aus Leishmania donovani (Ross, 1903)
Dissertation
Zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
am Fachbereich der Biologie
der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Universität Hamburg
vorgelegt von
Antje Hombach
aus Hofheim am Taunus
gruppe von PD Dr. Joachim Clos in der Abteilung Parasitologie des Bernhard-Nocht-Instituts für Tropenmedizin durchgeführt.
1. Gutachter: PD Dr. Joachim Clos
Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Parasitologie Bernhard-Nocht-Str. 74, 20359 Hamburg
2. Gutachter: Prof. Dr. Iris Bruchhaus
Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Parasitologie Bernhard-Nocht-Str. 74, 20359 Hamburg
Diese Dissertation ist meinen Eltern gewidmet...
....für großartige Unterstützung!!
Danksagung
Zu allererst möchte ich mich bei Herrn PD Dr. Joachim Clos für die Vergabe des interessanten Themas, die Begutachtung der Arbeit und die hervorragende Betreuung herzlichst bedanken. Lieber Joachim, vielen Dank für deine konstruktive Kritik, deine stetige Diskussionsbereit-schaft, deine Toleranz und Unterstützung. Ich freue mich sehr auf unsere zukünftige Zusam-menarbeit!
Frau Prof. Dr. Iris Bruchhaus danke ich herzlich für die Übernahme des Zweitgutachtens die-ser Arbeit und für ihre Co-Betreuung während der Doktorarbeit.
Ich möchte mich ganz herzlich bei der gesamten AG Leishmaniasis für die tolle Arbeitsatmo-sphäre bedanken. Ein besonderer Dank geht an Frau Dorothea Zander für die Durchführung der qRT-PCR und für ihre große Hilfsbereitschaft in all den Jahren. Des Weiteren möchte ich Frau Anne MacDonald für die Durchführung der Rasterelektronenmikroskopie sowie für ihre Ruhe und Geduld danken. Auch den ehemaligen AG-Mitgliedern Gabi Ommen und Mareike Chrobak möchte ich für die tolle Einarbeitung danken. Ein ganz großer Dank geht auch an die besten Mitdoktorandinnen Eugenia Bifeld und Carola Schäfer. Ihr habt einen frischen Wind in die AG gebracht und es macht mich froh, dass sich aus einem Arbeitsverhältnis eine tolle Freundschaft entwickelt hat. Wir werden bestimmt noch viel Spaß zusammen haben!
Des Weiteren bedanke ich mich bei all denjenigen, die mich während meiner Ausbildung und meines Studiums geprägt und unterstütz haben. In dem Zusammenhang möchte ich mich herzlichst bei Herrn Prof. Dr. Franz Petry bedanken. Ich denke oft an die Zeit in Mainz zurück, die mich in Bezug auf meinen wissenschaftlichen Werdegang positiv beeinflusst hat.
Ohne die liebe Unterstützung meiner Eltern, Geschwister und Freunde wäre das alles nicht möglich gewesen. Ich danke euch aus tiefstem Herzen, dass ihr mich so kennt wie ich bin und dass ich sein darf wie ich bin.
Mein größter Dank gilt dem Menschen, der all meine Launen, Freuden sowie Hochs und Tiefs mit mir teilt. Christoph, ich danke dir für all deine Unterstützung, deine Gelassenheit und dass du das Leben immer mit einem Augenzwinkern siehst. Ich freue mich auf unsere gemeinsame Zukunft und auf all die aufregenden Dinge, die uns noch bevorstehen.
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung! 1
Abstract! 3
1. Einleitung! 5
1.1 Leishmaniose und Verbreitung der Erkrankung! 5
1.2 Der Entwicklungszyklus von Leishmanien! 6
1.2.1 in vitro Stadiendifferenzierung von L. donovani 8
1.3 Das Prinzip der Hitzeschock-Antwort in Leishmanien! 8
1.3.1 Funktion der Hitzeschockproteine bei der Differenzierung des Parasiten 10
1.4 Struktur und Funktion von Hsp90! 11
1.5 Rolle der Co-Chaperone! 12
1.6 Der Hsp90/Co-Chaperonen-Komplex! 13
1.6.1 Die Struktur von Hsp90 und der Aufbau des Multichaperonen-Komplexes in Leishmanien 15
1.7 Die Rolle posttranslationaler Protein-Modifikationen! 18
1.7.1 Phosphorylierung von Hsp90 19
1.7.2 Phosphorylierung von Hsp90 in L. donovani 19
1.8 Interaktion von Hsp90 mit den spezifischen Inhibitoren Geldanamycin und Radicicol! 20 1.8.1 Auswirkungen einer pharmakologischen Inhibition von Hsp90 auf das 22
Wachstum von L.donovani 22
1.8.2 Inhibitor-resistente Hsp90-Varianten 23
1.9 Zielsetzung der Arbeit! 24
2. Material und Methoden! 25
2.1 Material! 25
2.1.1 Chemikalien und Lösungen 25
2.1.2 Geräte und sonstige Materialien 25
2.1.3 Kits 26
2.1.4 Enzyme und Größenstandards 26
2.1.5 Antikörper 26
2.1.6 Vektoren und Oligonukleotide 27
2.1.7 Organismen und Stämme 29
2.1.8 Nähmedien und Antibiotika 30
2.1.9 Häufig verwendete Lösungen und Puffer 31
2.2 Methoden! 31
2.2.1 Zellkultur von Leishmanien! 31
2.2.1.1 Kultivierung von Promastigoten 31
2.2.1.2 Kryokonservierung von Leishmanien 32
2.2.1.5 Fixierung von Zellen auf Objektträgern 33
2.2.1.6 in vitro Infektionsstudien 34
2.2.2 Molekularbiologische Methoden! 36
2.2.2.1 Phosphorylierung von Oligonukleotiden 36
2.2.2.2 Polymerase-Ketternreaktion (PCR) 36
2.2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese 38
2.2.2.4 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Gelen 38
2.2.2.5 Spaltung der DNA durch Restriktionsendonukleasen 38
2.2.2.6 Ligation von DNA-Fragmenten 39
2.2.2.7 Transformation von E. coli 39
2.2.2.8 Isolierung von genomischer DNA aus Leishmanien 40
2.2.2.9 Isolierung von Plasmid-DNA durch alakalische Lyse 40
2.2.2.10 Isolierung hochreiner Plasmid-DNA 41
2.2.2.11 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 42
2.2.2.12 Sequenzierung von DNA 42
2.2.2.13 Semi-quantitative real time PCR (qRT-PCR) 42
2.2.3 Proteinbiochemische Methoden! 43 2.2.3.1 Denaturierender Zellaufschluss 43 2.2.3.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 43 2.2.3.3 Coomassie-Brilliant-Blau Färbung 44 2.2.3.4 Western Blot 44 2.2.3.5 Immunoblot 45 2.2.3.6 GFP Trap M Ko-Immunpräzipitation 45 2.2.4 Mikroskopische Methoden! 46 2.2.4.1 Lichtmikroskopie 46 2.2.4.2 Raster-Elektronenmikroskopie (REM) 46 2.2.4.3 Immunfluoreszenzmikroskopie 47 2.2.5 Datenverarbeitung! 48 2.2.5.1 Bildbearbeitung 48 2.2.5.2 Statistische Auswertung 48
2.2.5.3 Vergleich von Hsp90-Proteinsequenzen 48
3. Ergebnisse! 50
3.1 Herstellung und Analyse einer Radicicol-resistenten Hsp90-Variante in L. donovani! 50
3.1.1 Verifizierung der Hsp90 Transgen-Expression auf mRNA-Ebene 52
3.1.2 Analyse der Wachstumskinetik unter RAD und GA-Selektion 53
3.1.3 Analyse der Zellmorphologie 54
3.1.4 in vitro Infektion von primären Maus-Knochenmarks-Makrophagen 55
3.2 Analyse der Interaktion von Sti1 mit Hsp90 in L. donovani! 57
3.2.1 Ko-Lokalisationsstudie von Sti1, Hsp90 und Hsp70 58
3.2.2 Verifizierung der Genexpression auf mRNA-Ebene 59
3.2.4 Analyse der Zellmorphologie 60
3.2.5 in vitro Infektion von murinen Knochenmarks-Makrophagen 62
3.2.6 Ko-Immunpräzipitation von Sti1 mit Hsp90 65
3.3 Mutationsanalyse putativer Phosphorylierungsstellen! 70
3.3.1 Phänotypische Analyse der P-Stellen an Position T211 und T216 72
3.3.2 Phänotypische Analyse der P-Stelle an Position T223 77
3.3.3 Phänotypische Analyse der P-Stellen an Position S289 und S526 81
3.3.4 Phänotypische Analyse der P-Stellen an Position S594 und S595 85
3.3.5 Zusammenfassung der phänotypischen Analysen putativer P-Stellen 90
4. Diskussion! 93
4.1 Hsp90-ein zentrales Chaperon beteiligt an der Reifung unterschiedlicher Klientenproteine
und somit essentiell für diverse zelluläre Prozesse! 93
4.2 Hsp90 spielt bei der Stadienumwandlung diverser protozooischer Parasiten eine wichtige Rolle und
er-öffnet somit neue therapeutische Möglichkeiten! 93
4.3 Hsp90-ein multi copy-Gen, das bislang nicht durch reverse Genetik untersucht werden konnte! 95
4.4 Etablierung einer RAD-resistenten Hsp90-Variante in L. donovani! 96
4.5 Das Repertoire an Co-Chaperonen ist organismusspezifisch und klientenabhängig! 98 4.5.1 Die Hsp90-Sti1-Interaktion ist entscheidend für die Proliferation beider Parasitenstadien 99 4.5.2 Synthese des konservierten Sti1-Bindungsmotivs führt zu einem Anstieg der extrazellulären und
intrazellu-lären Proliferation 101
4.6 Analysierte Hsp90-P-Stellen aus L. donovani sind teilweise konserviert! 102
4.6.1 Hsp90 aus L. donovani wird stadien-spezifisch phosphoryliert 104
4.6.2 Wie beeinflusst Phosphorylierung die Aktivität von Hsp90? 107
4.7 Ausblick! 108
5. Literaturverzeichnis! 109
6. Anhang! 119
6.1 Abkürzungsverzeichnis! 119
Zusammenfassung
Die Leishmaniose ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit, die häufig mit Armut asso-ziiert ist. Diese Erkrankung wird durch die obligat intrazellulären Protozoen der Gattung
Leishmania (L.) verursacht und von der weiblichen Sandmücke auf verschiedene Säugetiere
und den Menschen übertragen. Im Verlauf ihres parasitären Lebenszyklus passen sich die Pa-rasiten an zwei extrem unterschiedliche Umgebungen an. Diese Umgebungen sind der Darm der Sandmücke sowie das Phagolysosom der Säugetiermakrophagen. Während der Übertra-gung von Leishmanien durch einen poikilothermen Vektor auf einen homoiothermen Wirt er-fährt der Erreger drastische Veränderungen der Umgebungsbedinungen. Der rapide Tempera-turanstieg während der Übertragung induziert die sogenannte Hitzeschock-Antwort, die direkt mit der Stadienumwandlung des Parasiten assoziiert ist. Der Temperaturanstieg in Kombinati-on mit einem sauren pH, wie im Phagolysosom des infizierten Makrophagen, führen in vitro und in vivo zu einer Differenzierung der Promastigote zur pathogenen Amastigote.
Welche molekularen Mechanismen der Stadienumwandlung zu Grunde liegen ist noch weit-gehend unbekannt. Bekannt ist aber, dass im Zusammenhang mit der zellulären Hitzeschock-Antwort die Synthese der Hitzeschockproteine (Hsps) induziert wird. Die pharmakologische Inhibition von Hsp90, eines hoch-abundanten Mitglieds der Hsp-Familien, durch Geld-anamycin (GA) oder Radicicol (RAD) induziert, unabhängig von Veränderungen des Umge-bungsmileus die Stadienumwandlung von L. donovani in amastigoten-ähnliche Zellen. Dies weist auf eine entscheidende Rolle von Hsp90 während der Stadiendifferenzierung des Para-siten hin.
Hsp90 ist ein essentielles, konserviertes und konstitutiv exprimiertes Protein, dass in allen bis-lang untersuchten Organismen an diversen zellulären Prozessen beteiligt ist. Hsp90 ist im Rahmen seiner Eigenschaften als molekulares Chaperon an der Reifung und Aktivierung einer Reihe von regulatorischen Proteinen beteiligt. Während der Reifung von Klientenproteinen in-teragiert Hsp90 mit einer Vielzahl von Co-Faktoren. Zu diesen zählen weitere molekulare Cha-perone, wie Hsp70 und Hsp40, sowie diverse Co-Chaperone (Sti1, p23, Hip, Hop2, Sgt1). Das komplexe Zusammenspiel dieser Proteine bildet den Multichaperonen-Komplex, auch bekannt als Foldosom. Die Feineinstellungen des Multichaperonen-Komplexes wird durch di-verse posttranslationale Modifikationen von Hsp90 selbst oder den beteiligten Co-Chapero-nen reguliert.
Da Hsp90 ein essentielles Protein ist und in Leishmania von bis zu 17 identischen Genkopien kodiert wird, ist ein Genaustausch durch homologe Rekombinantion bislang nicht möglich.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte daher die Etablierung einer RAD-resistenten Hsp90-Varian-te in L. donovani, die es ermöglicht, die Funktion von Hsp90 besser zu charakHsp90-Varian-terisieren. Die RAD-Resistenz basiert auf einem einfachen Aminosäureaustausch in der hoch-konservierten ATP-Bindungstasche von Hsp90. Hierfür wurde das Leucin an Position 33 durch ein Isoleucin ausgetauscht. Es zeigte sich, dass die Synthese der resistenten Hsp90-Variante (Hsp90rr) un-ter RAD-Wirkung die Proliferation der Promastigote, die Promastigoten-Morphologie und die intrazelluläre Proliferation des AmastigotStadiums von L. donovani aufrecht erhält. Das en-dogen-kodierte Protein hingegen wird durch RAD inhibiert, was zum Wachstumsarrest des Parasiten führt.
Die Analyse der Interaktion von Hsp90 mit dem essentiellen Co-Chaperon Sti1 ergab, dass diese wichtig für die Proliferation der Promastigote sowie für die intrazelluläre Vermehrung der Amastigote ist. Das Fehlen des primären Sti1-Bindemotivs am extremen C-Terminus von Hsp90 hat somit erhebliche Auswirkungen auf beide Parasitenstadien. Leishmanien verfügen über ein leicht abgeändertes Sti1-Bindemotiv (N‘ MEQVD-C‘). Ein Glutaminsäure-Austausch an Position Glutamin698 resultierte in der konservierten Bindesequenz für Sti1 (N-‘MEEVD-C‘). Die Synthese des konservierten Bindemotivs unterstützt die Proliferation der Promasti-gote sowie die intrazelluläre Vermehrung der AmastiPromasti-gote und hat somit keine negativen Aus-wirkungen auf beide Parasitenstadien. Warum Leishmanien über ein leicht verändertes Sti1-Bindemotiv verfügen ist bislang unklar.
In der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich die Rolle von sieben identifizierten Phosphorylie-rungsstellen (P-Stellen) in der Hsp90-Sequenz aus L. donovani untersucht. Hierfür wurden die phosphorylierbaren Aminosäuren in der Hsp90rr-Sequenz durch Alanine ersetzt, was eine Dephosphorylierung imitiert. Durch diese Untersuchung konnten zwei amastigoten-spezifi-sche P-Stellen identifiziert werden, von denen eine dieser beiden Stellen für Leishmania-Hsp90 spezifisch ist. Welche Kinasen an der Leishmania-Hsp90-Phosphorylierung in L. donovani beteiligt sind ist bislang noch unbekannt. Dennoch deuten die in dieser Arbeit gewonnen Daten auf eine direkte Verbindung von Signaltransduktionswegen und dem Chaperonensystem in Leishmanien hin.
Die Etablierung einer RAD-resistenten Hsp90-Varianten in L. donovani und die dadurch be-reits gewonnenen Erkenntnisse eröffnen nun die Möglichkeit, die komplexe Rolle von Hsp90 während der Stadiendifferenzierung des Parasiten besser zu verstehen.
Abstract
Leishmaniasis is a poverty-related infectious disease with worldwide impact. It is caused by obligate intracellular parasitic protozoa of the genus Leishmania (L.) that are transmitted to the mammalian host via female sandflies. In the course of their parasitic life cycle, the parasites encounter two very extreme environments - the gut of the sandfly and the phagolysosome of mammalian macrophages. During the transmission of Leishmania spp from a poikilothermic insect vector to a homoeothermic mammalian host the parasite encounter a significant in-crease of ambient temperature. The inin-crease in temperature induces a heat stress response that is directly associated with the stage differentiation of the parasite. This temperature in-crease combined with the acidic mileu in the phagolysosomes of infected macrophages indu-ces the conversion from the promastigote stage to the pathogenic amastigote stage, but also the synthesis of heat shock proteins (Hsps).
Only limited information exists about the molecular mechanisms that regulate this stage con-version. Pharmacological inhibiton of Hsp90, an abundant member of the Hsp family, with geldanamycine (GA) or radicicol (RAD) mimics the environmental signals and induces conver-sion into amastigote-like cells. This indicates a crucial role for Hsp90 during stage converconver-sion of the parasite.
Hsp90 is an essential, conserved and constitutively expressed chaperone that is involved in a variety of cellular processes in all studied organisms. In the context of its capacity as a mole-cular chaperone Hsp90 is associated with the maturation and activation of a variety of sig-nalling client proteins. During the maturation of clients, Hsp90 interacts with a varity of co-fac-tors. These co-factors include other members of the Hsp-family, like Hsp70 and Hsp40, and co-chaperones (Sti1, p23, Hip, Hop2, Sgt1). The complex interplay of these proteins assem-bels the multi-chaperone-complex, the so called foldosome. The fine-tuning of the multi-cha-perone-complex is regulated by posttranslational modifications. These modifications can occur directly on Hsp90 or indirectly on co-chaperones.
The essential nature of Hsp90 and the large gene copy number in Leishmania have precluded an analysis of this important protein by gene replacement strategies.
To remedy this, a RAD-resistant Hsp90-variant in L. donovani was established in this work. This allowed to assess the function of Hsp90 in more detail. The RAD-resistance is caused by a simple leucine to isoleucine amino acid substitution at position 33 in the highly conserved ATP-binding pocket of Hsp90. The synthesis of the RAD-resistant Hsp90-variant (Hsp90rr) allows proliferation of the promastigote stage, maintanace of promastigote morphology and
intracellular survival of the amastigote stage of L. donovani under RAD inhibition where the endogenously encoded protein is inhibited by RAD.
The analysis of the Hsp90-Sti1 interaction showed that this interaction is crucial for both life cycle stages. The deletion of the Sti1 recognition motif a the extrem C-terminus of Hsp90 had substantial consequences on both parasite stages. In Leishmania-Hsp90, the Sti1 binding site (N‘-MEEVD-C‘) bears a variation from the canonical pentapeptide sequence (N‘-MEQVD-C‘). Introduction of the standard N‘-MEEVD-C‘ pentapeptide led to a sligthly increased in vitro growth and infectivity. The implications of this apparently suboptimal Sti1 recongnition motif are so far unknown.
The system also allows to analyse the importance of seven phosphorylation sites (P-sites) in Hsp90. For this approach the serine or threonine moieties of P-sites were replaced by alani-nes, thereby mimicking dephosphorylation. Two P-sites of Hsp90 are phosphorylated in an amastigote-specific manner, of which one P-site is specific for Leishmania-Hsp90. The kina-ses that phosphorylate Hsp90 in L. donovani are so far unknown, however gathered datae indicate that there is a crucial link between signal transduction pathways and the Leishmania chaperone system.
The newly established Hsp90rr inhibition/complementation system will allow further studies aimed at understanding the complex role of Hsp90 during stage conversion of Leishmania.
1. Einleitung
1.1 Leishmaniose und Verbreitung der Erkrankung
Die Leishmaniose ist eine Infektionskrankheit, die von obligat intrazellulären Protozoen der Gattung Leishmania (L.) verursacht wird. Diese Organismen sind trypanosomatide Flagellaten der Ordnung Kinetoplastidae (Young et al., 1987). Namensgebendes Merkmal dieser Orga-nismen ist der Kinetoplast. Dieser stellt einen Abschnitt des einzigen in der Zelle vorkommen-de Mitochondriums dar und enthält 15% vorkommen-der zellulären DNA. Die Erreger wervorkommen-den von weibli-chen Sandmücken der Gattungen Lutzomyia und Phlebotomus auf verschiedene Säugetiere und den Menschen übertragen.
Die Krankheit zählt zu den vernachlässigten tropischen Infektionskrankheiten und ist häufig mit Armut assoziiert (Murray et al., 2005). Die Leishmaniose wird in drei klinische Manifestati-onen kategorisiert, wobei zwischen kutaner, mukokutaner oder viszeraler Leishmaniose unter-schieden wird. Welche klinische Ausprägung der Erkrankung sich manifestiert, ist abhängig von der Leishmania-Art. Zusätzlich beeinflussen Pathogenität und Virulenz des Erregers, so-wie Wirtsfaktoren, so-wie z.B. der Immunstatus der infizierten Person, die Ausprägung. So tritt die viszerale Leishmaniose auch als opportunistische Erkrankung bei HIV-Infektion auf (Mur-ray et al., 2005).
Bei der kutanen Leishmaniose (“Orientbeule“) und der mukokutanen Leishmaniose (span. Espundia) handelt es sich um Zoonosen, d.h. Tier zu Mensch übertragbare Erkrankung, oder Anthroponosen, d.h. um eine Infektionskrankheit, bei der der Mensch den natürlichen Wirt darstellt. Die kutane Leishmaniose wird unter anderem von den Leishmania-Arten L. major und L. tropica verursacht und ist überwiegend im Mittleren Osten, mediterranen Mittelmeer-raum und Afrika verbreitet. Im Verlauf der kutanen Leishmaniose entsteht an der Einstichstelle eine Papula, die sich mit der Zeit vergrößert und in einer ulzerierenden Läsion enden kann. Diese Form der Leishmaniose heilt meistens nach einer gewissen Zeit von selbst, wobei die geheilte Person eine lebenslange Immunität gegenüber der Leishmania-Art, die die Infektion verursacht hat, erwirbt. Dennoch gelten geheilte Personen, aufgrund der Erregerpersistenz im Narbengewebe, als potentielle Überträger der Krankheit (David und Craft, 2009; Herwaldt, 1999; Murray et al., 2005). Die mukokutane Leishmaniose wird überwiegend von den Leishmania-Arten des L. braziliensis (viannia)-Komplexes verursacht. Diese Form der Leishmaniose tritt hauptsächlich in Lateinamerika auf. Die mukokutanen Ausprägung ist ge-kennzeichnet durch eine destruktive Entzündung des Nasen-Rachen-Raums, die häufig mit
bakteriellen Sekundärinfektionen assoziiert ist. Unbehandelt kann diese Form der Leishmani-ose lebensgefährlich für den Patienten werden (David und Craft, 2009; Herwaldt, 1999; Mur-ray et al., 2005). Die viszerale Leishmaniose (auch Kala-Azar) ist in Indien, Bangladesch, Ne-pal, Ostafrika aber auch im mediterranen Mittelmeerraum verbreitet und wird von L. donovani oder L. infantum verursacht. Bei einer Infektion mit L. donovani handelt es sich um eine Anth-roponose. L. infantum wird hingegen als Zoonose übertragen (Erregerreservoir ist der Hund, aber auch andere Säuger) und verursacht überwiegend die kanine Leishmaniose. Eine Infekti-on mit den genannten Erregern verursacht folgende Symptome: Müdigkeit, Fieber, Anorexie, Gewichtsverlust sowie starke Vergrößerung von Milz und Leber (Hepato/Splenomegalie). Wird eine viszerale Leishmaniose nicht behandelt, führt diese Erkrankung in 90% der Fälle zum Tod des Patienten (Chappuis et al., 2007; Herwaldt, 1999; Murray et al., 2005).
Bislang gibt es keine verlässlichen Therapien, die zur kompletten Eliminierung des Erregers und somit zur vollständigen Heilung des Patienten führen. Die vorhandenen Medikamente, wie Pentamidin, Antimon, Miltefosin, liposomales Amphotericin B, sind häufig mit starken Ne-benwirkungen und/oder hohen Kosten assoziiert. Eine wachsende Problematik bei der Be-handlung der Leishmaniose stellt auch die Zunahme an resistenten Leishmania-Stämmen dar, was die Entwicklung neuer und effizienter Therapien unumgänglich macht. Insgesamt ist die Leishmaniose in 98 Ländern auf 5 Kontinenten endemisch und umfasst ca. 350 Millionen infi-zierte Personen weltweit (Alvar et al., 2012).
1.2 Der Entwicklungszyklus von Leishmanien
1903 beschrieben W.B. Leishman und C. Donovan unabhängig voneinander erstmals die pro-tozooischen Erreger und waren namensgebend für diese Parasitenart (Fulton und Joyner, 1949).
Leishmanien durchlaufen einen biphasischen Entwicklungszyklus, bestehend aus der extra-zellulären, infektiösen promastigoten Form und der intraextra-zellulären, pathogenen amastigoten Form. Die promastigote Form besitzt einen länglichen Zellkörper und eine lange, bewegliche Geißel. Die amastigote Form hingegen weist eine ovale Zellform und eine stark verkürzte Gei-ßel auf. Der Entwicklungszyklus beginnt, wenn während der Blutmahlzeit einer infizierten Sandmücke teilungsunfähige und hoch-infektiöse, metazyklische promastigote Zellen in die Haut des Wirtsorganismus injiziert werden. Hier sind die promastigoten Zellen phagozytieren-den Gewebszellen, Blutzellen und dem Komplementsystem des Wirts ausgesetzt.
Der Erreger wird anschließend von mononukleären Zellen (Makrophagen, Monozyten), dendri-tischen Zellen oder neutrophilen Granulozyten aufgenommen, wobei die Vermehrung der amastigoten Form ausschließlich in mononukleären Zellen erfolgt (Kaye und Scott, 2011; Mat-lashewski, 2001). Innerhalb der Wirtszelle werden die phagozytierten Parasiten vom Phago-lysosom, bestehend aus Phagosom fusioniert mit Endosomen und Lysosomen, umhüllt und wandeln sich in 2-5 Tagen in die amastigote Zellform um. Diese vermehrt sich durch longitu-dinaler Teilung, was schließlich zur Lyse der Wirtszelle und zur Freisetzung der Erreger führt. Dieser wiederum kann neue Zellen infizieren. Im Blut infizierter Personen befinden sich freige-setzte Parasiten und infizierte Zellen (Murray et al., 2005), die bei einer weiteren Blutmahlzeit einer Sandmücke auf diese übertragen werden. Im Dünndarm der Mücke differenzieren die aufgenommenen oder freigesetzten amastigoten Zellen innerhalb von 24 Stunden in prozykli-sche promastigote Zellen. Die prozykliprozykli-schen Zellen assoziieren über das Hauptoberflächen-molekül promastigoter Leishmanien, das Lipophosphoglykan (LPG), mit dem Microvillisaum des Dünndarmepithels und verhindern somit ein Ausscheiden über den Enddarm (Dillon und Lane, 1999; Matlashewski, 2001). Diese nicht-infektiösen Stadien differenzieren in die für Säugetiere hoch-infektiöse, metazyklische Form, wodurch sie ihre Fähigkeit zum Anheften im Darm verlieren (Sacks et al., 2000). Anschließend wandern die metazyklischen Zellen aktiv in die Mundregion der Mücke, von wo sie bei der nächsten Blutmahlzeit wieder übertragen wer-den (Matlashewski, 2001). prozyklische! Promastigote metazyklische! Promastigote Biss der ! Sandmücke Biss der ! Sandmücke Anlagerung Makrophage Phagozytose Phagolysosom intrazelluläre Amastigote Teilung und! Vermehrung Zelllyse Amastigote
Abb 1: Schematische Darstellung des biphasi-schen Lebenszyklus von Leishmanien
Promastigote Leishmanien werden während der Blutmahlzeit einer infizierten Sandmücke in die Haut des Wirtsorganismus injiziert. Dort werden sie von den Wirtszellen aufgenommen, wandeln sich im Pha-golysosom der Zellen zur amastigoten Form um und vermehren sich. Die starke Vermehrung führt zur Lyse der Wirtszelle, wodurch die Parasiten freigesetzt wer-den und anschließend neue Zellen infizieren. Der Le-benszyklus schließt sich, wenn eine Sandmücke erneut amastigote Zellen aufnimmt und diese sich im Dünndarm der Mücke zu infektiösen promastigoten Zellen differenzieren. (modifiziert nach Kaye und Scott, 2011)
1.2.1 in vitro Stadiendifferenzierung von L. donovani
Die Stadiendifferenzierung von der promastigoten Form in die amastigote Form wird durch zwei wesentlichen Faktoren induziert. Erstens stellt die Übertragung des Erregers von einem poikilothermen Vektor auf einen homoiothermen Wirt eine drastische Erhöhung der Umge-bungstemperatur dar, was die sogenannte Hitzeschock-Antwort induziert. Zweitens liegt der pH-Wert im Phagolysosom infizierter Makrophagen im sauren Bereich. Der pH-Wert im Dünn-darm der Sandmücke hingegen ist schätzungsweise leicht basisch (Zilberstein und Shapira, 1994). Erhöhte Temperatur kombiniert mit niedrigem pH-Wert induzieren die Stadienumwand-lung, wodurch sich der Parasit an das Leben im Wirtsorganismus anpasst und somit ein Ü-berleben unter anderen Bedingungen ermöglicht wird (Ommen und Clos, 2009). Es konnte aber auch gezeigt werden, dass allein die Erhöhung der Umgebungstemperatur für die Sta-dienumwandlung von L. mexicana ausreicht (Bates et al., 1992) und die Amastigotendifferen-zierung von L. infantum beeinflusst (Alcolea et al., 2010).
Die Stadiendifferenzierung kann auch in vitro in axenischer (wirtsfreier) Form imitiert und indu-ziert werden. Hierfür wird der Differenzierungsprozess von L. donovani durch einen Hitze-schock mit anschließender Ansäuerung des Kulturmediums induziert. Nach 3-5 Tagen bei er-höhter Temperatur und saurem pH ist die Umwandlung abgeschlossen (Ommen und Clos, 2009; Saar et al., 1998). Die Stadienumwandlung ist durch Kultivierung der amastigoten Zellen unter Bedingungen der Promastigote (25°C, pH 7.0) reversibel.
Das Modell der axenischen Amastigote ist für zellbiologische, biochemische und pharmako-logische Untersuchungen des Säugetierstadiums von großer Bedeutung. Dennoch konnte belegt werden, dass sich die in vitro differenzierten Amastigoten stark von den aus Tiermodel-len gewonnen Amastigoten unterscheiden (Pescher et al., 2011).
1.3 Das Prinzip der Hitzeschock-Antwort in Leishmanien
Die Hitzeschock-Antwort ist eine universelle Schutzreaktion von Zellen auf abrupte Tempera-turerhöhung, die zu einer verstärkten Synthese von Hitzeschockproteinen (Hsps) führt. Weite-re StWeite-ressfaktoWeite-ren sind z.B. Chemikalien, Schwermetallionen, niedriger pH und oxidativer Stress (Morimoto, 1990; Vonlaufen et al., 2008). Die Synthese von Hitzeschockproteinen ist eine schnelle und effiziente Antwort der Zelle auf die oben genannten Stressoren und wird auf Ebenen der mRNA-Synthese, mRNA-Stabilität und Translation reguliert.
Hitzeschockproteine sind hoch konserviert, ubiqitär und in allen Zellarten und Organismen präsent. Entsprechend ihrer molekularen Masse und ihrer Primärstruktur werden sie in ver-schiedene Familien eingeteilt. Es wird zwischen folgenden Hsp-Familien unterschieden: Hsp110, Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40, Hsp10 und weitere kleine Hsps (Feder und Hofmann, 1999; Smith et al., 1998). Die verschiedenen Hsp-Familien sind untereinander so-wohl in ihrer Funktion, Lokalisation als auch strukturell nicht verwandt. Funktionell können sich die einzelnen Hitzeschockproteine zwischen verschieden Organismen unterscheiden (Feder und Hofmann, 1999).
Die Rolle der Hitzeschockproteine unter Stress besteht darin, Anhäufung von denaturierten Proteinen zu verhindern und somit die Proteinhomöostase der Zelle aufrecht zu erhalten. In den zellulären Stresssituationen stabilisieren Hitzeschockproteine andere Proteine, um sie vor Denaturierung zu bewahren, beschleunigen den Abbau von irreversibel denaturierten Protei-nen und beugen der Aggregation denaturierter Proteine vor. Des Weiteren unterstützen Hitze-schockproteine die korrekte Rückfaltung von Proteinen, wobei deren Aktivität und Struktur wieder hergestellt wird (Bukau et al., 2006; Feder und Hofmann, 1999; Mayer und Bukau, 1999). Unter physiologischen Bedingungen besitzen Hitzeschockproteine Chaperonenaktivi-tät. Das bedeutet, dass sie an der Reifung, Faltung, Translokation und Abbau von diversen Klientenproteinen beteiligt sind (Bukau et al., 2006; Picard, 2002).
In Leishmania induziert die Hitzeschock-Antwort eine verstärkte Synthese von Hitze-schockproteinen, wobei die Synthese nur durch Temperaturerhöhung und nicht, wie bei ande-ren Organismen, durch chemische Stressoande-ren verstärkt wird (Clos et al., 1998).
Das Promastigotenstadium von Leishmanien weist bereits unter stressfreien Bedingungen ein hohes Niveau bestimmter Hitzeschockproteine auf. Zu diesen zählen Hsp70 mit einem Anteil von 2,1% und Hsp90 mit einem Anteil von 2,8% am Gesamtprotein der promastigoten Zelle. Hsp70 und Hsp90 werden nach Temperaturanstieg vermehrt synthetisiert. Dennoch führt die hitzeinduzierte Synthese, aufgrund des ohnehin schon hohen Proteingehalts, nicht zu einem wesentlichen Anstieg des Proteinniveaus (Brandau et al., 1995). Hsp100/ClpB hingegen ist nur nach Temperaturanstieg nachweisbar, was auf eine relevante Funktion des Proteins in der Amastigote schließen lässt. Die weitere Synthese von Hsp100 verläuft bei hoher Temperatur konstitutiv (Brandau et al., 1995; Ommen und Clos, 2009). In L. donovani konnten zwei Hsp60-Genfamilien (CPN60.1, CPN 60.2) identifiziert werden. Die Abundanz von CPN60.2 steigt unter Hitzestress und in axenischen Amastigoten um das 2,5-fache. Hingegen ist die Expression von CPN60.1 in der Promastigote nicht nachweisbar (Schluter et al., 2000).
Die kleinen Hitzeschockproteine weisen die geringste Struktur- und Sequenzhomologie auf. Dennoch besitzen alle kleinen Hitzeschockproteine eine α-Crystallin-Domäne, die wahr-scheinlich für die Oligomersierung, stressinduzierte Chaperonenaktivität und die Vermeidung von unerwünschten Proteinaggregaten verantwortlich ist (Haslbeck et al., 2005). Über die kleinen Hitzeschockproteine in Leishmania ist bislang wenig bekannt (Folgueira und Requena, 2007). In L. mexicana panamensis konnte nach Hitzestress eine erhöhte Synthese von einigen kleinen Proteinen (22-27 kDa) festgestellt werden (Hunter et al., 1984).
Die Regulation der Hitzeschockantwort in Leishmania und anderen Kinetoplastida findet aus-schließlich auf posttranslationaler Ebene statt (Argaman et al., 1994; Brandau et al., 1995).
1.3.1 Funktion der Hitzeschockproteine bei der Differenzierung des Parasiten
Die Hitzeschockantwort, resultierend aus dem abrupten Temperaturanstieg während der Übertragung des Erregers, ist Teil des Entwicklungszyklus des Parasiten und kann daher als einleitendes Signal für den Differenzierungsprozess verstanden werden. Bei diesem Prozess weisen vor allem die Proteine Hsp100 und Hsp90 eine antagonistische Rollenverteilung auf. Hsp100/ClpB ist für die Aufrechterhaltung der intrazellulären amastigoten Form und die Ex-pression der Amastigoten-spezifischen Stressproteine der A2-Familie von essentieller Bedeu-tung. Hsp100 ist ein single copy Gen und konnte daher einer Analyse durch homologe Re-kombination unterzogen werden (Hubel et al., 1995; Hubel et al., 1997). Die Analyse von L.
donovani Hsp100-Nullmutanten ergab, dass das Fehlen von Hsp100 keine Auswirkungen auf
das Promastigotenstadium hat und diese sich in lebensfähige axenische amastigote Zellen umwandeln lassen. Die Nullmutanten waren dennoch nicht in der Lage Makrophagen zu infi-zieren, was Hsp100 zum einem zentralen Virulenzfaktor des Erreger macht (Krobitsch und Clos, 1999). Auch in L. major ist Hsp100 von kritischer Bedeutung für die Infektion von ex vivo Makrophagen, aber auch im in vivo Maus-Modell (Hubel et al., 1997)
Hsp90 hingegen ist für die schnelle Proliferation des Insektenstadiums und speziell während der Stadiendifferenzierung von Bedeutung. Pharmakologische Inhibition von Hsp90 mit den spezifischen Inhibitoren Geldanamycin (GA) und Radicicol (RAD) führt in L. donovani zu einem Anstieg der Hsp-Synthese, zu einem drastischen Wachstumsarrest in der G2-Phase des Zell-zykluses, der Expression von A2-Proteinen und zu einer amastigoten-ähnlichen Morphologie der Zellen (Wiesgigl, 2002; Wiesgigl und Clos, 2001).
Zusammengefasst lässt sich sagen, dass das Fehlen von Hsp100 die Umwandlung von der Ama- zur Promastigote beschleunigt und somit für die Stabilisierung des intrazellulären
ums von Bedeutung ist. Hsp90, bzw. seine Homöostase innerhalb der Zelle, hingegen, spielt eine zentrale Rolle bei der Differenzierung der Leishmanien von der Pro- zur Amastigote.
1.4 Struktur und Funktion von Hsp90
Die 90 kDa-großen Hitzeschockproteine (Hsp90) sind eine weit verbreitete Familie molekularer Chaperone, die in Bakterien, ausser den Archaebakterien, und in allen Eukaryonten vorkom-men. Viele Eukaryonten besitzen mehrere Hsp90-Homologe. Diese unterscheiden sich in ihrer subzellulären Lokalisation, ihrer Struktur und ihrer Spezifität gegenüber Klientenproteinen. Iso-formen von Hsp90 lokalisieren im Zytosol (Hsp90α und Hsp90β), im endoplasmatischen Reti-kulum (glucose regulated protein, Grp94) und im Mitochondrium bzw. im Chloroplasten (tumor
necrosis factor receptor assocciated protein, TRAP1) der Zelle (Chen et al., 2006). Ein weiteres
Mitglied der Familie ist das bakterielle HtpG. Phylogenetische Analysen der Hsp90-Sequenzen weisen darauf hin, dass das zytosolische Hsp90 und Grp94 von paralogen Genen kodiert werden, die durch Duplikation früh in der Evolution von Eukaryonten entstanden sind (Gupta, 1995). Das menschliche Genom verfügt über insgesamt 17 Gene, die Mitglieder der Hsp90-Familie kodieren (Chen et al., 2005). Die Menge an kodierenden Genen unterstreicht die Relevanz der Hsp90-Mitglieder als molekulare Chaperone im menschlichen Organismus. Die Hsp90-Isoformen werden aufgrund ihrer ATPase-Aktivität und Aufbau der ATP-Bindungs-tasche in die Familie der GHKL-ATPasen eingeordnet (Bergerat et al., 1997; Dutta und Inouye, 2000). Eukaryontisches Hsp90 ist für die Lebensfähigkeit unter allen Bedingungen (physiolo-gisch und Stress) essentiell. Hingegen ist das bakterielle Homolog, HtpG, unter Stressbedin-gungen nicht von Bedeutung.
Das native Protein ist ein Heterodimer, das unterschiedliche Konformationen einnimmt. Ver-gleichende Sequenzanalysen und der proteolytische Verdau von Hsp90 ergaben, dass das Protein strukturell in drei Domänen eingeteilt werden kann. Die ca. 25 kDa-große N-terminale Domäne (N-Domäne) enthält die ATP-Bindungstasche (Panaretou et al., 1998). Alle Hsp90- Isoformen besitzen ATPase-Aktivität, welche essentiell für die Funktion von Hsp90 ist (Panare-tou et al., 1998; Pearl und Prodromou, 2006). Die middle-Domäne (M-Domäne) ist speziell für die Interaktion mit Klientenproteinen, die von Hsp90 gebunden werden, von Bedeutung. N- und M-Domäne werden durch eine charged linker Region getrennt. Dieser Abschnitt besteht überwiegend aus sauren und basischen Aminosäuren und variiert stark in Länge und Se-quenzhomologie zwischen unterschiedlichen Organismen. Die charged linker Region von
Hsp90 ist für die Lebensfähigkeit von Hefezellen unwichtig (Louvion et al., 1996) und verleiht Hsp90 eine stärkere Affinität zu denaturierten Proteinen (Scheibel et al., 1999). An der C-ter-minalen Domäne (C-Domäne) erfolgt die Dimerisierung der Hsp90-Monomere, die essentiell für die Aktivität des Proteins ist. Des Weiteren befindet sich am C-Terminus ein Bindemotiv, das für die Interaktion mit bestimmten Co-Chaperonen (siehe 1.5) wichtig ist.
Hsp90 weist im Gegensatz zu anderen Chaperonen eine hohe Substratspezifität auf und ist an der Faltung und Reifung diverser Klientenproteine beteiligt. In den letzten Jahrzehnten konnten über 200 Hsp90-abhängige Klientenproteine identifizierte werden (siehe http://www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors.pdf). Zu diesen zählen unter anderem On-kogene (p53, Raf-1, erbB2), Kinasen , Transkriptionsfaktoren (HSF-1), Steroidhormon-Rezep-toren, sowie die Strukturproteine Aktin und Tubulin (Ochel et al., 2001; Picard, 2002) Die Hsp90-abhängigen Klientenproteine sind an vielen entscheidenden physiologischen Ereignis-sen beteiligt, z.B. spielen diese eine Rolle bei der zellulären Signaltransduktion sowie bei der Kontrolle des Zellzyklus und der Transkription (Buchner, 1999; Nathan und Lindquist, 1995; Pratt und Toft, 2003; Sanchez et al., 1987).
Die bislang bekannten Klientenproteine von Hsp90 unterscheiden sich stark in ihrer Struktur und Größe. Selbst die Reifung von funktionell-ähnlichen Proteinen mit hoher Sequenzhomo-logie, wird unterschiedlich von Hsp90 beeinflusst. Welche Merkmale die hohe Substratspezifi-tät des Chaperons ausmachen, sind bislang unbekannt. Neben der Reifung, Faltung und Mo-difikation von spezifischen Substratproteinen, bindet Hsp90 auch unspezifisch denaturierte Proteinen (Pearl und Prodromou, 2006).
1.5 Rolle der Co-Chaperone
Um die Aktivierung und Reifung von Klientenproteinen zu gewährleisten, werden molekulare Chaperone durch eine Anzahl von Partnerproteinen, den so genannten Co-Chaperonen, regu-liert und koordiniert. Co-Chaperone sind in der Lage die ATPase-Aktivität sowie die Interaktion von Hsp90 mit Klientenproteine und mit anderen Chaperonen direkt oder indirekt zu beein-flussen.
Die Proteine Sti1 (stress inducible Protein 1), PP5 (Serin-Threonin Phosphatase), Sgt1 (small
glutamin-rich Protein 1) und weitere, zählen zu den Co-Chaperonen, die ein oder mehrere
TPR (tetratrico-peptide repeat)-Motive besitzen. Diese Proteine binden mit der TPR-Domäne an das N‘-MEEVD-C‘ Motiv am extremen C-Terminus von Hsp90. Einige dieser Proteine
bieren die ATPase Aktivität von Hsp90, koordinieren den Transfer von Klientenproteinen oder stabilisieren den Hsp90/Klientenprotein-Komplex (Johnson und Brown, 2009; Scheufler et al., 2000; Schmid et al., 2012). Andere Co-Chaperone wiederum katalysieren die ATP-Bindung und Hydrolyse (Aha1, p23) oder vermitteln die Substratübertragung (Cdc37). Somit haben Co-Chaperone einen bedeutenden Einfluss auf die Spezifität der Co-Chaperonenaktivität, Regulation der ATPase-Aktivität und Koordination des Multichaperonen-Komplexes (Felts und Toft, 2003; Johnson und Brown, 2009; Prodromou, 2012).
Die Anzahl der vorhandenen Hsp90-relevanten Co-Chaperone variiert und es gibt keinen Or-ganismus der über das komplette Repertoire an Co-Chaperonen verfügt (Johnson und Brown, 2009). Dies deutet darauf hin, das Co-Chaperone organismus- und klientenprotein-spezifisch sind und sich das Hsp90-System im Laufe der Evolution an die unterschiedlichen Lebensbedingungen eines Organismus angepasst hat.
1.6 Der Hsp90/Co-Chaperonen-Komplex
Das Zusammenspiel von Hsp90 mit einer Vielzahl von Co-Chaperonen ist für die Reifung der Klientenproteine und somit für das Überleben von Zellen und Organismen essentiell.
Die Aktivierung und Reifung der Substratproteine ist abhängig von der Bindung und Hydroly-se von ATP, was entscheidend für die Funktion von Hsp90 ist. Die HydrolyHydroly-se führt zu einer Konformationsänderung des Proteins in dem dynamischen Hsp90-ATPase-Zyklus, der wie-derum mit dem Hsp70-ATPase-Zyklus und diversen Co-Chaperonen interagiert. Ein klassi-sches Beispiel für das Zusammenspiel des Multichaperonen-Komplexes ist die Reifung von Steroidhormon-Rezeptoren. Hsp90 stabilisiert hierbei den Rezeptor so, dass dieser jederzeit durch die Bindung eines Hormons aktiviert werden kann und dadurch vom Hsp90-Komplex dissoziiert (Dittmar und Pratt, 1997; Murphy et al., 2003; Pratt et al., 2004). In Abb 2 ist ein Modell des Hsp90-ATPase-Zyklus vereinfacht und schematisch dargestellt.
Abb 2: Modell des Hsp90/Co-Chaperonen-Zyklus
Der Hsp90-Zyklus beginnt, wenn ein Sti1-Molekül gleichzeitig an den extremen C-Terminus von Hsp70 und Hsp90 bindet und somit eine Verbindung zwischen diesen Chaperonen herstellt. Sti1 inhibiert die ATPase-Aktivität von Hsp90, was die offene Kon-formation des Chaperons stabilisiert. Das ungebundene Hsp90-Monomer kann von dem Enzym PPlase gebunden werden, wodurch ein asymmetrischer Komplex entsteht. Nach Übertragung des Substratproteins von Hsp70 auf Hsp90 und anschlie-ßender Bindung von ATP dissoziiert der Sti1/Hsp70-Komplex vom Komplex. Der Hsp90/Klientenprotein-Komplex wird durch p23 stabilisiert und nach ATP-Hydrolyse werden alle Komponenten (p23, gereiftes Klientenprotein) freige-setzt. Der Zyklus ist repetitiv. (modifiziert nach Li J. et al., 2011)
Der Hsp90-Zyklus beginnt, wenn das Adapter-Protein Sti1 ein Hsp90-Monomer und gleich-zeitig Hsp70 bindet. Somit wird eine Interaktion der beiden Chaperone hergestellt. Die noch freie TPR-Bindestelle des ungebundenen Hsp90-Monomers wird vorzugsweise von dem En-zym Prolylisomerase (PPlase) gebunden, wodurch ein asymmetrischer Hsp90-Komplex ent-steht. Sti1 inhibiert die ATPase-Aktivität von Hsp90, was die offene substratungebundene Konformation aufrecht erhält (Prodromou et al., 1999). Nach Ausbildung des Hsp90/Hsp70-Klienten-Komplexes werden die Klientenproteine von Hsp70 auf Hsp90 übertragen. Nach an-schließender ATP-Bindung nimmt Hsp90 eine geschlossen Konformation ein, die durch die Bindung von p23 stabilisiert wird. Diese Reaktion schwächt die Assoziation von Hsp90 mit Sti1, was dazu führt, dass Sti1 mitsamt der Hsp70 Maschinerie von dem Komplex dissoziiert. Potenziell kann dann ein weiteres PPlase-Molekül an den finalen Komplex binden. Anschlie-ßend erfolgt die Hydrolyse von ATP, was zur Freisetzung von p23 und dem gereiften Klienten-protein führt. Hsp90 nimmt wieder die geöffnete Ausgangsposition ein und kann sich nachfol-gend an der Reifung eines weiteren Klientenproteins beteiligen (Li et al., 2011).
1.6.1 Die Struktur von Hsp90 und der Aufbau des Multichaperonen-Komplexes in Leishmanien
Eine funktionelle und strukturelle Analyse von Hsp90 aus L. braziliensis (L.b.) ergab, dass das Protein ähnlich aufgebaut ist, wie das bereits gut charakterisierte Hsp90-Molekül aus
S. cerevisae (Silva et al., 2013). Der Sequenzvergleich von Hsp90 aus L.b. zeigte, dass das
Protein innerhalb der Leishmania-Arten hoch konserviert ist und eine 93%ige Sequenzidenti-tät mit den Hsp90-Homologen aus L. major und L. donovani aufweist. Eine 85%ige Sequenz-identität besteht zwischen Hsp90 aus L.b. und den Orthologen aus Trypanosoma cruzi und
Trypanosoma brucei, sowie eine 63%ige Sequenzübereinstimmung mit dem humanen
Hsp90α und dem Ortholog aus S. cerevisae (Ivens et al., 2005). Somit verfügt Hsp90 aus Leishmanien über eine starke Sequenzhomologie mit Hsp90-Molekülen aus anderen eukary-ontischen Organismen. Hsp90 aus L.b. besteht, wie alle Hsp90-Formen, aus einer N-termina-len Domäne (ATP-Bindung), einer middle-Domäne (Interaktion mit Klientenproteinen) und ei-ner C-terminalen Domäne (Dimerisierung). Die N-terminale Domäne und die middle-Domäne werden durch die charged linker region getrennt, die in L. braziliensis und den Trypanosomati-den verkürzt ist. Dieser Hsp90-Abschnitt ist für die Interaktion mit Co-Chaperonen und Klien-tenproteinen wichtig. Zusätzlich beeinflusst die Länge dieser Region die ATPase-Aktivität des Proteins (Hainzl et al., 2009). Für Hsp90 aus Plasmodium falciparum konnte gezeigt werden, dass das Protein über eine verlängerte charged linker region und gleichzeitig über eine hyper-aktive ATPase-Aktivität verfügt (Pallavi et al., 2010). Für Hsp90 aus L.b. konnte eine geringe ATPase-Aktivität festgestellt werden (kkat=0.320 min-1). Diese ist aber vergleichbar mit der
Hsp90-ATPase-Aktivität aus anderen Organismen. Die ATPase-Aktivität von Hsp90 reguliert die Geschwindigkeit des Hsp90-Zyklus. Eine verlangsamte ATPase-Aktivität deutet auf Unter-schiede in der Reaktionsgeschwindigkeit hin. Hsp90 aus L.b. ist auch in der Lage, Homodi-mere zu bilden, und die Dimerisierung zweier MonoHomodi-mere erfolgt, wie zuvor beschrieben (Ne-moto et al., 1995), an der C-terminalen Domäne des Proteins. Des Weiteren konnte für Hsp90 aus L.b. Chaperonenaktivität nachgewiesen werden. Als Reporterprotein wurde das Enzym Citrat-Synthase verwendet, das temperaturabhängig Proteinaggregate bildet. Rekombinantes Hsp90 ist in der Lage, die Bildung schädlicher Proteinaggregaten zu verhindern. Weitere As-pekte, die die konservierte Funktion von Hsp90 aus Leishmanien belegen, sind, dass die AT-Pase-Aktivität des Proteins durch GA inhibiert wird und eine Interaktion mit den Co-Chapero-nen Sti1 (Webb et al., 1997), p23 und Aha1 nachgewiesen wurde (Silva et al., 2013). Vor allem
die Interaktion von Hsp90 mit diversen Co-Chaperonen deutet auf die Existenz des Multicha-peronen-Komplex in Leishmanien hin, was die Reifung diverser Klientenproteine ermöglicht. In Leishmanien wird Hsp90 von bis zu 17 identischen Genkopien kodiert (Hubel und Clos, 1996; Shapira, 1989; Zilka et al., 2001). Auf Grund der Tatsache, dass Hsp90 als multi copy Gen vorliegt und ein essentielles Protein ist, sind genauere revers-genetische Analysen der Hsp90-Funktion, etwa durch homologe Rekombination, nicht aussichtsreich. Auch einige Pro-teine der Hsp10-, Hsp60- und Hsp70-Familie werden in Kinetoplastida von mehreren Genko-pien codiert (Lee et al., 1988; Ommen und Clos, 2009; Zamora-Veyl et al., 2005). Die Hsp40-Familien beinhalten 66, 67 und 65 Mitglieder in L. major, T. cruzi und T. brucei, wobei die meisten Mitglieder nur von einem Gen kodiert werden (Folgueira und Requena, 2007)
Für Leihmania konnten bereits noch weitere Hsp90-Isoformen identifiziert werden. Grp94, die im ER vorkommende Hsp90-Isoform, konnte für L. infantum, L. donovani sowie L. major iden-tifiziert und beschrieben werden. Grp94 aus Leishmanien ist mit der Synthese des Hauptober-flächenmoleküls der Promastigote und gleichzeitig beschriebenen Virulenzfaktors LPG assozi-iert (Descoteaux et al., 1998; Folgueira und Requena, 2007; Larreta et al., 2000). Die Inaktivie-rung von Grp94 und die damit verbundene Blockade der LPS-Synthese wirkt sich nicht auf die Viabilität der Zellen, sondern auf deren Virulenz aus (Descoteaux et al., 2002). Hsp90-Iso-formen sind somit direkt an der Reifung von Virulenzfaktoren beteiligt. Auch das mitochondri-ale Protein TRAP1 wurde bereits für Leishmania identifiziert. Die Bedeutung dieses Proteins wurde aber bislang noch nicht genauer untersucht (Folgueira und Requena, 2007). .
Eine Studie mit 19 unterschiedlichen eukaryontischen Organismen ergab, dass das Co-Cha-peronen-Repertoire abhängig vom Organismus sowie der Vielfalt und Anzahl an vorhandenen Klientenproteine ist. Zum Beispiel konnten in dieser Studie für den Organismus mit dem kleinsten Proteom (Genomgröße 2.5 Mb, 1997 kodierende Gene (Abrahamsen et al., 2004)),
Encephalitozoon cuniculi, nur drei von insgesamt zehn untersuchten Co-Chaperonen
nach-gewiesen werden, was auf eine Korrelation zwischen der Klienten-Diversität und der Komple-xität des Co-Chaperonen-Repertoires schließen lässt. Das menschliche Genom (Genomgröße 2851 Mb, 35845 kodierende Gene (Eisen et al., 2006)) hingegen kodiert mehrere Hsp90-Iso-formen, die in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert sind und sich strukturell sowie in der Klientenspezifität voneinander unterscheiden (Johnson, 2012). Die zytosolischen Hsp90-Isoformen, Hsp90α und Hsp90β, interagieren mit insgesamt zehn Co-Chaperonen. Für den obligat intrazellulären Erreger L. major, dessen Genomgröße 32.8 Mb beträgt und über
ca. 8272 kodierende Gene verfügt (Morrison et al., 2007), wurde eine zytosolische Hsp90-Iso-form sowie neun Co-Chaperone identifiziert (Johnson und Brown, 2009).
Das zentrale Bindeglied zwischen den Chaperonen Hsp90 und Hsp70 ist das Protein Sti1. In einer Spezies-übergreifenden Studie konnte Sti1 in 18 von 19 Organismen, darunter auch L.
major, nachgewiesen werden (Johnson und Brown, 2009). Für das Sti1-Homolog aus L. major
konnte bereits durch Ko-Immunpräzipitation gezeigt werden, dass es mit Hsp70 und Hsp90 interagiert (Webb et al., 1997). Auch für das Sti1-Homolog aus L. donovani wurde durch Im-munfluoreszenzassays eine stringente Kolokalisation von Sti1 mit Hsp70 und Hsp90 festge-stellt, was deutlich für eine Interaktion dieser Proteine spricht (Hombach et al., 2012). Die Sti1-Bindungsdomäne von Hsp90 enthält die konservierte Aminosäuresequenz N‘-MEEVD-C‘ (Met-Glu-Glu-Val-Asp) (Prodromou, 2012). In Leishmania, sowie dem intrazellulären Erreger T.
cruzi, besteht diese Domäne aus der untypischen Aminosäureabfolge N‘-MEQVD-C‘
(Met-Glu-Gln-Val-Asp) (Hombach et al., 2012). Warum diese intrazellulären Erreger ein modifiziertes Sti1-Bindemotiv expremieren, ist bislang unklar.
Weitere bekannte Hsp90-spezifische Co-Chaperone in Leishmanien sind Sgt1, p23, PP5, Aha1, Cns1, FKBP52, Cyp40, Pih1 (Johnson und Brown, 2009), wobei einige dieser Co-Cha-perone essentiell für die Lebensfähigkeit des Parasiten sind (Morales et al., 2010; Ommen et al., 2010).
Da Leishmanien innerhalb ihres Entwicklungszyklus drastischen Veränderungen ausgesetzt sind, ist das Zusammenspiel und die Expression diverser Hsps für die Anpassung und das Überleben des Parasiten von großer Bedeutung. Somit ist es nicht erstaunlich, dass dieser Organismus über ein großes Co-Chaperonen-Repertoir sowie diverse Hsp90-Isoformen, loka-lisiert in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten und mit unterschiedlichen Funktionen, verfügen. Auch die bereits hohe Abundanz einiger Hsps (Hsp90 2.8% und Hsp70 2.1%) unter physiologischen Bedingungen im Promastigotenstadium von L. donovani, spricht für einen Mechanismus, der die Proteinhomöostase der Zelle nach einem rapiden Temperaturanstieg aufrechterhalten soll (Brandau et al., 1995).
1.7 Die Rolle posttranslationaler Protein-Modifikationen
Die Diversität des Proteoms einer Zelle wird durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Proteinen potenziert. Das kovalente Anheften einer funktionellen Gruppe an ein Protein modifiziert oder reguliert dessen Funktion, Lokalisation oder Interaktion mit anderen zellulären Molekülen. Zu den posttranslationalen Modifikationen zählen Phosphoylierung, N-Acetylie-rung, MethylieN-Acetylie-rung, S-NitrosylieN-Acetylie-rung, UbiquitinieN-Acetylie-rung, Glykosylierung sowie die Proteolyse von Proteinen. Nur bestimmte Aminosäuren können durch PTMs modifiziert werden. Diese Reak-tionen werden enzymatisch katalysiert, wodurch eine funktionelle Gruppe an die entspre-chende Aminosäure angeheftet oder entfernt wird. Zu den an PTMs beteiligten Enzymen zäh-len unter anderem Kinasen, Phosphatasen, Transferasen sowie Ligasen. Viele Proteine sind auch in der Lage, sich selbst, durch autokatalytische Domänen, zu modifizieren. Nicht nur Proteine, sondern auch Lipide und Saccharide werden durch PTMs modifiziert. Des Weiteren regulieren PTMs kurzfristige intra- und extrazelluläre Veränderung, wodurch die schnelle Akti-vierung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen gewährleistet wird.
Auf der Ebene der Proteinregulation durch PTMs, ist die Phosphorylierung die am besten be-schrieben und wahrscheinlich wichtigste Form. Während der Phosphorylierung eines Proteins wird eine Phosphatgruppe reversibel an einen Aminosäurerest angehängt. Hauptsächlich werden die Aminosäuren Tyrosin (Tyr,Y), Serin (Ser,S) und Threonin (Thr,T) posphoryliert. Die Phosphorylierung wird durch Proteinkinasen katalysiert, wobei die Phosphatgruppe kovalent an den Aminosäurerrest gebunden wird. Eine Phosphorylierung hat meistens eine Konforma-tionsänderung des Proteins zur Folge und führt somit zur Aktivierung oder Inaktivierung des Proteins. Die Phosphorylierung von Proteinen spielt bei der Regulation einer Vielzahl zellulärer Prozesse eine wichtige Rolle.
Enzyme, die posttranslationale Modifikationen vermitteln, werden selbst durch diese aktiviert, wodurch sich ein Zusammenspiel unterschiedlicher PTMs ergibt. Zum Beispiel reguliert die S-Nitrosylierung diverser Ser/Thr-Kinasen, Tyr-Kinasen und Tyr-Phosphatasen deren Aktivität, was dazu führt, dass die aktivierten Enzyme wiederum weitere Substratproteine phosphorylie-ren (Hess und Stamler, 2012).
1.7.1 Phosphorylierung von Hsp90
Während der Bindung und Reifung von Klientenproteinen erfährt Hsp90 drastische Konforma-tionsänderungen, die einerseits durch die Bindung und Hydrolyse von ATP aber auch durch die Interaktion mit Co-Chaperonen initiiert werden. Die Dynamik des Hsp90-Konformations-Zyklus ist organismusabhängig und unterscheidet sich in seiner Geschwindigkeit. Daher liegt die Vermutung nahe, dass der Hsp90-Zyklus an diverse Wachstumsbedingungen angepasst ist. Die Feineinstellungen des Zyklus, werden wahrscheinlich durch komplexe posttranslatio-nale Modifikationen von Hsp90 selbst oder den beteiligten Co-Chaperonen koordiniert (Mol-lapour und Neckers, 2012).
Hsp90 ist ein Phosphoprotein und der Phosphorylierungsgrad des Proteins wird organis-musabhängig von unterschiedlichen zellulären Bedingungen beeinflusst. Mehrere phospho-proteomische Studien identifizierten eine Vielzahl von Phosphorylierungsstellen, die über die gesamte Hsp90-Sequenz verteilt sind. Über die korrespondierenden Kinasen ist bislang we-nig bekannt. Eiwe-nige bereits charakterisierte Kinasen sind in der Lage Hsp90 zu phosphorylie-ren, was somit Einfluss auf die Hsp90-Klientenprotein-Interaktion und die Substratspezifität hat. Teilweise sind einige Kinasen selbst Klientenproteine von Hsp90 (B-Raf, Akt, c-Src Kina-se, Casein Kinase II), was vermuten lässt, dass eine klientenvermittelte Phosphorylierung die Chaperonenaktivität von Hsp90 reguliert (Mollapour und Neckers, 2012).
Die Aktivität und Funktion von Hsp90 wird auch noch durch weitere postranslationale Modifi-kationen, wie N-Acetylierung, S-Nitrosylierung sowie Ubiquitinierung reguliert (Mollapour und Neckers, 2012).
1.7.2 Phosphorylierung von Hsp90 in L. donovani
Hsp90 spielt bei der Lebenszyklus-Kontrolle von Leishmanien eine entscheide Rolle und wirkt als Antagonist der Amastigotendifferenzierung. Dieser komplexe Umwandlungsprozess von Leishmanien beruht auf einer kontrollierten Expression und Regulation von Proteinen.
Das Fehlen klassischer Transkriptionskontrollen und der Ablauf der Genexpression durch po-lycistronische Transkription und trans-splicing ist charakteristisch für Kinetoplastida und un-terscheidet sie somit von anderen Eukaryonten. Reife mRNA und Proteine werden posttran-skriptional und posttranslational reguliert (Kramer, 2012). Eine Möglichkeit, wie während der drastischen morphologischen und zellulären Veränderung des Parasiten, Proteinfunktionen aufrechterhalten und reguliert werden, stellen PTMs dar (Morales et al., 2008).
Das Proteinprofil von L. donovani unterscheidet sich in beiden Entwicklungsstadien, wobei Hitzestress und Differenzierung zur axenischen Amastigote die Proteinsynthese stark beein-flussen und die Proteinsynthese induzieren. Die Hsp90-Synthese, sowie die Synthese weiterer Hsps, steigt während der Stadienumwandlung an (Bente et al., 2003). Des Weiteren konnten Hsp90 sowie Hsp70 in L. donovani als Phosphoproteine identifiziert werden, die in beiden Entwicklungsstadien exprimiert werden (Morales et al., 2008). Morales et al. (2010) war es möglich, die großen molekularen Chaperone, Hsp70 und Hsp90, die Co-Chaperone Sti1, Cyp40 sowie ein PPIase-ähnliches Ortholog aus L. donovani als Phosphoproteine verstärkt in axenischen Amastigoten nachzuweisen. Die Expression dieser Proteine in Pro- und Amasti-goten ist konstitutiv und wird nicht maßgeblich durch Hitzeschock beeinflusst. Die Autoren vermuten, dass die erhöhte Abundanz dieser Proteine in der amastigoten Form auf Verände-rungen der Phosphorylierungs-Stöchiometrie basiert. Für Sti1 konnte gezeigt werden, dass das Phosphorylierungs-Verhältnis dieses Proteins in der intrazellulären Form um ein 8-faches erhöht ist. In der selben Studie konnten für Hsp90, Hsp70 und Sti1 Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Für Hsp90 wurden zwei Phosphorylierungsstellen identifiziert, wobei eine dieser Stellen in der humanen Hsp90-Sequenz nicht konserviert ist. Möglicherweise wird die Funktion von Hsp90 in L. donovani parasitenspezifisch reguliert.
Für L. major konnten eine Vielzahl an Kinasen bestimmt werden, was darauf schließen lässt, dass Proteinphosphorylierung ein wichtiger Mechanismus für diverse parasitenspezifische Prozesse ist. Häufig werden Transkriptionsfaktoren durch Phosphorylierung aktiviert, wodurch diese die Expression von Genen induzieren. Da Leishmanien nicht über Transkriptionsfaktoren verfügen, ist wahrscheinlich die Phosphorylierung anderer downstream Substrate, die stadi-enspezifische und zellzyklusspezifische Funktionen besitzen, von besonderer Bedeutung (Parsons et al., 2005). Welche Kinasen an der Phosphorylierung von Hsp90 in Leishmanien beteiligt sind, ist bislang nicht bekannt.
1.8 Interaktion von Hsp90 mit den spezifischen Inhibitoren Geldanamycin und Rad-icicol
Geldanamycin (GA) und Radicicol (RAD) konnten in einem Screening biologischer Substanzen mit potentieller Antitumoraktivität, als spezifische Inhibitoren von Hsp90 identifiziert werden. Diese Inhibitoren wirken sowohl in vivo als auch in vitro und eröffnen somit die Möglichkeit Hsp90 noch besser zu analysieren (Buchner, 1999). Sowohl GA als auch RAD interagieren
spezifisch mit der hoch-konservierten und strukturell charakteristischen ATP-Bindungstasche von Hsp90. Dies stellt eine kompetitive Hemmung von Hsp90 und weiterführend von zahlrei-chen Klientenproteinen dar (Grenert et al., 1997; Schulte et al., 1999; Stebbins et al., 1997; Whitesell et al., 1994).
GA ist ein benzochinoides Ansamycin, das von dem Bakterium Streptomyces hygroscopius produziert wird (Ochel et al., 2001). GA imitiert die geknickte Konformation von ATP und kann so die ATP-Bindestelle von Hsp90 besetzten (Buchner, 1999). Nicht nur die zytosolische Hsp90-Isoform interagiert mit GA, sondern auch, das im endoplasmatischen Retikulum be-findliche Hsp90-Familienmitglied Grp94 (Chavany et al., 1996). Die Bindung von GA an der ATP-Bindungstasche von Hsp90 führt dazu, dass gebundenes ATP nicht hydolysiert wird, das Co-Chaperon p23 nicht am N-Terminus von Hsp90 bindet und letztendlich unreife Klienten-proteine frühzeitig vom Hsp90-Komplex entlassen werden. Die dissoziierten KlientenKlienten-proteine verlieren ihre Stabilität und werden proteolytisch abgebaut (Schulte et al., 1996). Trotz seines hohen Antitumorpotentials, hat GA als Wirkstoffkandidat einige Nachteile. Insbesondere die Hepatotoxizität von GA gab den Anlass, GA-Analoga zu entwickeln, die vor allem an Position 17 derivartisiert sind. Zu den Analoga zählen 17-AAG und 17-DMAG. Vor allem das GA-Analogon 17-AAG weist vielversprechende therapeutische Ansätze gegenüber Krebserkran-kungen (Usmani et al., 2009) aber auch gegenüber Infektionskrankheiten, wie Malaria, Trypa-nosomiasis und Leishmaniose auf (Pallavi et al., 2010; Petersen et al., 2012).
RAD ist ein makrozyklisches antimykotisches Antibiotikum, das von unterschiedlichen Pilzar-ten, die die Rizosphäre von Pflanzen besiedeln, produziert wird (Turbyville et al., 2006). Struk-turell unterscheidet sich RAD stark von GA. Basierend auf Mutationsanalysen wird postuliert, dass RAD aufgrund des strukturellen Unterschiedes mit anderen Aminosäuren in der ATP-Bindungstasche interagiert, als GA. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Bindungen von GA und RAD nicht auf eine funktionelle ATPase-Domäne angewiesen sind. Wie GA, arre-tiert auch RAD die ATP-gebundene Konformation von Hsp90, wodurch die Aktivierung von Klientenproteinen verhindert wird und diese letztlich vom Proteasom abgebaut werden (Schulte et al., 1999).
1.8.1 Auswirkungen einer pharmakologischen Inhibition von Hsp90 auf das Wachstum von L.donovani
Während der Übertragung von Leishmanien auf den Wirtsorganismus, sind diese einem dras-tischen Temperaturanstieg ausgesetzt, wodurch die Synthese von Hsp70 und Hsp90 hochre-guliert und die Hsp100-Expression induziert wird. Einige Leishmania-Arten differenzieren auch in axenischer Kultur, durch Erhöhung der Umgebungstemperatur und Ansäuern des Kultur-mediums, in die amastigote Form (Saar et al., 1998; Zilberstein und Shapira, 1994). Die abrup-te Veränderung der Lebensbedingungen von Leishmanien, dient als Signal für die Stadiendif-ferenzierung des Parasiten, die essentiell für das Überleben des Erregers und somit für die Ausbildung der Erkrankung ist.
Wiesgigl und Clos (2001) zeigten, dass die Inhibition von Hsp90 mit GA oder RAD die Stadi-endifferenzierung von der promastigoten Form in die amastigote Form induziert, wobei diese Umwandlung unabhängig von den Kulturbedingungen erfolgt. Die Behandlung von L.
dono-vani mit GA und RAD induziert die Umwandlung in amastigoten-ähnliche Zellen, die sich
morphologisch nicht von axenischen Amastigoten unterscheiden. Des Weiteren induziert die Inhibition von Hsp90 die Expression amastigotenspezifischer A2-Proteine, die auch mit Viru-lenz assoziiert sind (Hubel et al., 1997; Krobitsch und Clos, 1999; Zhang und Matlashewski, 1997). Eine GA-Behandlung führt ausserdem zu einem Wachstumsarrest der Parasiten in der G2-Phase, der durch eine spontane oder rekombinante Überexpression von Hsp90 aufgeho-ben wird. GA interagiert spezifisch mit Hsp90 und inhibiert somit dessen wichtige Funktion als molekulares Chaperon (Wiesgigl und Clos, 2001). Auch die Proteome von in vitro kultivierten Amastigoten und amastigoten-ähnlichen Zellen, die durch die pharmakologische Inhibition von Hsp90 induziert wurden, sind miteinander vergleichbar (Bente et al., 2003). Zusammenge-fasst lässt sich sagen, dass zwischen der Hsp90-Funktion und der Stadienumwandlung von Leishmanien eine direkte Verbindung besteht und dass die Hsp90-Homöostase die Hitze-stressantwort sowie morphologische Differenzierung der Zellen kontrolliert.
Auch für andere protozooische Parasiten konnten entscheidende Funktionen von Hsp90 im Zusammenhang mit deren komplexen Entwicklungszyklen festgestellt werden. Zu diesen zäh-len unter anderem P. falciparum (Banumathy et al., 2003), Eimeria tenella (Peroval et al., 2006),
T. cruzi (Graefe et al., 2002) und T. brucei (Jones et al., 2008).
1.8.2 Inhibitor-resistente Hsp90-Varianten
Auf Grund der potentiellen Antitumoraktivität der Hsp90-Inhibitoren befinden sich einige Substanzen bereits in klinischen Versuchen und werden auf ihre Wirksamkeit getestet (Trepel et al., 2010). Ein Problem bei der Etablierung neuer Medikamente ist die mögliche Entwick-lung von Resistenzen. Es wird vermutetet, dass die EntwickEntwick-lung von Mutationen gegenüber Hsp90-Inhibitoren sehr gering ist, da der N-Terminus von Hsp90, besonders die Aminosäuren, die an der Bindung und Hydrolyse von ATP beteiligt sind, stark konserviert und die ATPase-Aktivität essentiell für die Funktionalität des Proteins ist (Prodromou, 2012).
Natürlich vorkommende GA- oder RAD-Resistenzen sind bereits bekannt. Hsp90 aus dem Nematoden Caenorhabditis elegans weist in vivo eine deutlich geringere Sensitivität gegen-über GA auf und die Entwicklung sowie das Wachstum des Fadenwurms wird durch eine GA-Behandlung nicht beeinflusst. In vitro konnte mittels Bindungsanalyse mit immobilisiertem GA gezeigt werden, dass Hsp90 aus C. elegans eine deutlich geringere Affinität zu dem Inhibitor aufweist. Eine mögliche Hypothese zur Resistenzentwicklung ist, dass C. elegans die gleiche ökologische Nische wie das GA-produzierende Bakterium Streptomyces hygroscopius besie-delt und die GA-Resistenz einen evolutionären Adaptionsmechanismus darstellt (David et al., 2003).
Der Pilz Humicola fuscoatra trägt an Aminosäureposition 34, in der hoch-konservierten ATP-Bindungstasche, eine Substitution. Anstatt eines Leucin befindet sich an dieser Position in der Hsp90-Sequenz von H. fuscoatra ein Isoleucin. Dieser einfache Aminosäureaustausch ist da-für verantwortlich, dass Hsp90 eine deutlich geringere Affinität gegenüber RAD aufweist und so der Pilz resistent ist. Da die Bindung von GA oder ATP nicht beeinflusst wird, ist die Substi-tution an Position L34I spezifisch für die Interaktion mit RAD. Das Einfügen der Aminosäure-substitution, in die Hsp90-Sequenz von Hefezellen, verlieh den Zellen Resistenz gegenüber RAD. H. fuscoatra ist ein Eigenproduzent von RAD und es ist wahrscheinlich, dass der Resis-tenzmechanismus sich als Schutz gegenüber dem selbst produzierten RAD entwickelt hat (Prodromou et al., 2009).
1.9 Zielsetzung der Arbeit
Ein Hauptanliegen aktueller Forschung ist das generelle Verständnis molekularer Mechanis-men während der Stadiendifferenzierung des Parasiten. Das molekulare Chaperon Hsp90 ist maßgeblich an der Stadiendifferenzierung von Leishmanien beteiligt und spielt hierbei eine entscheidende Rolle. Auf Grund der essentiellen Natur und der Anordnung von Hsp90 als
multi copy Gen ist eine detaillierte Analyse von Hsp90 in Leishmanien durch homologe
Re-kombination nicht vielversprechend. Bislang konnte die besondere Funktion von Hsp90 wäh-rend der Stadienumwandlung des Erregers nur durch pharmakologische Inhibition des Prote-ins beobachtet werden. Welche Proteindomänen, Interaktionen mit Co-Chaperonen oder Kli-entenproteinen, sowie Regulationsmechanismen von Hsp90 für die Konservierung der Funk-tion und somit für die Lebensfähigkeit des Erregers entscheidend sind, ist weitestgehend un-bekannt. Daher liegt ein Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Etablierung einer RAD-resistenten Hsp90-Variante (Hsp90rr), die als Transgen in den Zellen exprimiert und Resistenz gegenüber RAD vermitteln soll. Hierfür soll zunächst in der Hsp90-Sequenz von L. donovani an Amino-säureposition 33 (in S. cerevisae 34) das konservierte Leucin durch ein Isoleucin mittels Muta-genese-PCR ausgetauscht werden und der Effekt der Aminosäuresubstitution unter RAD-Se-lektion untersucht werden.
Ein weitere Schwerpunkt dieser Arbeit ist es, gezielt Mutationen in die Hsp90rr-Sequenz ein-zufügen und die Ausprägungen der Mutationen auf die Funktionalität von Hsp90 zu charakte-risieren. Der Phänotyp der Mutation sollte dabei erst unter Selektion mit RAD sichtbar werden, sich also konditional manifestieren. Mit Hilfe dieses Systems soll die Bedeutung der Hsp90-Sti1 Interaktion für beide Parasitenstadien durch Deletion des Hsp90-Sti1-Bindemotivs am C-Termi-nus von Hsp90 analysiert werden. Des Weiteren soll der Einfluss von sieben bereits identifi-zierten Phosphorylierungsstellen auf die Funktion von Hsp90 und somit die Bedeutung von posttranslationalen Modifikationen bestimmt werden. Die Phänotypen der diversen Mutatio-nen sollen an Hand von Wachstumskinetiken promastigoter Zellen, der Morphologie und der Fähigkeit zur intrazellulären Proliferation der amastigoten Form in primären Knochenmarks-Makrophagen ermittelt werden.
2. Material und Methoden
2.1 Material2.1.1 Chemikalien und Lösungen
Die verwendeten Chemikalien werden von den Firmen Fluka (Buchs, Schweiz), Ratiopharm (Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma-Aldrich (St. Louis, U.S.A.) bezogen und in der Qualität “pro analysis“ eingesetzt. Sämtliche Lösungen werden mit deionisiertem Wasser (ddH2O) angesetzt.
2.1.2 Geräte und sonstige Materialien
In der vorliegenden Arbeit wurden die unten aufgelisteten Geräte und Materialien verwendet. Nicht angegeben Geräte entsprechen dem Laborstandard.
Bezeichnung! Hersteller
Biomate 3 Spectrphometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.A. Biometra UV Band Eluator Biometra, Göttingen
Branson Sonifier 250 G. Heinemann, Schwäbisch Gmünd Brutschrank, Modell:3324009903100 WTC Binder, Tuttlingen
Brutschrank, Heraeus B 6060 Heraeus, Hannover
CASY Cellcounter und Analyzer Schärfe System, Reutlingen Elektropotrationsküvetten (0,4 cm) Bio-Rad, München
Electrophoresis Power Supply-EPS301 Amersham, Buckinghamshire, U.K. Epi-Fluoreszenzmikroskop Leica, Solms
Eppendorf Centrifuge 5415D Eppendorf, Hamburg Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf, Hamburg Eppendorf Centrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg Eppendorf Mastercycler gradient Eppendorf, Hamburg Faltenfilter (ø 185 mm) Schleicher & Schüll, Dassel
GenePulser Bio-RAD, Münschen
HisBindResin Novagen, Madison, U.S.A.
InnovaTM4400 incubator shaker New Brunswick Scientific, New Jersey,U.S.A.
Invertoskop ID03 Zeiss, Oberkochen
J2-21 Zentrifuge Beckmann Coulter, Fullerton, U.S.A. J2-HS Zentrifuge Beckmann Coulter, Fullerton, U.S.A. Lab-Tek-8-Well chamber slides Nunc, Roskilde, DK
Neubauer-Zählkammer 0,02 mm Tiefe Assistent, Sondheim
PVDF-Membran Fluorotrans, 0,2 µm Pall, Europe, Portsmouth, U.K. PerfectBlue Gelsystem Peqlab, Erlangen
