Einfluss von Varianten der Gene MTHFR und DISC1 auf Volumina ausgewählter Gehirnregionen
gesunder Probanden
Der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Jakob Maria Kreczi
Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h. c. Jürgen Schüttler
Gutachter/in: Prof. Dr. Johannes Kornhuber Gutachter/in: Prof. Dr. Christian P. Müller
Tag der mündlichen Prüfung: 16. April 2019
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Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung ... 3
2. Abstract ... 5
3. Einleitung ... 7
3.1 Neuronale Entwicklung ... 7
3.2 Einfluss von genetischen Varianten auf verschiedene Gehirnregionen ... 8
3.3 Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase (MTHFR) ... 9
3.3.1 Genlokus und Genstruktur ... 9
3.3.2 MTHFR-Protein: Struktur, Vorkommen, Aufgaben ... 10
3.3.3 MTHFR-Defizienz ... 11
3.3.4 Polymorphismen ... 11
3.3.4.1 MTHFR SNP rs1801131 ... 12
3.3.4.2 MTHFR SNP rs1801133 ... 13
3.4 Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) ... 14
3.4.1 Genlokus und Genstruktur ... 14
3.4.2 DISC1-Protein: Struktur, Vorkommen, Aufgaben ... 15
3.4.3 Polymorphismen ... 17
3.4.3.1 DISC1 SNP rs3738401 ... 18
3.4.3.2 DISC1 SNP rs6675281 ... 19
3.4.3.3 DISC1 SNP rs821616 ... 19
3.5 Zielsetzung ... 21
4. Material und Methoden ... 22
4.1 Studienpopulation ... 22
4.2 MRT-Scans und Berechnung ausgewählter Hirnteilvolumina ... 22
4.3 Verwendete Verbrauchsmaterialien, Geräte und Software... 23
4.4 Methoden ... 25
4.4.1 DNA-Extraktion aus EDTA-Blut und Quantifizierung ... 25
4.4.2 Genotypisierung der DNA-Proben ... 27
4.4.2.1 Genotypisierung mittels RFLP-Analyse ... 28
4.4.2.2 Genotypisierung mittels Sequenzierung ... 30
4.4.2.3 Genotypisierung mittels HRM-Analyse ... 32
4.5 Statistik ... 34
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5. Ergebnisse ... 35
5.1 Genotypenverteilung und Hardy-Weinberg-Equilibrium ... 35
5.2 Geschlechterunterschiede der Gehirnvolumina ... 38
5.3 Einfluss der untersuchten SNPs auf Gehirnvolumina ... 38
5.3.1 Einfluss des MTHFR rs1801131 auf Gehirnvolumina ... 38
5.3.2 Einfluss des MTHFR rs1801131 auf Gehirnvolumina ... 40
5.3.3 Einfluss des DISC1 rs821616 auf Gehirnvolumina ... 43
5.3.4 Einfluss des DISC1 rs3738401 auf Gehirnvolumina ... 46
5.3.5 Einfluss des DISC1 rs6675281 auf Gehirnvolumina ... 50
6. Diskussion ... 53
6.1 Genetischer Einfluss der untersuchten SNPs ... 53
6.1.1 Einfluss von MTHFR-Varianten auf Gehirnvolumina ... 53
6.1.2 Einfluss von DISC1-Varianten auf Gehirnvolumina ... 54
6.2 Limitationen der Studie ... 58
6.3 Ausblick ... 59
7. Literaturverzeichnis ... 60
8. Abbildungsverzeichnis ... 72
9. Tabellenverzeichnis ... 74
11. Anhang ... 76
11.1 Tabellenanhang ... 76
12. Danksagung ... 87
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1. Zusammenfassung
Hintergrund und ZieleDie Gene MTHFR und DISC1 spielen eine zentrale Rolle in der neuronalen Entwicklung und gelten als Kandidatengene für verschiedene neurologische und psychiatrische Erkrankungen.
Das MTHFR-Gen kodiert für die 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reduktase, ein Enzym mit einer Schlüsselrolle im Ein-Karbon-Metabolismus. Das DISC1- Gen kodiert für das DISC1-Protein, das über ein weitverzweigtes Netzwerk mit einer Vielzahl Proteine interagiert und eine zentrale Rolle bei verschiedenen neuralen Vorgängen wie der neuronalen Proliferation, Migration und Differenzierung spielt. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Einflüsse mehrerer nicht-synonymer Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) im MTHFR-Gen und im DISC1-Gen auf das Volumen verschiedener Hirnregionen bei einer Gruppe junger, gesunder Probanden.
Methoden
Mittels High-resolution-melting und Restriktionsfragmentlängenpoly- morphismus-Analyse wurden DNA-Proben von 145 gesunden Probanden hinsichtlich fünf SNPs im MTHFR- und DISC1-Gen genotypisiert. Anschließ- end erfolgte eine geschlechtergetrennte Analyse der Einflüsse der Genotypen auf die Volumina ausgewählter Gehirnregionen.
Ergebnisse
Es konnten statistisch nominal signifikante Einflüsse mehrerer SNPs auf die Volumina verschiedener Gehirnregionen festgestellt werden. So hatte der MTHFR-SNP rs1801131 bei Frauen Einfluss auf die Volumina von Putamen und Globus pallidus. Bezüglich des MTHFR SNP rs1801133 fanden sich Unterschiede im Bereich der Volumina von kortikalen und zerebellären Strukturen bei Männern und Frauen. Der DISC1 SNP rs821616 beeinflusste die Volumina von Thalamus und Amygdala bei Männern. Hinsichtlich des DISC1 SNP rs3738401 fanden sich Effekte insbesondere auf Putamen, Amygdala, Globus pallidus, Hippocampus und Nucleus accumbens bei beiden Geschlechtern. DISC1 SNP rs6675281 beeinflusste die Volumina
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von Putamen, Globus pallidus bei Frauen sowie die weiße kortikale Substanz bei Männern.
Schlussfolgerung
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen eine Beeinflussung der Volumina verschiedener Gehirnregionen bei jungen, gesunden Menschen durch die untersuchten Varianten im MTHFR- und DISC1-Gen vermuten. Eine weitere Erforschung der Einflüsse dieser und anderer Kandidatengene auf die Gehirnstruktur ist auch hinsichtlich der möglichen strukturellen Veränderun- gen des Gehirns im Rahmen psychiatrischer Erkrankungen interessant.
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2. Abstract
Backround and aims
MTHFR and DISC1 are important genes implicated in neuronal development and are considered candidate genes for several neurological and psychiatric diseases. The MTHFR gene codes for the enzyme methylentetrahydrofolate reductase, a key enzyme in one-carbon metabolism. The DISC1 gene codes for the DISC1 protein, which plays a central role in neuronal proliferation, migration and differentiation. The aim of this thesis is to investigate the influence of five single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the MTHFR and DISC1 genes on the volume of selected brain regions in a group of young and healthy volunteers.
Methods
DNA samples of 145 young, healthy subjects were genotyped using either high resolution melting or restriction fragment length polymorphism analysis to examine the role of five SNPs of the MTHFR and DISC1 genes. Sex- specific influences of these SNPs on the volume of various brain regions were statistically analyzed.
Results
A number of statistically significant differences in various brain regions were found for all of the tested SNPs. The MTHFR SNP rs1801131 influenced the volumes of the putamen and globus pallidus in females. Different genotypes of the MTHFR SNP rs1801133 showed differences in cortical and cerebellar volumes in both sexes. The DISC1 SNP rs821616 was associated with volume differences in the thalamus und amygdala in males. DISC1 SNP rs3738401 had effects on the volumes of the putamen, amygdala, globus pallidus, hippocampus and nucleus accumbens in both sexes. The DISC1 SNP rs6675281 showed an influence on the volumes of the putamen, globus pallidus in females, as well as cortical white matter volumes in males.
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Conclusions
The results of this study demonstrate that MTHFR and DISC1 gene SNPs influence the volume of a number of selected brain structures in a young, healthy population. Further research on the role of these and other candidate genes on brain morphology and function may prove beneficial to our understanding of psychiatric diseases.
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3. Einleitung
3.1 Neuronale Entwicklung
Die Entwicklung des menschlichen Gehirns stellt einen einzigartigen und hochkomplexen Vorgang dar, der schon in der dritten Woche post conceptionem mit der Bildung der Neuralplatte aus Teilen des Ektoderms beginnt (Rohen und Lütjen-Drecoll, 2012). Durch primäre und sekundäre Neurulation entsteht in der dritten Woche p.c. aus der Neuralplatte das Neuralrohr, aus welchem sich in der weiteren Folge das gesamte zentrale und periphere Nervensystem entwickelt (Gilbert, 2010).
Aus den vorderen zwei Dritteln des Neuralrohres differenziert sich das Ge- hirn, aus dem hinteren Drittel das Rückenmark (Rohen und Lütjen-Drecoll, 2012).Diese Entwicklungen werden durch ein komplexes Zusammenspiel aus genetischen Faktoren und Umwelteinflüssen gesteuert.
Etwa am 42. Tag p.c. beginnen die neuronalen Vorläuferzellen der ventriku- lären Zone durch asymmetrische Teilung mit der Produktion von Neuronen (Stiles und Jernigan, 2010). Die weitere Fetalzeit ist geprägt von der Produk- tion, Migration und Differenzierung der Neuronen.
In dieser Zeit kommt es jedoch auch schon zum substantiellen Verlust von Neuronen. Durch gezielte apoptotische Prozesse wird der Aufbau von effek- tiven und funktionalen neuralen Kreisläufen reguliert (Buss et al., 2006). Des Weiteren wird angenommen, dass der regulierte Zelltod eine entscheidende Rolle bei der Elimination von neuronalen Zellen spielt, welche nur vorüber- gehende Funktionen während der Gehirnentwicklung innehaben (La Rosa und Pablo, 2000). In manchen Gehirnregionen konnte eine Apoptoserate bis zu 70 % beobachtet werden (Rabinowicz et al., 1996).
Postnatal setzt sich die Gehirnentwicklung weiter fort. Bis zu einem Alter von etwa sechs Jahren vervierfacht sich die Größe des Gehirns (Courchesne et al. 2000; Reiss et al. 1996). Es steht jedoch nicht mehr die neuronale Zell- vermehrung im Vordergrund, sondern die Ausbildung von Zellfortsätzen und Zellkontakten. So bilden kortikale Neurone im ersten Lebensjahr zirka 105 Synapsen zu anderen Neuronen (Rohen und Lütjen-Drecoll, 2012). Die Synapsenbildung setzt sich beim Menschen bis ins Erwachsenenalter fort und gewährleistet somit eine gewisse Plastizität des Gehirns.
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Im Gegensatz zur eingeschränkten postnatalen Neurogenese schreitet die pränatal begonnene Proliferation und Migration von glialen Vorläuferzellen und deren Wandlung zu Oligodendrozyten und Astrozyten postnatal in gro- ßem Ausmaß voran. Dieser Prozess ist unter anderem entscheidend für die regelhafte Myelinisierung der Nervenzellausläufer und ist somit grundlegend an der Ausreifung neuronaler Bahnsysteme beteiligt (Tau und Peterson, 2009; Stiles und Jernigan, 2010).
Auch postnatal finden neben Proliferation und Differenzierung degenerative Prozesse statt. Während der Phase der initialen Myelinisierung werden viele überschüssige Oligodentrozyten nur wenige Tage nach ihrer Differenzierung apoptotisch (McTigue und Tripathi, 2008).
Weitere relevante Entwicklungsvorgänge finden bis in die Zeit nach der Pubertät statt. Erst danach beginnt das neuronale Wachstum und die Gesamtzahl der Neuronen abzunehmen (Gilbert, 2010).
3.2 Einfluss von genetischen Varianten auf verschiedene Gehirnregionen
Durch ein komplexes Zusammenspiel einer Vielzahl von Genen sowie durch verschiedene Umwelteinflüsse ergibt sich der endgültige Phänotyp des menschlichen Gehirns. Etwa 10 000 Gene und somit zirka ein Drittel des menschlichen Genoms werden primär im Gehirn und während der Gehirn- entwicklung exprimiert (Johnson et al., 2009; Zhang et al., 2011).
Genetische Varianten, wie zum Beispiel Einzelnukeotidpolymorphismen (SNP) in diesen Genen können die Gehirnmorphologie beeinflussen.
Insbesondere Varianten in verschiedenen Kandidatengenen für psychiat- rische Erkrankungen wie Schizophrenie, Bipolare Störung, Depression und Autismus-Spektrum-Erkrankungen wurden hinsichtlich ihrer Einflüsse auf verschiedene Gehirnregionen untersucht. Studien an Jugendlichen und Erwachsenen konnten demonstrieren, dass Polymorphismen in mutmaß- lichen psychiatrischen Risikogenen Unterschiede der Gehirnstruktur bei Gesunden und bei psychiatrisch Erkrankten voraussagen (Scharinger et al., 2010).
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Zu den diesbezüglich besser untersuchten Genen gehören beispielsweise DISC1 (Hashimoto et al., 2006; Takahashi et al., 2009; Brauns et al., 2011;
Raznahan et al., 2010), COMT (Cerasa et al., 2008; Ohnishi et al., 2006;
Taylor et al., 2007).
NRG1 (Winterer et al., 2008; Wang et al., 2009), APOE (Plassman et al., 1997; Lemaître et al., 2005; Shaw et al., 2007), ESR1 (Boccardi et al., 2008), BDNF (Pezawas et al., 2004; Montag et al., 2009; Ho et al., 2006) und GAD1 (Addington et al., 2004).
Daneben gibt es jedoch noch eine Vielzahl weiterer Varianten in anderen Genen, welche bislang hinsichtlich möglicher Einflüsse auf Gehirn- (teil)volumina nicht oder nur spärlich untersucht worden sind.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgewählte SNP in den Genen MTHFR und DISC1 bezüglich ihrer Einflüsse auf zuvor festgelegte Gehirnteilvolumina analysiert.
3.3
Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase (MTHFR) 3.3.1 Genlokus und GenstrukturDas MTHFR-Gen ist auf Chromosom 1 (1p36.3) lokalisiert (Goyette et al., 1995). Es befindet sich auf dem Minus-Strang und umfasst eine Sequenz von 21197 Basen. Bisher sind beim Menschen 10 proteinkodierende Tran- skripte des Gens bekannt, wobei insgesamt 27 verschiedene Exons identi- fiziert wurden. Die Hauptvariante des MTHFR-Gens umfasst 11 kodierende Exons, die ein Transkript von 8378 bp ergeben (Abbildung 1) (Yates et al., 2016 (a)).
10 Abbildung 1: Intron/Exon-Schema des MTHFR-Gens
Die Exons 1-11 sind als schwarze Querbalken dargestellt. Die Positionen der beiden unter- suchten Einzelnukleotid-Polymorphismen rs1801131 (Exon 8) und rs1801133 (Exon 5) sind mittels roten Pfeilen markiert.
3.3.2 MTHFR-Protein: Struktur, Vorkommen, Aufgaben
Das MTHFR-Gen kodiert für das Enzym 5,10-Methylentetrahydrofolat- Reduktase. Das Protein hat eine Länge von 656 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 74597 Da (Yates et al., 2016, (a)). Es existieren jedoch mindestens zwei Enzymisoformen mit Molekulargewichten von 70 kDa und 77 kDa (Millar et al., 2000). Das Enzym besitzt eine Schlüsselrolle im Ein- Karbon-Metabolismus. MTHFR reduziert 5,10-Methylentetrahydrofolat irreversibel zu 5-Methylentetrahydrofolat. 5-Methylentetrahydrofolat stellt den Großteil des zirkulierenden Folats dar (Botto und Yang, 2000). 5- Methylentetrahydrofolat ist als Cofaktor an der de novo-Synthese von Nukleotiden, der Synthese von S-Adenosyl-Methionin, der Remethylierung von Homocystein zu Methionin und der Methylierung von DNA, Proteinen, Neurotransmittern und Phospholipiden beteiligt (Botto und Yang, 2000).
Defekte der MTHFR können zu aberranter DNA-Synthese (Greenblatt et al., 1994), erhöhtem Umsatz von Neurotransmittern (Greenblatt et al., 1994;
Bottiglieri et al., 2000) sowie aberranter DNA-Methylierung (Zeisel, 2009) führen. An seiner Beteiligung an dieser Vielzahl von Prozessen wird die Bedeutsamkeit des MTHFR-Proteins auch für die Entwicklung, Reifung und Funktion des Gehirns ersichtlich (del Río Garcia et al., 2009; Dror und Allen, 2008).
11 3.3.3 MTHFR-Defizienz
Die MTHFR-Defizienz ist eine angeborene, autosomal rezessive Störung des Folsäuremetabolismus aufgrund von Mutationen im MTHFR-Gen (Fattal- Valevski et al., 2000). Bisher konnten über 50 Mutationen im MTHFR-Gen identifiziert werden, die zur MTHFR-Defizienz führen (Watkins und Rosenblatt, 2012). Diese reduzieren die Aktivität der MTHFR in unterschied- lichem Ausmaß, wodurch es unter anderem auch zu einer verminderten Remethylierung von Homocystein zu Methionin und somit zur Hyperhomocysteinämie, Homocystinurie und zu erniedrigten Plasma- Methioninkonzentrationen kommt (Whitehead, 2006). Der klinische Schwere- grad der Erkrankung korreliert mit der Enzymrestaktivität und dem Erkrankungsalter (Whitehead, 2006). Phänotypisch sind daher sehr unterschiedliche Ausprägungen dieses Krankheitsbildes möglich. Schwere Verläufe manifestieren sich schon im ersten Lebensjahr. Zu den Symptomen gehören schwerwiegende Entwicklungsverzögerungen, mentale Retardierung, epileptische Anfälle, Bewegungs- und Gangstörungen und Thrombosen. (Goyette et al., 1995; Whitehead 2006; Watkins und Rosenblatt, 2012). Bei milderer Ausprägung der Defizienz sind jedoch auch bis ins Erwachsenenalter asymptomatische Verläufe möglich (Watkins und Rosenblatt, 2012). Eine erhöhte Homocysteinkonzentration stellt zudem einen Risikofaktor für vaskuläre Erkrankungen wie Arteriosklerose (Fanapour et al., 1999; McCully, 1969) und koronare Herzkrankheit (Clarke et al., 1991;
Blom und Smulders, 2011) dar.
3.3.4 Polymorphismen
Bislang wurden mehrere tausend Einzelnukleotidpolymorphismen im MTHFR-Gen identifiziert, die meisten in nicht kodierenden Genabschnitten (Yates et al., 2016 (a)). Bei einer Studie an über fünfhundert Probanden verschiedener Ethnien fanden sich insgesamt 14 nichtsynonyme Varianten, wovon bei 11 die Frequenz des selteneren Allels (minor allele frequency, MAF) bei unter 1% lag (Marini et al., 2008). Drei nichtsynonyme Polymorphismen rs1801131, rs1801133 und rs2274976 kommen mit einer MAF von >1 % vor (Cariaso und Lennon, 2012, (a), (b)).
12 3.3.4.1 MTHFR SNP rs1801131
Der SNP rs1801131 befindet sich im Exon 8 des MTHFR-Gens auf der Position Chromosom 1:11854476 (Yates et al., 2016, (a)). Er führt zu einem Basenaustausch von Adenosin zu Cytosin an Position 1286 (c.1286A>C) des Transkripts. Es handelt sich dabei um einen nichtsynonymen Polymorphis- mus („missense“), wobei es im Protein zu einem Aminosäureaustausch von Glutamat zu Alanin an Position 429 des Proteins kommt (p.429Glu>Ala).
Durch den Austausch des sauren, polaren Glutamats durch das neutrale, unpolare Alanin ist eine Auswirkung auf die Proteinfunktion vorstellbar. Die globale MAF liegt bei 0,23 für das C-Allel (Cariaso und Lennon (a), 2012).
Dieser Polymorphismus führt zu einer Verminderung der Enzymaktivität, wo- bei CC-Homozygote stärker betroffen sind als Heterozygote (AC) (van der Put et al., 1998). Trotz Verminderung der Enzymaktivität konnten ein Anstieg der Homozysteinkonzentration oder ein Abfall der Folatkonzentration im Blut nicht konsistent nachgewiesen werden (van der Put et al., 1998). Der SNP rs1801131 wird mit einer Reihe von Erkrankungen assoziiert, wobei diesbe- züglich allerdings teilweise auch widersprüchliche Daten vorliegen. Für Träger des C-Allels konnte ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Demenz vom Alzheimer Typ nachgewiesen werden (Cascalheira et al., 2009;
Mansoori et al., 2012). In einigen Studien konnten auch Assoziationen des Polymorphismus zur Schizophrenie (Kempisty et al., 2007; Sazci et al., 2003, Sazci et al., 2005) festgestellt werden. Eine Metaanalyse von zehn Studien stellte jedoch keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem c.A1286C Polymorphismus und der Diagnose einer Schizophrenie fest (Peerbooms et al., 2011).
Einige Studien berichteten über die Assoziation des Polymorphismus rs1801131 mit Bipolarer Störung (Jönsson et al., 2008; Ozbek et al., 2008;
Kempisty et al., 2007; Reif et al., 2005). Eine Metaanalyse dieser Studien bestätigte diesen Zusammenhang (Peerbooms et al., 2011). Außerdem konnte ein Einfluss des Polymorphismus auf die Entwicklung einer uni- polaren Depression nachgewiesen werden (Reif et al., 2005).
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Neben psychiatrischen Erkrankungen wurde der rs1801131 Polymorphismus unter anderem auch mit einem erhöhten Risiko für das Auftreten von Migräne (Stuart et al., 2012) in Verbindung gebracht.
3.3.4.2 MTHFR SNP rs1801133
Der SNP rs1801133 befindet sich im Exon 5 des MTHFR-Gens auf der Posi- tion Chromosom 1:11856378 (Yates et al., 2016, (a)). Er führt zu einem Basenaustausch von Cytosin zu Thymin an Position 794 des Transkripts (c.794C>T). Dabei handelt es sich ebenfalls um einen nichtsynonymen Polymorphismus („missense“), wobei es im Protein zu einem Aminosäure- austausch von Alanin zu Valin an Position 222 des Proteins kommt (p.222Ala>Val). Diese beiden Aminosäuren weisen eine hohe physikalisch- chemische Ähnlichkeit auf (unpolar, neutral). Die globale MAF liegt bei 0,32 für das T-Allel (Cariaso und Lennon (b), 2012). Diese Variante führt zur Bildung eines thermolabilen Enzyms mit verringerter Aktivität bei Körper- temperatur (Frosst et al., 1995). Heterozygote (Genotyp CT) haben eine um zirka 35% verminderte, TT-Homozygote eine um zirka 70% verminderte Enzymaktivität im Vergleich zu gesunden Homozygoten (Genotyp CC).
Durch den Abfall der Enzymaktivität kommt es zum Anstieg der Homocysteinkonzentration, insbesondere bei niedrigen Folsäurekonzen- trationen (Jacques et al., 1996). In untersuchten Populationen hatten TT- Homozygote um zirka 20% höhere Homocysteinkonzentrationen als CC- Homozygote. Aufgrund dessen wurde eine Vielzahl von Pathologien mit diesem Polymorphismus assoziiert. Der Polymorphismus rs1801133 als Risikofaktor für die Entstehung von psychiatrischen Störungen ist Gegenstand intensiver Forschung. In einer Reihe von Studien wurde ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Schizophrenie für homozygote Träger des Minor Alleles (Genotyp c.794T) nachgewiesen (Arinami et al., 1997; Tan et al., 2004; Kunugi et al., 1998; Sazci et al.; 2003, Sazci et al.;
2005, Kempisty et al., 2006). Eine Metaanalyse von 19 Studien bestätigte diese Assoziation (Peerbooms et al., 2011).
Des Weiteren konnten in mehreren Studien erhöhte Risiken zur Entwicklung sowohl einer Bipolaren Störung als auch einer Unipolarer Depression (Kunugi et al., 1998; Tan et al, 2004; Kempisty et al., 2006) bei TT-Homozy-
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goten festgestellt werden. Auch diese Zusammenhänge konnten in der Meta- analyse von Peerbooms bestätigt werden (Peerbooms et al., 2011).
Außerdem scheint der SNP auch Einfluss auf die neuronale Entwicklung zu haben. So wurde in mehreren Studien gezeigt, dass der Genotyp TT mit einem erhöhten Risiko für das Auftreten von Neuralrohrdefekten einhergeht (van der Put et al., 1995; Whitehead et al., 1995; Franchis et al., 1998;
Shields et al., 1999).
3.4 Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) 3.4.1 Genlokus und Genstruktur
St Clair et al. beschrieben 1990 erstmals eine balancierte Translokation t(1;11)(q42;q21) in einer schottischen Familie, in der überproportional viele Mitglieder an psychiatrischen Krankheiten litten (St Clair et al., 1990). An der Bruchstelle dieser Translokation auf Chromosom 1 (1q42.1) wurden später die beiden Gene Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) und 2 (DISC2) ent- deckt (Millar et al., 2000). DISC1 befindet sich auf dem Vorwärtsstrang und umfasst 414457 Basenpaare (Yates et al., 2016, (b)). Es besteht aus 13 Exons (Abbildung 2). Im Menschen werden hauptsächlich vier verschiedene Isoformen durch alternatives Splicen produziert und translatiert (Chubb et al., 2008). Diese werden als L-Isoform (Long isoform), Lv-Isoform (Long variant isoform), S-Isoform (Short isoform) und Es-Isoform (Extremely short isoform) bezeichnet (Millar et al., 2001; Taylor et al., 2003). Beim Menschen kommt am häufigsten die L-Isoform vor (Lipska et al., 2006).
Mittlerweile wurden jedoch eine Vielzahl weiterer Isoformen des Gens sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene beschrieben (Nakata et al., 2009). Im Ensembl Genome Browser sind bisher 24 Transkripte des Gens gelistet (Yates et al., 2016, (b)).
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Abbildung 2: Schematische Darstellung der Intron/Exon-Struktur des DISC1-Gens
1-13: Exons. Die Bruchstelle der Translokation t(1;11)(q42;q21) ist markiert. Die roten Pfeile signalisieren die Position der drei untersuchten SNPs rs3738401, rs821616 und rs667528.
3.4.2 DISC1-Protein: Struktur, Vorkommen, Aufgaben
Das aus der am häufigsten vorkommenden L-Isoform des Transkripts entstehende Protein hat eine Länge von 854 Aminosäuren (~100 kDa).
Strukturell besteht das Protein aus einer N-terminalen Kopfregion und einer alphahelikalen C-terminalen Region, welche mehrere Doppelwendelmotive beinhaltet (Abbildung 3) (Chubb et al., 2008).
Abbildung 3: Schematische Illustration der DISC1-Proteinstruktur
KLS: Kernlokalisationssignal. Die Doppelwendel-Domänen im Schwanzbereich gelten als wichtige Protein-Protein-Interaktionsstellen (nach Chubb et al., 2008).
Im Menschen wird DISC1 in einer Reihe von Geweben exprimiert, am stärksten in Gehirn, Herz und Plazenta (Millar et al., 2000). Im menschlichen Gehirn konnte eine starke DISC1-Expression besonders im Gyrus dentatus und im Hippocampus und schwächer ausgeprägt im Temporallappen sowie im Kortex parahippocampalis nachgewiesen werden (Lipska et al., 2006;
James et al., 2004).
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Die Funktionen des DISC1-Proteins sind vielfältig und noch nicht vollständig erfasst. Es ist an einer Vielzahl von zellulären Vorgängen während und nach der Gehirnentwicklung beteiligt (Chubb et al., 2008; Brandon und Sawa, 2011). Unter anderem spielt das DISC1-Protein bei der neuronalen Prolifera- tion, Differenzierung und Migration, sowie bei der Modulation des Cyto- skeletts eine Rolle (Chubb et al., 2008). Dabei wird es als Stützprotein und Bindungspartner für eine Reihe von anderen Proteinen aktiv, die ihrerseits an Prozessen der Gehirnentwicklung und Gehirnfunktion beteiligt sind (Kamiya et al., 2012). So interagiert DISC1 zum Beispiel mit zentrosomalen und zyto- skeletalen Proteinen und Regulatoren der neuronalen Entwicklung wie NDE1/NDEL1 und FEZ1 (Morris et al., 2003). Durch den wechselseitigen Kontakt mit diversen Proteinen wie LIS1, NDL1 und NDE beeinflusst DISC1 die neuronale Migration, die Aussprossung von Neuriten und die Entwicklung der Gehirnrinde (Kamiya et al., 2005; Hennah und Porteous, 2009). Des Weiteren vermittelt DISC1 durch die Regulation der Serin/Threonin-Protein- kinase GSK3β/β die Proliferation von Neuronen-Vorläuferzellen (Mao et al., 2009).
Insgesamt ergibt sich ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk, welches als DISC1-Interaktom bezeichnet wird. Dieses Netzwerk besteht aus mindestens 127 Proteinen und 158 Interaktionen (Camargo et al., 2007) (Abbildung 4).
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Abbildung 4: Teil des DISC1-Interaktoms (nach Hennah und Porteous, 2009) Die direkten Interaktionspartner von DISC1 sind in Orange markiert.
Aufgrund seiner zentralen Beteiligung an einer Vielzahl von neuro- molekularen Vorgängen werden Dysfunktionen des DISC1-Proteins mit einer Reihe von neuropsychiatrischen Auffälligkeiten und Erkrankungen in Ver- bindung gebracht. Das DISC1-Gen gilt als Kandidatengen für die Entwick- lung von psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie (Ekelund et al., 2001; Ekelund et al., 2004; Hodgkinson et al., 2004), bipolarer Depression (Hodgkinson et al., 2004; Thomson et al., 2005; Palo et al., 2007), Autismus und Asperger Syndrom (Kilpinen et al., 2008). Zur Klassifizierung von Störun- gen des Gehirns, welche in Zusammenhang mit einem dysfunktionalen DISC1-Protein stehen, prägte Korth im Jahre 2009 den Begriff DISCopathien (Korth, 2009).
3.4.3 Polymorphismen
Neben nichtkodierenden und synonymen Polymorphismen stehen besonders die drei nichtsynonymen Polymorphismen („Missense“-Variationen) im DISC1-Gen rs3738401, rs6675281 und rs821616, im Mittelpunkt der For- schung. Für diese Polymorphismen, welche zur Veränderung der Aminosäuresequenz und somit zu einer Strukturänderung des Proteins
[Geben Sie ein
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führen, konnten Assoziationen zu neurophysiologischen, kognitiven und strukturellen Auffälligkeiten festgestellt werden (Mackie et al., 2007). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die drei genannten SNPs untersucht.
3.4.3.1 DISC1 SNP rs3738401
Der SNP rs3738401 befindet sich innerhalb von Exon 2 (Abbildung 2) und führt im Gen zu einem Basenaustausch von Guanin zu Adenosin (c.791G>A), im Protein zu einem Aminosäureaustausch von Arginin (polar, stark basisch) zu Glutamin (polar, neutral) (p.Arg264Gln). Die MAF dieses SNP liegt bei 0.28 (A-Allel) (Cariaso und Lennon (d), 2012). Durch den Poly- morphismus bedingt, kommt es zu einer reduzierten Interaktion des DISC1- Proteins mit der Glykogensynthase-Kinase 3β (GSK-3β), was wiederum zu einer Inhibition des Wnt-Signalweges und einer verringerten Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen führt (Singh et al., 2011). Als Teil des Haplotyps Hep 3 (umfasst zusätzlich die beiden SNPs rs3738401 und rs751229) (Hennah et al., 2003) konnten Assoziationen dieses SNPs zu verschiedenen psychiatrischen Erkrankungen festgestellt werden. So wurden unter anderem Zusammenhänge des Hep3-Haplotyps mit der Entwicklung von Schizo- phrenie (Hennah et al., 2003; Hodgkinson et al., 2004), schizoaffektiven und bipolaren Störungen (Hodgkinson et al., 2004) sowie dem Asperger-Syndrom beschrieben (Kilpinen et al., 2008). Außerdem konnten diverse Einflüsse des Hep3-Haplotyps auf kognitive Fähigkeiten beobachtet werden. In einer Kohorte von Patienten mit bipolarer Störung erzielten Träger des Hep3- Haplotyps signifikant schlechtere Ergebnisse beim California Verbal Learning Test (Palo et al., 2007). In einer weiteren Studie zeigten Hep3-Träger signi- fikant schlechtere Ergebnisse des visuellen Arbeitgedächtnisses bei der Teil- nahme am Wechsler Intelligenztest (Hennah et al., 2005).
Zum Einfluss des SNP rs3738401 auf einzelne Gehirnstrukturen ist bisher wenig bekannt. Es konnte ein moderater Effekt des Polymorphismus auf die Dicke der Hirnrinde im lateralen okzipitalen Kortex nachgewiesen werden (Brauns et al., 2011).
19 3.4.3.2 DISC1 SNP rs6675281 (C1819T)
Der SNP rs6675281 befindet sich im Exon 9 des DISC1-Gens (Abbildung 2).
Es handelt sich dabei ebenfalls um einen nichtsynonymen Polymorphismus, in dem Cytosin durch Thymin (c.C1819T) ersetzt wird. Die MAF dieses SNP liegt bei 0,09 (T-Allel) (Cariaso und Lennon (e), 2012). Im Protein kommt es zu einem Austausch der Aminosäure Leucin (aliphatisch, neutral, unpolar) zu Phenylalanin (aromatisch, neutral, unpolar) an Position 607 (p.Leu607Phe).
Aufgrund seiner Lokalisation an einer Protein-Bindungsstelle für diverse Proteine konnten Einflüsse dieses Polymorphismus auf die DISC1-Interaktion mit Proteinen wie NDEL, MAP1A, ATF4 und ATF5 festgestellt werden (Hennah und Porteous, 2009). Wie rs3738401 stört auch dieser Polymor- phismus die Interaktion mit der Glykogensynthase-Kinase 3β (Singh et al., 2011). Des Weiteren bedingt diese Variante eine Veränderung des zentro- somalen Verteilungsmusters des PCM1-Proteins in Gliazellen (Eastwood et al., 2010).
Für den Polymorphismus rs667582 ist bisher eine Assoziation zur schizo- affektiven Störung bekannt (Hodgkinson et al., 2004).
Des Weiteren konnte ein Einfluss des SNP auf diverse Hirnstrukturen nach- gewiesen werden. Träger des T-Allels Genotypen (CT, TT) wiesen dabei im Vergleich zu CC-homozygoten Personen signifikant weniger graue Substanz im Gyrus frontalis superior, anterioren Gyrus cinguli und linken Gyrus supramarginalis auf (Brauns et al., 2011).
3.4.3.3 DISC1 SNP rs821616
Der SNP rs821616 befindet sich in Exon 11 des DISC1-Gens (Abbildung 2).
Er führt zu einem Basenaustausch von Adenosin zu Thymin (c.2110A>T).Die globale MAF dieses SNP liegt bei 0.25 (Cariaso und Lennon (c), 2012). Im Protein kommt es zu einem Aminosäureaustausch von Serin (aliphatisch, neutral, polar) zu Cystein (aliphatisch, neutral, polar) (p.Ser704Cys). Hieraus resultiert ebenfalls eine Veränderung des zentrosomalen Verteilungsmusters des PCM1-Proteins in Gliazellen (Eastwood et al., 2010). Außerdem kommt es zu einem veränderten Bindungsmuster mit den interagierenden Proteinen NDEL1 und NDE1 (Burdick et al., 2008).
20
Eine Reihe von Studien befasste sich bereits mit den Effekten des SNP rs821616. So assoziierten Calicott et al. (2005) den SNP erstmalig mit der Entwicklung einer Schizophrenie. In dieser Studie konnte auch ein Zusammenhang zwischen dem A-Allel dieses SNPs mit kognitiven Defiziten sowohl bei an Schizophrenie Erkrankten als auch bei gesunden Probanden festgestellt werden. Des Weiteren wurde ein Zusammenhang des A-Allels mit der Entwicklung einer Depression beobachtet (Hashimoto et al., 2006).
Die Bedeutung des Polymorphismus auf verschiedene Gehirnstrukturen ist ebenfalls Gegenstand einer Reihe von Studien. Insgesamt gibt es bisher jedoch inkonsistente und teils widersprüchliche Ergebnisse. In der ersten Studie zu diesem Thema konnte bei AA(Serin)-Homozygoten gesunden Pro- banden eine Volumenminderung des Hippocampus im Vergleich zu T-Allel- Trägern festgestellt werden (Callicott et al., 2005). In darauffolgenden Unter- suchungen konnte ein signifikanter Effekt des SNP rs821616 jedoch nicht bestätigt werden (Hashimoto et al., 2006; Takahashi et al., 2009). In einer weiteren Studie zeigte sich sogar ein gegensätzlicher Effekt, wobei das A- Allel mit einem vergrößerten hippocampalen Volumen assoziiert war (Di Giorgio et al., 2008).
Neben dem Hippocampus wurden auch Effekte des Polymorphismus auf andere Gehirnstrukturen beobachtet. So konnte eine Reduktion der grauen Substanz des Gyrus cinguli bei gesunden T-Allel-Trägern im Vergleich zu AA-Homozygoten nachgewiesen werden (Hashimoto et al., 2006).
Takahashi et al. (2009) untersuchten den Einfluss des SNP rs821616 auf das Volumen verschiedener Gehirnregionen bei schizophrenen Patienten und bei einer gesunden Kontrollgruppe. Auch hierbei zeigten sich signifikante Volumenunterschiede in verschiedenen Gehirnregionen.
21
3.5 Zielsetzung
Verschiedene Gene gelten als Kandidatengene für die Entwicklung neuro- logischer und psychiatrischer Erkrankungen. Die aktuelle Forschung befasst sich zunehmend auch mit strukturellen Veränderungen des Gehirns, aus- gelöst durch Mutationen oder Polymorphismen dieser Kandidatengene.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die geschlechtsspezifischen Einflüsse von zwei nichtsynonymen SNPs des MTHFR-Gens und drei nichtsynonymen SNPs des DISC1-Gens auf die Volumina ausgewählter Gehirnregionen (siehe Abschnitt 4.2) bei 145 gesunden Probanden untersucht.
22
4. Material und Methoden
4.1 StudienpopulationAls Grundlage dieser Arbeit wurden Blutproben von Probanden verwendet, welche in den Jahren 2007/2008 an der Universität Erlangen-Nürnberg rekrutiert wurden. Dasselbe Probandenkollektiv wurde bereits bezüglich mehrerer anderer Parameter hin untersucht (Richter-Schmidinger et al., 2011; Sidiropoulos et al., 2011; Alexopoulos et al., 2011; Rhein et al., 2014;
Reichel et al., 2014). Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Uni- versität befürwortet (Ethikvotum 3510). Entsprechend der Deklaration von Helsinki, willigten alle Probanden schriftlich zur Teilnahme an der Studie ein.
156 gesunde Probanden im Alter zwischen 18 und 35 Jahren wurden mittels eines Fragebogens bezüglich ihrer Gesundheit befragt. Ausschlusskriterien für die Studie waren in der Vorgeschichte liegende somatische Krankheiten, welche möglicherweise die Gehirnfunktion beeinträchtigen, des Weiteren psychiatrische Erkrankungen zum Zeitpunkt der Studie oder in der Vor- geschichte (z.B. Depression, Borderline-Persönlichkeitsstörung, Post- traumatische Belastungsstörung), Medikamenteneinnahme (außer hormo- neller Kontrazeption), eine Vorgeschichte von Substanzmissbrauch (außer Koffein, Nikotin und gelegentlichem Alkoholkonsum), Alkoholabusus, Schwangerschaft und Kontraindikationen für eine MRT. Darüber hinaus umfasste das Screening der Probanden eine Routine-Blutuntersuchung.
Insgesamt fünf Probanden mussten - analog der Studie von Richter- Schmidinger et al. (Richter-Schmidinger et al., 2011) - aufgrund von im Verlauf festgestellten auffälligen Befunden nachträglich aus der Studie ausgeschlossen werden: drei Probanden aufgrund einer Hyperthyreose, einer aufgrund eines Diabetes mellitus Typ I sowie ein Proband mit einer nachgewiesenen Läsion im rechten Frontallappen. Von sechs Probanden lagen keine MRT-Daten vor. Somit reduzierte sich die endgültige Studienpopulation auf 145 Probanden.
4.2 MRT-Scans und Berechnung ausgewählter Hirnteilvolumina Vom o.g. Probandenkollektiv wurden zerebrale MRT-Scans von 150 Pro- banden akquiriert. Die Bildgebung erfolgte mittels eines Sonata 1,5 Tesla
23
MRT-Gerätes (Siemens Healthcare). Anhand von axialen FLAIR-Sequenzen (5 mm Schichtdicke) wurden von einem Neuroradiologen intrakranielle Pathologien ausgeschlossen. Es wurden sagittale T1-gewichtete 3D-Se- quenz-Bilder mit MPRAGE (magnetization prepared rapid gradient echo) (TR= 2,030 ms, TE=3,9 ms, Sichtfeld (field of view)=290x290, Voxelgröße (voxel size)=1x1x1 mm3, Matrixgröße (matrix size)=256x256) generiert. Zur weiteren vollautomatischen Bildverarbeitung und Volumenberechnung wurde die FreeSurfer-Software (surfer.nmr.mgh.harvard.edu) verwendet. Zur Eliminierung von Einflüssen aufgrund von individuellen Unterschieden des Gehirnvolumens auf die errechneten Teilvolumina wurden alle spezifischen errechneten Volumina durch das intrakranielle Volumen (ICV) dividiert. In der Folge sind deshalb alle standardisierten Volumina ohne Einheit.
Die Ergebnisse der Volumenmessungen wurden dem Verfasser freundlicher- weise von der Arbeitsgruppe Molekulare Neurobiologie, Psychiatrische und Psychotherapeutische Klinik der Universität Erlangen-Nürnberg zur Ver- fügung gestellt.
Aus den vorliegenden Daten wurden für diese Studie folgende elf Teil- regionen ausgewählt: Weiße Substanz des Zerebellums, Kortex des Zerebellums, Thalamus, Nucleus caudatus, Putamen, Globus pallidus, Hippocampus, Amygdala, Nucleus accumbens, Großhirncortex, Weiße Substanz des Kortex.
Es erfolgte eine seitengetrennte (rechts, links) sowie eine kombinierte (beid- seitige) Analyse der hier angeführten Volumina.
4.3 Verwendete Verbrauchsmaterialien, Geräte und Software
In Tabelle 1 sind die verwendeten Verbrauchsmaterialien, Geräte und Soft- ware aufgelistet. Bei selbst hergestellten Reagenzien und Verdünnungen wurde destilliertes Wasser aus einem MilliQ-Deionizator mit einem spezi- fischen Widerstand von 18,2 MW/cm3 verwendet.
24 Tabelle 1: Verwendete Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterialien Hersteller
LE Agarose Biozym
Aqua destillata aus MilliQ deionizator (Millipore)
Cell Lysis Solution mit RNase A Qiagen
DNA Hydration Solution Qiagen
Ethanol (70 %) Apotheke des Uniklinikums
Erlangen
Ethidiumbromid 10 mg/ml Roth
Eva Green® Farbstoff 20x Biotium
Exonuclease I 20 U/µl Thermo Fisher Scientific/Fermentas
FastAP 1 U/µl Thermo Fisher Scientific/Fermentas
Gelelektrophorese Loading buffer 1x Fermentas
Gentra Puregene Blood Kit Qiagen
Isopropanol Roth
Lightcycler 480® High Resolution Melting Master 2x Roche
Magnesiumchlorid25 mM und 50mM Fermentas
O'GeneRuler Low Range DNA Ladder Fermentas
Paq-DNA-Polymerase Stratagene/Agilent Technology Tfi-PCR Reaction Buffer 5x Invitrogen
PCR Single Cap 8er Softstrips 0,2 ml Bio Scientific GmbH PCR Reaction Buffer A 10x bestehend aus:
50 ml KCl 1 M; 10 ml Tris HCl pH 8.3 1 M; 0,2 ml Triton X-100; 39,8 ml H2O
Selbst hergestellt
PCR Reaktion Buffer G 10x bestehend aus: 50 ml KCl 1 M; 10 ml Tris HCl pH 8.9 1 M; 0,2 ml Tween- 20; 39,8 ml H2O
Selbst hergestellt
Pipettenspitzen 2-100 µl und 101-1000 µl Sarstedt
Protein Precipitation Solution Qiagen
DNA Primer (siehe Tabelle 2) Sigma-Aldrich
Red Blood Cell (RBC) Lysis Solution Qiagen
Sequnezierungs-Mix Applied Biosystems
Strip PCR Tubes& Caps 200 µl Roche
TaqI-Restriktionsendonuklease Thermo Scientific TaqI-Reaction Buffer Thermo Scientific TBE Puffer 20x bestehend aus: 432 g Tris, 220 g
Borsäure, 160 ml 0,5 M EDTA pH 8.0, 2000 ml H2O
Selbst hergestellt
Tfi-DNA-Polymerase Invitrogen
25
Tabelle 1, Fortsetzung: Verwendete Geräte und Software.
Geräte Hersteller
EDTA –Blutentnahmeröhrchen Sarstedt
Elektrophoresekammern Bio-Rad
Eppendorf-Reaktionsgefäße 1.5 ml Eppendorf
Geldoc 2000 Bio-Rad
Gelträger Sub Cell® GT Bio-Rad
Heraeus® Pico™ Tischzentrifuge Thermo Scietific
LightCycler® 480 II Roche
Mikrowellenofen Privileg 8020 Privileg
MilliQ-Deionizator Millipore
NanoDrop ND-1000 UV-Spektrophotometer Pegalab Pipetten 10 µl, 20 µl, 100 µl, 1000 µl Eppendorf
Sprout Minizentrifuge Biozym
ThermoCycler SensoQuest
Thermoschüttler Eppendorf
Rotilabo Mini-Zentrifuge Carl Roth
Vortex Genie 2 Vortexgerät Scientific Industries
Software Hersteller
LightCycler 480® Gene Scanning Software® 1.5 Roche
Primer 3 Software http://primer3.ut.ee/
Quantity One 1-D Analysis Software Bio-Rad
SPSS Statistics Version 21 IBM
Microsoft Excel 2010 Microsoft
4.4 Methoden
4.4.1 DNA-Extraktion aus EDTA-Blut und Quantifizierung
Nach der Abnahme wurden EDTA-Blutproben der Studienteilnehmer bis zur weiteren Prozessierung bei -80°C aufbewahrt. Zur Gewinnung von genomi- scher DNA aus den Blutproben wurde der Gentra Puregene Blood Kit ver- wendet. Folgendes, leicht modifiziertes Protokoll des Herstellers (Qiagen) wurde zur Extraktion angewendet:
Die Proben (EDTA-Blut, gefroren bei -80°C) wurden im 37°C Wasserbad 5- 10 Min. möglichst rasch aufgetaut, danach auf Eis gelagert. Es wurden dann je 900 µl Red Blood Cell (RBC-) Lysis-Solution in 1.5 ml Eppendorf- Reaktionsgefäße pipettiert und je 300 µl EDTA-Blut zugegeben, 7-10 Min.
bei Raumtemperatur inkubiert und währenddessen mehrmals vorsichtig in- vertiert. Nachdem es so zur Lyse der Erythrozyten gekommen war, wurden die Proben 20 Sek. lang bei 15000 U/Min. zentrifugiert. Es bildete sich ein weißliches Pellet aus Leukozyten. Der Überstand wurde verworfen und dem
26
Pellet erneut 900 µl RBC-Lysis Solution zugegeben. Die Proben wurden nochmals, wie oben beschrieben, inkubiert und zentrifugiert. Danach wurde der Überstand teilweise abpippetiert. Etwa 20 µl Flüssigkeit wurden im Eppendorf-Gefäß belassen. Das Pellet wurde durch gründliches Vortexen möglichst vollständig resuspendiert. Zum Freisetzen der DNA aus den Zell- kernen erfolgte die Zugabe von 300 µl Cell Lysis Solution und 1,5 µl RNase A Solution. Anschließend wurden die Proben 10 Sek. gevortext und dann zuerst 15 Min. im Thermoschüttler (700 rpm) bei 37 C, danach mindestens 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Währenddessen wurde mehrfach ge- vortext. Nach kurzer Zentrifugation zum Sammeln der Flüssigkeit erfolgte die Zugabe von 100 µl Protein Precipitation Solution. Die Proben wurden sofort 20 Sek. gevortext, dann 5 Min. auf Eis inkubiert und anschließend für eine Minute bei 15000 U/Min. zentrifugiert, bis ein festes Pellet aus Zellproteinen entstand. Der Flüssigkeitsüberstand mit der enthaltenen genomischen DNA wurde in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt und nochmals für eine Minute zentrifugiert, um alle Proteinpelletreste zu sammeln. Der Überstand wurde dann nochmals in ein neues Eppendorf-Gefäß pipettiert. Dazu wurden 300 µl Isopropanol zugegeben und die Proben zirka fünfzig Mal invertiert, bis die DNA sichtbar ausfiel. Die Proben wurden dann eine Minute lang bei 15000 U/Min. zentrifugiert und der Flüssigkeitsüberstand über der DNA ver- worfen. Den Proben wurde dann zum Waschen je 300 µl Ethanol (70 %) zu- geben. Danach wurden die Proben einige Male invertiert und anschließend eine Minute bei 15000 U/Min. zentrifugiert. Von der so „gewaschenen“ DNA wurde der Flüssigkeitsüberstand möglichst vollständig entfernt, bis lediglich weiße DNA-Pellets zurückblieben. Diese wurden etwa zehn Minuten in den geöffneten Probengefäßen getrocknet. Danach wurde den Proben je 100 µl DNA Hydration Solution zugegeben und diese für 5 Min. bei 65°C im Thermoschüttler inkubiert. Die Proben wurden anschließend zum voll- ständigen Lösen der DNA über Nacht bei Raumtemperatur gelagert und im Anschluss daran vorsichtig für einige Minuten gevortext. Die weitere Lage- rung bis zur Verwendung erfolgte bei 4°C.
Zur Konzentrationsbestimmung der aus EDTA-Blut gewonnenen gDNA- Proben wurde ein NanoDrop UV-Spektrophotometer verwendet. Es erfolgte eine zweifache Messung jeder Probe mit 1,5 µl bei 260 nm und 280 nm. Zur
27
weiteren Verwendung waren nur Proben mit einer DNA-Konzentration zwi- schen 20 und 50 ng/µl geeignet. Bei Proben mit zu geringer DNA-Konzentra- tion wurde erneut DNA aus EDTA-Blutproben isoliert. Bei Proben mit zu gro- ßer DNA-Konzentration erfolgte eine Verdünnung der Probe auf eine Konzentration von 20 ng/µl mit Hydration Solution.
4.4.2 Genotypisierung der DNA-Proben
Die Genotypisierung erfolgte für vier SNPs (rs1801131, rs1801133, rs821616, rs3738401). Die Ergebnisse des fünften untersuchten SNP, rs6675281, wurden von der Arbeitsgruppe für Molekulare Neurobiologie der psychiatrischen Klinik der FAU Erlangen-Nürnberg zur Verfügung gestellt.
Die Genotypisierung hinsichtlich des SNP rs1801133 erfolgte mittels Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus- (RFLP-) Analyse sowie mittels High Resolution Melting- (HRM-) Analyse. Die Genotypisierung hinsichtlich der weiteren SNPs erfolgte mittels HRM-Analyse. Die Ergebnisse aus der HRM-Analyse wurden durch die Sequenzierung ausgewählter Proben kon- trolliert. Mittels DNA-Sequenzierung genotypisierte Proben dienten auch als interne Standards bei der HRM-Genotypisierung. Tabelle 2 zeigt die für die Genotypisierung verwendeten Primer sowie die entsprechenden Primer- paarungen und die sich daraus ergebenden Amplikon-Längen. Die Primer MTHFR_rs1801133_f2 und MTHFR_rs1801133_r2 wurden von Norambuena et al. (Norambuena et al., 2009) vorbeschrieben. Alle anderen Primer wurden mittels Primer3-Software ausgewählt, wobei pro SNP teilweise mehrere verschiedene Primer verwendet wurden. Zur HRM-Analyse wurde auf die Schaffung möglichst kurzer Amplikons geachtet. Zur DNA- Sequenzierung wurde hingegen eine ausreichende Entfernung der Primer zu den jeweiligen Polymorphismen berücksichtigt.
28
Tabelle 2: Zur Genotypisierung verwendete Primer, deren Paarungen sowie die sich hieraus ergebenden Amplikon-Längen
SNP ID Primer Name Basensequenz
rs1801131 MTHFR_rs1801131_f AGAGCAAGTCCCCCAAGGAG
MTHFR _rs1801131_r ATGAACCAGGGTCCCCACTC MTHFR _rs1801131_f2 GGGAGGAGCTGACCAGTGAA
MTHFR _rs1801131_r2 GTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACT
rs1801133 MTHFR _rs1801133_f AGGGAGCTTTGAGGCTGACC
MTHFR _rs1801133_r CCCTCACCTGGATGGGAAAG MTHFR _rs1801133_f2 GAAGGAGAAGGTGTCTGCG MTHFR _rs1801133_r2 AGCTGCGTGATGATGAAATC
rs821616 DISC1_rs8261616_f TGGGAAGCTGACTTGGAAGC
DISC1_rs8261616_r CCTGGCTTCCTGGAGCTGTA DISC1_rs8261616_r2 TCCAGCACAGTGCAGAGAGG
rs3738401 DISC1_rs3738401_f AGGACCCGCGATGTCTCTCT
DISC1_rs3738401_f2 GCTGAGTCCCATTGCCAGAG DISC1_rs3738401_r TCTGCAGAGACCCGTGTAGC
Primerpaar Amplikon Länge (bp)
MTHFR _rs1801131_f/MTHFR_rs1801131_r 155 (Sequenzierung) MTHFR_rs1801131_f2/MTHFR_rs1801131_r2 50 (HRM)
MTHFR_rs1801133_f/MTHFR_rs1801133_r 176 (Sequenzierung) MTHFR_rs1801133_f2/MTHFR_rs1801133_r2 45 (HRM)
DISC1_rs8261616_f/DISC1_rs8261616_r 63 (HRM)
DISC1_rs8261616_f/DISC1_rs8261616_r2 222 (Sequenzierung) DISC1_rs3738401_fDISC1_rs3738401_r 58 (HRM)
DISC1_rs3738401_f2/DISC1_rs3738401_r 125 (Sequenzierung)
4.4.2.1 Genotypisierung mittels RFLP-Analyse
Zur DNA-Amplifikation wurde entweder eine Tfi-DNA-Polymerase oder eine Paq-DNA-Polymerase verwendet. Die PCR-Reaktionsgemische mit einem Gesamtvolumen von 10 µl wurden wie in Tabelle 3 als Mastermixe auf Eis angesetzt. Die PCR-Reaktionen wurden im ThermoCycler (SensoQuest) durchgeführt. Tabelle 4 zeigt die angewendeten PCR-Protokolle.
29
Tabelle 3: Rezept der PCR mit Tfi-DNA-Polymerase/Paq-DNA Polymerase für rs1801133
Komponente Volumen Konzentration/Gesamtmenge
5x Tfi-PCR Reaction Buffer oder Reaction Buffer A 10x
2,0 µl/1,0 µl 1x/
1x Tfi DNA Polymerase 5 U/µl oder
Paq-DNA-Polymerase 5 U/µl
0,1 µl/
0,05 µl
0,5 Units/
0,25 Units
MgCl2 50 mM 0,3 µl 1,5 mM
MTHFR_rs1801133_f 10 µM 0,2 µl 0,2 µM MTHFR_rs1801133_r 10 µM 0,2 µl 0,2 µM
dNTPs Mix 10 mM, jeweils 0,2 µl 2,0 mM, jeweils
Template DNA 20-50 ng/µl 1,0 µl 20-50 ng
H2O 6,0 µl / 6,75 µl -
Tabelle 4: Protokoll der PCR mit Tfi-DNA-Polymerase/ Paq-DNA-Polymerase für rs1801133
Schritt Temperatur Zeit Zyklen
Prädenaturierung 96°C 2 min 1
Amplifikation:
Denaturierung Hybridisierung Elongation
94°C 62°C 72°C
15 Sek 20 Sek.
15 Sek.
45
Finale Elongation 72°C 10 min 1
Nach Abschluss der PCR erfolgte das Schneiden der PCR-Produkte mit Restriktionsenzymen in einem Gesamtvolumen von 20 µl. Die Komponenten (0,2 µl Taq I-Restriktionsendonuclease 10 U/µl, 2,0 µl Taq I-Buffer 10x, 7,8 µl H2O, 10,0 µl PCR-Produkt) wurden als Mastermix auf Eis gemischt und den DNA-Proben direkt im PCR-Reaktionsgefäß zugefügt. Anschließend wurden die Proben im ThermoCycler bei 65°C für 12 h inkubiert. Zur RFLP-Analyse wurde die Taq1-Restriktionsendonuklease verwendet. Diese erkennt die palindromische DNA-Sequenz 3´-AGCT-5´und schneidet die DNA nach dem C, wobei „klebrige“ Schnittstellen entstehen. Bei TT-Homozygoten wird im Bereich des SNP rs1801133 die gesamte DNA geschnitten; es entstehen zwei DNA Produkte mit Längen von 121 bp und 55 bp. Im Fall von CC- Homozygoten schneidet die Taq I-Restriktionsendonuclease nicht an der Stelle des SNP rs1331180; das DNA-Amplikon mit 176 bp Länge bleibt be- stehen. Bei Heterozygoten lassen sich folglich insgesamt drei DNA-Produkte mit Längen von 176 bp, 121 bp und 55 bp nachweisen.
Zur Gelelektrophorese wurden 1.5 %ige Agarosegele verwendet. Dazu wur- den 2.25 g Agarose-Pulver mit 150 ml TBE-Puffer in einem 0.5 l Erlenmeyer- kolben in einem handelsüblichen Mikrowellenofen bis zur vollständigen
30
Lösung des Agarose-Pulvers erhitzt. Nach Abkühlung auf 50°C wurden dem Gemisch 2.0 µl Ethidiumbromid 10 mg/ml zupippetiert. Danach wurde das Gemisch in einen Gelträger mit eingesetzten Kämmen gegossen und unter Abdeckung zum Festwerden bei Zimmertemperatur stehen gelassen.
Nach Einlage des erkalteten Gels wurde dieses mit TBE-Puffer bedeckt, da- nach die Gelkammern mit 10 µl der DNA-Proben sowie 1 µl Ladepuffer ge- laden. Als Längenstandard wurden pro Gel jeweils 2.0 µl O'GeneRuler Low Range DNA Ladder (50 ng/µl) verwendet. Anschließend erfolgte die Gelelektrophorese bei 120 V für 30-40 Minuten. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in die Geldokumentationsanlage Geldoc 2000 übertragen, fotografiert und mit der Quantity One 1-D Analysis-Software bearbeitet und ausgewertet.
4.4.2.2 Genotypisierung mittels Sequenzierung
Die der Sequenzierung vorausgehenden PCRs erfolgten nach dem unten stehendem Rezept (Tabelle 5) und Protokoll (Tabelle 6) mit den in Tabelle 2 gelisteten Primern.
Tabelle 5: Rezept der PCR vor DNA-Sequenzierung
Komponente Volumen Konzentration/Gesamtmenge
Reaction Buffer A 10x 1,0 µl 1x
Tfi DNA Polymerase 5 U/µl 0,1 µl 0,5 Units
MgCl2 25 mM 0,6 µl 1,5 mM
forward Primer (s.u.) 0,2 µl 0,2 µM
reverse Primer (s.u.) 0,2 µl 0,2 µM
dNTPs Mix 10 mM 0,2 µl 2,0 mM
Template DNA 20ng/µl 0,7 µl 20-50 ng
H2O 7,0 µl -
Tabelle 6: Protokoll der PCR vor DNA-Sequenzierung
Schritt Temperatur Zeit Zyklen
Prädenaturierung 96°C 2 min 1
Amplifikation:
Denaturierung Hybridisierung Elongation
96°C 59°C 72°C
15 Sek 15 Sek.
12 Sek.
45
Finale Elongation 92°C 2 min 1
31
An die PCR anschließend wurden 0.5 µl Exonuclease I 20 U/µl und 1.0 µl FastAP 1 U/µl direkt zu den PCR-Ansätzen in die 200 µl PCR-Gefäße zu- gegeben und für 15 min bei 37°C im Thermocycler inkubiert. Die Behandlung mit Exonuclease I und Alkalischer Phosphatase diente einerseits zum Abbau der einsträngigen PCR-Primer sowie zur Dephosphorylierung von rück- ständigen Nukleotiden und war andererseits zur Vermeidung von Störungen in der folgenden Sequenzierungsreaktion notwendig. Zur Enzyminaktivierung erfolgte danach eine Inkubation bei 85°C für 10 min.
Für die Sequenzierungsreaktion wurde das in Tabelle 7 angeführte Rezept verwendet. Tabelle 8 zeigt das Protokoll der Sequenzierungsreaktion.
Tabelle 7: Rezept der Sequenzierungsreaktion
Komponente Volumen
Seq-Mix 2.0 µl
MTHFR_rs1801131_f1 10 µM oder DISC1_rs8261616_f 10 µM oder DISC1_rs3738401_f2 10 µM
0.5 µl
Behandeltes PCR-Produkt 0.5 µl
H2O 7.0 µl
Tabelle 8: Protokoll der Sequenzierungsreaktion
Schritt Temperatur Zeit Zyklen
Prädenaturierung 96°C 2 min 1
Denaturierung Hybridisierung Elongation
96°C 59°C 60°C
15 Sek.
15 Sek.
1 min
35
Lagerung -20°C - -
Die Reinigung der PCR-Produkte zur Entfernung von Salzen und nicht einge- bauten Nukleotiden sowie die Sequenzierungsläufe (48er Kapillar- sequenzierer, Applied Biosystems) wurden vom Humangenetischen Institut am Universitätsklinikum Erlangen durchgeführt.
32
4.4.2.3 Genotypisierung mittels HRM-Analyse
Die der HRM-Analyse vorausgehenden PCR-Amplifikationen erfolgten im LightCycler 480 II. Alle PCR-Gemische wurden als Mastermixe auf Eis ange- setzt. Im direkten Anschluss an die PCR-Reaktion erfolgte ebenfalls im LightCycler 480 II das High Resolution Melting. Die Tabellen 9-12 zeigen die für die verschiedenen PCRs verwendeten Rezepte sowie PCR- und HRM- Protokolle.
Tabelle 9: HRM-PCR-Rezept für MTHFR rs1801133
Komponente Volumen Finale Konzentration
Lightcycler 480 High Resolution Melting Master 2x 5.0 µl 1x
MgCl2 25 mM 0.8 µl 2.0 mM
MTHFR_rs1801133_f2 Primer 10µM 0.5 µl 0.5 µM MTHFR_rs1801133_r2 Primer10µM 0.5 µl 0.5 µM
Template-gDNA 20-50ng/µl 1.0 µl 2-5 ng/µl
H2O 2.2 µl -
Tabelle 10: HRM-PCR-Rezept für rs1801131, rs821616 und rs3738401
Komponente Volumen Finale Konzentration
10x PCR Reaktion Buffer G 1.0 µl 1x
EvaGreen Farbstoff 20x 0.5 µl 1x
dNTP-Mix 10mM 0.2 µl 0.2 mM
MTHFR_rs1801131_f2 10µM oder DISC1_rs8261616_f oder
DISC1_rs3738401_f
0.5 µl 0.5 µM
MTHFR_rs1801131_r2 10µM oder DISC1_rs8261616_r oder
DISC1_rs3738401_r
0.5 µl 0.5 µM
MgCl2 25mM 0.8 µl 2.0 mM
Tfi DNA-Polymerase 5U/µl 0.1 µl 0.5 U/ µl
Template-gDNA 20-50ng/µl 0.7 µl 1.4-3.5 ng/µl
H2O 5.7 µl
33 Tabelle 11: PCR- und HRM- Protokoll für rs1801133
Schritt Temperatur Zeit Zyklen
Prädenaturierung 95°C 2 min 1
Amplifikation Denaturierung Hybridisierung Elongation
96°C 59°C 72°C
12 Sek.
15 Sek.
15 Sek.
45
HRM
Denaturierung Kühlung HRM Start Erhitzung Kühlung
95°C 40°C 70°C 70°C-95°C 40°C
1 min 1 min 1 Sek.
0.02°C/s 30 Sek.
1
Tabelle 12: PCR- und HRM Protokoll für rs1801131, rs821616 und rs3738401
Schritt Temperatur Zeit Zyklen
Prädenaturierung 95°C 10 min 1
Amplifikation Denaturierung Hybridisierung Elongation
96°C 60°C 72°C
15 Sek.
15 Sek.
10 Sek.
40-45
HRM
Denaturierung Kühlung HRM Start Erhitzung Kühlung
95°C 40°C 65°C 65°C -95°C 40°C
1 min 1 min 1 Sek.
0.02°C/s 30 Sek.
1
Am Ende der Amplifikationsphasen erfolgte jeweils eine Fluoreszenz- messung. Während des HRM-Prozesses wurden 25 Fluoreszenzmessungen pro Sekunde durchgeführt. Die dadurch gewonnenen Schmelzkurven wurden mit Hilfe der GeneScanning-Software analysiert. Tabelle 13 zeigt die Pro- gramm-Parametereinstellungen für die einzelnen SNPs.
Tabelle 13: Programm-Parametereinstellungen der Schmelzkurvenanalyse
SNP Pre-Melt Slider Post-Melt Slider Threshold Sensitivity
High Low High Low
rs1801133 73.0°C 75.0°C 81.0°C 83.0°C 5 0.7
rs1801131 72.0°C 73.0°C 80.0°C 81.0°C 1 0.4
rs821616 72.0°C 73.0°C 84.9°C 85.2°C 0 0.3
rs3738401 74.3°C 74.5°C 85.0°C 85.2°C 2 0.3
34
4.5 Statistik
Es erfolgte die Berechnung der erwarteten Genotypenverteilungen im Studienkollektiv nach dem Hardy Weinberg Equilibrium (HWE). Die tat- sächlichen und erwarteten Genotypenverteilungen wurden mittels Chi- Quadrat-Test auf Übereinstimmung getestet.
Mögliche Zusammenhänge zwischen den untersuchten Genotypen bzw.
Allelträgergruppen wurden mittels Kruskal-Wallis-Test bzw. t-Test analysiert.
Zuvor wurden die Normalverteilungsannahme mit dem Kolmogorov-Smirnov- Test sowie die Gleichheit der Varianzen mit dem Levene-Test untersucht.
Das Signifikanzniveau lag bei 5 % (p=0,05).
Die statistischen Berechnungen erfolgten mit den Programmen Microsoft Excel (Version 2010) und IBM SPSS (Version 21).
