1 Einleitung
1.1 Allgemeines
Eine Entzündung ist die Reaktion des Gefäßbindegewebsapparates auf physikalische oder chemische Reize, auf Traumen oder auf Infektionen mit Mikroorganismen und Parasiten.
Schon vor mehr als 2000 Jahren hat Celsus vier Kardinalsymptome entzündlicher Reaktionen beschrieben. Dieses sind die Rötung (Rubor), die Schwellung (Tumor), die lokale Überwär- mung (Calor) und der Schmerz (Dolor). Später wurden diese von Galen um ein fünftes Kardi- nalsymptom, die gestörte Funktion (Functio laesa), ergänzt. Die häufigste chronisch entzünd- liche Systemerkrankung des Bindegewebes ist die rheumatoide Arthritis, die im deutschen Sprachraum meist als chronische Polyarthritis bezeichnet wird. Etwa 2-5% der Bevölkerung sind davon betroffen, Frauen häufiger als Männer. Die Erkrankung führt zu einer schubweise fortschreitenden Zerstörung von Knorpel und Knochen in den Gelenken und damit zu einer zunehmenden Einschränkung der Beweglichkeit. Als Ursache für diese Erkrankung wird eine Autoimmunreaktion angenommen.
Zur Therapie der chronischen Polyarthritis werden zur Zeit verschiedene Arzneistoffe einge- setzt. Häufig werden zunächst nichtsteroidale Antiphlogistika wie Indometacin verabreicht.
Diese Substanzen wirken der Schwellung und dem Schmerz entgegen, den Fortlauf der Er- krankung, d.h. die Gelenkzerstörung, können sie jedoch nicht stoppen. Ihre Wirkung beruht auf einer Hemmung der Prostaglandinsynthese. Ferner werden sogenannte langfristig wirksame Antirheumatika eingesetzt, früher auch Basistherapeutika genannt. Zu ihnen zählen Goldverbindungen wie Aurothioglucose, das Malariamittel Chloroquin, die Mercaptoamino- säure D-Penicillamin und Sulfasalazin. Der Wirkmechanismus dieser Verbindungen ist weitgehend unbekannt. Sie sollen die Progredienz der Erkrankung verlangsamen können, die Therapie verläuft aber insgesamt gesehen häufig unbefriedigend. Nach 5 Jahren werden die Substanzen nur noch von einem Viertel der Patienten eingenommen.
Gute Effekte lassen sich in der Regel mit Substanzen erzielen, die das Immunsystem suppri- mieren, wie z.B. Methotrexat, Cyclophosphamid oder Etanercept. Diese Immunsuppresiva können zwar die Gelenkzerstörung verlangsamen, weisen jedoch den Nachteil auf, dass sie die Infektionsabwehr beeinträchtigen und somit mit einem vermehrten Auftreten von Infektionen und auch Krebserkrankungen zu rechnen ist. Zur Gruppe der immunsuppressiven
Substanzen können auch die stark entzündungshemmenden Glucocorticoide gezählt werden.
Die Langzeitanwendung dieser Substanzen kann außer den genannten Nebenwirkungen u.a.
auch das Auftreten einer Osteoporose hervorrufen.
Insgesamt sind somit die Therapiemöglichkeiten rheumatischer Erkrankungen noch nicht als befriedigend anzusehen. Es besteht ein Bedarf an verträglichen und gut wirksamen Medika- menten. Einen Fortschritt bei der Therapie rheumatischer Erkrankungen könnten Hemmstoffe der cytosolischen Phospholipase A2 bringen.
1.2 Entzündungskaskade
Ziel einer Entzündungsreaktion ist es in der Regel, die Ursache der Entzündung (Noxe) rasch zu eliminieren, um bleibende Schäden zu vermeiden. Hierbei kommt es zur Mobilisierung und Aktivierung der verschiedenen Zellen des Immunsystems (Abb. 1), also der Granulocy- ten, mononukleären Phagocyten (Monocyten/Makrophagen) und Lymphocyten, welche u.a.
Entzündungsmediatoren (Tabelle 1) freisetzen.
Abb 1: Zellen des Immunsystems
neutrophile Granulozyten beteiligt an akuten Entzündungen.
Monozyten/Makrophagen beteiligt an chronischen Entzündungen.
Diese leisten einen wichtigen Beitrag zur Abwehr der Infektionserreger, gleichzeitig sind sie aber auch für die Symptome der Entzündung verantwortlich.
Tabelle 1: Entzündungsmediatoren aus neutrophilen Granulozyten und Makrophagen
Enzyme: z.B. Proteasen und Phospholipasen
Lipidmediatoren: Prostaglandine, Leukotriene, Plättchen-akti- vierender Faktor (PAF)
Sauerstoff- und Stickstoffspezies: O2•−, H2O2, NO•
Cytokine: z.B. inflammatorische Cytokine wie Tumor-
nekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukin-1 (IL-1)
Eine Schlüsselrolle bei jeder Entzündung besitzen die proinflammatorischen Cytokine. Dies sind Proteine mit Molmassen zwischen 8 und 45 kDa, die von Zellen des Immunsystems gebildet werden und die Aktivierung des Immunsystems steuern. Eines der wichtigsten Cytokine ist der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), ein Peptid aus 157 Aminosäuren und einem Molmassen von 17 kDa. Dieser steht an der Spitze der Entzündungskaskade und wird, wie in Abb. 2 dargestellt, gebildet.
Durch Aktivierungssignale, wie z.B. Immunkomplexe oder bakterielle Antigene, wird der nukleäre Transkriptionsfaktor NF-κB, der im Normalfall mit seinem Inhibitor IκB-α komple- xiert ist, aktiviert. Der freigesetzte NF-κB löst dann die Transkription des TNF-α-Gens im Zellkern aus. Bei der Translation der TNF-α-mRNA in das ProTNF-α-Protein ist eine be- stimmte Proteinkinase, die p38 MAP-Kinase beteiligt. Das so gebildete ProTNF-α Protein kann die Zelle selbst nicht verlassen, es wird erst durch Abspaltung eines Proteinteils in eine sezernierbare Form überführt. Dieser Prozeß wird durch das TNF-α-Converting-Enzym (TACE) katalysiert.
Nach ihrer Synthese und Freisetzung induzieren die inflammatorischen Cytokine, zu denen neben TNF-α auch Interleukin 1β (IL-1β) zählt, die Expression von Selektinen (membrange- bundene Glykoproteine)[1], welche die Einwanderung der phagozytierenden Leukozyten (neutrophile Granulozyten und Monozyten) aus der Blutbahn in das von der Entzündung betroffene Gewebe vermitteln[2].
Infolge der Aktivierung von Leukozyten kommt es auch zur Freisetzung bzw. Bildung von Sauerstoffradikalen, Stickstoffmonooxid (NO), degradierenden Enzymen und Lipidmediato- ren (Abb. 3).
P P NIK-P
Aktivierungssignal
NIK (NF-κB Inducing Kinase)
IKKα/β (Inhibitory κB-Protein Kinase)
IKKα/β-P
Zellkern NF-κB
aktiv IkB (Inhibitory κB-Protein) NF-κB
inaktiv
P: Phosphatrest
DNA-Bindung
mRNA-Synthese ProTNF-α
TNF-α TACE
TACE:
TNF-α- Converting Enzyme
p38 MAP Kinase
Abb. 2: Bildung von TNF-α über eine Aktivierung des nukleären Transkriptionsfaktors NF- κB
T-Lymphocyten Monocyten Makrophagen
Monocyten Makrophagen
neutrophile Granulocyten Noxe
TNF-α
TNF-α
O2, NO
Matrixmetalloproteinase Arachidonsäurekaskade
Expression von Selektinen, die die Einwanderung der Leukocyten in das entzün- dete Gewebe vermitteln
ENTZÜNDUNG
Abb. 3: Entstehung der Entzündung
Die gebildeten Sauerstoff- und Stickstoffspezies wie das Superoxidradikal-Anion, Was- serstoffperoxid und NO sollen eingedrungene Infektionserreger abtöten. NO spielt auch eine große regulatorische und modulatorische Rolle im Entzündungsgeschehen, indem es die durch die inflammatorischen Cytokine ebenfalls ausgelöste Zellproliferation über eine Hem- mung der Polyaminsynthese bremst[3,4].
Die freigesetzten lysosomalen Enzyme haben die Aufgabe, Fremdstoffe abzubauen. Die Matrixmetalloproteinasen (MMPs), deren Bildung ebenfalls durch TNF-α induziert wird[5], können alle Hauptkomponenten der extrazellulären Matrix abbauen und damit die Destruk- tionsprozesse in Knorpel und Knochen fördern.
Im Rahmen der Entzündung spielen auch Lipidmediatoren wie Prostaglandine, Leukotriene und der Plättchen-aktivierende Faktor, die über die sogenannte Arachidonsäurekaskade gebil- det werden, eine sehr bedeutsame Rolle (Eicosanoid-Biosynthese). Die Entstehung dieser Lipidmediatoren setzt die Freisetzung der Arachidonsäure aus Membranphospholipiden vor- aus. Dies geschieht durch die cytosolische Phospholipase A2, auf deren Aufbau in Abschnitt 1.4 genauer eingegangen wird.
Die Aktivierung und vermehrte Biosynthese der cytosolischen Phospholipase A2 wird durch proinflammatorische Cytokine verursacht[6-11]. Nach ihrer Aktivierung spaltet sie Membranphospholipide in Arachidonsäure und Lysophospholipide. Die Arachidonsäure kann dann weiter zu oxidierten Produkten metabolisiert werden[12]. Welche Lipidmetaboliten dabei entstehen, hängt von der Enzymausstattung der jeweiligen Zelle ab. Über den Cyclooxyge- nase-Weg können Prostaglandine gebildet werden, eine Metabolisierung über den 5-Lipoxy- genase-Weg liefert die Leukotriene[13]. Bestimmte Lysophospholipide können durch eine Acetyltransferase zum Plättchen-aktivierenden Faktor (PAF) acetyliert werden[14] (Abb. 4).
Das beim Entzündungsgeschehen gebildete Prostaglandin E2 (PGE2) führt durch Erweiterung der Blutgefäße und Erhöhung ihrer Permeabilität zur Schwellung und Rötung des Gewebes.
Außerdem bewirkt PGE2 eine Hyperalgesie durch Senkung der Reizschwelle von Nocizeptoren.
Leukotriene wirken u.a. chemotaktisch, bronchokonstriktorisch und vasoaktiv. Der PAF ver- stärkt das Entzündungsgeschehen, indem er die cPLA2 zusätzlich stimuliert[14,15].
Die lyso-Phospholipide sind cytotoxisch[16] und bewirken die Ausschüttung von Histamin aus Mastzellen[17], das auch gefäßerweiternde und permeabilitätserhöhende Eigenschaften be- sitzt[18].
Monocyten
Makrophagen neutrophile
Granulocyten
C
C5H11 O
O CH H2C H2C
O O
Y P X O O
C17H35 cytosolische Phospholipase A2
X = Cholin, Ethanolamin oder Serin
Y = CH2, C O Phospholipid
C
C5H11 O
OH
HO CH H2C H2C
O O
Y P X O O
C17H35 Arachidonsäure
lyso-Phospholipid
Prostaglandine PAF Cyclooxygenase
5-Lipoxygenase
Acetyl-Transferase
Leukotriene TNF-α
O2, NO
Matrixmetalloproteinasen
ENTZÜNDUNG
ENTZÜNDUNG
wird über NF-kB gebildet
T-Lymphocyten Monocyten Makrophagen Noxe
TNF-α
Abb. 4: Entzündungskaskade
Die genannten Entzündungsmediatoren agieren nicht nur unabhängig voneinander, zum Teil erfolgt die Aktivierung eines Mediators durch einen anderen. So ist z.B. die Aktivierung der cPLA2 eine Voraussetzung für die Bildung von Matrixmetalloproteinasen[19]. Das Leukotrien LTB4 erhöht die Freisetzung von lysosomalen Enzymen und Sauerstoffspezies, die Sauer- stoffspezies aktivieren wiederum die Expression von Selektinen[20].
Zur Therapie entzündlicher Erkrankungen besteht die Möglichkeit, auf mehreren Ebenen der Entzündungskaskade anzugreifen (Abb. 5).
TNF-α NF-kB
cPLA2
Arachidonsäure PAF 5-LOX COX
Leukotriene Prostaglandine
NO und Sauerstoffspezies
Matrixmetalloproteinase
p38 MAP-Kinase TACE
Selektine
TNF-α Blocker: Infliximab, Etanercept p38 MAP-Kinase-Inhibitoren iNOS-Inhibitoren
Matrixmetalloproteinase-Inhibitoren
Inhibitoren der cytosolischen Phospholipase A2
Dualer COX/LOX- Inhibitor: Licofelone
Selektin-Antagonisten
Lipoxygenase-Inhibitoren: Zileuton und
Leukotrienrezeptor-antagonist Montelukast Cyclooxygenase-Inhibitoren: ASS,
Indometacin; selektive COX-2-Inhibitoren Celecoxib und Rofecoxib
Inhibitoren des Plättchen- aktivierenden-Faktors
Abb. 5: Entzündungskaskade und Angriffspunkte
Die vor etwa 2 Jahren zugelassenen Arzneistoffe Infliximab (Remicade®) und Etanercept (Enbrel®) greifen ganz am Anfang der Entzündungskakade an, indem sie die Wirkung des TNF-α neutralisieren. Bei Infliximab handelt es sich um modifizierte monoklonale Anti- körper, welche TNF-α binden und somit ausschalten[21]. Die gute Wirksamkeit von Infliximab in Kombination mit Methotrexat im Vergleich zu einer Monotherapie mit Methotrexat wurde anhand einer Langzeitstudie (ATTRACT = Anti-TNF-α-Trial in Rheumatoid Arthritis with Concomitant Therapy) gezeigt. Behandelt wurden Patienten, die auf koventionelle Therapien nicht mehr ansprachen. Der TNF-α-Blocker kann jedoch die zelluläre Immunabwehr schwä- chen und so zum Beispiel zur Manifestierung einer Tuberkulose führen[22].
Etanercept besteht aus dem Bindungsteil des menschlichen TNF-α-Rezeptors sowie dem Fc- Anteil des humanen Immunglobulin IG1. Etanercept fängt wie Infliximab den zirkulierenden TNF-α ab, so dass dieser nicht mehr an die entsprechenden Bindungsstellen andocken kann.
Die Wirksamkeit von Etanercept wurde in klinischen Studien[23, 24] untersucht. Die behan- delten Arthritis-Patienten, bei denen andere Basistherapeutika nicht mehr ansprachen, zeigten bezüglich aller nach dem American College of Rheumatology (ACR) definierten Kriterien deutliche Verbesserung. In den klinischen Studien traten unter Etanercept häufiger Infektio- nen, besonders der oberen Atemwege auf. Über ein vermehrtes Vorkommen von Lymphomen oder anderen Tumoren können zur Zeit keine Aussagen gemacht werden. Eine engmaschige Überwachung der Patienten ist jedoch unbedingt erforderlich.
Das Cytokin IL-1 vermittelt die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten im Gelenk, aktiviert Makrophagen und fördert die Differenzierung von T- und β-Lymphozyten und ist somit wie TNF-α an der Gelenkzerstörung beteiligt. Daher entwickelten Forscher des US-amerikani- schen Biotech-Unternehmens Amgen einen rekombinanten humanen IL-1-Rezeptorantago- nisten (Anakinra Kineret®), der vor kurzem zugelassen wurde. Das Protein soll bei der rheu- matoiden Arthritis das zwischen IL-1 und dem endogenen Rezeptorantagonisten herrschenden Ungleichgewicht zu Gunsten des endogenen IL-1-Antagonisten verschieben. Anakirna ist zur symptomatischen Therapie der rheumatoiden Arthritis bei Patienten zugelassen, die nicht aus- reichend auf Methotrexat ansprechen. Das therapeutische Potential dieses Medikamentes ge- genüber Methotrexat wurde in zwei randomisierten placebokontrollierten Doppelblind-Stu- dien an 920 Probanden überprüft[25]. Dabei erwies sich das neue Antirheumatikum wirksamer als Methotrexat. Unter Anakirna erkrankten die Patienten etwas häufiger an einer schweren Infektion als unter Placebo. Daher empfiehlt der Hersteller, die Behandelten sorgfältig zu überwachen.
Die antiphlogistisch wirkenden Glucocorticoide greifen in das Entzündungsgeschehen ein, indem sie die Synthese von TNF-α und Interleukin-1β hemmen. Darüber hinaus beruht ihre Wirkung auf weiteren Mechanismen. So verhindern sie u.a. die Synthese und Aktivierung der cPLA2[8, 26-29]. Sie entfalten hierbei ihre Aktivität über bestimmte Proteine, deren Biosynthese sie induzieren[30-32].
Zur Zeit in Entwicklung sind Hemmstoffe[33, 34] der p38-MAP-Kinase, die ebenfalls, wie aus der Abb.2 ersichtlich, zur Blockade der TNF-α-Synthese führen können.
Bei der Behandlung der chronischen Polyarthritis wird derzeit häufig sehr früh schon der Fol- säureantagonist Methotrexat eingesetzt. Die Substanz wirkt in höherer Dosis vorwiegend als ein Hemmstoff des Zellwachstums. Bei der zur Behandlung der chronischen Polyarthrithis üblichen niedrigen Dosierung (7.5 mg/Woche) scheint die Hemmung des Zellwachstums nur von untergeordneter Bedeutung für die Wirksamkeit zu sein. Vielmehr steht offensichtlich eine direkte entzündungshemmende Wirkung im Vordergrund. Trotz der niedrigen Dosierun- gen treten in etwa 60% der Fälle unerwünschte Wirkungen auf, wie z.B. Störungen des Gastrointestinaltraktes, Leberschädigung, Leukopenie und Teratogenität.
Die Selektine vermitteln, wie bereits erwähnt, die Gewebsinvasion von Monocyten. Eine Hemmung der Selektinbildung stellt demnach auch einen Ansatzpunkt zur Behandlung ent- zündlicher Erkrankungen dar. Die als Basistherapeutika verwendeten Goldverbindungen sollen die synoviale Expression von E-Selektin unterbinden[35].
Mit dem Arzneistoff Bimosiamose der Firma Revator Biopharmaceuticals AG befindet sich derzeit der erste synthetische niedermolekulare Selektinantagonist in der klinischen Entwicklung[36].
Die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) wurden in den letzten Jahren als interessantes Target für die Entwicklung neuer Arzneistoffe zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen wie Rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis angesehen. Eine Reihe von MMP-Inhibitoren befinden sich z.Zt. in klinischer Entwicklung wie z.B. Marimastat von British Biotech, Trocade (Roche) und die von Bayer entwickelte Substanz Bay-12-9566. Es werden jedoch potenzielle kanzerogene Eigenschaften dieser Verbindungen diskutiert[37].
Die selektive Hemmung der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) ist prinzipiell eine weitere Möglichkeit, chronische Entzündungen zu beeinflussen[38, 39]. In den letzten Jahren wurden eine Reihe von iNOS-Inhibitoren synthetisiert; hochselektive und nicht toxische Hemmstoffe stehen jedoch noch nicht zur Verfügung.
Die bekannten nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR) greifen in die Arachidonsäure- kaskade ein. Sie blockieren dabei die Bildung der Prostaglandine durch Hemmung der Cyclo- oxygenasen.
Die Cyclooxygenasen unterteilen sich in Cyclooxygenase 1 (COX-1) und Cyclooxygenase 2 (COX-2)[40]. Der Typ 1 (COX-1) ist konstitutiv in den meisten Geweben vorhanden, während COX-2 überwiegend erst durch Entzündungsvorgänge induziert wird. Anhand dieses Befun- des wurde die Hypothese abgeleitet, dass die therapeutische Wirkung der bisher verfügbaren NSAR hauptsächlich auf der COX-2-Hemmung beruht, während die COX-1-Hemmung über- wiegend für das Nebenwirkungsprofil verantwortlich gemacht wird. So wäre COX-1 für die physiologischen Vorgänge wichtig, während die spezifische Hemmung der COX-2 den Ent- zündungsprozess beeinflusst.
Nach neueren Untersuchungen ist die COX-1 allerdings ebenfalls signifikant an der Produk- tion von Prostaglandinen im entzündeten Gewebe beteiligt. Dies zeigten Ergebnisse von Ex- perimenten mit Mäusen, die keine COX-1 mehr exprimierten. Entzündungssymptome nach Auslösen einer Entzündung waren bei ihnen deutlich geringer als bei Mäusen mit COX-1.
Die COX-2 ist dagegen auch an wichtigen physiologischen Prozessen beteiligt, wie Blut- druckregulation, Fortpflanzung und Gewebsreparatur. 40% der Patienten sollen nach längerer Einnahme von COX-2-Inhibitoren erhöhte Blutdruckwerte aufweisen. Demnach ist das Konzept einer selektiven COX-2- Hemmung nicht so schlüssig wie es sich ursprünglich darstellte[41].
Acetylsalicylsäure, Indometacin (Abb. 6), Piroxicam und Ibuprofen als Nichtsteroidale An- tirheumatika (NSAR) und Analgetika hemmen bevorzugt die COX-1[40]. Arzneistoffe wie Diclofenac, Meloxicam und Naproxen sind bei beiden Cyclooxygenasen äquipotent oder be- vorzugt COX-2-Inhibitoren. Celecoxib und Rofecoxib (Abb.6) gehören zu den selektiven Inhibitoren der COX-2.
N O Cl
H3CO
S O O H3C
O O
N Cl
O HO O
OH
Indometacin Rofecoxib Licofelone
Abb. 6: Strukturen einiger Cyclooxygenase- bzw. Cyclooxygenase/5-Lipoxygenase- Hemmstoffe
Nachdem vor etwa 20 Jahren erkannt worden war, dass Metabolite der 5-LOX auch Entzün- dungsmediatoren[18] sind, richtete sich das Interesse auf das Auffinden von Hemmstoffen der 5-Lipoxygenase[42]. Die antiphlogistische Aktivität selektiver 5-LOX Inhibitoren war jedoch enttäuschend, so dass derartige Hemmstoffe nicht als Antiphlogistika zur Anwendung kamen.
Allerdings befindet sich ein dualer COX, 5-LOX-Inhibitor (Licofelone) in der klinischen Entwicklung[43] (Abb. 6).
Ebenfalls enttäuschend war die klinische Wirkung von Antagonisten des auch über die Ara- chidonsäurekaskade gebildeten PAF[44]. Die Ausschaltung dieses Mediators alleine ist somit zur Erzielung ausreichender antiphlogistischer Effekte nicht ausreichend.
Einen therapeutischen Fortschritt bei der Behandlung entzündlicher Erkrankungen erhofft man sich allerdings von Stoffen, die das Schlüsselenzym der Arachidonsäurekasade, die cPLA2, hemmen. Derartige Stoffe würden nämlich gleichzeitig die Synthese aller proin- flammatorischen Lipidmediatoren, die über diesen Stoffwechselweg entstehen, unterbinden.
1.3 Einteilung der Phospholipasen
C
C5H11 O
O CH H2C H2C
O O
C P O
(CH2)n O
CH3 O
O
CH2 CH2 N CH3
CH3 CH3 Phospholipase A1
Phospholipase B
Phospholipase A2 Phospholipase C Phospholipase D
Abb.7: Angriffspunkte der Phospholipasen am Glycerophospholipid
Enzyme Spaltprodukte Phospholipase A2 Lysophospholipide Phospholipase C Diacylglycerol (DAG)
Phospholipase D Phosphatidsäure Phospholipase B
(nur bei Mikroorganismen)
Lysophospholipide
Phospholipase ist die Gruppenbezeichnung für Enzyme, die Phospholipide hydrolysieren. Die Phospholipasen kann man entsprechend ihres molekularen Angriffspunktes in verschiedene Arten untergliedern (Abb. 7).
Bei den Phospholipasen A2 handelt es sich um Enzyme, welche die hydrolytische Spaltung von Glycerophospholipiden an der C2-Position katalysieren, wobei Fettsäuren und Ly- sophospholipide freigesetzt werden.
Bei Säugetieren wurden bis heute 19 Enzyme mit PLA2-Aktivität identifiziert, dazu gehören Ca2+-abhängige niedermolekulare sekretorische Phospholipasen A2 (sPLA2), Ca2+-unabhän- gige hochmolekulare Phospholipasen A2 (iPLA2), Ca2+-abhängige hochmolekulare cytosoli- sche Phospholipasen A2 (cPLA2)[45-47] und Ca2+-unabhängige Lipoprotein-assozierte- Phospholipasen A2 (LP-PLA2), früher auch PAF-Acetylhydrolasen genannt (Abb. 7).
PLA 2
sPLA2 cPLA2 iPLA2
Calcium-abhängig sekretorisch
Histidin im aktiven Zentrum 14-19 KDa
Calcium-abhängig cytosolisch
Serin im aktiven Zentrum 85 KDa
Typ IV A
Calcium-unabhängig cytosolisch
Serin im aktiven Zentrum 85 KDa
Typ VI Typ I B
(Pankreas) Typ II A
(Synovialflüssigkeit, Blutplättchen Typ V
(Herz, Lunge, Macrophagen) Typ X
(Milz, Thymus, Leukocyten) Typ XII
(Herz, Muskel,Pankreas, Niere)
LP-PLA2
Calcium-unabhängig
Lipoprotein- assozierte PLA2 Serin im aktiven Zentrum 26-45 KDa
Typ VII, VIII
Abb. 8: Einteilung von Phospholipasen
Alternativ zu dieser Einteilung werden die PLA2 auch in die Typen IB bis XII untergliedert.
In Säugetieren kommen Typ IB, IIA, IV, V, VI, X und XII vor[48-50].
Zur Gruppe der sPLA2 zählen u.a. die Typ IB (im Pankreas enthalten, beteiligt an der Verdauung von Nahrungslipiden) und Typ IIA PLA2 (von verschiedenen Zellen sezerniert).
Die Ca2+-unabhängigen Phospholipasen A2 (iPLA2) entsprechen dem Typ VI PLA2. Diese Phospholipasen spielen scheinbar eine wichtige Rolle bei Reparaturprozessen in den Zell- membranen [51-52].
Die Lipoprotein-assozierte Phospholipase (LP-PLA2), die auch als PAF-Acetylhydrolase be- kannt ist, katalysiert die Hydrolyse von oxidierten Phospholipiden[53]. LP-PLA2 spielt ver- mutlich eine wichtige Rolle bei der Progression von Atherosklerose[54].
Die cPLA2 beinhaltet drei Isoenzyme. Hierzu gehören die im Jahr 1991 gereinigte und klo- nierte cPLA2-α (Gruppe IVA)[55] sowie die später beschriebenen Formen cPLA2-β (Gruppe IVB) und cPLA2-γ (Gruppe IVC)[56-57].
Die Freisetzung der Arachidonsäure, die zur Bildung von entzündungsauslösenden Lipidme- diatoren führt, wurde lange Zeit der Typ IIA sPLA2 zugeschrieben. Diese Annahme begrün- dete sich u.a. darauf, dass in Körperflüssigkeiten von Patienten mit entzündlichen Erkrankun- gen große Mengen dieses Enzyms nachgewiesen werden konnten[48, 58-62]. Viele potente Inhibitoren dieses Enzyms wurden entwickelt wie z.B. bestimmte Indol-3-acetamide[63] und Thielocin B3-Derivate[64]. Derartige Hemmstoffe zeigten jedoch nur in einigen der üblicherweise verwendeten in vivo Testmodellen Wirksamkeit[65]. Außerdem konnten bei transgenen Mäusen, die die Typ II sPLA2 überexprimierten, keinerlei Anzeichen einer systematischen Entzündung festgestellt werden[66]. Die vermehrte Sezernierung dieser PLA2 im Rahmen des Entzündungsgeschehens scheint demnach nicht zur Bereitstellung von Arachidonsäure und darauf folgend zur Biosynthese von Lipidmediatoren beizutragen, sondern möglicherweise zur Bekämpfung von Bakterien durch Zerstörung ihrer Phospholipidmembranen[45] und zur Verstärkung von Entzündungsprozessen[67-74].
Mittlerweile wird die cPLA2-α (im folgenden als cPLA2 bezeichnet) als Schlüsselenzym für die Freisetzung der Arachidonsäure verantwortlich gemacht. So zeigten Inhibitoren der cPLA2 Wirksamkeit in akuten und chronischen in vivo Entzündungsmodellen[65]. Die Untersuchungen von gezüchteten cPLA2-Knock out Mäusen bestätigten die Beteiligung der cPLA2 am Entzündungsgeschehen[75, 76]. Die Makrophagen dieser Tiere, die keine cPLA2 mehr produzieren, setzen nach Stimulation keine Prostaglandine und Leukotriene mehr frei.
Außerdem beobachtete man nach Applikation des entzündungsauslösenden Phorbolesters (TPA) nur eine geringe Schwellung des Ohrs im Vergleich zu den Kontrolltieren. Demnach könnte die cPLA2 ein Target bei der Entwicklung von neuartigen Antiphlogistika sein.
Da Hemmstoffe der cPLA2 - anders als die therapeutisch verwendeten Cyclooxygenase- Inhibitoren - nicht nur die Bildung der Prostaglandine hemmen, sondern auch die Biosynthese der ebenfalls am Entzündungsgeschehen beteiligten Leukotriene, lyso-Phospholipide und des PAFs unterbinden, kann erwartet werden, dass cPLA2 Inhibitoren den therapeutisch verwen- deten Cyclooxygenase-Hemmstoffen in der Wirkstärke überlegen sind.
1.4 Aufbau und Eigenschaften der cytosolischen Phospholipase A2
Die cPLA2 hat ein Molekulargewicht von 85 kDa und besteht aus 749 Aminosäuren. Sie spaltet im Gegensatz zu den sekretorischen PLA2 selektiv Phospholipide mit einem Arachi- donsäurerest in Position 2. Dabei spielt die Art der polaren Kopfgruppe (Cholin, Ethanolamin, Serin) und die Art der sn-1-Bindung (Ester- oder Etherbindung) keine Rolle für die Hydroly- serate.
Die Arbeitsgruppe von J.D. Clark veröffentlichte im Jahr 1999 die Kristallstruktur[77] der cPLA2. Diese zeigt eine N-terminale calciumabhängige Lipidbindungsdomäne und ein kata- lytisches Zentrum mit einem Serin- (Ser), Asparaginsäure- (Asp) und Argininrest (Arg).
Außerdem besitzt das Enzym einen flexiblen Deckel, der sich wegbewegen muss, um dem Substrat den Zugang zum aktiven Zentrum zu ermöglichen. Der optimale pH-Aktivitäts- bereich dieses Enzyms liegt bei pH 7.0-8.0.
Eine erhöhte Calciumkonzentration im Cytoplasma fördert die Translokation des Enzyms vom Cytosol zur Zellkernmembran bzw. zum endoplasmatischen Retikulum und führt zur Aktivierung des Enzyms. Dabei sind die Calciumionen nicht Bestandteil des aktiven Zent- rums, sondern sie binden an eine N-terminale Lipid-Bindungsdomäne[78, 79]. Außerdem kann das Enzym durch Proteinkinase-katalysierte Phosphorylierung u.a. an Serin-505 und Serin- 727 aktiviert werden. Bei den dafür verantwortlichen Protein-Kinasen[80, 81] handelt es sich u.a. um Mitogen-aktivierte-Proteinkinasen (MAP-Kinase) bzw. um Mitogen-aktivierte- Proteinkinase-aktivierende-Proteinkinasen (MAPKAPKs) (Abb. 9). Eine Aktivierung dieser Protein-Kinasen ist u.a. durch TNF-α möglich.
Stimuli Rezeptor
MAPKs-
und MAPKAPKs-Aktivierung
cPLA2 Phosphorylierung
Translokation
Phosphorylierte cPLA2 Arachidonsäurekaskade
Ca2+
Abspaltung der Arachidonsäure
Abb. 9: Regulations- und Aktivierungsmechanismus von cPLA2.
Für die katalytische Abspaltung der Arachidonsäure vom Membranphospholipid ist ein im aktiven Zentrum vorhandener nukleophiler Serinrest (Ser-228) essentiell. Ein Modell des ka- talytischen Mechanismus wurde von Clark et al.[82] vorgeschlagen (Abb 10).
O O
O O
O
P O O
O N O
O O O
P O O
O N
O Ser228
H O
O Ser228
O O
Ser228 Lyso-Phospholipid
H2O O
OH Arachidonsäure
Abb. 10:Modell des katalytischen Mechanismus der cytosolischen Phospholipase A2 nach Clark et al[82].
Bei der Spaltung des Phospholipids erfolgt zunächst eine Umesterung, bei der die Carbonyl- funktion des Esters an der sn-2 Position durch den nukleophilen Serinsauerstoff des Enzyms angegriffen wird. Es entsteht ein Acyl-Enzym-Intermediat, welches anschließend durch Hydrolyse Arachidonsäure freisetzt.
Nachdem 1999 die Struktur der cPLA2 komplett aufgeklärt werden konnte, wurde ein genau- eres Modell des katalytischen Vorganges vorgelegt[77]. Das aktive Zentrum sitzt danach in einer Tasche mit einer Tiefe von 70 pm, in die die zu spaltenden Phospholipide bis zur ersten
Doppelbindung der Arachidonsäure hineintauchen. Dort sind Aminosäuren wie Asp, Ser und Arg an der Umsetzung beteiligt.
Clark et al. schlagen folgenden Mechanismus vor: Nach Translokation des Enzyms zu einer Membran kann ein Substratmolekül in eine schmale Schleife des Enzyms diffundieren, so dass seine sn-2-Position für das Ser-228 zugänglich wird. Die Phosphatgruppe des Substrates wird über das Arg-200 stabilisiert und die beiden Fettsäurereste ragen aus der Tasche heraus.
Anschließend erfolgt die Umwandlung zum Enzym-Substrat-Komplex. Hierbei wird dem Ser- 228 während seines nucleophilen Angriffes am Substrat durch Asp-549 ein Proton abstrahiert, wodurch dieses aktiviert wird. Dabei entsteht ein Sauerstoffanion, welches durch Gly-197 und Gly-198 polarisiert wird. Dies führt zur Stabilisierung des Übergangszustandes.
Durch Übergabe eines Protons von Asp-549 an das abgespaltene Lyso-Phospholipid wird ein Serin-Acyl-Intermediat gebildet. Eine Hydrolyse dieses Intermediates durch Wasser führt zur Freisetzung der Arachidonsäure. Anschließend kann der Vorgang von neuem beginnen oder das Enzym sich von der Membran trennen.
Abb 11: Entstehung des Übergangszustandes zwischen der cPLA2 und dem Glyce- rophospholipid durch nucleophilen Angriff von Ser-228 an der sn-2-Position des Substrates.
Phosphatrest in schwarz; Reste, die an der katalytischen Abspaltung der Arachidonsäure be- teiligt sind in grün; AA: Arachidonsäure, HG: Hauptgruppe, C18: Octadecylgruppe.
1.5 Bekannte Hemmstoffe der cytosolischen Phospholipase A2
Bisher wurden eine ganze Reihe von wirksamen Hemmstoffen der cPLA2 in der Literatur beschrieben. Von diesen Substanzen befindet sich unseres Wissens nach jedoch noch keine in fortgeschrittener klinischer Entwicklung.
Einer der ersten bekannten Hemmstoffe der cPLA2 war das kommerziell erhältliche Triflu- ormethyl-Analoge[83] der Arachidonsäure (AACOCF3) 1 (Abb. 12). Dieser Stoff wurde häu- fig zur Erforschung der Rolle der cPLA2 in Zellsystemen verwendet, ohne i.d.R. die Cyto- toxizität[84, 85] dieser Substanz in Betracht zu ziehen. Neben diesem und anderen Fettsäu- reanaloga wurden verschiedene Aminderivate wie das Prolinderivat Wy-48,489 2 als cPLA2- Hemmstoffe[86] erkannt (Abb. 12).
C
C5H11 O
CF3
N
H O
N C16H33 H
1 2
Abb. 12: Bekannte cPLA2-Hemmstoffe
In unserem Arbeitskreis wurden verschiedene Indol- und Pyrrolcarbonsäuren 3, 4, 4a und 5 entwickelt (Abb. 13), welche die cPLA2-katalysierte Arachidonsäurefreisetzung in Thrombo- zyten hemmen[87-90]. Verbindung 3 zeigte auch in in vivo-Modellen Wirksamkeit. So ließ sich bei der Applikation von 100 mg / kg 3 i.p. das durch Zymosan stimulierte Mäusepfotenödem zu 49-62%, sowie das Carrageenan-induzierte Rattenpfotenödem um 69%[91, 92] hemmen.
N
O OH
COOH C11H23 O
N
O
COOH C11H23 O
O OH
N
OH O
O OH O
C11H23
3 R = H 4 5
F 4a
R
Abb. 13: Bekannte cPLA2-Hemmstoffe aus unserem Arbeitskreis
Weitere bekannte Inhibitoren des Enzyms sind Indolderivate[93] von Genetics Institute (6), 4- Aryl-1,1,1-trifluorbutan-2-on-Derivate (7) von Bristol-Myers Squibb[94] sowie verschiedene 2-Oxoamide[95] (8).
N NC
H3CO
COOH
O CF3
O S
O Cl
Cl O
O
O NH
OH O O
C14H29
6 7
8
Abb. 14: Bekannte cPLA2-Hemmstoffe
Zu den derzeit wohl potentesten Hemmstoffen der cPLA2 zählen 1,3-disubstituierte Propan- 2-one[96]der Fa. AstraZeneca (9) und Thiazolidindione[97] der Fa. Shionogi (10, 11 und 11a).
O O
O
COOH S
N O
O
F
F N H
O
NH S
O O N
N O
O
F
F NH
O
NH S
O O S
N O
O
F N H
O
NH S
O O O
9
10
11
11a
Abb. 15: Derzeit potenteste Hemmstoffe der cPLA2
Die Substanzen 9 und 10-11a zeigten bei in vitro Tests am isolierten Enzym eine deutlich stärkere Wirksamkeit[96, 97] als der Standard cPLA2 Blocker AACOCF3. Ergebnisse von in vivo Untersuchungen letzterer Verbindungen sind jedoch noch nicht publiziert worden.
1.6 Aufgabenstellung
In unserem Arbeitskreis wurden wie bereits erwähnt eine Reihe von Substanzen hergestellt, welche die cPLA2-katalysierte Freisetzung der Arachidonsäure aus Thrombozyten hemmen.
Zu den aktivsten Verbindungen gehören verschiedene 3-Acylindol-2-carbonsäurederivate wie 1-(7-Carboxyheptyl)-3-dodecanoylindol-2-carbonsäure (3) und 6-[2-(2-carboxyethyl)-4-do- decanoyl-3,5-dimethylpyrrolyl]hexansäure (5).
Einige diese Verbindungen haben sich im Tierversuch[91, 92] als entzündungshemmend erwie- sen, jedoch mussten sie zum Erzielen einer Hemmung nach peroraler Applikation hoch dosiert werden.
N COOH
N
COOH O O
COOH COOH
3 5
Abb. 16: Leitstrukturen aus unserem Arbeitskreis
Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, durch systematische Variation der bekannten 3- Acylindol-2-carbonsäuren zu wirksameren Verbindungen zu gelangen. Hierbei sollten u.a.
Strukturveränderungen am Acylrest vorgenommen werden, wie der Austausch der CO- Gruppe des Dodecanoylrestes durch SONH, SO2NH, SO und SO2. Außerdem sollte der Do- decanoylrest durch Acylreste, die in bekannten Hemmstoffen enthalten sind, ersetzt werden.
Ferner sollten neuartige Leitstrukturen aufgefunden und variiert werden, bei denen die poten- tiellen pharmakophoren Gruppen ebenfalls an einem Indolgerüst fixiert sind.
Durch die zu ermittelnden Struktur/Wirkungsbeziehungen sollten außerdem Erkenntnisse über die Art der Wechselwirkung der Stoffe mit der cPLA2 gewonnen werden.
2 Biochemische Testung
2.1 Bestimmung der Hemmung der cPLA2-abhängigen Freisetzung von Arachidon- säure
Die zur Entwicklung von Hemmstoffen der cPLA2 verwendeten in vitro Testsysteme kann man in zwei Gruppen einteilen und zwar in solche, welche die isolierte, gereinigte cPLA2 einsetzen und in solche, die auf intakte Zellen zurückgreifen. Bei den ersteren Verfahren die- nen u.a. Tumorzellkulturen als Enzymquelle[98, 99], als Substrate werden Phospholipide mit radioaktiv markierter Arachidonsäure[99], Ester von Fettsäuren mit fluoreszierendem 7- Hydroxycumarin[100] sowie Phospholipide mit einer Arachidonylthioestergruppierung[101] ein- gesetzt. Die Enzymspaltprodukte werden durch Radiometrie, Fluorimetrie bzw. spektropho- tometrisch nach Derivatisierung zu farbigen Produkten nachgewiesen. Der Nachteil dieser Methoden ist, dass das isolierte Enzym mit Substratanordnungen konfrontiert wird (z.B. mo- nomere Phospholipide, Mizellen, gemischte Mizellen), deren physiologische Relevanz nicht beurteilt werden kann.
Bei der zweiten Gruppe von Testmethoden wird die Aktivität der cPLA2 in intakten Zellen (z.B. Thrombozyten oder Knochenmarkzellen) gemessen[102-104]. Der Vorteil solcher Verfah- ren liegt darin, dass sie die in vivo Verhältnisse besser widerspiegeln.
Üblicherweise werden die Zellen hierbei zuerst mit radioaktiv markierter Arachidonsäure inkubiert, wobei diese in die Phospholipide eingebaut wird. Als nächstes wird die überschüs- sige Arachidonsäure ausgewaschen und die cPLA2 durch Zugabe bestimmter Agentien akti- viert. Anschließend wird die Menge an freigesetzter radioaktiv markierter Arachidonsäure bzw. ihrer Metaboliten mittels Radiometrie bestimmt. Neben diesen radioaktiven Methoden sind Assays beschrieben, bei denen die aus den Zellen freigesetzte endogene Arachidonsäure nach Derivatisierung durch HPLC/UV oder GC/MS gemessen wird.
In unserem Arbeitskreis wurde zur Bestimmung von Hemmstoffen der cPLA2 ein zelluläres Testsystem[105, 106] aufgebaut, bei welchem die aus Thrombozyten freigesetzte Arachidonsäure direkt ohne vorherige Derivatisierung mit HPLC und UV-Detektion bei 200 nm gemessen wird. Die Thrombozyten wurden dabei aus Rinder- bzw. Humanblut durch Zentrifugation isoliert.
Wie bereits im Abschnitt 1.4 erwähnt, tritt die cPLA2 auf zellulärer Ebene dann in Aktion, wenn sie durch Proteinkinasen phosphoryliert wird, oder wenn die intrazelluläre Calcium- ionenkonzentration auf einen bestimmten Wert ansteigt[82, 107]. So kann die Enzymreaktion in Thrombozyten z.B. durch Zugabe des Phorbolesters TPA, der Protein-Kinasen aktiviert, oder durch den Calciumcarrier Calcium Ionophor A23187, der die Calciumkonzentration im Cyto- sol erhöht, gestartet werden (Abb. 17). Letztere Substanz diente bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen als Stimulans.
In unserem Arbeitskreis wurden als Enzymquelle anfangs intakte Rinderthrombozyten einge- setzt. Später wurde das Testsystem auf entsprechende humane Zellen umgestellt. Gleichzeitig wurde dabei auf die Zugabe von Calcium-Ionen zum Inkubationspuffer verzichtet. Die endogen in Calciumspeichern enthaltenen Calcium-Ionen reichen nämlich zur Aktivierung des Enzymes aus. Außerdem hatte es sich gezeigt, dass exogenes Calcium zu einer etwas geringeren Arachidonsäurefreisetzung führt. Die Hemmwerte einiger in unserem Arbeitskreis hergestellten Verbindungen sowie in der Literatur beschriebener cPLA2-Hemmstoffe wurden mit Rinder- und mit Humanthrombozyten ermittelt. Hierbei war keine gravierende spezies- bzw. assaybedingte Abweichung der IC50-Werte zu beobachten [108].
OH H3C
O
O
H O
CH3 H
H H3C OAc
CH3
CH3
NH O
CH3 O H
O
O N H3C
CH3
CH3 H
NHCH3 COOH
OH
C13H27 O
Abb. 17: 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat Calcium Ionophor A23187 (TPA)
In den Thrombozyten wird die durch die cPLA2 freigesetzte Arachidonsäure zum einen über den Cyclooxygenase-Weg zum Thromboxan B2 und zur 12-Hydroxyheptadecatriensäure (12- HHT) und zum anderen über den 12-Lipoxygenase-Weg zur 12-Hydroxyeicosatetraensäure (12-HETE) weiter metabolisiert (Abb 18).
Membranphospholipid
cPLA2 Aktivierung durch Calcium Ionophor
A23187
C
C5H11 O
OH
+ Lysophospholipid
(Arachidonsäure)
Cyclooxygenase 12-Lipoxygenase
Prostaglandin H2
12-Hydroxyeicosatetraensäure (12-HETE)
C
C5H11 O
OH
OH
Thromboxan B2 12-Hydroxyheptadecatriensäure (12-HHT)
Thromboxan- Synthase
COOH
OH COOH
OH O
HO
OH
ETYA hemmt beide Wege
Abb. 18: Arachidonsäuremetabolismus in Thrombozyten
Dies hat zur Folge, dass die Konzentration an freier Arachidonsäure in den Zellen normaler- weise sehr gering ist. Aus diesem Grund wurde vor dem Start der Enzymreaktion eine 10 µM- Lösung von ETYA (5,8,11,14-Eicosatetrainsäure) zugegeben. ETYA ist ein dualer COX- und 12-LOX-Inhibitor, der den oben genannten Arachidonsäuremetabolismus in den Zellen komplett unterdrücken kann, so dass die freigesetzte Arachidonsäure in den Zellen kumuliert und dadurch durch direkte Messung der UV-Absorption bei 200 nm bestimmt werden kann.
Kurz zusammengefasst erfolgte die Durchführung des Assays in folgender Weise:
Die in DMSO gelöste Testsubstanz wurde zu einer Lösung von ETYA in DMSO gegeben und mit der aus Humanblut gewonnenen Thrombozytensuspension versetzt und 10 min bei 37°C inkubiert. Als Kontrolle wurde dies in Abwesenheit der Testsubstanz durchgeführt.
Als nächstes erfolgte die Aktivierung der cPLA2 durch Zusatz von Calcium Ionophor A23187. Nach 1 min Inkubationszeit bei 37°C wurde die Enzymreaktion durch Zugabe einer Mischung aus Methanol, Acetonitril und wässriger EDTA-Lösung, welche Nordihydroguaja- retsäure (NDGA) als Antioxidans und einen internen Standard enthielt, wieder gestoppt.
Anschließend wurde die Testlösung zentrifugiert, mit Wasser verdünnt und das Enzympro- dukt durch Festphasenextraktion an RP18-Material isoliert und mittels HPLC bestimmt.
Durch das oben beschriebene Testsystem wurden die Hemmwerte der Testverbindungen im Verhältnis zur maximal produzierbaren Arachidonsäure (= Kontrolle) erhalten. Die IC50- Werte resultieren aus mindestens zwei unabhängig voneinander durchgeführten Bestimmun- gen. Der Schwankungsbereich der ermittelten IC50-Werte betrug üblicherweise ± 20%.
In Thrombozyten ist neben der cPLA2 der Typ II sPLA2 enthalten. Der Typ II sPLA2 ist dort in den sekretorischen Granula lokalisiert und wird nach Stimulation der Zellen z.B. mit Thrombin sezerniert[6]. Die Ausschüttung dieser sPLA2 ruft jedoch nicht eine vermehrte Frei- setzung an Arachidonsäure hervor[109-112]. In der älteren Literatur wurde häufiger diskutiert, dass Arachidonsäure durch sequentielles Einwirken einer Phospholipase C und einer Diglyce- rid-Lipase auf Membranphospholipide bereitgestellt werden kann[113]. Zumindest in Throm- bozyten spielt dieser Stoffwechselweg keine Rolle; es konnte nämlich gezeigt werden, daß die selektive Aktivierung der PLC nicht zu einer erhöhten Konzentration an Arachidonsäure bzw.
ihrer Metaboliten in den Zellen führt[111, 114], und dass die Calcium-Ionophor bzw.
Phorbolester induzierte Arachidonsäurefreisetzung nicht durch einen Diglycerid-Lipase Inhi- bitor (RHC 80267) hemmbar ist. Demnach konnte davon ausgegangen werden, dass die Arachidonsäurefreisetzung in Thrombozyten weitgehend spezifisch von der cPLA2 katalysiert wird. Diese Annahme wurde von kürzlich veröffentlichten[115] Versuchen mit Thrombozyten von cPLA2 knock out Mäusen nochmals bestätigt. Die Zellen dieser Tiere setzten nach Stimulation mit Collagen keine bzw. nur noch sehr geringe Mengen der Arachidonsäure- metaboliten TXB und 12-HETE frei.
2.2 Bestimmung der Zelllyse
In unserer Arbeitsgruppe wurde festgestellt, dass Substanzen, welche die Zellstruktur zerstö- ren, eine Hemmung der cPLA2 vortäuschen. Deshalb wurde routinemäßig bei allen unseren Testsubstanzen zuerst deren Fähigkeit zur Zelllyse ermittelt, wodurch eine Fehlinterpretation der Testergebnisse vermieden werden sollte. Diese Untersuchungen erfolgten mittels einer einfachen turbidimetrischen Methode. Dabei wurden die Thrombozyten wie bei der Testung auf cPLA2 Hemmung behandelt, ohne jedoch die Enzymreaktion mit Calcium Ionophor A23187 zu starten. Statt dessen wurde nach 10 min die Trübung der Lösungen, die eine Testsubstanz enthielten, im Vergleich zur Trübung von Lösungen ohne Testsubstanz ermittelt.
Hierzu wurde die Absorption photometrisch bei 800 nm gemessen. Bei einer Zelllyse nahm die Trübung ab, demzufolge wurde die Absorption geringer. Wie bei der Bestimmung der Hemmwerte erfolgte die Ermittlung der Lyse in mindestens zwei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen. Die untersuchten Verbindungen durften bei der Konzentration, bei der sie zur Testung eingesetzt wurden, keine signifikante Lyse zeigen.
Alternativ zur Trübungsmessung hätte die Zelllyse auch durch Messung der Lactatdehydro- genase-Konzentration (LDH)[85] sowie durch Ermittlung der Serotonin-Freisetzung[116]erfasst werden können.
Die Bestimmung der Zelllyse unserer Testverbindungen wurde bei einer Konzentration von 10 µM durchgeführt. Sofern bei dieser Konzentration keine signifikante Zelllyse festzustellen war, wurde auf deren Darstellung in den folgenden aufgeführten Testergebnissen verzichtet.
