4.1 Hsp90-ein zentrales Chaperon beteiligt an der Reifung unterschiedlicher Klien-tenproteine und somit essentiell für diverse zelluläre Prozesse
Molekulare Chaperone binden während der Hitzeschockantwort einer Zelle unspezifisch de-naturierte Proteine und verhindern so die Bildung schädlicher Proteinaggregate. Die Chapero-nenaktivität diverser Hitzeschockproteine ist für die Lebensfähigkeit der Zelle, besonders un-ter Stressbedingungen, von zentraler Bedeutung.
Das molekulare Chaperon Hsp90 ist zwar auch an der zellulären Hitzeschockantwort beteiligt, spielt aber hauptsächlich während der Reifung, Aktivierung und Faltung von diversen Klien-tenproteinen eine entscheidende Rolle. Hsp90 verhilft nicht nur “guten“ Proteinen zur vollständigen Reifung und Aktivierung sondern ist auch mit der Reifung des mutierten Tumor-suppressorproteins p53 und diverser Onkogene, wie z.B. erbB2 und raf-1, assoziiert (Levine, 1992; Nigro et al., 1989; Ochel et al., 2001). Hsp90 ist somit ein interessantes Targetprotein für Substanzen mit Antitumoraktivität, wie die bekannten Inhibitoren GA und RAD. Eine weitere Schattenseite von Hsp90 ist, dass auch die Reifung diverser Virusproteine an die Hsp90-Funktion der Wirtszelle gekoppelt ist. Das wiederum macht Hsp90-Inhibitoren auch zu poten-tiellen antiviralen Wirkstoffen (Geller et al., 2012) Die Antitumoraktivität des derivatisierten GA-Analogon 17AAG wurde bereits in klinischen Studien getestet (Whitesell und Lindquist, 2005), aber seit 2010 nicht mehr weiterverfolgt (http://www.myelomabeacon.com/news/2010/07/22/
tanespimycin-development-halted/), trotz guter Erfahrung.
4.2 Hsp90 spielt bei der Stadienumwandlung diverser protozooischer Parasiten eine wichtige Rolle und eröffnet somit neue therapeutische Möglichkeiten
Während der Übertragung von protozooischen Erregern auf den Wirtsorganismus sind diese drastischen Veränderungen der Umgebungsbedingungen ausgesetzt und an diese ange-passt. Der drastische Wechsel der Umgebungsbedingungen ist mit dem komplexen Lebens-zyklus der Parasiten assoziiert und induziert die Umwandlung der Parasitenstadien. Somit ist es nicht unerwartet, dass die Proliferation und Adaption der Erreger innerhalb des neuen Um-gebungsmileus von der Hsp90-Funktionalität abhängt.
Für L. donovani konnte gezeigt werden, dass Hsp90 eine zentrale Rolle bei dem komplexen Umwandlungsprozess des Parasiten spielt. Die Hsp90-Homöostase kontrolliert die Umwand-lung von der extrazellulären promastigoten Form in die intrazelluläre amastigote Form, wobei der Temperaturanstieg die Hsp90-Homöostase stört und so die Umwandlung induziert. Auch die pharmakologische Inhibition von Hsp90 führt zur Stadienumwandlung des Erregers, wo-bei die Inhibitor-induzierte Umwandlung unabhängig von Veränderungen des Umgebungsmi-leus erfolgt. Inhibitor-behandelte Zellen weisen nicht nur eine amastigoten-ähnliche Morpho-logie auf sondern exprimieren auch die Stress-Proteine der A2-Familie und arretieren in der G2-Phase des Zellzyklus. Auch die Behandlung mit RAD führte zu einem Inhibitor-induzierten Wachstumsarrest und zur Stadienumwandlung in amastigoten-ähnliche Zellen (Hombach et al., 2012; Wiesgigl und Clos, 2001). Wie bereits Wiesgigl und Clos (2001) zeigen konnten, er-möglicht die spontane oder rekombinante Überexpression von Hsp90wt das Wachstum der Zellen unter GA. Das konnte auch in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden. Die Wirkung von RAD scheint, verglichen mit der von GA, stärker zu sein, da beobachtet wurde, dass eine rekombinante Hsp90wt-Überexpression die Zellen nicht vor einem Wachstumsarrest schützt (Hombach et al., 2012). Die Erklärung hierfür ist, dass RAD eine deutlich höhere Affinität ge-genüber der ATP-Bindungstasche besitzt als GA (Roe et al., 1999).
Der Erreger der Malaria tropica, P. falciparum (Pf), ist ebenfalls ein gutes Beispiel dafür, wie diverse Parasiten die Hsp90-Maschinerie nutzen, um auf Veränderungen der Umgebungsbe-dingungen zu reagieren. P. falciparum erfährt während der Übertragung auf den Wirtsorga-nismus eine drastische Erhöhung der Umgebungstemperatur. Des Weiteren hat der Erreger sich an die rapiden Temperaturfluktuationen, während der periodisch auftretenden Fieber-schüben, die mit der Malaria assoziiert sind, angepasst. Die Expression von PfHsp90 wird durch den Temperaturanstieg induziert und ist somit maßgeblich an der Hitzestressantwort von P. falciparum beteiligt. Die pharmakologische Inhibition von PfHsp90 verhindert die Um-wandlung der heran reifenden Ringform zum aktiven Trophozoit von P. falciparum und stoppt somit die Vermehrung des Parasiten in infizierten Erythrozyten (Banumathy et al., 2003).
Für T. cruzi konnte gezeigt werden, dass die pharmakologische Inhibition von Hsp90 das Wachstum des Parasiten in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert und die Umwandlung in ein Zwischenstadium, die Spheromastigote, induziert (Graefe et al., 2002). Eine ähnliche Funktion von Hsp90 konnte auch für eine Vielzahl weiterer protozooischer Erreger nachgewiesen wer-den. Hsp90 ist somit ein zentrales Protein, dass aufgrund seiner Funktion entscheiden für die Stadiendifferenzierung und somit für das Überleben diverser human-pathogener Parasiten ist.
Diskussion
Die Tatsache, dass die Funktion von Hsp90 so eng mit der lebenswichtigen Stadienumwand-lung diverser protozooischer Erreger assoziiert ist, macht das Protein zu einem potentiellen Medikamenten-Target. Einige Studien belegen das Potential von Hsp90 als mögliches Target-protein gegen parasitäre Infektionskrankheiten wie Malaria, Trypanosomiasis und Leishmanio-se (Pallavi et al., 2010; PeterLeishmanio-sen et al., 2012).
Petersen et al. (2012) analysierten ausführlich den Effekt des Hsp90-Inhibitors 17AAG in vivo.
Hierfür wurden mit L. amazonensis infizierte Makrophagen mit unterschiedlichen 17AAG-Do-sen behandelt. Es zeigte sich, abhängig von der Inhibitordosis und der Behandlungsdauer, dass sich die Parasitenlast innerhalb der infizierten Makrophagen stark reduzierte. Des Weite-ren ergab diese Studie, dass eine 17AAG-Behandlung die wirtseigene Produktion von anti-mikrobiellen Molekülen (O2-, NO) und pro-inflammatorischen Substanzen, wie TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ, nicht induziert, sondern verglichen mit einer unbehandelten Infektion sogar redu-ziert. Die Autoren vermuten, dass 17AAG das Überleben des Parasiten direkt beeinflusst und keine toxischen Auswirkungen auf die Wirtszelle hat. Eine kutane und mukokutane Leishma-niose ist mit einer starken Entzündungsreaktion assoziiert, was zur Zerstörung des infizierten Gewebes führen kann. Somit stellt 17AAG aufgrund der Eliminierung des Erregers und der reduzierten Produktion pro-inflammatorischer Substanzen eine mögliche Behandlungsme-thode gegen diese Formen der Leishmaniose dar. Allerdings konnte bereits gezeigt werden, dass der Effekt von GA zumindest in vitro durch spontane Amplifikation von Hsp90-Genen abgeschwächt werden kann (Wiesgigl und Clos, 2001).
4.3 Hsp90-ein multi copy-Gen, das bislang nicht durch reverse Genetik untersucht werden konnte
In den Kinetoplastida existieren mehrere Hsp90-Gene, die in einer head-to-tail Anordnung als ausgedehnte Genkluster organisiert sind. Für L. major wurden insgesamt 17 identische und hintereinander angeordnete Hsp90-Gene auf Chromosom 33 identifiziert. Für L. braziliensis, L. infantum und L. donovani wurden jeweils 5 beziehungsweise 3 und >6 Hsp90-Gene auf Chromosom 33 identifiziert (Folgueira und Requena, 2007; Hubel und Clos, 1996; Silva et al., 2013). Im Genom von T. cruzi konnten 6 Hsp90-Gene identifiziert werden (Folgueira und Re-quena, 2007). T. brucei verfügt über 10-12 hintereinander angeordnete Genkopien (Mottram, 1989).
Da Hsp90 für die Aktivierung vieler unterschiedlicher Proteine erforderlich ist und diese an der Regulation einer Vielzahl von intrazellulären Prozessen beteiligt sind, ist Hsp90 essentiell für
die Lebensfähigkeit eukaryontischer Organismen. Die essentielle Funktion von Hsp90 und die Anordnung der identischen Genkopien als große Genkluster, verhinderten bis jetzt die Herstel-lung einer Hsp90-Nullmutante in L. donovani. Prinzipiell, ist es in Leishmanien sehr einfach, single copy Gene durch homologe Rekombination gegen Antibiotika-Resistenzgene auszu-tauschen und somit Nullmutanten zu erzeugen (Ommen et al., 2009). Diese Methode ist auch innerhalb der Arbeitsgruppe gut etabliert und konnte bereits für diverse Gene erfolgreich an-gewendet werden (Chrobak et al., 2012; Hubel et al., 1997; Morales et al., 2010; Ommen et al., 2010; Ommen et al., 2009). Dennoch ist bislang weder hier noch in anderen Laboren ein Austausch von großen Genklustern in Leishmanien gelungen.
4.4 Etablierung einer RAD-resistenten Hsp90-Variante in L. donovani
Da der Austausch von Hsp90 mittels homologer Rekombination keinen Erfolg versprach, war es nötig, alternative Systeme zu etablieren, die es ermöglichen, die Funktion des Proteins und die damit verbundenen Auswirkungen auf die Parasitenstadien in Abhängigkeit von bestimm-ten Sequenzmotiven zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit gelang es erstmalig, ein Sys-tem zu etablieren, das auf der episomalen Expression einer RAD-resistenten Hsp90-Variante basiert (Hsp90rr).
RAD-Resistenz ist ein natürlich vorkommendes Phänomen in diversen RAD-produzierend Pilzarten (Prodromou et al., 2009; Turbyville et al., 2006). RAD und GA binden spezifisch an die ATP-Bindungstasche von Hsp90, inhibieren dadurch die ATPase-Aktivität und verhindern so die Aktivierung diverser Klientenproteine. Der RAD-Resistenz-Mechanismus konnte durch die Analyse der ATP-Bindungstaschen der Hsp90-Homologe aus S. cerevisae und dem RAD-produzierenden Pilz H. fuscoatra genauer beschrieben werden. Für die RAD-Resistenz von H.
fuscoatra ist eine Aminosäuresubstitution an Position L34I in der konservierten ATP-Bin-dungstasche von Hsp90 verantwortlich. Analysen der Co-Kristallstruktur der L34I-Hsp90-Va-riante ergab, dass Isoleucin die Bindung eines weiteren Wassermoleküls ermöglicht, wodurch das Anheften des RAD-Chloratoms verhindert wird (Prodromou et al., 2009).
In der Hsp90-Sequenz von L. donovani (L.d.) befindet sich das entsprechende Leucin (L) an Position 33 (siehe 3.1, Abb 3). Ein einfacher Isoleucine-Aminosäureaustauschs an Position L33 führt zu einer geringeren Affinität von L.d.Hsp90rr gegenüber RAD, beeinflusst nicht die Funktion des Proteins und stabilisiert das Promastigotenstadium unter RAD-Selektion auf-recht. Somit liefern die hier gezeigten Daten den endgültigen Beweis, dass Hsp90 direkt an der Morphogenese und der Proliferation der Promastigote beteiligt ist. Des Weiteren zeigen
Diskussion
die Daten dieser Arbeit, dass wahrscheinlich nur die zytosolische Hsp90-Isoform in L. dono-vani, und nicht die Isoformen Grp94 und TRAP1, an der Stadienkonversion beteiligt ist.
Auch das intrazelluläre Amastigotenstadium wird durch eine RAD-Vorbehandlung nicht beein-flusst. Das Wachstum und somit das Überleben beider Stadien hängt vollständig von der Synthese der mutierten Hsp90-Variante ab, da endogen-kodiertes Hsp90 durch RAD inhibiert wird. Die RAD-Resistenz, identifiziert für H. fuscoatra, ist somit auf andere Organismen über-tragbar (Hombach et al., 2012; Prodromou et al., 2009). Denn es zeigte sich, dass nur die Zel-len in der Lage waren zu proliferieren, die Hsp90rr synthetisieren. Die Hsp90wt-überexprimie-renden Zellen hingegen waren unfähig unter RAD zu wachsen, wogegen die Hsp90-Überex-pression zu einem Gen-Dosis-Effekt, der die Proliferation der Zellen unter GA ermöglicht, führt. Die Tatsache, dass nur Hsp90rr-synthetisierende Zellen unter RAD-Selektion wachsen können zeigt, dass die Mutation spezifisch für die Interaktion von Hsp90 mit RAD ist. RAD und GA unterscheiden sich strukturell voneinander und interagieren auch mit unterschiedli-chen Aminosäuren in der ATP-Bindungstasche von Hsp90 (Grenert et al., 1997; Schulte et al., 1999). Die unterschiedlichen Interaktion der Inhibitoren mit unterschiedlichen Aminosäuren erklärt die Spezifität der Mutation gegenüber RAD.
Auch die Expression der A2-Protein-Familie wird durch eine RAD- und GA-Behandlung indu-ziert (Wiesgigl und Clos, 2001). A2-Proteine gelten als Marker für Stress und werden von den Zellen nach Temperaturerhöhung und während der Umwandlung in axenische Amastigote exprimiert. Die A2-Proteinfamilie wird nicht von allen Leishmania-Arten exprimiert, z.B. nicht von L. major, aber von L. donovani (Zhang und Matlashewski, 2001). In der vorliegenden Ar-beit konnte die Expression der A2-Proteine nach einer RAD-Behandlung von L.d.wt und L.d.Hsp90wt nachgewiesen werden. Hingegen konnte keine A2-Protein-Expression für L.d.Hsp90rr bestimmt werden (nicht gezeigte Daten). Dass bedeutet, dass die Synthese von Hsp90rr den Parasiten vor RAD-induziertem Stress schützt.
Auch die Infektion von Makrophagen zeigte, dass die RAD-Präinkubation von LdHsp90wt sich signifikant auf die intrazelluläre Proliferation auswirkt. Allerdings hat die RAD-Vorbehand-lung nur einen geringen Einfluss auf die Infektiösität der Zelle (Reduktion um ca. 30%). Das Infektionsexperiment, durchgeführt zur Analyse der Sti1-Hsp90-Interaktion (siehe 3.2.5, Abb 14), zeigte, dass sich die Infektionsrate von L.d.Hsp90wt nach einer 48-stündigen Infektions-dauer halbierte. Möglicherweise ist der Parasit nicht in der Lage neue Makrophagen zu infizie-ren oder die infizierten Makrophagen können diesen eliminieinfizie-ren. Da die Funktion von Hsp90 mit der Stressantwort assoziiert und für die Anpassung des Erregers an das intrazelluläre Mi-lieu wichtig ist, führt eine Hsp90-Inhibition eventuell zu einer verringerten Toleranz des Parasi-ten gegenüber dem sauren pH, der erhöhParasi-ten Temperatur sowie den wirtseigenen
antimikro-biellen Molekülen (O2-, NO). Eine Wiederholung dieses Experiments mit einer längeren Infekti-onsdauer (72h) könnte, an Hand der Infektionsrate und Parasitenlast, aufklären, ob der Parasit intrazellulär eliminiert wird. Zusätzlich wäre eine Optimierung des Infektionssystems notwen-dig. Bislang wurden die rekombinanten Parasiten vor Beginn der Infektion mit RAD prä-inku-biert, wodurch der Kontakt von wirtseigenem Hsp90 mit RAD verhindert wird. Welche RAD-Konzentration vom Makrophagen toleriert wird und ob der Inhibitor direkt der Infektion zuge-setzt werden kann ist bislang unklar. Denkbar wäre es auch, transgene Mäuse mit RAD-resis-tenten Hsp90α und Hsp90β herzustellen. Makrophagen aus solchen Mäusen wären gegen-über RAD unempfindlich.
Dass L.d.Hsp90rr in der Lage ist unter RAD-Selektion zu wachsen, sich nicht in amastigoten-ähnliche Zellen umwandelt und weiterhin intrazellulär proliferiert zeigt, dass die Mutation an Position L33I sich nicht auf die Funktionalität des Proteins auswirkt. Eine Möglichkeit dies zu bestätigen, wäre die Analyse der ATPase-Aktivität. Es ist davon auszugehen, dass die essen-tielle ATPase-Aktivität durch den Aminosäureaustasch nicht maßgeblich beeinflusst wird, da Hsp90rr-synthetisierende Zellen proliferationsfähig sind und keinen auffälligen Phänotyp auf-weisen. Weitere Möglichkeiten, um die Funktionalität von Hsp90rr nachzuweisen ist die Ana-lyse der Interaktion mit dem Co-Chaperon p23, das die N-terminale Domäne von Hsp90 bin-det, und der Aktivierung von Klientenproteinen. Bislang wurden noch keine spezifischen Kli-entenproteine von Hsp90 aus L. donovani identifiziert. Die Identifizierung spezifischer Klien-tenproteine, z.B. durch Ko-Präzipitationsanalysen, würde die Möglichkeit eröffnen, die Funkti-on vFunkti-on Hsp90 besser zu charakterisieren und zu verstehen. Die reduzierte Affinität vFunkti-on LdHsp90rr gegenüber RAD könnte durch einen RAD-Bindungs Assay verifiziert werden.
4.5 Das Repertoire an Co-Chaperonen ist organismusspezifisch und klientenabhän-gig
Die Reifung der Klientenproteine wird durch die Interaktion von Hsp90 mit diversen Co-Cha-peronen gewährleistet. Co-Chaperone regulieren direkt die ATPase-Aktivität von Hsp90 oder vermitteln die Interaktion von Hsp90 mit spezifischen Klientenproteinen und anderen Cha-peronen (Felts und Toft, 2003; Lee et al., 2012; Prodromou, 2012; Prodromou et al., 1999;
Riggs et al., 2004; Zuehlke und Johnson, 2012). Eine Vielzahl Hsp90-assoziierter Co-Cha-peronen wurden durch Ko-Präzipitations-Analysen und der Reinigung isolierter Hsp90-Kom-plexe aus humanen Zellextrakten oder Hefezellextrakten identifiziert.
Diskussion
Leishmanien verfügen bekanntermaßen über ein komplexes Co-Chaperonen-Repertoir (Johnson und Brown, 2009), wobei einige der Co-Chaperone in L. donovani essentiell sind. Zu diesen zählen die TPR-enthaltenden Proteine Sti1 und Sgt1 (Morales et al., 2010; Ommen et al., 2010). Andere Co-Chaperone sind nicht essentiell bzw. das Fehlen des Proteins kann zumindest in der Promastigote und teilweise in der Amastigote kompensiert werden. Zu die-sen zählen die TPR-enthaltenden Co-Chaperone Hop2 und Hip (Ommen et al., 2009) sowie p23 (Ommen und Hombach, unveröffentlichte Daten). Die Frage, ob auch die Interaktion von Hsp90 mit seinen Co-Chaperonen wichtig für die Proliferation beider Parasitenstadien ist, wurde bislang nicht beantwortet. Das in der vorliegenden Arbeit etablierte Hsp90rr-System ermöglicht nun, solche Fragestellung zu untersuchen.
4.5.1 Die Hsp90-Sti1-Interaktion ist entscheidend für die Proliferation beider Parasi-tenstadien
In der vorliegenden Arbeit wurde mit dem etablierten Hsp90rr-System zunächst die Interaktion von Hsp90 mit dem essentiellen Co-Chaperon Sti1 genauer untersucht. Sti1 ist ein essentiel-les Co-Chaperon. Der Austausch beider Sti1-Allele in L. donovani durch homologe Rekombi-nation resultiert in nicht lebensfähigen Parasiten (Morales et al., 2010). Die Übertragung nati-ver Klientenproteine von Hsp70 auf Hsp90, das die abschließende Reifung oder Aktivierung der Klienten katalysiert, wird durch die simultane Interaktion beider Chaperone mit Sti1 ver-mittelt. Es stellte sich die Frage, ob die Hsp90-Sti1-Interaktion wichtig für beide Entwick-lungsstadien ist.
Der Vergleich des Wachstumsverhalten der rekombinanten Parasiten unter RAD-Selektion er-gab, dass die Deletion des Sti1-Bindemotivs zu einem deutlichen Wachstumsarrest und zur Inhibitor-induzierten Stadienumwandlung führte (siehe 3.2.3, Abb12 und 3.2.4, Abb 13). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das Fehlen des Sti1-Motivs zu einer halbierten Ko-Im-munpräzipitations (Ko-IP)-Effizienz führte (siehe 3.2.6, Abb 18). Es wurde auch beobachtet, dass eine RAD-Behandlung keinen direkten Einfluss auf die Interaktion der Proteine hat, da Sti1 weiterhin auch an Hsp90wt bindet. Dennoch weist L.d.Hsp90wt unter RAD ein arretiertes Wachstum auf. Der beobachtete Phänotyp von L.d.Hsp90rr:∆695 ist somit wahrscheinlich auf das Fehlen der Hsp90-Sti1-Interaktion zurück zuführen. Das deletierte Protein konnte, wenn auch in reduzierter Konzentration, nachgewiesen werden. Sti1 wird nur von einem Hsp90-Monomer des dimeren Komplexes gebunden (Li et al., 2011). Somit ist es wahrscheinlich, dass Hsp90rr:∆695 gemischte Komplexe mit der endogen-kodierten Hsp90-Variante bildet.
An diese Variante kann Sti1 weiterhin binden und ermöglicht somit die zusätzliche Ko-IP der deletierten Hsp90-Form. Möglicherweise ist die deletierte Hsp90-Variante auch instabiler und wird schneller vom Proteasom abgebaut. Das könnte die reduzierten Proteinmenge der input-Fraktion vor RAD-Behandlung erklären (siehe 3.2.6, Abb 16).
Bislang ist unklar, welche weiteren TPR-enthaltenden Co-Chaperone an das Motiv N‘-MEQVD-C‘ binden und ob diese Interaktionen wichtig für die Parasitenproliferation sind. Mög-liche TPR-enthaltende Co-Chaperone, die eventuell an das N‘-MEQVD-C‘ Motiv binden sind das essentielle Protein Sgt1 (Ommen et al., 2010) oder die nicht essentiellen Proteine HIP und HOP2 (Ommen et al., 2009). Diese Fragestellung könnte mit dem etablierten Hsp90rr-System beantwortet werden.
Die in vitro Infektion von Maus-Knochenmarks-Makrophagen mit RAD-präinkubierten Parasi-ten ergab, dass das Fehlen der Hsp90-Sti1-Interaktion zu einer starken Abnahme der intrazel-lulären Proliferation führt (siehe 3.2.5, Abb 14). Bereits nach einer 24-stündigen Infektionsdau-er reduziInfektionsdau-erte sich die durchschnittliche Parasitenlast infiziInfektionsdau-ertInfektionsdau-er Makrophagen um ca. 30%.
Nach einer 48-stündigen Infektionsdauer sank die Parasitenlast um insgesamt ca. 50%. Die Infektionsrate von L.d.Hsp90rr:∆695 wurden durch eine RAD-Präinkubation nicht beeinflusst.
Es ist nicht klar, ob eine längere Infektionsdauer (z.B. 72-96 h) zur Abnahme der Infektionsrate führen würde. Dies konnte für L.d.Hsp90wt bereits nach einer 48h-stündigen Infektionsdauer beobachtet werden und deutet auf eine mögliche Eliminierung des Erregers durch die Wirts-zelle hin.
Zusammengefasst lässt sich sagen, dass nicht nur funktionell aktives Hsp90 sondern auch die Interaktion des Chaperons mit seinem Co-Chaperon Sti1 für beide Parasitenstadien von großer Bedeutung ist. Das Fehlen der Hsp90-Sti1-Interaktion hat wahrscheinlich zur Folge, dass naszierende Klientenproteine nicht auf Hsp90 transferiert und somit nicht aktiviert wer-den. Das wiederum hätte zur Folge, dass für diverse zelluläre Prozesse benötigte Proteine nicht verfügbar sind und die Zelle in ihrem Wachstum arretiert (Pearl und Prodromou, 2006;
Riggs et al., 2004; Wegele et al., 2004).
Eine interessante Alternative, um die wichtige Bedeutung der Hsp90-Sti1-Interaktion zu verifi-zieren ist, dass der neuartige Chaperoneninhibitor C9 die Interaktion von Hsp90 mit Sti1 ver-hindert und dadurch den Reifungszyklus der Klientenproteine blockiert. Die Aktivität dieses Inhibitors konnte bereits in unterschiedlichen Brustkrebszelllinien bestätigt werden und führt zum Absterben dieser Zelllinien (Pimienta et al., 2011; Yi und Regan, 2008).
Diskussion
4.5.2 Synthese des konservierten Sti1-Bindungsmotivs führt zu einem Anstieg der extrazellulären und intrazellulären Proliferation
Eine vergleichende Analyse des am C-Terminus lokalisierten Sti1-Bindungsmotiv ergab, dass Hsp90 aus Leishmanien an Position 698 des hochkonservierten Motivs N‘-MEEVD-C‘ ein leicht Glutamin (Gln, Q) tragen (N‘-MEQVD-C‘) (Hombach et al., 2012).
In der vorliegenden Arbeit wurde Untersucht, ob die Synthese der kanonischen Sequenz N‘-MEEVD-C‘ Auswirkungen auf beide Parasitenstadien hat. Es zeigte sich, dass unter RAD die Synthese des “optimierten“ Proteins zu einem nicht-signifikant erhöhtem Wachstum der Pro-mastigote führt (verglichen mit L.d.Hsp90rr) (siehe 3.2.3, Abb 12). Zusätzlich zeigte LdHsp90rr:Q698E keine morphologischen Merkmale einer Inhibitor-induzierten Stadienum-wandlung und weist nach RAD-Behandlung eine durchschnittliche Zellkörperlänge von ca. 11 µm auf (siehe 3.2.4, Abb 14). Die Synthese des “optimierten“ Sti1-Bindungsmotivs hat offen-sichtlich keine negativen Auswirkungen auf das promastigoten Stadium. Auch die in vitro In-fektion von Makrophagen ergab, dass L.d.Hsp90rr:Q698E in der Wirtszelle proliferiert und die Parasitenlast nach längerer Infektionsdauer ansteigt (siehe 3.2.5, Abb 14). In diesem Experi-ment konnte für die Makrophagen, infiziert mit L.d.Hsp90rr:Q698E, jeweils nach 24-stündiger und 48-stündiger Infektionsdauer die höchste Parasitenlast (ca. 22 bzw. 25 Parasiten pro infi-ziertem Makrophage) bestimmt werden. Die Synthese des konservierten Sti1-Bindemotivs verleiht offensichtlich sowohl der Promastigote als auch der Amastigote einen geringfügigen Wachstumsvorteil.
Die Bestimmung der Ko-IP-Effizienz ergab, dass die Interaktion von Sti1 mit 3HA::Hsp90:Q698E stärker ist, als die Interaktion mit 3HA::Hsp90wt oder 3HA::Hsp90rr (siehe 3.2.6, Abb 18). Möglicherweise assoziiert das konservierte Bindemotiv stärker mit Sti1 und verleiht dadurch beiden Parasitenstadien einen Wachstumsvorteil. Ob eine stärkere Interakti-on vInterakti-on Hsp90 mit Sti1 auch die Stresstoleranz des Parasiten erhöht, ist bislang nicht unter-sucht. Dennoch belegen die hier gezeigten Daten den enormen Einfluss der Interaktion von Hsp90 mit Sti1 sowie die wichtige Rolle eines funktionierenden Multichaperonen-Komplexes für das Wachstum der extra- und intrazellulären Erregerform.
Warum Leishmanien ein leicht abgeändertes Sti1-Bindemotiv exprimieren ist bislang unklar.
Sti1 inhibiert die ATPase-Aktivität von Hsp90. Eine zu starke Assoziation von Sti1 mit Hsp90 führt möglicherweise zu einer weiteren Verringerung der inherent gerringeren ATPase-Aktivität
in Leishmania (Prodromou et al., 1999; Silva et al., 2013). Möglicherweise verhindert eine ab-geschwächte Hsp90-Sti1-Interaktion eine zu starke Dämpfung der essentiellen ATPase-Aktivi-tät. Dies lässt sich jedoch schwer überprüfen, da die Wechselwirkung von Leishmania Hsp90 und Sti1 in vitro nicht nachgestellt werden konnte.
Auch der intrazelluläre Erreger T. cruzi sowie der Protozoon Tetrahymena thermophilia, die Al-ge Thalassiosira pseudonana, der Schleimpilz Dictyostelium discoidum und die einzelligen Pa-rasiten Giardia lamblia und E. cuniculi weisen eine veränderte Aminosäurekomposition des Sti1-Bindemotivs auf (Hombach et al., 2012; Johnson und Brown, 2009). Für E. cuniculi ist bekannt, dass dieser Organismus über keine Gene verfügt, die für TPR-enthaltende Co-Cha-perone kodieren. Es wird postuliert, dass das Fehlen dieser Co-ChaCo-Cha-perone mit den Sequenz-unterschieden am C-Terminus von Hsp90 zusammen hängt (Johnson und Brown, 2009). Das Arsenal an TPR-enthaltende Proteine ist organismusabhängig (Johnson und Brown, 2009), womit sich eventuell erklären lässt, warum in Leishmanien und andere Organismen das Bin-demotiv für diese Co-Chaperone variiert. Das Repertoire an Co-Chaperonen und deren Inter-aktion mit Hsp90 stellt einen spezifischen Mechanismus dar, der unterschiedliche Organismen an differenzierte Lebensbedingungen anpasst. Da wahrscheinlich noch weitere Co-Chapero-ne mit dem N‘-MEQVD-C‘ interagieren, wäre es denkbar, dass die ungewöhnlich Sequenz bei anderen Interaktionen Vorteile bringt. Allerdings zeigen die Daten dieser Arbeit nur, dass auf organismischer Ebene die kanonische N‘-MEEVD-C‘ zu einer leicht verbesserten Viabilität des Parasiten führt. Eine Analyse der Interaktion des “optimierten“ Motivs mit anderen Co-Cha-peronen wurde bislang noch nicht durchgeführt.
4.6 Analysierte Hsp90-P-Stellen aus L. donovani sind teilweise konserviert
In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der Hsp90-Phosphorylierung für die Funktio-nalität des Proteins untersucht. Dies geschah durch Mutationsanalyse. Es wurden insgesamt sieben Phosphorylierungsstellen (P-Stellen) modifiziert. Die P-Stellen an Position T223 und S526 wurde zuvor für L. donovani identifiziert und sind bereits publiziert (Morales et al., 2010).
Alle weiteren P-Stellen (T216, S289, S594 und S595) wurden bereits für L. mexicana identifi-ziert und sind in L. donovani konserviert (M. Wiese, persönliche Kommunikation). Die in dieser Arbeit untersuchten P-Stellen sind über die gesamte Hsp90-Sequenz verteilt. Einige der Stel-len lokalisieren in der charged linker region, einige in der M-Domäne und in der C-Domäne von Hsp90. Keine der hier untersuchten P-Stellen befindet sich in der N-Domäne von Hsp90.
Diskussion
In der gering konservierten charged linker region von LdHsp90 befinden sich die P-Stellen T211, T216 und T223. Die Aminosäure an Position T211 wurde bislang noch nicht als eindeu-tige P-Stelle für Leishmanien identifiziert. Die humanen Orthologe Hsp90α und Hsp90β (hHsp90) verfügen nicht über konservierten P-Stellen an den korrespondierenden Positionen (R227 in hHsp90α, R222 in hHsp90β) . Hingegen zeigen T. cruzi und T. brucei an dieser Posi-tion ein konserviertes Threonin, was auf eine mögliche regulative P-Stelle an Aminosäureposi-tion 211 hindeutet.
Die P-Stelle T216 ist in der Hsp90-Sequenz der Trypanosomatidae konserviert. Die humanen zytosolischen Orthologe tragen an den korrespondierenden Positionen jeweils Serine (S231 in hHsp90α und S226 in hHsp90β). Diese Serine wurden als eindeutige P-Stellen identifiziert, die von der Casein Kinase II (CKII) phosphoryliert werden. Bei dieser Kinase handelt es sich um eine ubiquitäre azidophile Serin-Theronin-Kinase, deren Aktivität von der Chaperonenaktivität von Hsp90 abhängt (Dougherty et al., 1987; Miyata, 2009; Mollapour und Neckers, 2012; Mol-lapour et al., 2011a). Für L. major wurden bereits zwei Isoformen der Casein Kinase II-Familie identifiziert (Parsons et al., 2005). Somit besteht die Wahrscheinlichkeit, dass die P-Stelle T216 auch in Leishmanien von dieser Kinase phosphoryliert wird.
Eine vergleichende Analyse unterschiedlicher Hsp90-Sequenzen durch MUSCLE alignment (Edgar, 2004) an Position T223 ergab, dass sowohl die zytosolischen humanen Hsp90-Ortho-loge sowie die OrthoHsp90-Ortho-loge aus den Tryanosomatiden an den korrespondierenden Positionen keine phosphorylierbaren Aminosäuren tragen. hHsp90α trägt an der korrespondierenden Po-sition ein Asp (D), hHsp90β ein Glycin (Gly,G) und Hsp90 aus T. cruzi und T. brucei ein Ala (A).
Bereits veröffentlichte Daten postulieren, dass sich an der korrespondierenden Postion (240) im hHsp90 ein Serin befindet und diese Position potentiell durch Phosphorylierung reguliert wird (Morales et al., 2010). Die postulierte P-Stelle S240 wurde bislang noch nicht als eindeu-tige P-Stelle im hHsp90α identifiziert (Mollapour und Neckers, 2012). Des weiteren ist die Re-gion, in der sich die P-Stelle T223 befindet hoch variabel, was Sequenz-alignments erschwert.
Daher ist es möglich, dass die P-Stelle T223 Leishmanien-spezifisch ist. Auch wurde für den hier durchgeführten Proteinsequenzvergleich eine aktueller Algorithmus (MUSCLE) verwendet, wodurch sich das Ergebnis des Vergleichs verändert.
Die P-Stellen S289 und S526 befinden sich in der M-Domäne des Proteins. An Stelle des S289 befindet sich an den korrespondierenden Positionen im hHsp90α sowie im hHsp90β jeweils Threonine (T317 bzw. T309). Diese Aminosäuren werden durch Phosphorylierung mo-difiziert. Die spezifische Kinase, die die Reaktion an diesen Positionen katalysiert, ist bislang nicht bekannt (Mollapour und Neckers, 2012). Auch in T. cruzi und T. brucei ist dagegen das
Serin konserviert. Diese P-Stellen konnte somit bereits in den humanen Isoformen und in Hsp90 aus L. mexicana als eindeutige P-Stelle verifiziert werden.
Die P-Stelle S526 ist in den humanen zytosolischen Orthologen nicht konserviert. hHsp90α und hHsp90β tragen an den korrespondierenden Positionen (554 bzw. 549) ein Asp (D). Die Orthologe aus T. cruzi und T. brucei hingegen besitzen ein Threonin an dieser Stelle. Diese P-Stelle wurde bereits publiziert und die Autoren postulieren, dass es sich um eine Leishmanien-spezifische P-Stelle handelt (Morales et al., 2010). Da Tryanosomatidae und andere einzellige Organismen, wie S. cerevisae, C. elegans, Euglena gracilis, an den korrespondierenden Posi-tionen ein Threonin tragen, das auch durch Phosphorylierung reguliert werden kann, kann nicht von einer Leishmanien-spezifischen P-Stelle gesprochen werden. Dennoch ist die Ana-lyse dieser P-Stelle von großem Interesse, da diese nicht in den humanen Orthologen konser-viert ist, sondern dort mit einer konstitutiv negativ geladenen Aminosäure belegt ist.
Die näher am C-Terminus lokalisierten P-Stellen S594 und S595 werden wahrscheinlich nicht gleichzeitig phosphoryliert (M. Wiese, mündliche Kommunikation). Die P-Stelle S594 ist inner-halb der Kinetoplastida konserviert. Die humanen Orthologe tragen jeweils an den entspre-chenden Positionen (622 im hHsp90α,617 im hHsp90β) ein Asparagin (Asn, N). Somit ist die-se P-Stelle auch nicht funktionell in den humanen zytosolischen Orthologen kondie-serviert. Die P-Stelle S595 hingegen ist hoch konserviert. Die korrespondierende Kinase ist bislang noch nicht bekannt.
4.6.1 Hsp90 aus L. donovani wird stadien-spezifisch phosphoryliert
In der vorliegenden Arbeit wurde in allen bekannten P-Stellen Serine bzw. Threonine durch Alanine (Ala) ersetzt. Ala ist eine unpolare und hydrophobe Aminosäure und der Austausch imitiert eine konstitutive Dephosphorylierung. Die Analyse der Proliferationskinetik der rekom-binaten Parasiten unter RAD ergab, dass alle Ala-Mutationen zu einem intermediären Wachs-tums-Phänotyp führen. Das bedeutet, dass das Wachstum der rekombinanten Parasiten nicht komplett arretiert (wie für L.d.Hsp90wt beobachtet), diese aber auch nicht die Zelldichte errei-chen, die für L.d.Hsp90rr gemessen wurde. Somit ist keine der bislang untersuchten P-Stellen für sich essentiell für das Promastigotenstadium. Auch die Inhibitor-induzierte Stadienum-wandlung in amastigoten-ähnliche Zellen konnte für fast alle der rekombinanten Parasiten be-obachtet werden, die P-Stellen-Mutationen in den Hsp90rr-Transgenen trugen.
Diskussion
Zusätzlich wurden die Serine bzw. Threonine einiger P-Stellen auch gegen ein Asp getauscht.
Dieser Aminosäureaustausch führt zu einer negativen Ladung und imitiert dadurch eine dau-erhafte Dephosphorylierung. Es wurde erwartet, dass dieser Austausch beobachtete Effekte einer Ala-Mutation wieder aufhebt und somit den Phänotyp normalisiert. Dieser Austausch diente somit als Kontrolle. Dass die Asp-Mutationen den Phänotyp, vor allem in der Promasti-gote, nicht wieder herstellen, lässt vermuten, dass nicht eindeutig zwischen den Auswirkun-gen einer fehlenden P-Stelle und möglichen VeränderunAuswirkun-gen in der Proteinstruktur differenziert werden kann.
Die P-Stellen an den Positionen T211 und T216 wurden als Doppelmutante und als Einzelmu-tante untersucht. Eine simultane Ala-Mutation beider Positionen hatte den stärksten inhibitori-schen Effekt auf das Wachstum der Promastigote unter RAD. Dieser Effekt konnte nicht durch eine simultane Asp-Mutation aufgehoben werden (siehe 3.3.1, Abb 21).
Auch die Analyse der Einzelmutationen ergab, dass beide Positionen für die Proliferation der Promastigote von Bedeutung sind. Ein Asp-Austausch konnte den Phänotyp auch nicht auf-heben (siehe 3.3.1, Abb 23). Da T211 bislang nicht als eindeutige P-Stelle in Leishmanien i-dentifiziert wurde, können die beobachteten Effekte nicht eindeutig auf fehlende Phosphor-ylierungsereignisse an dieser Position zurück geführt werden. Auch durch die Mutation verur-sachte Veränderungen der Proteinstruktur können für den beobachten Phänotyp verantwort-lich sein.
Auch der Ala-Austausch an Position S289 führte zu einem starken inhibitorischen Effekt von RAD auf die Promastigote (siehe 3.3.3, Abb 31). Auch im Infektionsversuch führte die Ala-Mu-tation zu einer reduzierten intrazellulären Proliferation der Amastigote und einer geringeren In-fektionsrate. Allerdings zeigten die rekombinanten Parasiten bereits ohne RAD-Präinkubation eine reduzierte Proliferation (siehe 3.3.3, Abb 33) innerhalb der Wirtszelle. Dies könnte auf ei-nen dominant-negativen Effekt hindeuten, der die intrazelluläre Vermehrung der Amastigote bereits ohne RAD-Präinkubation beeinflusst. Da diese P-Stelle nicht in den humanen Ortholo-gen konserviert ist, sollte an dieser Position auch ein Asp-Austausch untersucht werden.
Wenn der Phänotyp unter RAD umkehrbar ist, dann handelt es sich mit großer Wahrschein-lichkeit um eine wichtige P-Stelle für beide Parasitenstadien.
Ein wirklich interessantes Ergebnis ist, dass die inhibierte Proliferation der Amastigote, verur-sacht durch die Ala-Mutation an Position T223, durch einen Asp-Austausch wieder hergestellt wird (siehe 3.3.2, Abb 29). Dieser Effekt konnte nicht für das Promastigotenstadium