2. Material und Methoden
2.2 Methoden
2.2.2 Molekularbiologische Methoden
on). In der vorliegenden Arbeit wurden alle PCR-Ansätze mit dem iProof PCR Kit für GC-rei-che DNA (Bio-Rad) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. In Tab 5 sind die Komponen-ten für einen PCR-Ansatz mit einem Endvolumen von 25 µl zusammengefasst.
Tab 5: Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes mit einem Endvolumen von 25 µl
Menge [µl] Bezeichnung
12,5 2x iProof Master Mix
(3 mM MgCl2, 0.04 U/µl iProof, 400 µM je dNTP)
0,7 10 µM forward Primer, phosphoryliert
0,7 10 µM reverse Primer, phosphoryliert
7,6 ddH2O
3 DMSO
0,5 Template (DNA oder ddH2O)
Die Bedingungen werden für jede PCR individuell erstellt und sind abhängig von der Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragments. In Tab 6 sind die Konditionen eines PCR-Pro-gramms aufgelistet.
Tab 6: Konditionen eines PCR-Programms
Reaktionsschritt Temperatur [°C] Dauer [min] Zyklenzahl
Intitial Denaturierung 98 0,3 1
Denaturierung 98 1 30
Annealing 72 0,5
30
Elongation 72 0,25 pro 1kbp
30
Füllsynthese 72 5 1
Nach einer abgeschlossenen PCR werden die entstandenen PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt (siehe 2.2.2.3), extrahiert und gereinigt (siehe 2.2.2.4).
2.2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese
Das Auftrennen negativ geladener Nukleinsäure-Moleküle in einem elektrischen Feld erfolgt durch Agarose-Gelelektrophorese. Hierbei werden Agarosepolymere zu einem Gel vernetzt, welches, abhängig von der Porengröße, DNA-Fragmente an Hand ihrer Größe auftrennt. Die eingesetzten Agarosekonzentrationen liegen zwischen 0,8-1,5% in TAE-Puffer. Der aufge-kochten Agarose wird zusätzlich Ethidiumbromid (0,1 µg/ml pro Gel) zugegeben, wodurch im späteren Verlauf die aufgetrennte DNA mit einem UV-Transilluminator nachgewiesen und fo-tografisch dokumentiert werden kann. Die DNA-Proben werden mit dem entsprechenden Vo-lumen an 6x DNA-Ladepuffer versetzt. Das Auftrennen der DNA erfolgt bei 10 V/cm für 1-2 h.
Der Fragment-Längen-Bestimmung dient der 1 kb DNA-Längenstandard.
2.2.2.4 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Gelen
Zur Klonierung von DNA-Fragmenten ist es notwendig, die jeweilige DNA aus den Agarose-Gelen zu extrahieren. Hierzu wird das Nucleo Spin Extract Kit II laut Herstellerangaben ver-wendet. Das gewünschte DNA-Fragment wird unter langwelligem UV-Licht aus dem Gel ge-schnitten, die Agarose bei 50°C aufgelöst und die DNA durch Zentrifugation an die Membran der Säule gebunden. Nach einem Waschschritt wird die DNA von der Säule gelöst und die Qualität der gewonnen und gereinigten DNA durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt.
2.2.2.5 Spaltung der DNA durch Restriktionsendonukleasen
Unter der Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen versteht man die enzymatische Spaltung von doppelsträniger DNA an bestimmten Positionen. Dabei erkennt jedes Enzym eine spezifische, meist palindromische Sequenz, wodurch einzelstränige Fragemente mit 3‘-oder 5‘-Überhängen (sticky ends) 3‘-oder mit glatten Enden (blunt ends) entstehen können. Die Spaltung der DNA erfolgt unter Berücksichtigung der Temperaturoptima der Enzyme (meist bei 37°C) in den vom Hersteller mitgelieferten Puffern. In der vorliegenden Arbeit werden Restriktionsendonukleasen zur Identifizierung von DNA-Konstrukten (analytisches Verfahren) sowie zur gerichteten Klonierung verwendet (präparatives Verfahren). Für analytische Zwecke werden 1 µg DNA mit 2 U Enzym für 1h inkubiert. Für präparative Zwecke werden 10 µg DNA mit 45 U Enzym für 2h inkubiert. Durch die Zugabe von 6x DNA-Ladepuffer oder einfrieren des Reaktionsansatzes bei -20°C wird die enzymatische Reaktion gestoppt. Im Fall von zwei
Material und Methoden
aufeinander folgenden Einzelreaktionen wird die verdaute DNA mit dem in 2.2.2.4 beschrie-benen Kit gereinigt.
2.2.2.6 Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligation zweier DNA-Fragmente über eine Phosphodiesterbindung erfolgt unter ATP-Ver-brauch und wird von dem Enzym Ligase katalysiert. In der vorliegenden Arbeit wird die Ligase T4 aus dem gleichnamigen Bakteriophagen verwendet. Die Reaktion erfolgt in einem 10 µl Ansatz und die Komponenten einer Ligation sind in Tab 7 aufgelistet. Hierzu werden Vektor und Insert in einem molaren Verhältnis von 1:3 eingesetzt. Die Ligation von überhängenden Enden erfolgt bei 4°C über Nacht, die von glatten Enden bei RT für 3h. Anschließend werden die Liagtionsprodukte in E. coli transformiert.
Tab 7: Ligationsansatz für ein Endvolumen von 10 µl
Menge [µl] Bezeichnung
1 T4 DNA Ligase 0,4U/µl
1 10x T4 DNA Ligase Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1mM ATP)
x ddH2O
x Insert
x Vektor
2.2.2.7 Transformation von E. coli
Bei der Transformation von E. coli kommt es zur Aufnahme freier und löslicher Plasmid-DNA.
Plasmide und Ligationsprodukte werden in kompetente E. coli DH5α und Expressionsplasmi-de zur präparativen Proteinexpression in E. coli BL21 (DE3) [pAPlacIQ]-Zellen transformiert.
Die kompetenten Zellen werden zunächst auf Eis aufgetaut. 50 µl der Zellen werden mit 5 µl eines Ligationsansatzes oder 1 µl Plasmid-DNA für 30min auf Eis inkubiert. Der Hitzeschock erfolgt bei 42°C für 20sec (DH5α-Zellen) bzw. für 30sec bei BL21 (DE3) [pAPlacIQ]-Zellen.
Nach kurzer Inkubation auf Eis werden den Zellen 1 ml LB-Medium zugegeben und diese für 1h bei 37°C inkubiert. Anschließend folgt eine kurze Sedimentation der Zellen (5min, 3.220x g,
RT). Der Überstand wird bis auf 100 µl abgenommen, die Zellen in diesem Volumen resus-pendiert und das gesamte Volumen auf vorgewärmte LB-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika ausplattiert. Die ausplattierten Zellen werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Durch die Aufnahme der Plasmid-DNA besitzen die Bakterien ein (zusätzliches) Resistenzgen, das ihnen das Wachstum auf entsprechenden Selektionsplatten ermöglicht.
2.2.2.8 Isolierung von genomischer DNA aus Leishmanien
Die Isolierung von genomischer DNA erfolgt mit dem DNA Isolation Cell and Tissue Kit der Firma Gentra System nach Angaben des Herstellers. Für die Isolierung von genomischer DNA werden 1x108 Zellen aus einer logarithmisch wachsenden Parasitenkultur abgenommen und sedimentiert (1250 x g, 10min, 4°C). Nach mehrmaligen waschen der Zellen mit 1xPBS wer-den die Zellen in 1ml 1xPBS aufgenommen und die genomische DNA isoliert.
2.2.2.9 Isolierung von Plasmid-DNA durch alakalische Lyse
Die Minipräparation von Plasmid-DNA dient zur Kontrolle der klonierten und transformierten Konstrukte. Bei dieser Methode werden geringe Mengen an DNA isoliert, welche durch einen analytischen Restriktionsverdau kontrolliert werden können. Die isolierte Plasmid-DNA kann auch zur wiederholten Transformation in kompetente E. coli Zellen verwendet werden. Für ei-ne Transfektion in Leishmanien wird hochreiei-ne Plasmid-DNA, nach eiei-ner Maxipräparation, be-vorzugt. 2 ml LB-Medium, versetzt mit den entsprechenden Antibiotika, werden mit einer frisch transformierten Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Bak-terien werden sedimentiert (16.100 x g, 2min, 4°C) und das Pellet in 100 µl Plasmid-Lösung I resuspendiert. Durch die Zugabe von 200 µl Plasmid-Lösung II erfolgt die Lyse der Zellen.
Das in Lösung II befindliche SDS sowie die Zellproteine werden durch die Zugabe von 150 µl Plasmid-Lösung III und einer fünfminütigen Inkubation auf Eis gefällt. Anschließend werden Zelltrümmer, gefällte Proteine und SDS-Reste sedimentiert (16.100 x g, 10min, 4°C). Die Plasmid-DNA befindet sich im klaren Überstand. Dieser wird abgenommen und in eine neues Reaktionsgefäß überführt. Durch die Zugabe von 1 ml 96% EtOH wird die DNA gefällt (16.100 x g, 10min, RT). Der Überstand wird abgenommen, das DNA-Präzipitat mit 70% EtOH gewa-schen und wiederholt zentrifugiert (16.100 x g, 10min, RT). Die DNA wird in 40 µl TE-RNaseA aufgenommen und für 30min bei 37°C inkubiert. Dieser Schritt dient zum Abbau der RNA.
Material und Methoden
Die isolierte Plasmid-DNA wird im Anschluss für einen analytischen Restriktionsverdau einge-setzt (siehe 2.2.2.5).
2.2.2.10 Isolierung hochreiner Plasmid-DNA
Für die Transfektion von Leishmanien sollte hochreine superhelikale Plasmid-DNA verwendet werden. Diese kann durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden.
200 ml Cycle-Grow LB Medium, versetzt mit den entsprechenden Antibiotika, werden mit ei-ner Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Sedimantation der Bakterienkultur (5.000 x g, 20min, 4°C) wird das Pellet in 5 ml Plasmid-Lösung I resuspen-diert. Die Zellen werden mit 10 ml Plasmid-Lösung II lysiert, gemischt und für 10min bei RT auf einem Rollentisch inkubiert. Anschließend wird der Ansatz mit 7,5 ml Plasmid-Lösung III versetzt, für 10min auf Eis inkubiert, sedimentiert (5.000 x g, 30 min, 4°C) und der Überstand durch einen Faltenfilter in ein neues Reaktionsgefäß filtriert. Nachfolgend werden 0,7 Vol Iso-propanol zugefügt, der Ansatz für 20min bei RT inkubiert und die DNA sedimentiert (3.220 x g, 20 min, RT). Die gefällte DNA wird anschließend mit 10 ml 70% EtOH gewaschen, wiederholt zentrifugiert (3. 220 x g, 20min, RT) und das DNA-Präzipitat in 4 ml TE-Puffer (pH 8.0) vollständig gelöst. Nachfolgend wird die DNA-Lösung mit 4,9 g Cäsiumchlorid sowie mit 150 µl Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) versetzt, gut gemischt und kurz zentrifugiert. Die DNA-Lösung wird mit Hilfe einer Pasteurpipette in Quick-Seal-Ultrazentrifugenröhrchen überführt.
Die Röhrchen werden austariert und blasenfrei verschweißt. Die Ultrazentrifugation erfolgt für 8h bei 50.000 rpm und 25°C. Nach Beendigung der Ultrazentrifugation wird die Bande, wel-che die superhelikale Plasmid-DNA enthält, vorsichtig abgenommen. Um das mit der DNA interkalierte Ethidiumbromid zu entfernen, wird die DNA-Lösung mit 1 Vol NH4-Acetat gesät-tigtem Isopropanol gewaschen. Der Überstand wird abgenommen und der Waschvorgang wiederholt. Die DNA wird anschließend mit 2 Vol ddH2O und 0,1 Vol 7,5 M NH4-Acetat ver-setzt. Durch die Zugabe von 2,5 Vol 96% EtOH wird die DNA gefällt, 30min bei RT inkubiert und sedimentiert (3.220 x g, 30min, RT). Das DNA-Präzipitat wird je nach DNA-Ausbeute in 200-500 µl TE-Puffer (pH 8.0) gelöst. Die DNA-Konzentration wird fotometrisch bestimmt (sie-he 2.2.2.11) und die gewonnene Plasmid-DNA mit einem analytisc(sie-hen Restriktionsverdau ü-berprüft (siehe 2.2.2.5).
2.2.2.11 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Konzentration von Nukleinsäuren in einer wässrigen Lösung wird photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels der optischen Dichte (OD) bestimmt. Bei einer Wellenlänge von 280 nm werden Proteinverunreinigungen gemessen. Das Verhältnis von OD260 zu OD280
ergibt die Reinheit der Nukleinsäure. Reine DNA liegt bei einem Wert von 1,8-2,0. Liegt die Reinheit unter diesem Wert deutet das auf eine Kontamination mit Proteinen hin. Bei Werten über 2,0 liegt die Verunreinigung an vorhandener RNA.
2.2.2.12 Sequenzierung von DNA
Die isolierte hochreine Plasmid-DNA wird mittels vergleichender Sequenzanalyse untersucht.
Hiermit wird verifiziert, dass die DNA keine Leseraster-Verschiebung aufweist und ob eine ge-richtete Punktmutation richtig eingefügt wurde. Die Sequenzierung wird von der Firma LGC (Berlin) durchgeführt und die Auswertung der DNA-Sequenzen erfolgt unter der Anwendung der Software MacVector 12.0.5 sowie mittels Datenbankabgleichen mit öffentlichen Daten-banken (GenDB, TriTryp).
2.2.2.13 Semi-quantitative real time PCR (qRT-PCR)
Die Quantifizierung der mRNA-Level transfezierter Leishmanien erfolgt mittels semi-quantitati-ver real time PCR. Hierfür wird die RNA aus den Zellen isoliert. 5x107 Zellen werden aus einer logarithmisch wachsenden Kultur abgenommen, sedimentiert und mehrmals mit 1xPBS ge-waschen. Die RNA-Isolation erfolgt mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) oder dem InviTrap Spin Cell RNA Mini Kit (Stratec molecular). Die Isolation wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach der RNA-Isolation wird die gewonnene mRNA von dem Enzym reverse Transkriptase und der Verwendung von random-Primern in cDNA umgeschrieben. Dies erfolgt mit dem DyNAmo cDNA Synthesis Kit (Finnzymes). Die gewonnene cDNA wird in einer RT-qPCR mit spezifischen Oligonukleotiden für das gene of interest (GOI) eingesetzt. In der vor-liegenden Arbeit wurden diese Oliginukleotide so gewählt, dass nur die transgen-kodierten Hsp90-Varianten nachgewiesen werden. Als interner Standard wurde eine Quantifizierung der Aktin-mRNA mit den entsprechenden Oligonukleotiden durchgeführt. Die Amplifizierung und Quantifizierung erfolgte mit dem DyNAmo Color Flash SYBR Green qPCR Kit (Finnzymes), welches SYBR Green als Farbstoff enthält. Der Nachweis erfolgt im Corbett Rotor Gene 6000.
Material und Methoden
2.2.3 Proteinbiochemische Methoden
2.2.3.1 Denaturierender Zellaufschluss
Zur Herstellung von Leishmania-Zellysaten werden Aliquots einer logarithmisch wachsenden Kultur abgenommen und sedimentiert (3.200 x g, 10min, 4°C). Das Zellsediment wird an-schließend zweimal mit 1xPBS gewaschen, je nach gewünschter Zelldichte in 1xPBS resus-pendiert und mit 1Vol 2x Lämmli-Probenpuffer versetzt. Die Lysate werden 10min bei 100%
Output und RT im Ultraschallbad sonifiziert. Im Anschluss werden die Lysate 10min bei 95°C gekocht und zentrifugiert (16.100 x g, 5min, RT). Im Überstand befindet sich das zelluläre Ge-samtprotein, das gelelektrophoretisch analysiert wird.
2.2.3.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese handelt es sich um eine analytische Methode, die zur Trennung eines Proteingemischs nach der Molekülmasse in einem elektrischen Feld genutzt wird. Zunächst werden zwei EtOH-gereinigte Glasplatten und zwei Platzhalter in einen vertikalen Gel-Gießstand eingespannt. Je nach Größe der zu trennenden Proteine werden 7,5-12%ige Trenngele angesetzt (375 mM Tris-HCL [pH 8.8], 7,5-12% Acrylamid-Bisacryla-mid [37,5:1, 40%], 0,1% SDS, 0,1% APS, 0,1% TEMED).
Das Trenngel wird mit 70% EtOH überschichtet und bis zur vollständigen Polymerisierung bei RT gelagert. Nach der Polymerisierung wird das Trenngel mit einem 5% Sammelgel über-schichtet (125 mM Tris-HCL [pH 6.8], 5% Acrylamid-Bisacrylamid [37,5:1, 40%], 0,1% SDS, 0,1% APS, 0,1% TEMED) und mit einem Probenkamm versehen. Nach Polymerisierung des Sammelgels wird die Apparatur in eine vertikal Gelkammer eingebaut. Die Gelkammer wird mit SDS-Laufpuffer (25 mM Tris, 250 mM Glycin, 0,1% SDS) gefüllt, bis das Gel vollständig bedeckt ist. Anschließend wird der Kamm entfernt und die Taschen mit Puffer gespült. Die vorbereiteten Proteinproben werden im Anschluss auf das Gel aufgetragen. In der vorliegen-den Arbeit wird pro Spur das Zelllysat von 5x106 Zellen aufgetragen und analysiert. Als Grö-ßenmarker werden der PageRuler Prestained Protein Ladder (für Western Blot-Analyse) und der PageRuler Unstainded Protein Ladder (für Coomassie-Brilliant-Blau Färbung) verwendet.
Die Auftrennung der Proben erfolgt bei einer Spannung von 15 V/cm für 2h. Daraufhin werden die Proteine entweder mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt oder auf eine Membran transfe-riert.
2.2.3.3 Coomassie-Brilliant-Blau Färbung
Der Farbstoff Coomassie-Brilliant-Blau R-250 lagert sich an die basischen Seitenketten der Aminosäuren. Der Farbstoff färbt dadurch unspezifisch alle Proteine und dient zur Färbung von Polyacrylamidgelen. Die Färbung der Proteine erfolgt für mindestens 2h bei RT in der Färbelösung (1g/l Coomassie-Brilliant-Blau R-250, 40% EtOH [96%], 10% Essigsäure). An-schließend wird das Gel solange mit Entfärberlösung (40% EtOH [96%], 10% Essigsäure) be-handelt, bis nur noch die Proteinbanden gut sichtbar sind. Nach der Entfärbung wird das Gel mit ddH2O gespült, digitalisiert und zwischen zwei feuchten Zellophanpapieren getrocknet.
2.2.3.4 Western Blot
Der Western Blot ist eine Methode zum Nachweis von Proteinen durch den Transfer auf eine Trägermembran wie z.B. Nitrocellulose oder Polyvinyldifluorid-Membran (PVDF). In der vorlie-genden Arbeit wird ausschließlich PVDF-Membran verwendet und der Transfer von Proteinen erfolgt im semi-dry Verfahren in einer horizontalen Blot-Apparatur. Die Proteine wandern dabei in einem elektrischen Feld von der Kathode zur Anode. Das bedeutet, die Proteine wandern aus dem Polyacrylamidgel in Richtung PVDF-Membran, an die sie über hydrophobe Wech-selwirkungen binden. Für den Western Blot wird zunächst die PVDF-Membran (Fluorotrans, 0,2 µm) und 2 Lagen 3MM Whatman Filter auf die Größe des SDS-Gels zugeschnitten. Eine Lage Filterpapier wird mit Blot-Transfer-Puffer befeuchtet und auf die Kathode der Blot-Appa-ratur gelegt. Anschließend wird das Polyacrylamidgel auf dieser Lage Filterpapier platziert. Die PVDF-Membran wird kurz in MeOH aktiviert, dreimal mit ddH2O gespült und in Blot-Transfer-Puffer äquilibriert. Die Membran wird anschließend auf dem Gel platziert und mit einer weite-ren Lage befeuchtetem Filterpapier überschichtet. Der Western Blot sollte möglichst luftbla-senfrei aufgebaut werden. Abschließend wird die Anode auf die Blot-Apparatur aufgesetzt und der Proteintransfer gestartet (1 mA/cm2, 60min). Die Membran wird nach Beendigung des Transfers immunologisch untersucht oder getrocknet und zwischen zwei Filterpapieren gela-gert.
Material und Methoden
2.2.3.5 Immunoblot
Der Immunoblot ist ein Verfahren, um immobilisierte Proteine mit Hilfe von Antikörperreaktio-nen zu identifizieren und sichtbar zu machen. Hierfür wird die Membran, unmittelbar nach dem Protein-Transfer, für 1h bei RT in Blockierungslösung inkubiert (5% Milchpulver in TBS, 0,1% Tween 20). Dieser Schritt dient dazu freie Bindungsstellen der Membran abzusättigen.
Bereits getrocknete Membranen werden zuvor durch die kurze Inkubation mit MeOH reakti-viert und anschließen dreimal mit ddH2O gespült. Nach der Absättigung freier Bindungsstellen erfolgt eine Inkubation der Membran für mindestens 1h mit dem in Blockierungslösung ver-dünnten primären Antikörpern. In dieser Arbeit werden die verwendeten primären Antikörper (anti-Sti1, anti-Hsp90, anti-3HA) in einer Verdünnung von 1:500-1:1000 eingesetzt. Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper wird durch dreimaliges Waschen der Membran mit Waschpuffer (TBS, 0,05% Tween 20) ungebundene Antikörperreste entfernt. Anschließend erfolgt die Inkubation mit dem in Blockierungslösung verdünnten sekundär Antikörper (anti-Maus-AP, 1:1000). Die Membran wird mindestens 1h mit dieser Antikörper-Verdünnung inku-biert. Nach einem dreimaligen Waschschritt mit Waschpuffer und einem einmaligen Wasch-schritt mit AP (Alkalische Phosphatase)-Puffer erfolgt der kolorimetrische Nachweis von AP.
Dies erfolgt durch die Zugabe von BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3_indolylphosphat), als chromo-genes Substrat, zusammen mit NBT (4-Nitroblautetrazoliumchlorid). Das Enzym wandelt BCIP in Verbindung mit NBT zu einem blauen unlöslichen Indigo-Farbstoff um. Die Reaktion wird im Dunkeln durchgeführt und nach deutlicher Anfärbung der Proteinbanden durch mehrmaliges spülen mit Leitungswasser gestoppt. Die entwickelte Membran wird abschließend getrocknet und digitalisiert.
2.2.3.6 GFP Trap M Ko-Immunpräzipitation
Mit Hilfe der Ko-Immunpräzipitation können GFP-Fusionsproteine und deren Interaktionspart-ner isoliert und nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde zu diesem Zweck das GFP Trap M Kit der Firma Chromotek nach Angaben des Herstellers verwendet. Das Prinzip dieser Me-thode basiert auf der Bindung von GFP-Bindeproteinen, die an magnetische Partikel gekop-pelt sind, mit dem GFP-Fusionsprotein.
Hierfür wurden 1x107 Zellen einer logarithmisch wachsenden Kultur entnommen und sedi-mentiert (3.200 x g, 10min, 4°C). Nach zweimaligem Waschen mit 1xPBS werden die Zellen in 100 µl Lysepuffer resuspendiert und 30min auf Eis inkubiert, wobei die Zellsuspension
wäh-rend der Inkubation mehrmals gemischt wird. Anschließend wird die Zellsuspension sedimen-tiert (16.100 x g, 10min, 4°C) und der Überstand in ein neues vorgekühltes Reaktionsgefäß überführt. Der Überstand wird mit Waschpuffer auf ein Endvolumen von 400 µl aufgefüllt und ein 50 µl-Aliquot entnommen (input-Fraktion). Die input-Fraktion wird mit 1 Vol 2x Lämmli-Probepuffer versetzt und bei 95°C aufgekocht. Das Proteingemisch wird anschließend mit ä-quilibrierten GFP-Trap beads für 2h bei 4°C gemischt. Zur Äquilibrierung der beads werden 25 µl der beads-Suspension mit 250 µl eiskaltem Waschpuffer gewaschen und magnetisch ge-trennt. Der Waschpuffer wird abgenommen und der Waschschritt zweimal wiederholt. Nach Ablauf der zweistündigen Inkubation wird das Protein-beads-Gemisch magnetisch aufge-trennt. Die Fusionsproteine sollten nun an die GFP-Bindeproteine des magnetischen Träger-materials gebunden sein. Das Gemisch wird zweimal mit 400 µl eiskaltem Waschpuffer gewa-schen. Durch die Zugabe von 100 µl heißem 1x Lämmli-Probenpuffer und der Inkubation bei 95°C für 10min dissoziiert der Immunokomplex von den beads. Der magnetische Anteil der Suspension wird für 2min bei 4°C vom Immunokomplex separiert und der Überstand ge-sammelt (bound-Fraktion). Die Fraktionen werden anschließend mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und im Immunoblot analysiert. Hierfür werden 10 µl der input-Fraktion und 20 µl der bound-input-Fraktion eingesetzt.
2.2.4 Mikroskopische Methoden
2.2.4.1 Lichtmikroskopie
Das Wachstum und die Morphologie der Promastigoten wird regelmäßig lichtmikroskopisch beobachtet. Hierfür werden die Zellen bei 32-facher Vergrößerung am inversen Zeiss ID03 Mikroskop betrachtet.
2.2.4.2 Raster-Elektronenmikroskopie (REM)
Mit Hilfe der REM werden Veränderungen der Zellmorphologie nach RAD-Behandlung ge-nauer untersucht. Hierfür wird die Oberfläche der Zellen mit einem feinen Elektronen-Strahl
“gerastert“ und anschließend dargestellt. Für diese Methode wird keine definierte Zellzahl ein-gesetzt. Die Zellen werden zunächst sedimentiert (3.200 x g, 10min, 4°C) und zweimal mit 1xPBS gewaschen. Das Sediment wird mit 1 ml 2%Glutaraldehyd (in 0,01M Na-Cacodylat-Puffer) fixiert. 20 µl der Zellsuspension werden auf mit 0,01% Poly-L-Lysin beschichteten
Material und Methoden
Deckgläschen gegeben und getrocknet. Anschließend werden die getrockneten Zellen drei-mal für 10min mit Na-Cacodylat-Puffer gewaschen und für 1h bei 4°C mit 1% Osmiumtetrao-xid (OSO4) nachfixiert. Zur Entfernung von OSO4 werden die Zellen zweimal mit ddH2O ge-spült und die Proben in einer aufsteigenden Isopropanolreihe (2x5 min in 30%-50%-70%-80%-90%-100%-Isopropanol) entwässert. Nach der critical point Trocknung in dem Gerät Polaron CPD7501, wobei die Präparate auf 40°C erwärmt werden und einem Druck von 1300 psi ausgesetzt sind, erfolgt die Befestigung der Deckgläschen auf Metallträgern und die Be-schichtung mit Goldstaub. Die Präparate werden mit einem Rasterelektronenmikroskop (Phi-lips PSEM 500) untersucht. Die Dokumentation erfolgt mit einer Kleinbildkamera und einem APX schwarz/weiß Film. Die Aufnahmen werden zusätzlich digitalisiert.
2.2.4.3 Immunfluoreszenzmikroskopie
Mit der Immunfluoreszenzmikroskopie lassen sich Moleküle in Zellen mit Hilfe von fluores-zenzmarkierten Antikörpern nachweisen. Mit dieser Methode können auch DNA-enthaltende Zellorganellen, wie der Nukleus und Kinetoplast, mittels DAPI-Färbung (4`,6-Diamidino-2-phenylindol) sichtbar gemacht werden.
Die zuvor auf Objektträgern fixierten Zellen (siehe 2.2.1.5) werden zunächst für 10min mit Waschpuffer (PBS [pH 7.0], 0,01% Triton X-100) gewaschen und anschließend permeabili-siert. Die Permeabilisierung der Zellen erfolgt für 15min mit Permeabilisierungslösung (50 mM NH4Cl, PBS [pH 7.0], 0,1% Triton X-100). Um freie Bindungsstellen abzusättigen werden die Zellen anschließend 20min mit Blockierungslösung (2% BSA in PBS, 0,1% Triton X-100) be-handelt. Nach einem weiteren Waschschritt erfolgt die Inkubation mit dem in Blockierungslö-sung verdünnten primären Antikörpern (anti-Sti1, anti-Hsp70 bzw. anti-Hsp90, 1:250-1:500) für 1h. Nach dreimaligem Waschen folgt die Inkubation mit dem sekundären Antikörper ver-dünnt in Blockierungslösung (Alexa 488-gekoppelter anti-Maus AK bzw. Alexa 594-gekoppel-ter anti-Huhn AK,1:250-1:500) für 1h. Nach dreimaligem Waschen werden die Zellen mit dem DAPI-Farbstoff (1:50 in Blockierungslösung) für 1h inkubiert und anschließend mehrmals ge-waschen. Die Inkubation der Zellen mit den Antikörpern und dem DAPI-Farbstoff wird im Dunkeln durchgeführt. Als Negativkontrolle wurden die Zellen nur mit dem primären Antikör-per, nur mit dem sekundären Antikörper oder nur mit DAPI behandelt. Abschließend werden die Präparate mit einem Tropfen Mowiol Eindeckmedium (25% Glyzerol, 0,1 M Tris-HCl [pH 8.5], 10% Mowiol 4-88) und einem Deckgläschen versehen. Durch die Lagerung der Präpara-te bei 4°C wird das Eindeckmedium fest. Für die Auswertung der in vitro Infektionen werden
die Zellen nur mit DAPI gefärbt. Für die Analyse der Ko-Lokalisation von Sti1 mit Hsp90 und Hsp70 in L. donovani werden die Proteine durch fluoreszierende Antkörper sichtbar gemacht und die DNA-enthaltenden Organellen mittels DAPI gefärbt. Die Proben werden bei 100-fa-cher Vergrößerung am Epi-Fluoreszenzmikroskop (Leica) oder bei 100-fa100-fa-cher Vergrößerung am konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Olympus) betrachtet.
2.2.5 Datenverarbeitung
2.2.5.1 Bildbearbeitung
Die Auswertung der digitalen Aufnahmen der Infektionsstudien am Epi-Fluoreszenzmikroskop und der Ko-Lokalisationsstudie am konfokalen Fluoreszenzmikroskop erfolgt mit der Software Openlab 5.0. Die Graphen zur Bestimmung der Wachstumskinetik, Infektionsraten, Parasiten-lasten und Quantifizierung der mRNA-Level werden mit der Software GraphPad Prism 5.0 ge-staltet. Die Coomassie-Brilliant-Blau gefärbten SDS-Gele und Immunoblots werden mit einem Flachbettscanner (Epson Perfection V700 Photo) digitalisiert. Die Agarosegele werden unter UV-Ausleuchtung fotografiert. Die Bestimmung der Zellkörperlänge erfolgt mit der Software Intaglio 3.0.2. Die Bearbeitung der Aufnahmen erfolgt mit der Software Abode Photoshop CS3 Extended 10.01 und die Beschriftung der Abbildungen mit der Software Intaglio 3.0.2. in silico Klonierungen werden mit der Software MacVector 12.0.5 durchgeführt.
2.2.5.2 Statistische Auswertung
Für die Berechnung der Signifikanzen wird der Mann-Whitney U-Test durchgeführt (http://elegans.som.vcu.edu/~leon/stats/utest.html). Zur Quantifizierung von Proteinbanden wird die Software ImageJ 10.2 verwendet. Die Anzahl der durchgeführten Experiment ist in der Legende der jeweiligen Abbildung aufgeführt (n).
2.2.5.3 Vergleich von Hsp90-Proteinsequenzen
Für die vergleichende Analyse von Proteinsequenzen wird ein ClustalW alignment oder MUSCLE alignment mit der Software MacVector 12.0.5 durchgeführt. Für diese Analyse wer-den die Hsp90-Proteinsequenzen unterschiedlicher Organismen eingesetzt. Folgende Prote-insequenzen werden analysiert: L. braziliensis LbrM.33.0350, L. mexicana LmxM32.0312, L.
Material und Methoden
major LmjF.33.0312, L. infantum #1 LinfJ.33.0350), H. fuscoatra EU747829, T. cruzi Tc00.1047053509105 und T. brucei Tb427.10.10890, P. falciparum PF3D7_0708400, To-xoplasma gondii AY292379, Homo sapiens NM_001017963, S. cerevisiae AAA02743.