838 Notizen
Isolierung von 3-H ydroxyanthranilsäure aus dem Kulturmedium
chloridazonabbauender Bakterien
Isolation o f 3-H ydroxy-anthranilic Acid from the Culture M edium of Chloridazon Degrading Bacteria Robert Buck und Franz Lingens
Institut für Mikrobiologie der Universität Hohenheim, Garbenstr. 30, D-7000 Stuttgart 70
Z. Naturforsch. 35 c, 838-839 (1980);
received June 13,1980
Chloridazon Degrading Bacteria, 3-Hydroxy-anthranilic Acid, Tryptophan Metabolism, Induction of Anthranilate Synthase
3-Hydroxyanthranilic acid could be isolated from the culture medium of chloridazon degrading bacteria growing under supplementation with phenylalanine. Anthranilate synthase is induced by phenylalanine.
Kürzlich konnten wir zeigen, daß chloridazonab- bauende Bakterien Phenylalanin au f einem bisher noch nicht beschriebenem Wege abbauen [1].
In der vorliegenden A rbeit wird die Isolierung von 3-H ydroxyanthranilsäure aus dem M edium die
ser Bakterien beschrieben, die sich nur nachweisen läßt, wenn unter Zusatz von Phenylalanin gezüchtet wird.
Bakterienstamm: D er Stam m N der chloridazon- abbauenden Bakterien aus der Stam m sam m lung des Instituts wurde verwendet.
Kulturmedium: Das M ineralsalzm edium enthielt in 1000 ml deion. Wasser;
0,875 g K H2P 0 4, 0,125 g K2H P 0 4,
0,5 g M g S 04 • 7 H20 , 0,1g N aC l, 0,1 g C aC l2 -6 H20 , 0,1 g (N H4)2S 0 4, 0,3 mg H3BO3,
0,04 mg C u S 04 • 5 H20 , 0,1 mg KI,
0,3 mg FeC l3 • 3 H20 , 0,4 mg M n S 04 • 4 H zO, 0,4 mg Z n S 04 • 7 H zO, 0,2 mg (N H4)2M o 0 4, 0,1 mg Biotin und 0,03 mg Cyanocobalam in.
Diesem M ineralsalzm edium w urden 3,6 mmol l-
Phenylalanin zugesetzt, und anschließend wurde der pH-W ert m it 2,5 n N aO H a u f 6,8 eingestellt. Bei 121 °C wurde 15 min autoklaviert.
Züchtungsbedingungen: 0,1 / Phenylalanin-M e- dium im 250 ml Erlenm eyer-K olben w urde m it
Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. F. Lingens.
0341-0382/80/0900-0838 $ 0 1 .0 0 /0
einer Impföse Bakterienzellen beim pft und bei 30 °C 2 Tage lang geschüttelt. Diese K ultur wurde anschließend in einen 2-/-Kolben m it 1/ Phenylala- nin-M edium transferiert und 26 h bei 30 °C inku
biert. Mit dieser V orkultur wurde ein 10-/-Fermen- ter angeimpft, der 36 h bei 30 °C gerührt und b e
lüftet wurde. Danach wurden die Zellen bei 4 ° C und 9000x0 in 30 min abzentrifugiert und m it M i
neralsalzm edium gewaschen.
„Resting-cells“ -Versuche: Frische, in der logarith- mischen W achstumsphase geerntete Zellen w urden in 2,3 / Akkum ulationsm edium (M ineralsalzm edium m it 11,4 m m ol// L -Phenylalanin) suspendiert und bei 30 °C unter starker Luftzufuhr inkubiert. N ach M etabolisierung von ca. 50% des eingesetzten Sub
strates wurden die Bakterien durch Zentrifugation aus dem M edium entfernt.
Isolierung der 3-Hydroxyanthranilsäure: D as M e
dium wurde au f pH 2 angesäuert, zur Trockene ein
geengt und der Rückstand m it Ethanol extrahiert.
D er Extrakt wurde konzentriert, in wenig E th an o l/
Wasser 50:50 aufgenom m en und über eine Sepha- dex-LH-20-Säule (100x5 cm) aufgetrennt. Als Elu
tionsmittel diente ein Gemisch aus gleichen Teilen Ethanol und Wasser. Das fraktionierte Säuleneluat wurde dünnschichtchromatographisch und UV-spek- troskopisch auf 3-Hydroxyanthranilsäure untersucht.
D ie Fraktionen m it dem gereinigten M etaboliten wurden zur Trockene eingeengt.
Dünnschichtchromatographie: Fertigplatten (25 x 25 cm) m it Kieselgel 60 F254 von Merck w urden ver
wendet. Als Laufm ittel dienten:
Isopropanol/W asser/A m m oniak (20/2/1) und Chloroform /Ethanol (40/60).
Substanzflecken wurden m it UV-Licht lokalisiert und die 3-H ydroxyanthranilsäure m it Ehrlichs R ea
genz nachgewiesen.
Bei „resting-cells“-Versuchen m it Phenylalanin als Substrat wurde nach Auftrennung des A kkum u
lationsm edium s an einer Sephadex-LH-20-Säule (100x5cm ) 3-H ydroxyanthranilsäure in den F ra k tionen 24 0 -2 5 0 eluiert. D ie isolierte Substanz und authentische 3-Hydroxyanthranilsäure zeigten bei der Dünnschichtchrom atographie gleiche R pW erte in verschiedenen Laufmitteln: 0,58 (in I) und 0,68 (in II). Beim Besprühen m it Ehrlichs Reagenz wurde eine charakteristische Farbreaktion erhalten.
Beim UV-spektroskopischen Vergleich besaßen die isolierte und authentische 3-Hydroxyanthranilsäure
This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs 3.0 Germany License.
On 01.01.2015 it is planned to change the License Conditions (the removal of the Creative Commons License condition “no derivative works”). This is to allow reuse in the area of future scientific usage.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:
Creative Commons Namensnennung-Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland Lizenz.
Zum 01.01.2015 ist eine Anpassung der Lizenzbedingungen (Entfall der Creative Commons Lizenzbedingung „Keine Bearbeitung“) beabsichtigt, um eine Nachnutzung auch im Rahmen zukünftiger wissenschaftlicher Nutzungsformen zu ermöglichen.
Notizen 839 gleiche M axim a bei 298 nm (pH 3) oder 333 nm
(pH 12). D ie Identität der isolierten 3-Hydroxyan- thranilsäure wurde w eiterhin über IR- und MS- Spektroskopie gesichert. Aus dem W achstum sm edi
um konnte keine 3-H ydroxyanthranilsäure isoliert werden, sie trat nur unter „resting-cells“-Bedingungen m it Phenylalanin auf. D a die 3-Hydroxyanthranil- säure offensichtlich aus Tryptophan gebildet wird, erhebt sich die Frage, ob Phenylalanin in irgend
einer Weise die Biosynthese des Tryptophans stim u
liert. Es w urde deshalb geprüft, ob Phenylalanin das erste Enzym der Tryptophanbiosynthese, die An- thranilatsynthase, aktiviert oder induziert. N ach A n
zucht der Bakterien unter Zusatz von Phenylalanin konnte tatsächlich eine verm ehrte Bildung von An-
thranilatsynthase im Vergleich zum phenylalanin
freien M edium nachgewiesen werden.
Als plausible Erklärung für die Bildung von 3-Hy- droxyanthranilsäure bietet sich dem nach die Stim u
lierung der Tryptophanbiosynthese durch Phenyl
alanin an, die nachfolgend zu einer verm ehrten Bil
dung von 3-H ydroxyanthranilsäure führt.
Danksagung
D er Deutschen Forschungsgem einschaft und dem Fonds der Chem ischen Industrie danken wir für U n
terstützung unserer A rbeiten und Susanne W eiß für die sorgfältige technische Assistenz bei der D urch
führung der Versuche.
[1] R. Buck, J. Eberspächer u. F. Lingens, Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 360,957-969 (1979).
