Die zur Entwicklung von Hemmstoffen der cPLA2 verwendeten in vitro Testsysteme kann man in zwei Gruppen einteilen und zwar in solche, welche die isolierte, gereinigte cPLA2 einsetzen und in solche, die auf intakte Zellen zurückgreifen. Bei den ersteren Verfahren die-nen u.a. Tumorzellkulturen als Enzymquelle[98, 99], als Substrate werden Phospholipide mit radioaktiv markierter Arachidonsäure[99], Ester von Fettsäuren mit fluoreszierendem 7-Hydroxycumarin[100] sowie Phospholipide mit einer Arachidonylthioestergruppierung[101] ein-gesetzt. Die Enzymspaltprodukte werden durch Radiometrie, Fluorimetrie bzw. spektropho-tometrisch nach Derivatisierung zu farbigen Produkten nachgewiesen. Der Nachteil dieser Methoden ist, dass das isolierte Enzym mit Substratanordnungen konfrontiert wird (z.B. mo-nomere Phospholipide, Mizellen, gemischte Mizellen), deren physiologische Relevanz nicht beurteilt werden kann.
Bei der zweiten Gruppe von Testmethoden wird die Aktivität der cPLA2 in intakten Zellen (z.B. Thrombozyten oder Knochenmarkzellen) gemessen[102-104]. Der Vorteil solcher Verfah-ren liegt darin, dass sie die in vivo Verhältnisse besser widerspiegeln.
Üblicherweise werden die Zellen hierbei zuerst mit radioaktiv markierter Arachidonsäure inkubiert, wobei diese in die Phospholipide eingebaut wird. Als nächstes wird die überschüs-sige Arachidonsäure ausgewaschen und die cPLA2 durch Zugabe bestimmter Agentien akti-viert. Anschließend wird die Menge an freigesetzter radioaktiv markierter Arachidonsäure bzw. ihrer Metaboliten mittels Radiometrie bestimmt. Neben diesen radioaktiven Methoden sind Assays beschrieben, bei denen die aus den Zellen freigesetzte endogene Arachidonsäure nach Derivatisierung durch HPLC/UV oder GC/MS gemessen wird.
In unserem Arbeitskreis wurde zur Bestimmung von Hemmstoffen der cPLA2 ein zelluläres Testsystem[105, 106] aufgebaut, bei welchem die aus Thrombozyten freigesetzte Arachidonsäure direkt ohne vorherige Derivatisierung mit HPLC und UV-Detektion bei 200 nm gemessen wird. Die Thrombozyten wurden dabei aus Rinder- bzw. Humanblut durch Zentrifugation isoliert.
Wie bereits im Abschnitt 1.4 erwähnt, tritt die cPLA2 auf zellulärer Ebene dann in Aktion, wenn sie durch Proteinkinasen phosphoryliert wird, oder wenn die intrazelluläre Calcium-ionenkonzentration auf einen bestimmten Wert ansteigt[82, 107]. So kann die Enzymreaktion in Thrombozyten z.B. durch Zugabe des Phorbolesters TPA, der Protein-Kinasen aktiviert, oder durch den Calciumcarrier Calcium Ionophor A23187, der die Calciumkonzentration im Cyto-sol erhöht, gestartet werden (Abb. 17). Letztere Substanz diente bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen als Stimulans.
In unserem Arbeitskreis wurden als Enzymquelle anfangs intakte Rinderthrombozyten einge-setzt. Später wurde das Testsystem auf entsprechende humane Zellen umgestellt. Gleichzeitig wurde dabei auf die Zugabe von Calcium-Ionen zum Inkubationspuffer verzichtet. Die endogen in Calciumspeichern enthaltenen Calcium-Ionen reichen nämlich zur Aktivierung des Enzymes aus. Außerdem hatte es sich gezeigt, dass exogenes Calcium zu einer etwas geringeren Arachidonsäurefreisetzung führt. Die Hemmwerte einiger in unserem Arbeitskreis hergestellten Verbindungen sowie in der Literatur beschriebener cPLA2-Hemmstoffe wurden mit Rinder- und mit Humanthrombozyten ermittelt. Hierbei war keine gravierende spezies- bzw. assaybedingte Abweichung der IC50-Werte zu beobachten [108].
Abb. 17: 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat Calcium Ionophor A23187 (TPA)
In den Thrombozyten wird die durch die cPLA2 freigesetzte Arachidonsäure zum einen über den Cyclooxygenase-Weg zum Thromboxan B2 und zur 12-Hydroxyheptadecatriensäure (12-HHT) und zum anderen über den 12-Lipoxygenase-Weg zur 12-Hydroxyeicosatetraensäure (12-HETE) weiter metabolisiert (Abb 18).
Membranphospholipid
cPLA2 Aktivierung durch Calcium Ionophor
A23187
Thromboxan B2 12-Hydroxyheptadecatriensäure (12-HHT)
Abb. 18: Arachidonsäuremetabolismus in Thrombozyten
Dies hat zur Folge, dass die Konzentration an freier Arachidonsäure in den Zellen normaler-weise sehr gering ist. Aus diesem Grund wurde vor dem Start der Enzymreaktion eine 10 µM-Lösung von ETYA (5,8,11,14-Eicosatetrainsäure) zugegeben. ETYA ist ein dualer COX- und 12-LOX-Inhibitor, der den oben genannten Arachidonsäuremetabolismus in den Zellen komplett unterdrücken kann, so dass die freigesetzte Arachidonsäure in den Zellen kumuliert und dadurch durch direkte Messung der UV-Absorption bei 200 nm bestimmt werden kann.
Kurz zusammengefasst erfolgte die Durchführung des Assays in folgender Weise:
Die in DMSO gelöste Testsubstanz wurde zu einer Lösung von ETYA in DMSO gegeben und mit der aus Humanblut gewonnenen Thrombozytensuspension versetzt und 10 min bei 37°C inkubiert. Als Kontrolle wurde dies in Abwesenheit der Testsubstanz durchgeführt.
Als nächstes erfolgte die Aktivierung der cPLA2 durch Zusatz von Calcium Ionophor A23187. Nach 1 min Inkubationszeit bei 37°C wurde die Enzymreaktion durch Zugabe einer Mischung aus Methanol, Acetonitril und wässriger EDTA-Lösung, welche Nordihydroguaja-retsäure (NDGA) als Antioxidans und einen internen Standard enthielt, wieder gestoppt.
Anschließend wurde die Testlösung zentrifugiert, mit Wasser verdünnt und das Enzympro-dukt durch Festphasenextraktion an RP18-Material isoliert und mittels HPLC bestimmt.
Durch das oben beschriebene Testsystem wurden die Hemmwerte der Testverbindungen im Verhältnis zur maximal produzierbaren Arachidonsäure (= Kontrolle) erhalten. Die IC50-Werte resultieren aus mindestens zwei unabhängig voneinander durchgeführten Bestimmun-gen. Der Schwankungsbereich der ermittelten IC50-Werte betrug üblicherweise ± 20%.
In Thrombozyten ist neben der cPLA2 der Typ II sPLA2 enthalten. Der Typ II sPLA2 ist dort in den sekretorischen Granula lokalisiert und wird nach Stimulation der Zellen z.B. mit Thrombin sezerniert[6]. Die Ausschüttung dieser sPLA2 ruft jedoch nicht eine vermehrte Frei-setzung an Arachidonsäure hervor[109-112]. In der älteren Literatur wurde häufiger diskutiert, dass Arachidonsäure durch sequentielles Einwirken einer Phospholipase C und einer Diglyce-rid-Lipase auf Membranphospholipide bereitgestellt werden kann[113]. Zumindest in Throm-bozyten spielt dieser Stoffwechselweg keine Rolle; es konnte nämlich gezeigt werden, daß die selektive Aktivierung der PLC nicht zu einer erhöhten Konzentration an Arachidonsäure bzw.
ihrer Metaboliten in den Zellen führt[111, 114], und dass die Calcium-Ionophor bzw.
Phorbolester induzierte Arachidonsäurefreisetzung nicht durch einen Diglycerid-Lipase Inhi-bitor (RHC 80267) hemmbar ist. Demnach konnte davon ausgegangen werden, dass die Arachidonsäurefreisetzung in Thrombozyten weitgehend spezifisch von der cPLA2 katalysiert wird. Diese Annahme wurde von kürzlich veröffentlichten[115] Versuchen mit Thrombozyten von cPLA2 knock out Mäusen nochmals bestätigt. Die Zellen dieser Tiere setzten nach Stimulation mit Collagen keine bzw. nur noch sehr geringe Mengen der Arachidonsäure-metaboliten TXB und 12-HETE frei.