DISC1 SNP rs3738401

Der SNP rs3738401 befindet sich innerhalb von Exon 2 (Abbildung 2) und führt im Gen zu einem Basenaustausch von Guanin zu Adenosin (c.791G>A), im Protein zu einem Aminosäureaustausch von Arginin (polar, stark basisch) zu Glutamin (polar, neutral) (p.Arg264Gln). Die MAF dieses SNP liegt bei 0.28 (A-Allel) (Cariaso und Lennon (d), 2012). Durch den Poly-morphismus bedingt, kommt es zu einer reduzierten Interaktion des DISC1-Proteins mit der Glykogensynthase-Kinase 3β (GSK-3β), was wiederum zu einer Inhibition des Wnt-Signalweges und einer verringerten Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen führt (Singh et al., 2011). Als Teil des Haplotyps Hep 3 (umfasst zusätzlich die beiden SNPs rs3738401 und rs751229) (Hennah et al., 2003) konnten Assoziationen dieses SNPs zu verschiedenen psychiatrischen Erkrankungen festgestellt werden. So wurden unter anderem Zusammenhänge des Hep3-Haplotyps mit der Entwicklung von Schizo-phrenie (Hennah et al., 2003; Hodgkinson et al., 2004), schizoaffektiven und bipolaren Störungen (Hodgkinson et al., 2004) sowie dem Asperger-Syndrom beschrieben (Kilpinen et al., 2008). Außerdem konnten diverse Einflüsse des Hep3-Haplotyps auf kognitive Fähigkeiten beobachtet werden. In einer Kohorte von Patienten mit bipolarer Störung erzielten Träger des Hep3-Haplotyps signifikant schlechtere Ergebnisse beim California Verbal Learning Test (Palo et al., 2007). In einer weiteren Studie zeigten Hep3-Träger signi-fikant schlechtere Ergebnisse des visuellen Arbeitgedächtnisses bei der Teil-nahme am Wechsler Intelligenztest (Hennah et al., 2005).

Zum Einfluss des SNP rs3738401 auf einzelne Gehirnstrukturen ist bisher wenig bekannt. Es konnte ein moderater Effekt des Polymorphismus auf die Dicke der Hirnrinde im lateralen okzipitalen Kortex nachgewiesen werden (Brauns et al., 2011).

19 3.4.3.2 DISC1 SNP rs6675281 (C1819T)

Der SNP rs6675281 befindet sich im Exon 9 des DISC1-Gens (Abbildung 2).

Es handelt sich dabei ebenfalls um einen nichtsynonymen Polymorphismus, in dem Cytosin durch Thymin (c.C1819T) ersetzt wird. Die MAF dieses SNP liegt bei 0,09 (T-Allel) (Cariaso und Lennon (e), 2012). Im Protein kommt es zu einem Austausch der Aminosäure Leucin (aliphatisch, neutral, unpolar) zu Phenylalanin (aromatisch, neutral, unpolar) an Position 607 (p.Leu607Phe).

Aufgrund seiner Lokalisation an einer Protein-Bindungsstelle für diverse Proteine konnten Einflüsse dieses Polymorphismus auf die DISC1-Interaktion mit Proteinen wie NDEL, MAP1A, ATF4 und ATF5 festgestellt werden (Hennah und Porteous, 2009). Wie rs3738401 stört auch dieser Polymor-phismus die Interaktion mit der Glykogensynthase-Kinase 3β (Singh et al., 2011). Des Weiteren bedingt diese Variante eine Veränderung des zentro-somalen Verteilungsmusters des PCM1-Proteins in Gliazellen (Eastwood et al., 2010).

Für den Polymorphismus rs667582 ist bisher eine Assoziation zur schizo-affektiven Störung bekannt (Hodgkinson et al., 2004).

Des Weiteren konnte ein Einfluss des SNP auf diverse Hirnstrukturen nach-gewiesen werden. Träger des T-Allels Genotypen (CT, TT) wiesen dabei im Vergleich zu CC-homozygoten Personen signifikant weniger graue Substanz im Gyrus frontalis superior, anterioren Gyrus cinguli und linken Gyrus supramarginalis auf (Brauns et al., 2011).

3.4.3.3 DISC1 SNP rs821616

Der SNP rs821616 befindet sich in Exon 11 des DISC1-Gens (Abbildung 2).

Er führt zu einem Basenaustausch von Adenosin zu Thymin (c.2110A>T).Die globale MAF dieses SNP liegt bei 0.25 (Cariaso und Lennon (c), 2012). Im Protein kommt es zu einem Aminosäureaustausch von Serin (aliphatisch, neutral, polar) zu Cystein (aliphatisch, neutral, polar) (p.Ser704Cys). Hieraus resultiert ebenfalls eine Veränderung des zentrosomalen Verteilungsmusters des PCM1-Proteins in Gliazellen (Eastwood et al., 2010). Außerdem kommt es zu einem veränderten Bindungsmuster mit den interagierenden Proteinen NDEL1 und NDE1 (Burdick et al., 2008).

20

Eine Reihe von Studien befasste sich bereits mit den Effekten des SNP rs821616. So assoziierten Calicott et al. (2005) den SNP erstmalig mit der Entwicklung einer Schizophrenie. In dieser Studie konnte auch ein Zusammenhang zwischen dem A-Allel dieses SNPs mit kognitiven Defiziten sowohl bei an Schizophrenie Erkrankten als auch bei gesunden Probanden festgestellt werden. Des Weiteren wurde ein Zusammenhang des A-Allels mit der Entwicklung einer Depression beobachtet (Hashimoto et al., 2006).

Die Bedeutung des Polymorphismus auf verschiedene Gehirnstrukturen ist ebenfalls Gegenstand einer Reihe von Studien. Insgesamt gibt es bisher jedoch inkonsistente und teils widersprüchliche Ergebnisse. In der ersten Studie zu diesem Thema konnte bei AA(Serin)-Homozygoten gesunden Pro-banden eine Volumenminderung des Hippocampus im Vergleich zu T-Allel-Trägern festgestellt werden (Callicott et al., 2005). In darauffolgenden Unter-suchungen konnte ein signifikanter Effekt des SNP rs821616 jedoch nicht bestätigt werden (Hashimoto et al., 2006; Takahashi et al., 2009). In einer weiteren Studie zeigte sich sogar ein gegensätzlicher Effekt, wobei das A-Allel mit einem vergrößerten hippocampalen Volumen assoziiert war (Di Giorgio et al., 2008).

Neben dem Hippocampus wurden auch Effekte des Polymorphismus auf andere Gehirnstrukturen beobachtet. So konnte eine Reduktion der grauen Substanz des Gyrus cinguli bei gesunden T-Allel-Trägern im Vergleich zu AA-Homozygoten nachgewiesen werden (Hashimoto et al., 2006).

Takahashi et al. (2009) untersuchten den Einfluss des SNP rs821616 auf das Volumen verschiedener Gehirnregionen bei schizophrenen Patienten und bei einer gesunden Kontrollgruppe. Auch hierbei zeigten sich signifikante Volumenunterschiede in verschiedenen Gehirnregionen.

21

3.5 Zielsetzung

Verschiedene Gene gelten als Kandidatengene für die Entwicklung neuro-logischer und psychiatrischer Erkrankungen. Die aktuelle Forschung befasst sich zunehmend auch mit strukturellen Veränderungen des Gehirns, aus-gelöst durch Mutationen oder Polymorphismen dieser Kandidatengene.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die geschlechtsspezifischen Einflüsse von zwei nichtsynonymen SNPs des MTHFR-Gens und drei nichtsynonymen SNPs des DISC1-Gens auf die Volumina ausgewählter Gehirnregionen (siehe Abschnitt 4.2) bei 145 gesunden Probanden untersucht.

22

4. Material und Methoden

4.1 Studienpopulation

Als Grundlage dieser Arbeit wurden Blutproben von Probanden verwendet, welche in den Jahren 2007/2008 an der Universität Erlangen-Nürnberg rekrutiert wurden. Dasselbe Probandenkollektiv wurde bereits bezüglich mehrerer anderer Parameter hin untersucht (Richter-Schmidinger et al., 2011; Sidiropoulos et al., 2011; Alexopoulos et al., 2011; Rhein et al., 2014;

Reichel et al., 2014). Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Uni-versität befürwortet (Ethikvotum 3510). Entsprechend der Deklaration von Helsinki, willigten alle Probanden schriftlich zur Teilnahme an der Studie ein.

156 gesunde Probanden im Alter zwischen 18 und 35 Jahren wurden mittels eines Fragebogens bezüglich ihrer Gesundheit befragt. Ausschlusskriterien für die Studie waren in der Vorgeschichte liegende somatische Krankheiten, welche möglicherweise die Gehirnfunktion beeinträchtigen, des Weiteren psychiatrische Erkrankungen zum Zeitpunkt der Studie oder in der Vor-geschichte (z.B. Depression, Borderline-Persönlichkeitsstörung, Post-traumatische Belastungsstörung), Medikamenteneinnahme (außer hormo-neller Kontrazeption), eine Vorgeschichte von Substanzmissbrauch (außer Koffein, Nikotin und gelegentlichem Alkoholkonsum), Alkoholabusus, Schwangerschaft und Kontraindikationen für eine MRT. Darüber hinaus umfasste das Screening der Probanden eine Routine-Blutuntersuchung.

Insgesamt fünf Probanden mussten - analog der Studie von Richter-Schmidinger et al. (Richter-Richter-Schmidinger et al., 2011) - aufgrund von im Verlauf festgestellten auffälligen Befunden nachträglich aus der Studie ausgeschlossen werden: drei Probanden aufgrund einer Hyperthyreose, einer aufgrund eines Diabetes mellitus Typ I sowie ein Proband mit einer nachgewiesenen Läsion im rechten Frontallappen. Von sechs Probanden lagen keine MRT-Daten vor. Somit reduzierte sich die endgültige Studienpopulation auf 145 Probanden.

4.2 MRT-Scans und Berechnung ausgewählter Hirnteilvolumina Vom o.g. Probandenkollektiv wurden zerebrale MRT-Scans von 150 Pro-banden akquiriert. Die Bildgebung erfolgte mittels eines Sonata 1,5 Tesla

23

MRT-Gerätes (Siemens Healthcare). Anhand von axialen FLAIR-Sequenzen (5 mm Schichtdicke) wurden von einem Neuroradiologen intrakranielle Pathologien ausgeschlossen. Es wurden sagittale T1-gewichtete 3D-Se-quenz-Bilder mit MPRAGE (magnetization prepared rapid gradient echo) (TR= 2,030 ms, TE=3,9 ms, Sichtfeld (field of view)=290x290, Voxelgröße (voxel size)=1x1x1 mm³, Matrixgröße (matrix size)=256x256) generiert. Zur weiteren vollautomatischen Bildverarbeitung und Volumenberechnung wurde die FreeSurfer-Software (surfer.nmr.mgh.harvard.edu) verwendet. Zur Eliminierung von Einflüssen aufgrund von individuellen Unterschieden des Gehirnvolumens auf die errechneten Teilvolumina wurden alle spezifischen errechneten Volumina durch das intrakranielle Volumen (ICV) dividiert. In der Folge sind deshalb alle standardisierten Volumina ohne Einheit.

Die Ergebnisse der Volumenmessungen wurden dem Verfasser freundlicher-weise von der Arbeitsgruppe Molekulare Neurobiologie, Psychiatrische und Psychotherapeutische Klinik der Universität Erlangen-Nürnberg zur Ver-fügung gestellt.

Aus den vorliegenden Daten wurden für diese Studie folgende elf Teil-regionen ausgewählt: Weiße Substanz des Zerebellums, Kortex des Zerebellums, Thalamus, Nucleus caudatus, Putamen, Globus pallidus, Hippocampus, Amygdala, Nucleus accumbens, Großhirncortex, Weiße Substanz des Kortex.

Es erfolgte eine seitengetrennte (rechts, links) sowie eine kombinierte (beid-seitige) Analyse der hier angeführten Volumina.

4.3 Verwendete Verbrauchsmaterialien, Geräte und Software

In Tabelle 1 sind die verwendeten Verbrauchsmaterialien, Geräte und Soft-ware aufgelistet. Bei selbst hergestellten Reagenzien und Verdünnungen wurde destilliertes Wasser aus einem MilliQ-Deionizator mit einem spezi-fischen Widerstand von 18,2 MW/cm³ verwendet.

24 Tabelle 1: Verwendete Verbrauchsmaterialien

Verbrauchsmaterialien Hersteller

LE Agarose Biozym

Aqua destillata aus MilliQ deionizator (Millipore)

Cell Lysis Solution mit RNase A Qiagen

DNA Hydration Solution Qiagen

Ethanol (70 %) Apotheke des Uniklinikums

Erlangen

Ethidiumbromid 10 mg/ml Roth

Eva Green® Farbstoff 20x Biotium

Exonuclease I 20 U/µl Thermo Fisher Scientific/Fermentas

FastAP 1 U/µl Thermo Fisher Scientific/Fermentas

Gelelektrophorese Loading buffer 1x Fermentas

Gentra Puregene Blood Kit Qiagen

Isopropanol Roth

Lightcycler 480® High Resolution Melting Master 2x Roche

Magnesiumchlorid25 mM und 50mM Fermentas

O'GeneRuler Low Range DNA Ladder Fermentas

Paq-DNA-Polymerase Stratagene/Agilent Technology Tfi-PCR Reaction Buffer 5x Invitrogen

PCR Single Cap 8er Softstrips 0,2 ml Bio Scientific GmbH PCR Reaction Buffer A 10x bestehend aus:

50 ml KCl 1 M; 10 ml Tris HCl pH 8.3 1 M; 0,2 ml

Pipettenspitzen 2-100 µl und 101-1000 µl Sarstedt

Protein Precipitation Solution Qiagen

DNA Primer (siehe Tabelle 2) Sigma-Aldrich

Red Blood Cell (RBC) Lysis Solution Qiagen

Sequnezierungs-Mix Applied Biosystems

Strip PCR Tubes& Caps 200 µl Roche

TaqI-Restriktionsendonuklease Thermo Scientific

25

Tabelle 1, Fortsetzung: Verwendete Geräte und Software.

Geräte Hersteller

EDTA –Blutentnahmeröhrchen Sarstedt

Elektrophoresekammern Bio-Rad

Eppendorf-Reaktionsgefäße 1.5 ml Eppendorf

Geldoc 2000 Bio-Rad

Gelträger Sub Cell® GT Bio-Rad

Heraeus® Pico™ Tischzentrifuge Thermo Scietific

LightCycler® 480 II Roche

Mikrowellenofen Privileg 8020 Privileg

MilliQ-Deionizator Millipore

NanoDrop ND-1000 UV-Spektrophotometer Pegalab Pipetten 10 µl, 20 µl, 100 µl, 1000 µl Eppendorf

Sprout Minizentrifuge Biozym

ThermoCycler SensoQuest

Thermoschüttler Eppendorf

Rotilabo Mini-Zentrifuge Carl Roth

Vortex Genie 2 Vortexgerät Scientific Industries

Software Hersteller

LightCycler 480® Gene Scanning Software^® 1.5 Roche

Primer 3 Software http://primer3.ut.ee/

Quantity One 1-D Analysis Software Bio-Rad

SPSS Statistics Version 21 IBM

Microsoft Excel 2010 Microsoft

4.4 Methoden

4.4.1 DNA-Extraktion aus EDTA-Blut und Quantifizierung

Nach der Abnahme wurden EDTA-Blutproben der Studienteilnehmer bis zur weiteren Prozessierung bei -80°C aufbewahrt. Zur Gewinnung von genomi-scher DNA aus den Blutproben wurde der Gentra Puregene Blood Kit ver-wendet. Folgendes, leicht modifiziertes Protokoll des Herstellers (Qiagen) wurde zur Extraktion angewendet:

Die Proben (EDTA-Blut, gefroren bei -80°C) wurden im 37°C Wasserbad 5-10 Min. möglichst rasch aufgetaut, danach auf Eis gelagert. Es wurden dann je 900 µl Red Blood Cell (RBC-) Lysis-Solution in 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert und je 300 µl EDTA-Blut zugegeben, 7-10 Min.

bei Raumtemperatur inkubiert und währenddessen mehrmals vorsichtig in-vertiert. Nachdem es so zur Lyse der Erythrozyten gekommen war, wurden die Proben 20 Sek. lang bei 15000 U/Min. zentrifugiert. Es bildete sich ein weißliches Pellet aus Leukozyten. Der Überstand wurde verworfen und dem

26

Pellet erneut 900 µl RBC-Lysis Solution zugegeben. Die Proben wurden nochmals, wie oben beschrieben, inkubiert und zentrifugiert. Danach wurde der Überstand teilweise abpippetiert. Etwa 20 µl Flüssigkeit wurden im Eppendorf-Gefäß belassen. Das Pellet wurde durch gründliches Vortexen möglichst vollständig resuspendiert. Zum Freisetzen der DNA aus den Zell-kernen erfolgte die Zugabe von 300 µl Cell Lysis Solution und 1,5 µl RNase A Solution. Anschließend wurden die Proben 10 Sek. gevortext und dann zuerst 15 Min. im Thermoschüttler (700 rpm) bei 37 C, danach mindestens 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Währenddessen wurde mehrfach ge-vortext. Nach kurzer Zentrifugation zum Sammeln der Flüssigkeit erfolgte die Zugabe von 100 µl Protein Precipitation Solution. Die Proben wurden sofort 20 Sek. gevortext, dann 5 Min. auf Eis inkubiert und anschließend für eine Minute bei 15000 U/Min. zentrifugiert, bis ein festes Pellet aus Zellproteinen entstand. Der Flüssigkeitsüberstand mit der enthaltenen genomischen DNA wurde in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt und nochmals für eine Minute zentrifugiert, um alle Proteinpelletreste zu sammeln. Der Überstand wurde dann nochmals in ein neues Eppendorf-Gefäß pipettiert. Dazu wurden 300 µl Isopropanol zugegeben und die Proben zirka fünfzig Mal invertiert, bis die DNA sichtbar ausfiel. Die Proben wurden dann eine Minute lang bei 15000 U/Min. zentrifugiert und der Flüssigkeitsüberstand über der DNA ver-worfen. Den Proben wurde dann zum Waschen je 300 µl Ethanol (70 %) zu-geben. Danach wurden die Proben einige Male invertiert und anschließend eine Minute bei 15000 U/Min. zentrifugiert. Von der so „gewaschenen“ DNA wurde der Flüssigkeitsüberstand möglichst vollständig entfernt, bis lediglich weiße DNA-Pellets zurückblieben. Diese wurden etwa zehn Minuten in den geöffneten Probengefäßen getrocknet. Danach wurde den Proben je 100 µl DNA Hydration Solution zugegeben und diese für 5 Min. bei 65°C im Thermoschüttler inkubiert. Die Proben wurden anschließend zum voll-ständigen Lösen der DNA über Nacht bei Raumtemperatur gelagert und im Anschluss daran vorsichtig für einige Minuten gevortext. Die weitere Lage-rung bis zur Verwendung erfolgte bei 4°C.

Zur Konzentrationsbestimmung der aus EDTA-Blut gewonnenen gDNA-Proben wurde ein NanoDrop UV-Spektrophotometer verwendet. Es erfolgte eine zweifache Messung jeder Probe mit 1,5 µl bei 260 nm und 280 nm. Zur

27

weiteren Verwendung waren nur Proben mit einer DNA-Konzentration zwi-schen 20 und 50 ng/µl geeignet. Bei Proben mit zu geringer DNA-Konzentra-tion wurde erneut DNA aus EDTA-Blutproben isoliert. Bei Proben mit zu gro-ßer DNA-Konzentration erfolgte eine Verdünnung der Probe auf eine Konzentration von 20 ng/µl mit Hydration Solution.

4.4.2 Genotypisierung der DNA-Proben

Die Genotypisierung erfolgte für vier SNPs (rs1801131, rs1801133, rs821616, rs3738401). Die Ergebnisse des fünften untersuchten SNP, rs6675281, wurden von der Arbeitsgruppe für Molekulare Neurobiologie der psychiatrischen Klinik der FAU Erlangen-Nürnberg zur Verfügung gestellt.

Die Genotypisierung hinsichtlich des SNP rs1801133 erfolgte mittels Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus- (RFLP-) Analyse sowie mittels High Resolution Melting- (HRM-) Analyse. Die Genotypisierung hinsichtlich der weiteren SNPs erfolgte mittels HRM-Analyse. Die Ergebnisse aus der HRM-Analyse wurden durch die Sequenzierung ausgewählter Proben kon-trolliert. Mittels DNA-Sequenzierung genotypisierte Proben dienten auch als interne Standards bei der HRM-Genotypisierung. Tabelle 2 zeigt die für die Genotypisierung verwendeten Primer sowie die entsprechenden Primer-paarungen und die sich daraus ergebenden Amplikon-Längen. Die Primer MTHFR_rs1801133_f2 und MTHFR_rs1801133_r2 wurden von Norambuena et al. (Norambuena et al., 2009) vorbeschrieben. Alle anderen Primer wurden mittels Primer3-Software ausgewählt, wobei pro SNP teilweise mehrere verschiedene Primer verwendet wurden. Zur HRM-Analyse wurde auf die Schaffung möglichst kurzer Amplikons geachtet. Zur DNA-Sequenzierung wurde hingegen eine ausreichende Entfernung der Primer zu den jeweiligen Polymorphismen berücksichtigt.

28

Tabelle 2: Zur Genotypisierung verwendete Primer, deren Paarungen sowie die sich hieraus ergebenden Amplikon-Längen

SNP ID Primer Name Basensequenz

rs1801131 MTHFR_rs1801131_f AGAGCAAGTCCCCCAAGGAG

MTHFR _rs1801131_r ATGAACCAGGGTCCCCACTC MTHFR _rs1801131_f2 GGGAGGAGCTGACCAGTGAA

MTHFR _rs1801131_r2 GTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACT

rs1801133 MTHFR _rs1801133_f AGGGAGCTTTGAGGCTGACC

MTHFR _rs1801133_r CCCTCACCTGGATGGGAAAG MTHFR _rs1801133_f2 GAAGGAGAAGGTGTCTGCG MTHFR _rs1801133_r2 AGCTGCGTGATGATGAAATC

rs821616 DISC1_rs8261616_f TGGGAAGCTGACTTGGAAGC

DISC1_rs8261616_r CCTGGCTTCCTGGAGCTGTA DISC1_rs8261616_r2 TCCAGCACAGTGCAGAGAGG

rs3738401 DISC1_rs3738401_f AGGACCCGCGATGTCTCTCT

DISC1_rs3738401_f2 GCTGAGTCCCATTGCCAGAG DISC1_rs3738401_r TCTGCAGAGACCCGTGTAGC

Primerpaar Amplikon Länge (bp)

MTHFR _rs1801131_f/MTHFR_rs1801131_r 155 (Sequenzierung) MTHFR_rs1801131_f2/MTHFR_rs1801131_r2 50 (HRM)

MTHFR_rs1801133_f/MTHFR_rs1801133_r 176 (Sequenzierung) MTHFR_rs1801133_f2/MTHFR_rs1801133_r2 45 (HRM)

DISC1_rs8261616_f/DISC1_rs8261616_r 63 (HRM)

DISC1_rs8261616_f/DISC1_rs8261616_r2 222 (Sequenzierung) DISC1_rs3738401_fDISC1_rs3738401_r 58 (HRM)

DISC1_rs3738401_f2/DISC1_rs3738401_r 125 (Sequenzierung)

4.4.2.1 Genotypisierung mittels RFLP-Analyse

Zur DNA-Amplifikation wurde entweder eine Tfi-DNA-Polymerase oder eine Paq-DNA-Polymerase verwendet. Die PCR-Reaktionsgemische mit einem Gesamtvolumen von 10 µl wurden wie in Tabelle 3 als Mastermixe auf Eis angesetzt. Die PCR-Reaktionen wurden im ThermoCycler (SensoQuest) durchgeführt. Tabelle 4 zeigt die angewendeten PCR-Protokolle.

29

Tabelle 3: Rezept der PCR mit Tfi-DNA-Polymerase/Paq-DNA Polymerase für rs1801133

Komponente Volumen Konzentration/Gesamtmenge

5x Tfi-PCR Reaction Buffer oder Reaction Buffer A 10x

2,0 µl/1,0 µl 1x/

1x Tfi DNA Polymerase 5 U/µl oder

Paq-DNA-Polymerase 5 U/µl

MTHFR_rs1801133_f 10 µM 0,2 µl 0,2 µM MTHFR_rs1801133_r 10 µM 0,2 µl 0,2 µM

dNTPs Mix 10 mM, jeweils 0,2 µl 2,0 mM, jeweils

Template DNA 20-50 ng/µl 1,0 µl 20-50 ng

H₂O 6,0 µl / 6,75 µl

-Tabelle 4: Protokoll der PCR mit Tfi-DNA-Polymerase/ Paq-DNA-Polymerase für rs1801133

Schritt Temperatur Zeit Zyklen

Prädenaturierung 96°C 2 min 1

Amplifikation:

Finale Elongation 72°C 10 min 1

Nach Abschluss der PCR erfolgte das Schneiden der PCR-Produkte mit Restriktionsenzymen in einem Gesamtvolumen von 20 µl. Die Komponenten (0,2 µl Taq I-Restriktionsendonuclease 10 U/µl, 2,0 µl Taq I-Buffer 10x, 7,8 µl H2O, 10,0 µl PCR-Produkt) wurden als Mastermix auf Eis gemischt und den DNA-Proben direkt im PCR-Reaktionsgefäß zugefügt. Anschließend wurden die Proben im ThermoCycler bei 65°C für 12 h inkubiert. Zur RFLP-Analyse wurde die Taq1-Restriktionsendonuklease verwendet. Diese erkennt die palindromische DNA-Sequenz 3´-AGCT-5´und schneidet die DNA nach dem C, wobei „klebrige“ Schnittstellen entstehen. Bei TT-Homozygoten wird im Bereich des SNP rs1801133 die gesamte DNA geschnitten; es entstehen zwei DNA Produkte mit Längen von 121 bp und 55 bp. Im Fall von CC-Homozygoten schneidet die Taq I-Restriktionsendonuclease nicht an der Stelle des SNP rs1331180; das DNA-Amplikon mit 176 bp Länge bleibt be-stehen. Bei Heterozygoten lassen sich folglich insgesamt drei DNA-Produkte mit Längen von 176 bp, 121 bp und 55 bp nachweisen.

Zur Gelelektrophorese wurden 1.5 %ige Agarosegele verwendet. Dazu wur-den 2.25 g Agarose-Pulver mit 150 ml TBE-Puffer in einem 0.5 l Erlenmeyer-kolben in einem handelsüblichen Mikrowellenofen bis zur vollständigen

30

Lösung des Agarose-Pulvers erhitzt. Nach Abkühlung auf 50°C wurden dem Gemisch 2.0 µl Ethidiumbromid 10 mg/ml zupippetiert. Danach wurde das Gemisch in einen Gelträger mit eingesetzten Kämmen gegossen und unter Abdeckung zum Festwerden bei Zimmertemperatur stehen gelassen.

Nach Einlage des erkalteten Gels wurde dieses mit TBE-Puffer bedeckt, da-nach die Gelkammern mit 10 µl der DNA-Proben sowie 1 µl Ladepuffer ge-laden. Als Längenstandard wurden pro Gel jeweils 2.0 µl O'GeneRuler Low Range DNA Ladder (50 ng/µl) verwendet. Anschließend erfolgte die Gelelektrophorese bei 120 V für 30-40 Minuten. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in die Geldokumentationsanlage Geldoc 2000 übertragen, fotografiert und mit der Quantity One 1-D Analysis-Software bearbeitet und ausgewertet.

4.4.2.2 Genotypisierung mittels Sequenzierung

Die der Sequenzierung vorausgehenden PCRs erfolgten nach dem unten stehendem Rezept (Tabelle 5) und Protokoll (Tabelle 6) mit den in Tabelle 2 gelisteten Primern.

Tabelle 5: Rezept der PCR vor DNA-Sequenzierung

Komponente Volumen Konzentration/Gesamtmenge

Reaction Buffer A 10x 1,0 µl 1x

Tfi DNA Polymerase 5 U/µl 0,1 µl 0,5 Units

MgCl2 25 mM 0,6 µl 1,5 mM

forward Primer (s.u.) 0,2 µl 0,2 µM

reverse Primer (s.u.) 0,2 µl 0,2 µM

dNTPs Mix 10 mM 0,2 µl 2,0 mM

Template DNA 20ng/µl 0,7 µl 20-50 ng

H2O 7,0 µl

-Tabelle 6: Protokoll der PCR vor DNA-Sequenzierung

Schritt Temperatur Zeit Zyklen

Prädenaturierung 96°C 2 min 1

Amplifikation:

Finale Elongation 92°C 2 min 1

31

An die PCR anschließend wurden 0.5 µl Exonuclease I 20 U/µl und 1.0 µl FastAP 1 U/µl direkt zu den PCR-Ansätzen in die 200 µl PCR-Gefäße zu-gegeben und für 15 min bei 37°C im Thermocycler inkubiert. Die Behandlung mit Exonuclease I und Alkalischer Phosphatase diente einerseits zum Abbau der einsträngigen PCR-Primer sowie zur Dephosphorylierung von rück-ständigen Nukleotiden und war andererseits zur Vermeidung von Störungen in der folgenden Sequenzierungsreaktion notwendig. Zur Enzyminaktivierung erfolgte danach eine Inkubation bei 85°C für 10 min.

Für die Sequenzierungsreaktion wurde das in Tabelle 7 angeführte Rezept verwendet. Tabelle 8 zeigt das Protokoll der Sequenzierungsreaktion.

Tabelle 7: Rezept der Sequenzierungsreaktion

Komponente Volumen

Tabelle 8: Protokoll der Sequenzierungsreaktion

Schritt Temperatur Zeit Zyklen

-Die Reinigung der PCR-Produkte zur Entfernung von Salzen und nicht einge-bauten Nukleotiden sowie die Sequenzierungsläufe (48er Kapillar-sequenzierer, Applied Biosystems) wurden vom Humangenetischen Institut am Universitätsklinikum Erlangen durchgeführt.

32

4.4.2.3 Genotypisierung mittels HRM-Analyse

Die der HRM-Analyse vorausgehenden PCR-Amplifikationen erfolgten im LightCycler 480 II. Alle PCR-Gemische wurden als Mastermixe auf Eis ange-setzt. Im direkten Anschluss an die PCR-Reaktion erfolgte ebenfalls im LightCycler 480 II das High Resolution Melting. Die Tabellen 9-12 zeigen die für die verschiedenen PCRs verwendeten Rezepte sowie PCR- und HRM-Protokolle.

Tabelle 9: HRM-PCR-Rezept für MTHFR rs1801133

Komponente Volumen Finale Konzentration

Lightcycler 480 High Resolution Melting Master 2x 5.0 µl 1x

MgCl₂ 25 mM 0.8 µl 2.0 mM

MTHFR_rs1801133_f2 Primer 10µM 0.5 µl 0.5 µM MTHFR_rs1801133_r2 Primer10µM 0.5 µl 0.5 µM

Template-gDNA 20-50ng/µl 1.0 µl 2-5 ng/µl

H₂O 2.2 µl

-Tabelle 10: HRM-PCR-Rezept für rs1801131, rs821616 und rs3738401

Komponente Volumen Finale Konzentration

10x PCR Reaktion Buffer G 1.0 µl 1x

EvaGreen Farbstoff 20x 0.5 µl 1x

dNTP-Mix 10mM 0.2 µl 0.2 mM

MTHFR_rs1801131_f2 10µM oder DISC1_rs8261616_f oder

DISC1_rs3738401_f

0.5 µl 0.5 µM

MTHFR_rs1801131_r2 10µM oder DISC1_rs8261616_r oder

DISC1_rs3738401_r

0.5 µl 0.5 µM

MgCl2 25mM 0.8 µl 2.0 mM

Tfi DNA-Polymerase 5U/µl 0.1 µl 0.5 U/ µl

Template-gDNA 20-50ng/µl 0.7 µl 1.4-3.5 ng/µl

H2O 5.7 µl

33 Tabelle 11: PCR- und HRM- Protokoll für rs1801133

Schritt Temperatur Zeit Zyklen

Tabelle 12: PCR- und HRM Protokoll für rs1801131, rs821616 und rs3738401

Schritt Temperatur Zeit Zyklen

Am Ende der Amplifikationsphasen erfolgte jeweils eine Fluoreszenz-messung. Während des HRM-Prozesses wurden 25 Fluoreszenzmessungen pro Sekunde durchgeführt. Die dadurch gewonnenen Schmelzkurven wurden mit Hilfe der GeneScanning-Software analysiert. Tabelle 13 zeigt die Pro-gramm-Parametereinstellungen für die einzelnen SNPs.

Tabelle 13: Programm-Parametereinstellungen der Schmelzkurvenanalyse

SNP Pre-Melt Slider Post-Melt Slider Threshold Sensitivity

High Low High Low

rs1801133 73.0°C 75.0°C 81.0°C 83.0°C 5 0.7

rs1801131 72.0°C 73.0°C 80.0°C 81.0°C 1 0.4

rs821616 72.0°C 73.0°C 84.9°C 85.2°C 0 0.3

rs3738401 74.3°C 74.5°C 85.0°C 85.2°C 2 0.3

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4.5 Statistik

Es erfolgte die Berechnung der erwarteten Genotypenverteilungen im Studienkollektiv nach dem Hardy Weinberg Equilibrium (HWE). Die

Es erfolgte die Berechnung der erwarteten Genotypenverteilungen im Studienkollektiv nach dem Hardy Weinberg Equilibrium (HWE). Die

Im Dokument Einfluss von Varianten der Gene MTHFR und DISC1 auf Volumina ausgewählter Gehirnregionen gesunder Probanden (Seite 20-0)