Dorsoflexion) und wird durch Druck des Fesselträgers und der Beugesehnen palmar bzw.
plantar gehalten, um einer übermäßigen Hyperextension vorzubeugen (BUDRAS et al. 1991 Articulatio metacarpophalangea) wird von der Gelenkfläche mit Walze des Hauptmittelfußknochens, der grubenförmigen Gelenkfläche der Gleichbeine (eingebettet
igamentum metacarpointersesamoideum) und des Fesselbeins als straff geführt gebildet. Durch die Fesselgelenkskapsel entsteht eine Gelenkshöhle dorsal und palmar einen Recessus besitzt, wobei der palmare
ion der Testsubstanzen herangezogen wurde. Er erstreckt sich 4 proximal zwischen Mittelfußknochen und Endsehne des Musculus interosseus dorsal der palmar liegenden Sehnenscheide der oberflächlichen- und
NICKEL et al. 2004b). Die Gelenkshöhle ist in
llung der Gelenksaussackungen zwischen Hauptmittelfußknochen (A
Strahlbein (E). Der palmare Recessus des Gelenksacks des Fesselgelenks wurde für die intraartikuläre Injektion verwendet. Modifiziert nach NICKEL et al. (2004b)
Der palmare Anteil der Gelenkskapsel ist dickwandiger und größer als der d
dem verdickten Teil der Capsular articularis, am distalen Ende des dritten Beim Pferd befindet sich das Fesselgelenk bei Belastung im Zustand der Hyperextension nd der Beugesehnen palmar bzw.
BUDRAS et al. 1991).
) wird von der Gelenkfläche mit Walze Gelenkfläche der Gleichbeine (eingebettet ) und des Fesselbeins als straff geführtes gebildet. Durch die Fesselgelenkskapsel entsteht eine Gelenkshöhle, die almare Recessus für die ion der Testsubstanzen herangezogen wurde. Er erstreckt sich 4- bis 5 cm nach Musculus interosseus liegend und und tiefen Beugesehne Die Gelenkshöhle ist in Abbildung 3
Hauptmittelfußknochen (A), Fesselbein (B), Der palmare Recessus des Gelenksacks des Fesselgelenks
NICKEL et al. (2004b)
ickwandiger und größer als der dorsale Anteil. Auf , am distalen Ende des dritten
33
Metakarpalknochens, liegt ein Schleimbeutel unter den dort verlaufenden Beugesehnen.
Dieser kann mit der Gelenkskapsel kommunizieren (KAINER 1989).
Als seitliche Stabilisierung des Fesselgelenks verlaufen die Ligamenta collateralia mediale und laterale von den Bandhöckern und –gruben des Metakarpalknochens und inserieren am Rand der Gelenkfläche des Fesselbeins und mit einem kräftigeren Anteil abaxial am Gleich- und Fesselbein (BUDRAS et al. 1991).
Zum Fesselträger, dem Halteapparat des Fesselgelenks, gehört proximal der Musculus interosseus medius, der mit seinen Schenkeln zu den Gleichbeinen und mit einem weiteren Unterstützungsschenkel (Ligamentum accessorium) zur gemeinsamen Strecksehne zieht. Der Unterstützungsschenkel antagonisiert die Beugung des Hufgelenks durch die tiefe Beugesehne und sorgt für ein Aufsetzen des Hufes auf der Sohlenfläche. Mittlere Tragestrukturen sind Bänder, die innerhalb der Gleichbeine verlaufen sowie die Ligamenta sesamoidea collateralia. Zu den distalen Strukturen gehören Sesambeinbänder, welche von den Gleichbeinen zum Kronbein und Fesselbein ziehen. Die in die Sesambeinbänder eingebetteten Gleichbeine dienen als zentrale Verankerungsstelle der proximalen, mittleren und distalen Tragestrukturen und zusammen mit den verbindenden Bändern als Gleitlager für den Musculus flexor digitalis profundus (KAINER 1989; BUDRAS et al. 1991).
Die Blutversorgung im Fesselgelenksbereich wird über ein Netzwerk aus einem arteriellen Zufluss und einem venösen Abfluss (dargestellt in Abbildung 4) gesichert. Die Gefäßversorgung ist hierbei entscheidend für die Geschwindigkeit des Abtransportes von Arzneimitteln aus dem Fesselgelenk.
Neben den in Abbildung 4 dargestellten Hauptgefäßen der distalen Gliedmaße, g
Synovialmembran selber. Diese wird in einem Review von
zusammengefasst. Im lockeren Bindegewebe verlaufende größere Gefäße liegen tief im Gewebe, parallel zum Kapselgewebe und zur Oberfläche. Diese Gefäße anastomisieren irregulär um Arterien- und Venenplexus zu bilden, d
der Oberfläche der Synovialmembran in V
Bindegewebe verlaufen die größeren Gefäße hingegen longitudinal entlang der Gewebsfasern als Dreier-Verband. Sie kommunizieren üb
Mikrozirkulation der Synovialmembran wird aus einem dichten Kapillarnetzwerk gebildet.
Kapillaren, dicht an der Synovialmembran liegend, sind stark fenestriert und somit durchlässiger (MOSKALEWSKI et al. 2014
Eine Zunahme der Vaskularis
beobachtet werden (BONNET u. WALSH 2005
gesteigerte NADPH-Oxidase Genexpression sein, die wiederum ein für die Initiierung der Angiogenese darstellt
Für die Abflutung der Arzneimittel, die intraartikulär appliziert werden, spielt die Diffusionsstrecke aus dem Gelenk in das Kreislaufsystem
Abbildung
Fesselgelenksbereich. Palmare Ansicht. 30:
palmares communes
palmares propriae NICKEL et al. (2004a)
34
dargestellten (und in Abbildung 5 andeutungsweise erkennbaren) der distalen Gliedmaße, gibt es Untersuchungen zur Vaskularisation der Synovialmembran selber. Diese wird in einem Review von MOSKALEWSKI et al. (2014) zusammengefasst. Im lockeren Bindegewebe verlaufende größere Gefäße liegen tief im Gewebe, parallel zum Kapselgewebe und zur Oberfläche. Diese Gefäße anastomisieren und Venenplexus zu bilden, die über ein feines Kapillarnetzwerk mit der Oberfläche der Synovialmembran in Verbindung stehen. In der Kapsel
Bindegewebe verlaufen die größeren Gefäße hingegen longitudinal entlang der Gewebsfasern Sie kommunizieren über transversal verlaufende Gefäße. Die Mikrozirkulation der Synovialmembran wird aus einem dichten Kapillarnetzwerk gebildet.
Kapillaren, dicht an der Synovialmembran liegend, sind stark fenestriert und somit MOSKALEWSKI et al. 2014).
Eine Zunahme der Vaskularisierung durch Angiogenese kann bei Entzündungen der Gelenke BONNET u. WALSH 2005). Grund hierfür könnte
xidase Genexpression sein, die wiederum einen entscheidende für die Initiierung der Angiogenese darstellt (BINIECKA et al. 2014).
Für die Abflutung der Arzneimittel, die intraartikulär appliziert werden, spielt die m Gelenk in das Kreislaufsystem eine Rolle. Je dichter die
Abbildung 4: Gefäßversorgung der distalen Pferdegliedmaße im Fesselgelenksbereich. Palmare Ansicht. 30: Aa metarcarpales palmares (tiefe Gefäßversorgung), 34 und 35: Aa digitalis palmares communes (oberflächliche Gefäßversorgung), 39:
palmares propriae, 41: Rr dorsales phalangis proximalis NICKEL et al. (2004a)
andeutungsweise erkennbaren) ibt es Untersuchungen zur Vaskularisation der MOSKALEWSKI et al. (2014) zusammengefasst. Im lockeren Bindegewebe verlaufende größere Gefäße liegen tief im Gewebe, parallel zum Kapselgewebe und zur Oberfläche. Diese Gefäße anastomisieren ie über ein feines Kapillarnetzwerk mit erbindung stehen. In der Kapsel oder strafferem Bindegewebe verlaufen die größeren Gefäße hingegen longitudinal entlang der Gewebsfasern er transversal verlaufende Gefäße. Die Mikrozirkulation der Synovialmembran wird aus einem dichten Kapillarnetzwerk gebildet.
Kapillaren, dicht an der Synovialmembran liegend, sind stark fenestriert und somit
durch Angiogenese kann bei Entzündungen der Gelenke die durch Hypoxie entscheidenden Faktor
Für die Abflutung der Arzneimittel, die intraartikulär appliziert werden, spielt die eine Rolle. Je dichter die
er distalen Pferdegliedmaße im Aa metarcarpales Aa digitalis palmares (oberflächliche Gefäßversorgung), 39: Aa digitales langis proximalis. Aus
35
Gefäßversorgung (z. B. durch Angiogenese bei entzündlichen Prozessen im Gelenk) und je durchlässiger die Gefäße sind, desto schneller ist ein Austritt der Substanz aus dem Gelenk zu erwarten. Für Triamcinolonacetonid nach intraartikulärer Applikation konnte z. B. eine Transfer-Halbwertszeit von 5,2 Stunden aus dem Gelenk in den Blutkreislauf ermittelt werden (SOMA 2011).
Abbildung 5: Anfärbung der Gefäße des Fesselgelenkbereiches nach Trypan-Blau Injektion in die A. mediana
Die Pfeile kennzeichnen angefärbte Gefäße
36 2.4 Corticosteroide
2.4.1 Allgemeine Pharmakologie
Endogene Glucocorticoide (z. B. Cortisol) werden in der Zona fasciculata der Nebennierenrinde gebildet und haben vor allem eine Wirkung auf den Kohlenhydratstoffwechsel. Mineralocorticoide mit Wirkung auf den Elektrolythaushalt werden hingegen in der Zona glomerulosa der Nebennierenrinde synthetisiert. Beide haben als Vorläufer das Cholesterin und werden de novo nach Stimulation der Nebennierenrinde durch das Adrenocorticotrope Hormon (ACTH) aus dem Hypophysenvorderlappen, welches wiederum durch das Corticotropin Releasing Hormon (CRH) aus dem Hypothalamus angeregt wird, freigesetzt und synthetisiert. Dies folgt in der Regel einer circadianen Rhythmik. Morgens ist der endogene Cortisolspiegel höher als abends, und auch in Stresssituationen (durch eine erhöhte ACTH-Ausschüttung) steigt der Cortisolspiegel an. Da ein negativer Feedbackmechanismus zwischen der Hypophyse, dem Hypothalamus und übergeordneten Zentren einerseits und den Glucocorticoiden andererseits besteht, sind diese in der Lage, ihre eigene Synthese und Sekretion zu hemmen (BARNES 2006;
STEINFELDER u. OETJEN 2009). Für die Dopinganalytik spielt dieser Mechanismus eine entscheidende Rolle, so dass eine potentiell vorrangegangene unerlaubte Medikation mit Glucocorticoiden durch eine Suppression des endogenen Cortisolspiegels auffallen kann. Die FN hat daher untere Grenzwerte für Cortisol (>1 µg/ml Urin) festgelegt (DEUTSCHE REITERLICHE VEREINIGUNG 2013).
Sowohl die intraartikulären Gaben von Betamethason als auch von Triamcinolonacetonid waren in der Lage, den Cortisolspiegel soweit zu senken, dass der Grenzwert der FN mit starken interindividuellen Schwankungen unterschritten wurde. Die Glucocorticoide konnten jedoch länger nachgewiesen werden als die Cortisolsuppression andauerte, was sich auf eine zunehmend sensitiver werdende Analytik in der Detektion der Corticoide zurückführen lässt (LÖWENICH 2012). ABRAHAM et al. (2009) stellten mit perkutan appliziertem Dexamethason fest, dass der endogene Cortisolgehalt um 75-80 % vom Basalwert nach unten abwich. Somit kann auch perkutan verabreichtes Dexamethason zu systemischen Effekten und positiven Dopingproben führen (ABRAHAM et al. 2009). Diese Erfahrung musste Ludger Beerbaum 2004 in Athen mit seinem Pferd Goldfever nach lokaler Behandlung mit einer betamethasonhaltigen-Salbe machen (ANONYM 2004). Auch andere Studien
37
beschäftigten sich mit einer endogenen Cortisolsuppression nach lokaler Glucocorticoid Applikation und stellten fest, dass lokale Formulierungen für eine nachweisliche Cortisolsuppression, die über mehrere Tage andauerte, ausreichten (SOMA et al. 2011;
SOMA et al. 2013).
Das entzündungshemmende Potenzial des endogenen Cortisols wurde 1950 entdeckt und brachte Kendall und Reichstein im selben Jahr den Nobelpreis für die Isolation und Synthese von Cortisol und ACTH. Hench, der die antiinflammatorischen Effekte nach i.v. Applikation dieser Substanzen bei Rheumapatienten beschrieb, erhielt ebenfalls den Nobelpreis für seine Arbeit (MÜHL u. PFEILSCHIFTER 2003; BARNES 2006). Zu den stärksten bekannten antiinflammatorischen Substanzen gehören jedoch die synthetischen Glucocorticoide (HÖGGER 2003; BARNES 2006). Strukturell leiten sich die synthetischen Glucocorticoide von dem Nebennierenrindenhormon Cortisol ab und können durch chemische Modifikation der Steroid-Basen in ihren Eigenschaften bezüglich Resorption, Metabolisierung, Ausscheidung und Wirkung, Proteinbindung und Rezeptoraffinität beeinflusst werden (FERGUSON et al. 2009). Gemeinsamer Vorläufer ist das Cholesterol, ein 21-Carbon Molekül aus drei sechsgliedrigen- und einem fünfgliedrigen Ring (YARBROUGH 2004). Es handelt sich hierbei um C21-Steroide, die wasserunlöslich (lipophil) und kristallin sind. Allen gemein sind die Doppelbindung zwischen dem C1-C2 und C4-C5 Atom, sowie die Ketogruppe im A Ring an Position C3. Weiterhin allen gemein ist der Sauerstoff als Keton am C20-Atom (HÖGGER 2003). Bei der Synthese exogener Glucocorticoide ging es darum, den mineralocorticoiden Effekt (unerwünscht) zu unterdrücken und gleichzeitig die Wirkpotenz der Glucocorticoide zu erhöhen. Abbildung 6 stellt den Einfluss der Struktur auf die Rezeptorbindung und Abbildung 7 die möglichen chemischen Variationen am Cortisol-Gerüst nach HÖGGER (2003) dar.
38
Abbildung 6: Darstellung der Rezeptorselektivität- und affinität am Beispiel des Hydrocortisons nach HÖGGER (2003)
Abbildung 7: Mögliche strukturelle Variation der Glucocorticoide am Beispiel des Prednisolons nach HÖGGER (2003)
Synthetische Glucocorticoide sind im Plasma zu ca. zwei Dritteln an Proteine (Albumin) gebunden und lediglich zu ca. einem Drittel ungebunden. Gebunden sind die Glucocorticoide biologisch inaktiv. Das endogene Cortisol bindet überwiegend an Transcortin, da die Affinität zu diesem Transportprotein im Vergleich zu Albumin höher ist (HÖGGER 2003).
An der Zelle angekommen, diffundieren die Glucocorticoide aufgrund ihrer Struktur leicht durch die Zellmembran ins Cytosol und binden hier an den zytosolischen Glucocorticoid- Rezeptor, welcher wiederum an ein Hitzeschockprotein 90 (Hsp-90) gebunden ist. Auch ein nicht genomischer Wirkmechanismus über einen membranständigen Rezeptor kann bei hohen Glucocorticoid-Dosen und Sättigung des zytosolischen Rezeptors beobachtet werden (s.u.) (FERGUSON et al. 2009).
Es gibt zwei Arten von Glucocorticoidrezeptoren (GR): den GRα (sehr häufig vorkommend) und den GRβ, eine seltene Splice-Variante des Rezeptors, die zwar an die
39
Desoxyribonukleinsäure (DNA) bindet, aber nicht von Glucocorticoiden aktiviert werden kann und mit steroid-resistentem Asthma assoziiert wurde (STEINFELDER u. OETJEN 2009). Erst nach Abspaltung des Hsp-90 wird der Glucocorticoid-Rezeptorkomplex aktiv und transloziert in den Zellkern, wo er am Glucocorticoid-responsiven Element (GRE) der DNA bindet und die Transkription bestimmter Proteine beeinflusst. Auf diese Weise kann die Synthese bestimmter Proteine gesteigert, aber auch gehemmt werden (SCHILD u.
FÖRSTERMANN 2009).
BARNES (2006) beschreibt die antiinflammatorische Wirkung der Glucocorticoide durch Suppression multipler inflammatorischer Gene auf molekularer Ebene. Während einer Entzündung kommt es zum Anstieg der Genexpression vieler inflammatorischer Proteine, wie z. B. von Zytokinen, Adhäsionsmolekülen, inflammatorischen Enzymen und Rezeptoren.
Diese werden über die Zunahme der Gentranskription bestimmt und durch proinflammatorische Transkriptionsfaktoren wie den Nuklear Faktor-κB (NFκB) und das Aktivator Protein-1 (AP-1) reguliert.
ITO et al. (2000) untersuchten den Einfluss proinflammatorischer Substanzen wie Interleukin (IL)-1β oder Endotoxine auf epitheliale Zellen und stellten einen Anstieg von NFκB mit nachfolgender Acetylierung des Histons H4 fest und eine damit verbundene vermehrte Expression von Genen, die für inflammatorische Proteine codieren (ITO et al. 2000). Histone sind Proteine, die zusammen mit der DNA das Chromatin bilden. Sie sind für die Struktur der DNA verantwortlich und folglich für die Genexpression entscheidend. Unter einer geschlossenen Konformation wird die Supression der Genexpression verstanden.
Gentranskription hingegen ist mit einer Remodellierung der Chromatinstruktur durch enzymatische Modifikation der Histone durch Acetylierung, die durch eine Histon Acetyltransferase (HAT) katalysiert wird, verbunden. Dieser Vorgang ist reversibel und wird durch einen Corepressor, die Histon-Deacetylase (HDAC), reguliert (BARNES 2006).
Durch Bindung von NFκB und AP-1 an eine spezifische Region der DNA und nachfolgender Interaktion mit dem Coaktivator cyclisches Adenosinmonophosphat response Element bindendes Protein (CBP) kommt es zur Acetylierung der Histone durch die HAT des CBP und folglich zur Genexpression. Glucocorticoide können nun über mehrere Wege in die Genexpression eingreifen, wobei die wenigsten Gene direkt durch Glucocorticoide reguliert
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werden, sondern eher indirekt über die Steuerung von Coaktivatoren und Transkriptionsfaktoren und z. B. der HDAC (BARNES 2006).
Man unterscheidet bei der Wirkung der Glucocorticoide einen DNA-bindungsabhängigen Mechanismus von einem DNA-bindungsunabhängigen Mechanismus. Beim DNA-bindungs- abhängigen Mechanismus bindet der Glucocorticoid-Rezeptor-Komplex an die GRE der DNA. Dadurch kommt es über eine Rekrutierung von Coaktivatoren (z. B. CBP) zu einer gesteigerten Transkription von antiinflammatorischen Substanzen wie z. B. IκB-α, einem Inhibitor von NFκB, und einem Glucocorticoid induziertes Leucin Zipper Protein (GILZ) oder Lipocortin-1. Letzteres ist in der Lage, die Prostaglandinsynthese und die Leukozytenmigration zu hemmen (FLOWER u. ROTHWELL 1994). Es kann aber auch zu einer Aktivierung der negativen GRE kommen, was vor allem mit Nebenwirkungen von Glucocorticoiden assoziiert wird (Synthese von Osteokalzin und Keratin, gefolgt von Osteoporose, Wachstumsverzögerungen und Hautfragilität).
Ein DNA-bindungsunabhängiger Mechanismus ist durch eine Interaktion mit Transkriptionsfaktoren wie NFκB und AP-1 durch direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen ohne Bindung an die DNA gekennzeichnet. Folglich kommt es zur Hemmung der Gentranskription einiger inflammatorischer Proteine, Zytokine, Enzyme, Adhäsionsmoleküle und Rezeptoren (BARNES 2006; STEINFELDER u. OETJEN 2009). Ein weiterer Wirkungsmechanismus der Glucocorticoide über Membranrezeptoren oder außerhalb des Zellkernes bei hohen Glucocorticoidkonzentrationen wird beschrieben (FERGUSON et al.
2009; STEINFELDER u. OETJEN 2009). In einer Dissertation von STREHL (2011) wurde die Herkunft dieses membranständigen Glucocorticoidrezeptors untersucht und festgestellt, dass er aus dem gleichen humanen Gen codiert wird (NR3C1 Gen) wie der cytosolische Glucocorticoidrezeptor. Erst posttranslational wird er so modifiziert, dass er sich von dem cytosolischen Rezeptor unterscheidet, erkannt und zur Zellmembran für die Verankerung transportiert und eingebaut werden kann (STREHL 2011).
Ein ebenfalls nicht-genomischer Effekt, der innerhalb von Sekunden nach Gabe hoch dosierter Glucocorticoide beobachtet wird, ist die physikochemische Beeinflussung des Kationentransportes an der Membran (SONG u. BUTTGEREIT 2006).
