Tierärztliche Hochschule Hannover
Multiplex Branched DNA Assay zur Untersuchung der Genexpression von Hormonrezeptoren kaniner Mammatumoren und tumorassoziierter Gene in der
Zellkultur
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Annika Esther Mohr
Münster
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Ingo Nolte Klinik für Kleintiere
Tierärztliche Hochschule Hannover 2. PD Dr. Hugo Murua Escobar
Klinik für Hämatologie, Onkologie und Palliativmedizin
Universitätsmedizin Rostock
1. Gutachter: Prof. Dr. Ingo Nolte
2. Gutachterin: Prof. Dr. Anne-Rose Günzel-Apel
Tag der mündlichen Prüfung: 03.11.2016
Meiner Familie
Das folgende Manuskript wurde am 20.09.2016 publiziert:
Hormone Receptor Expression Analyses in Neoplastic and Non-neoplastic Canine Mammary Tissue by a Bead Based Multiplex Branched DNA Assay: A Gene Expression Study in Fresh Frozen and Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Samples
Annika Mohr, Florenza Lüder Ripoli, Susanne Conradine Hammer, Saskia Willenbrock, Marion Hewicker-Trautwein, Zdzisław Kiełbowicz, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte PLoS ONE 11(9): e0163311. doi:10.1371/journal.pone.0163311
Das folgende Manuskript wurde zur Publikation eingereicht:
Longitudinal analysis of 20 tumor-associated genes in non-neoplastic and neoplastic canine mammary tissues and their corresponding cultivated cells
Annika Mohr, Susanne Conradine Hammer, Florenza Lüder Ripoli, Saskia Willenbrock, Marion Hewicker-Trautwein, Bertram Brenig, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte
Eingereicht bei BMC Cancer am 17.08.2016
Teile der Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Vorträgen auf den folgenden Fachtagungen präsentiert:
24. Jahrestagung der FG Innere Medizin und klinische Labordiagnostik der DVG, InnLab (29.
Januar 2016, Berlin)
Luminex basierte Untersuchung der Genexpression von Hormonrezeptoren in Mammagewebe des Hundes
Annika Mohr, Florenza Lüder Ripoli, Susanne Conradine Hammer, Saskia Willenbrock, Marion Hewicker-Trautwein, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte
DVG-Vet-Congress 2016 (27.10.-30.10.2016, Berlin)
Bedeutung von Hormonrezeptoren bei Mammatumoren des Hundes
A. Mohr, F. L. Ripoli, S. C. Hammer, S. Willenbrock, M. Hewicker-Trautwein, Z.
Kiełbowicz, H. Murua Escobar, I. Nolte
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Literaturübersicht 5
2.1 Hormonrezeptoren 5
2.2 Tumorassoziierte Gene 8
2.3 Multiplex Branched DNA Assay 10
3. Material und Methoden 13
3.1 Kryokonservierte Proben 13
3.2 Formalin-fixierte, paraffin-eingebettete Proben 13
3.3 Zellkultur-Proben 13
3.4 RNA-Isolierung 15
3.5 Zellpellets 15
3.6 Multiplex Branched DNA Assay 16
3.7 Housekeeping-Gene 16
3.8 Daten-Analyse und statistische Analyse 16
4. Ergebnisse 18
4.1 Studie 1 18
4.2 Studie 2 20
5. Diskussion 43
6. Zusammenfassung 50
7. Summary 52
8. Literaturverzeichnis 54
9. Abkürzungsverzeichnis 79
10. Danksagung 81
Einleitung
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1 1. Einleitung
Tumoren der Gesäugeleiste sind die häufigste Tumorart bei der Hündin (DORN et al. 1968;
RICHARDS et al. 2001; MERLO et al. 2008) und das Ergebnis der histopathologischen Diagnose ist in ca. 50% der Fälle bösartig (MOULTON et al. 1970; BOSTOCK 1986; MOE 2001; BRONDEN et al. 2010). Obwohl die mediane Überlebenszeit bei malignen Mammatumoren in Abhängigkeit vom histopathologischen Grad des Tumors weniger als zwei Jahre beträgt (YAMAGAMI et al. 1996; PHILIBERT et al. 2003; CHANG et al. 2005;
BETZ et al. 2012), sind, im Gegensatz zum Menschen, noch keine diesbezüglichen prognostischen Biomarker für die verschiedenen Tumorsubtypen bekannt. Ebenso werden bisher kaum endokrinologische Ansätze oder Targetgene für eine gezielte Tumortherapie genutzt (MORRIS et al. 1993; TAVARES et al. 2010; GUIL-LUNA et al. 2011; SINGER et al. 2012; PEÑA et al. 2014).
Die Routinediagnostik von Karzinomen der Brust beim Menschen schließt regelmäßig die Untersuchung von Östrogen- und Progesteronrezeptoren (PAYNE et al. 2008; HAMMOND et al. 2010) sowie des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (HER2) mit ein (PAYNE et al. 2008; WOLFF et al. 2013). Aufgrund der möglicherweise ähnlichen hormonabhängigen Inzidenz von Mammatumoren des Hundes wurden bereits Studien bezüglich des prognostischen und therapeutischen Potenzials von Östrogen- und Progesteronrezeptoren durchgeführt. Mehrere Autoren berichten von einem Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von Steroidhormonrezeptoren und der Prognose von Mammatumoren (NIETO et al. 2000; CHANG et al. 2009), während andere Studien diesen Zusammenhang nicht bestätigen konnten (MARTIN DE LAS MULAS et al. 2005; MILLANTA et al. 2005). Auch im Hinblick auf die therapeutische Vorgehensweise werden Östrogen- und Progesteronrezeptoren beim Hund bisher nicht berücksichtigt (MORRIS et al. 1993;
TAVARES et al. 2010; GUIL-LUNA et al. 2011; PEÑA et al. 2014).
Um die Tumorentwicklung zu untersuchen, aber auch, um mögliche prognostische Marker zu finden, welche in die Routinediagnostik integriert werden könnten, wurden beim Hund in Anlehnung an den Menschen auch andere Hormonrezeptoren (Prolaktin, Somatotropin) sowie weitere tumorassoziierte Gene untersucht. Das beim Menschen im Fokus stehende Gen HER2 liegt beim Hund in ähnlicher Verteilung überexprimiert vor (17,6 bis 38%) (RUNGSIPIPAT
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et al. 1999; MARTIN DE LAS MULAS et al. 2003; HSU et al. 2009; RESSEL et al. 2013;
SHINODA et al. 2014) wie in Karzinomen der Brust (20-30%) (SLAMON et al. 1987;
REVILLION et al. 1998; ALMASRI u. HAMAD 2005). Es konnte jedoch bisher nur in einer Studie eine Korrelation mit der Überlebenszeit von Hündinnen mit Mammatumoren festgestellt werden (HSU et al. 2009).
Für die Tumorsuppressor-Gene PTEN, BRCA1 und BRCA2 sowie für die Prolaktin- und Somatotropinrezeptoren ergab sich in mehreren voneinander unabhängigen Studien ein Zusammenhang zwischen maligner Transformation von Tumoren der Mamma und einer Abnahme der Protein- oder Genexpression (VAN GARDEREN et al. 1999; NIETO et al.
2003; QIU et al. 2008; RESSEL et al. 2009; MICHEL et al. 2012; SPOERRI et al. 2015;
YOSHIKAWA et al. 2015; RIPOLI et al. 2016). Auch die Tumorsuppressorgene TP53, PFDN5 und FOXO3 sollen mit der Entstehung von Mammatumoren des Hundes assoziiert sein (MUTO et al. 2000; LEE u. KWEON 2002; LEE et al. 2004; KOLTAI u. VAJDOVICH 2014; HENNECKE et al. 2015; RIPOLI et al. 2016). Weitere mit Brustkrebs der Frau assoziierte Gene sind GATA4 (HUA et al. 2009; TAKAGI et al. 2014), HMGA1 (CHIAPPETTA et al. 2004; SHAH et al. 2013), HMGA2 (SUN et al. 2013; WU et al. 2016), HMGB1 (SUN et al. 2015), MAPK1 (SLATTERY et al. 2014), MAPK3 (MUELLER et al.
2000), MCL1 (O'DRISCOLL et al. 2004; WANG et al. 2014), MYC (PEREIRA et al. 2013) und PIK3CA (LOPEZ-KNOWLES et al. 2010; ZARDAVAS et al. 2014), welche jedoch bei Mammatumoren des Hundes noch nicht näher charakterisiert sind.
Die molekularbiologische Untersuchung zielt beim Menschen nicht nur auf prognostische Aspekte, sondern auch auf die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten basierend auf in Brustkrebs exprimierten Genen (HIGGINS u. BASELGA 2011; KALIMUTHO et al. 2015;
SANTA-MARIA u. GRADISHAR 2015; ZEICHNER et al. 2016). Zur orientierenden Evaluierung der Wirksamkeit von Therapeutika eignen sich aus dem Organismus isolierte Zellen (SHARMA et al. 2010; DOKE u. DHAWALE 2015). Voraussetzung ist, dass das Gen, welches gezielt ausgewählt wird, sowohl im Ursprungsgewebe, als auch in der Zellkultur exprimiert wird.
Um für den Hund Zelllinien mit der Expression von tumorassoziierten Genen (BRCA1, BRCA2, FOXO3, GATA4, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1,
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MYC, PFDN5, PIK3CA, PTEN und TP53) und der Genexpression von Östrogen-, Progesteron-, Prolaktin- und Somatotropinrezeptoren (ESR1, PGR, PRLR und GHR) zu etablieren, wurden 10 neoplastische und 6 nicht-neoplastische Mammagewebeproben und aus diesem Gewebe gewonnene Zellkulturen untersucht. Daraus ergaben sich die Fragestellungen, (i) spiegeln die kultivierten Zellen die Genexpression des Originalgewebes wider? und (ii) lassen sich Primärkulturen oder daraus hervorgehende Zelllinien identifizieren, die eine gleichmäßige Genexpression über mehrere Passagen vorweisen und damit für zukünftige Versuche zur Evaluierung von therapeutischen Ansätzen geeignet sind?
Bei der für die Genexpressionsanalyse in der vorliegenden Arbeit genutzten Methode handelt es sich um einen Multiplex Branched DNA Assay, der die Möglichkeit bietet, gleichzeitig bis zu 100 Targets in einer Probe zu messen (FLAGELLA et al. 2006). Die gängige Methode zum Nachweis insbesondere von Östrogen-/Progesteronrezeptoren und HER2 in malignen Mammatumoren des Menschen ist die Immunhistochemie (IHC) (PAYNE et al. 2008;
HAMMOND et al. 2010; WOLFF et al. 2013). Dabei werden in der Regel formalin-fixierte, paraffin-eingebettete (FFPE) Proben genutzt (GJERDRUM et al. 2004; PAYNE et al. 2008).
Für die Untersuchung von Hormonrezeptoren, aber auch anderer Marker in der Tumorforschung, stellen Genexpressionsanalysen eine Alternative dar, durch die zudem eine weitergehende Charakterisierung von Tumoren erfolgen kann (PEROU et al. 2000;
SOTIRIOU u. PUSZTAI 2009). Im Allgemeinen ermöglichen Genexpressionsanalysen im Gegensatz zur semi-quantitativen IHC eine quantitative Evaluierung von Tumormarkern und objektivieren damit den Vergleich verschiedener Gewebe. Dabei dienen kryokonservierte Proben als Goldstandard für Genexpressionsanalysen (SCICCHITANO et al. 2006;
PENLAND et al. 2007; LEHMANN-CHE et al. 2011; CALLARI et al. 2014). Solche Proben liegen jedoch nur im Einzelfall frisch vor oder werden in aufwendigen Gewebebänken konserviert (PENLAND et al. 2007; RIBEIRO-SILVA et al. 2007; CALLARI et al. 2014). Im Vergleich dazu bilden FFPE-Proben aus der Routinediagnostik einen großen und interessanten Probenpool für retrospektive Studien (LEWIS et al. 2001; RIBEIRO-SILVA et al. 2007; SCHWEIGER et al. 2009; WEBSTER et al. 2015). Allerdings ist die RNA von FFPE-Proben häufig durch zu lange Exposition in Formalin und anschließende Lagerung degradiert oder fragmentiert (RIBEIRO-SILVA et al. 2007; BASS et al. 2014; NAM et al.
Einleitung
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2014; WEBSTER et al. 2015). Daher werden für die Genexpressionsanalyse Methoden benötigt, die auch mit FFPE-Proben repräsentative Ergebnisse liefern.
Der Branched DNA Assay wurde bereits mit verlässlichen und reproduzierbaren Ergebnissen an FFPE-Proben vom Menschen getestet (KNUDSEN et al. 2008; YIM et al. 2010). Da aus FFPE-Proben im Allgemeinen nur geringe Mengen an RNA extrahiert werden können (ROBERTS et al. 2009; NAM et al. 2014), ist es von besonderem Vorteil, dass für die Analyse von zahlreichen Genen mit dem Multiplex Branched DNA Assay nur wenig RNA eingesetzt werden muss. Durch den schnellen und einfachen Arbeitsablauf bietet er zusätzlich die Möglichkeit, eine große Anzahl an Proben gleichzeitig zu messen (FLAGELLA et al.
2006; KNUDSEN et al. 2008). Die Analyse der Gene ESR1, PGR und HER2 aus FFPE- Proben hat mit diesem Assay in Tumoren der Brust bereits vielversprechenden Ergebnissen erbracht (YIM et al. 2010).
Mit der vorliegenden Arbeit sollte daher geprüft werden, ob der Multiplex Branched DNA Assay für die Genexpressionsanalyse der Hormonrezeptoren ESR1, PGR, PRLR und GHR im Mammagewebe des Hundes geeignet ist und, ob die gemessenen Expressionslevel in verschiedenen Entitäten von kryokonservierten und FFPE-Proben vergleichbar sind. An diesem unterschiedlich gelagerten Probenmaterial sollte in einem weiteren Schritt untersucht werden, ob ESR1, PGR, PRLR und GHR in nicht-neoplastischem Mammagewebe, benignen und malignen Mammatumoren unterschiedlich exprimiert werden und ob ein Einfluss der Kastration oder der Rasse erkennbar ist.
Literaturübersicht
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5 2. Literaturübersicht
2.1 Hormonrezeptoren
Die Steroidhormone Progesteron und Östrogene führen in jedem Zyklus dazu, dass das Mammagewebe zur Proliferation angeregt wird (DANIEL et al. 1987; CLARKE 2000;
LYDON et al. 2000). Abhängig von der Zyklusphase befindet sich das Mammagewebe entweder unter Östrogeneinfluss, sodass duktales Wachstum gefördert wird (DANIEL et al.
1987) oder aber unter Progesteroneinfluss, sodass es zu einer Entwicklung der lobuloalveolären Zellen kommt (LYDON et al. 2000). Im Zusammenhang mit dem proliferativen Effekt von Progesteron wird zudem eine Hochregulierung des Wachstumshormons Somatotropin angenommen, welches vermutlich einen Einfluss auf Stammzellen des Gesäuges besitzt (MOL et al. 1996; GINESTIER u. WICHA 2007). Deren Anregung zur Teilung, könnte den ersten Schritt der Karzinogenese darstellen (REYA et al.
2001; MARTINEZ-CLIMENT et al. 2006). Da Hormone über ihre jeweiligen Rezeptoren wirken und da Östrogen- und Progesteronrezeptoren beim Menschen bereits eine prognostische und prädiktive Bedeutung bei Brustkrebs zugesagt wird (PAYNE et al. 2008;
HAMMOND et al. 2010), beschäftigen sich auch verschiedene Studien mit der Untersuchung von Hormonrezeptoren in Mammatumoren des Hundes (RUTTEMAN et al. 1988; NIETO et al. 2000; MARTIN DE LAS MULAS et al. 2005; MILLANTA et al. 2005; CHANG et al.
2009; MAINENTI et al. 2014). Dabei konnte bestätigt werden, dass die Anzahl der Rezeptoren von Östrogenen und Progesteron im gesunden Mammagewebe über benigne Mammatumoren bis hin zu malignen abnimmt (MARTIN DE LAS MULAS et al. 2005;
CHANG et al. 2009; SPOERRI et al. 2015). Bei einer differenzierten Betrachtung der malignen Mammatumoren wurde festgestellt, dass eine höhere Immunreaktivität von Östrogenrezeptoren in Adenokarzinomen vorhanden ist, verglichen mit der Gruppe von Neoplasien mit tubulärer Formation, wie beispielsweise solide Karzinome (NIETO et al.
2000). Auch wurden niedrigere Proteinlevel bei Tumoren mit aggressivem Verhalten (MAINENTI et al. 2014) und bei invasiven Karzinomen verglichen mit In-situ-Karzinomen (MILLANTA et al. 2005) nachgewiesen. Ähnliche Ergebnisse für Östrogen- und Progesteronrezeptoren wurden bei Brustkrebs festgestellt, wobei die Immunreaktivität mit zunehmendem histopathologischen Grad des Tumors sank (DUNNWALD et al. 2007;
AZIZUN et al. 2008). Während beim Menschen bereits eine Nutzung des
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Steroidrezeptorstatus für die prognostische Einschätzung erfolgt (PAYNE et al. 2008;
HAMMOND et al. 2010), gehen die Ergebnisse bezüglich einer prognostischen Bedeutung beim Hund auseinander. Ein Teil der Studien berichtet von einem Zusammenhang zwischen der Expression von Steroidhormonrezeptoren auf die Überlebenszeit von Hündinnen mit Mammatumoren (NIETO et al. 2000; C. C. CHANG et al. 2009), während in anderen Studien dieser Zusammenhang nicht nachweisbar war (MARTIN DE LAS MULAS et al. 2005;
MILLANTA et al. 2005).
Bei der Untersuchung der Hormonrezeptor-Verteilung ist es auch von Bedeutung, die Situation nach Kastration zu betrachten. Studien, die zwischen kastrierten und unkastrierten Hündinnen differenzierten, fanden bislang entweder keinen Unterschied (MARTIN DE LAS MULAS et al. 2005; CHANG et al. 2009) oder einen niedrigeren Gehalt an Östrogenrezeptoren bei Tumoren kastrierter Tiere (NIETO et al. 2000; MAINENTI et al.
2014). Gleichzeitig war eine geringe Menge an Östrogenrezeptoren mit Tumoren schlechterer Prognose (MAINENTI et al. 2014) oder einer kürzeren Überlebenszeit (NIETO et al. 2000) assoziiert. In einer weiteren Studie wurde gezeigt, dass Hündinnen, bei denen das Intervall zwischen Kastration und Mammatumor-Operation weniger als 2 Jahre betrug, eine höhere Überlebenszeit besaßen (SORENMO et al. 2000). Die Autoren folgerten daraus, dass eine spätere Kastration für die Entwicklung von östrogenrezeptor-positiven Tumoren von Vorteil sein könnte. Dementsprechend wird die Empfehlung für eine frühe Kastration von SCHNEIDER et al. (1969) angezweifelt. Nach dieser Untersuchung haben Hündinnen, die vor der ersten Läufigkeit kastriert werden, das geringste Risiko (0,5%) für ein späteres Auftreten von Mammatumoren. Dieses Risiko steigt bei Kastration nach 2 Läufigkeiten auf 26%. Andere Studien konnten diesen Zusammenhang zwischen Kastration und geringerer Inzidenz von Mammatumoren nicht feststellen (RICHARDS et al. 2001; TORRES DE LA RIVA et al. 2013; HART et al. 2014). Zusätzlich wurde in einem systematischen Review, welches den Einfluss der Kastration auf die Ausbildung von Mammatumoren untersucht, die Evidenz der durchgeführten Studien als „schwach“ bezeichnet (BEAUVAIS et al. 2012).
Trotzdem ist die häufigste Begründung, weshalb Tierärzte Patientenbesitzern empfehlen, ihre Hündinnen kastrieren zu lassen, das verminderte Auftreten von Mammatumoren (DIESEL et al. 2010). Weitere Studien sind notwendig, um den Einfluss der Kastration auf die Ausbildung von Mammatumoren und auf die Expression von Hormonrezeptoren zu beurteilen.
Literaturübersicht
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Bei Brustkrebs profitieren Frauen, bei denen mittels IHC Östrogenrezeptoren im Tumor festgestellt wurden, von einer hormonellen Therapie mit Aromatasehemmern oder Östrogenrezeptormodulatoren (HAMMOND et al. 2010). Die Behandlung von Hunden mit dem Östrogenrezeptormodulator Tamoxifen wird durch das Auftreten von teilweise starken Nebenwirkungen limitiert (MORRIS et al. 1993; TAVARES et al. 2010). Dabei handelt es sich einerseits um Veränderungen des Genitaltrakts, andererseits um ophthalmologische Nebenwirkungen (TAVARES et al. 2010), weshalb der therapeutische Ansatz beim Hund bis jetzt nicht genutzt wird (PEÑA et al. 2014). Eine weitere Möglichkeit der Behandlung könnte der Progesteron-Rezeptor-Antagonist Aglepriston sein, welcher bei rezeptor-positiven Mammatumoren eine Verminderung des Proliferations-, nicht aber des Apoptose-Index auslösen konnte (GUIL-LUNA et al. 2011). Obwohl die Studie vielversprechende Ergebnisse lieferte, war die Zahl der Patienten (n=22) und Kontrolltiere (n=8) zu klein, um die Eignung des Medikaments abschließend zu beurteilen.
Weitere beim Hund bis jetzt nicht im Detail untersuchte Einflüsse auf die Entstehung von Mammatumoren sind die Hormone Prolaktin und Somatotropin. Für beide Hormone wurde sowohl beim Menschen als auch beim Hund nachgewiesen, dass sie auch vom Mammagewebe produziert werden können, sodass von einer autokrinen/parakrinen Wirkung ausgegangen wird (CLEVENGER et al. 1995; GINSBURG u. VONDERHAAR 1995; VAN GARDEREN et al. 1997; RACCURT et al. 2002; QUEIROGA et al. 2005). Beim Menschen sind Prolaktin- und Somatotropinrezeptoren in Karzinomen der Brust höher exprimiert als in gesundem Brustgewebe (TOURAINE et al. 1998; GEBRE-MEDHIN et al. 2001), weshalb Prolaktinrezeptoren bereits als potenzielle Targets für therapeutische Ansätze untersucht werden (DAMIANO et al. 2013; AGARWAL et al. 2016). Beim Hund sind sowohl Prolaktin- als auch Somatotropinrezeptoren in malignen Mammatumoren gering exprimiert (VAN GARDEREN et al. 1999; MICHEL et al. 2012; SPOERRI et al. 2015), vergleichbar mit Östrogen- und Progesteronrezeptoren. Im Gegensatz zu den Steroidhormonrezeptoren wurden noch keine Studien über die Verteilung von Prolaktin- oder Somatotropinrezeptor in histopathologischen Untergruppen von Mammatumoren des Hundes durchgeführt. Auch Studien über eine mögliche prognostische Bedeutung fehlen bis jetzt. In humanem Brustgewebe waren prolaktinrezeptor-negative Tumoren mit einer schlechteren Prognose assoziiert (FAUPEL-BADGER et al. 2014; HACHIM et al. 2015).
Literaturübersicht
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Untersuchungen von Hormonrezeptoren im Mammagewebe des Hundes auf der RNA-Ebene sind bis jetzt selten (MICHEL et al. 2012; KIM et al. 2014; SPOERRI et al. 2015).
Stattdessen wird in Anlehnung an die Humanmedizin meist eine Beurteilung mittels IHC vorgenommen, obwohl die quantitative Analyse der Genexpression durchaus Vorteile hat.
Insbesondere bei malignen Mammatumoren, welche grundsätzlich niedrige Mengen an Hormonrezeptoren aufweisen, besteht das Risiko, dass diese Mengen mit semiquantitativen Methoden übersehen werden und fälschlicherweise eine Einstufung als „hormonrezeptor- negativ“ erfolgt (KIM et al. 2014).
2.2 Tumorassoziierte Gene
Im Gegensatz zum Menschen ist das Wissen über die genetischen Grundlagen der Entstehung von Mammatumoren beim Hund begrenzt. Es wird jedoch aufgrund der Tatsache, dass Mammatumoren bei bestimmten Hunderassen gehäuft vorkommen, von einer genetischen Prädisposition ausgegangen (SLEECKX et al. 2011; DOBSON 2013). Einen zusätzlichen Hinweis für eine genetische Prädisposition liefern die beim Menschen untersuchten Gene BRCA1 und BRCA2. Vererbte Mutationen führen bei betroffenen Frauen zu einem bis zu 82%
erhöhten Risiko, an Brustkrebs zu erkranken (KING et al. 2003). Beim Hund konnte eine verminderte BRCA1- und BRCA2-Expression bei malignen Mammatumoren gefunden werden (NIETO et al. 2003; YOSHIKAWA et al. 2015), welche beim Englischen Springer Spaniel und Shih Tzu rassebedingt sein könnte (RIVERA et al. 2009; IM et al. 2013). Auch andere Gene sind beim Menschen mit der Tumorgenese oder Tumorprogression von Brustkrebs assoziiert, auf deren Basis auch Studien im Mammagewebe des Hundes durchgeführt wurden.
HER2 ist bei ca. 30% der Frauen in Tumoren der Brust überexprimiert und weist auf eine schnelleres Wiederauftreten und eine kürzere Überlebenszeit hin (SLAMON et al. 1987).
Zudem können HER2-positive Tumoren bei der Frau heute teils erfolgreich mit Trastuzumab, einem monoklonalen Antikörper gegen HER2 behandelt werden (COBLEIGH et al. 1999;
SLAMON et al. 2001; PAYNE et al. 2008). Ähnlich wie bei der Frau konnte in 17,6-38% der malignen kanine Mammatumoren eine Überexpression von HER2 nachgewiesen werden (RUNGSIPIPAT et al. 1999; MARTIN DE LAS MULAS et al. 2003; HSU et al. 2009;
RESSEL et al. 2013; SHINODA et al. 2014). Diese war in einigen Untersuchungen mit einer
Literaturübersicht
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höheren Überlebensrate oder besseren Prognose assoziiert (HSU et al. 2009; SHINODA et al.
2014).
Vielversprechende Ergebnisse liefern auch Studien mit dem Tumorsuppressorgen TP53.
Dabei wird zumeist die mutierte Form von TP53 untersucht, da diese das Tumorsuppressor- Potenzial verliert und Onkogen-Aktivität erlangt (ELIYAHU et al. 1984; FINLAY et al.
1988; HINDS et al. 1989). Der Mutationsstatus von TP53 ist ein möglicher prognostischer Faktor sowohl für Brustkrebs der Frau (SILVESTRINI et al. 1993; OVERGAARD et al.
2000; LANGEROD et al. 2007), als auch für Mammatumoren des Hundes (LEE et al. 2004;
ŁOPUSZYŃSKI et al. 2010). Außerdem sollen die Tumorsuppressor-Gene PTEN, PFDN5 und FOXO3 mit der Entstehung von Mammatumoren assoziiert sein. PTEN zeigt eine geringe Expression in malignen Neoplasien des Gesäuges (RESSEL et al. 2009). Dabei hat es, ähnlich wie beim Menschen (BOSE et al. 2002; TSUTSUI et al. 2005), das Potenzial eines prognostischen Markers, da der Verlust von PTEN mit prognostischen Faktoren wie
„Metastasierung“, „Rezidiven“ und „kürzere Überlebenszeit“ korreliert war (RESSEL et al.
2009). In einer Microarray-Analyse von SNPs in Mammatumoren des Hundes konnte zudem festgestellt werden, dass PTEN häufig dereguliert ist und damit potenziell zur Entwicklung von Mammatumoren beitragen könnte (BORGE et al. 2015). Bei PFDN5 handelt es sich um ein bis dato unzureichend charakterisiertes Gen. Während beim Menschen lediglich eine verringerte Expression in 69% der untersuchten Brustkrebs-Proben gefunden werden konnte (SCHUMMER et al. 2010), hat eine Studie über kanine Mammatumoren ergeben, dass eine Deletion von PFDN5 mit höheren Proliferationsaktivitäten des Tumors assoziiert ist (BECK et al. 2013). Weitere Studien bestätigten, dass die Deletion hauptsächlich in malignen Neoplasien zu finden ist, insbesondere in soliden Karzinomen (HENNECKE et al. 2015) und, dass die Genexpression in malignen Neoplasien vermindert ist (RIPOLI et al. 2016). Während FOXO3 bei Brustkrebs der Frau als potenzieller prognostischer Faktor zur Einschätzung der Überlebenszeit angesehen wird (HABASHY et al. 2011; JIANG et al. 2013) und bereits mögliche gezielte Therapieansätze für FOXO3-negative Tumoren untersucht werden (TAYLOR et al. 2015; PARK et al. 2016), ist über seine Bedeutung beim Hund bis jetzt wenig bekannt. Eine kürzlich durchgeführte Analyse von neoplastischem und nicht- neoplastischem Mammagewebe des Hundes hat allerdings gezeigt, dass die Expression von FOXO3 in malignen Tumoren vermindert ist (RIPOLI et al. 2016). Weitere tumorassoziierte
Literaturübersicht
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Gene, die in Mammatumoren des Hundes noch nicht im Detail untersucht wurden, sind die Tumorsuppressorgene GATA4, MAPK1 und MAPK3, sowie die Onkogene HMGA1, HMGA2, HMGB1, MCL1, MYC und PIK3CA. Ein mögliches prognostisches Potenzial im Hinblick auf die Überlebenszeit von Patienten mit Brustkrebs konnte beim Menschen für die Gene GATA4 (TAKAGI et al. 2014), HMGA2 (WU et al. 2016), HMBG1 (KOSTOVA et al. 2010; SUN et al. 2015), MCL1 (DING et al. 2007), MYC (PEREIRA et al. 2013) und PIK3CA (CIZKOVA et al. 2012) bestätigt werden.
Trotz der teilweise schon betrachteten Expression der genannten Gene im Mammagewebe des Hundes, wurde bis jetzt kaum ihre Brauchbarkeit als Targets für die gezielte Tumortherapie getestet. Lediglich die Wirkung von Trastuzumab als monoklonaler Antikörper gegen HER2 wurde bereits geprüft (SINGER et al. 2012). Dabei konnte in kaninen Mammazelllinien eine verminderte Proliferation der Zellen als Folge der Bindung des Antikörpers festgestellt werden. Bei Brustkrebs des Menschen wurden neben HER2 von den bereits erwähnten Genen FOXO3 (PARK et al. 2016), HMGA1 (DI CELLO et al. 2013; SHAH et al. 2013), MCL1 (MODUGNO et al. 2015) und PIK3CA (SHE et al. 2016) für die gezielte Tumortherapie untersucht. Um eine erste Einschätzung der Behandlungsmöglichkeiten vorzunehmen, werden häufig Zelllinien genutzt (GOODSPEED et al. 2016), da die aus dem Organismus isolierten Tumorzellen, das Originalgewebe repräsentieren sollen (BURDALL et al. 2003). Erste Einschätzungen über die Wirksamkeit des Medikaments können über die Beurteilung der Zellproliferation oder der Vitalität der Zellen vorgenommen werden (ASTASHKINA et al.
2012). Für die spätere Anwendbarkeit in in-vivo-Versuchen ist es von Bedeutung, dass die Genexpression in der Zellkultur die im Originalgewebe widerspiegelt.
2.3 Multiplex Branched DNA Assay
Bei dem Multiplex Branched DNA Assay handelt es sich um eine Kombination aus Branched DNA Assay und xMAP® magnetische Beads, welche einen quantitativen Nachweis von mehreren Genen in einer Probe ermöglicht (FLAGELLA et al. 2006). Dabei ist der Branched DNA Assay eine Methode, die aufgrund ihrer Sensitivität und Spezifität von der US Food and Drug Administration als Technik für die klinische Diagnostik anerkannt ist (TSONGALIS 2006). Das direkte Detektieren der RNA steht im Gegensatz zur quantitativen PCR (qPCR),
Literaturübersicht
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bei der eine Amplifikation der Zielsequenz und nicht des Reportersignals erfolgt (TSONGALIS 2006; ZHENG et al. 2006). Der initiale Schritt des Branched DNA Assays ist die Hybridisierung der nachzuweisenden RNA-Zielsequenzen an die sogenannten zielsequenz-spezifischen DNA-Fangsonden („Capture Probe“) und an eine Detektionssonde („Capture Extender“). In darauffolgenden Hybridisierungsschritten werden synthetisch verzweigte und chemisch markierte Oligonukleotid-Sonden an die Detektionssonde gebunden, welche als „Signalverstärker-DNA" („Label Extender“) wirken sollen. Die letztendliche Quantifizierung erfolgt durch die Bindung von „Label Probe“-Molekülen, an die wiederum ein Reporterfarbstoff (Streptavidin-konjugiertes R-Phycoeryhrin, SAPE) bindet (COLLINS et al. 1997; TSONGALIS 2006; YANG et al. 2006; KNUDSEN et al. 2008).
Während die qPCR als eine der Standardmethoden zur Untersuchung von Genexpressionen (LEWIS et al. 2001), ein geringes Multiplex-Potential aufweist, können mittels des Branched DNA Assays in Kombination mit xMAP® magnetische Beads bis zu 100 Gene parallel in einer Probe nachgewiesen werden (FLAGELLA et al. 2006). Die Anfangs erwähnten DNA- Fangsonden sind an die Beads gekoppelt. Durch Auslesen der Beads, also durch Anregen der bead-spezifischen Wellenlänge mittels Laserlicht, können diese in Verbindung mit den Zielsequenz-Komplexen einem bestimmten Targetgen zugeordnet werden. Gleichzeitig ist die ermittelte Fluoreszenzintensität des Reporterfarbstoffes proportional zu der gebundenen Menge der RNA-Zielsequenz (FLAGELLA et al. 2006). Weitere Vorteile des Branched DNA Assays sind der schnelle Arbeitsablauf und die Möglichkeit mit Lysaten des Gewebes zu arbeiten, anstatt eine RNA-Isolierung durchzuführen. Dadurch können extraktionsbedingte Fehler vermieden werden (YANG et al. 2006; KNUDSEN et al. 2008).
FFPE-Proben stellen einen großen und interessanten Pool für retrospektive Studien dar (LEWIS et al. 2001; RIBEIRO-SILVA et al. 2007; SCHWEIGER et al. 2009; WEBSTER et al. 2015), während kryokonservierte Proben auf wenige Gewebebänke beschränkt sind (PENLAND et al. 2007; RIBEIRO-SILVA et al. 2007; CALLARI et al. 2014). Jedoch liefern Genexpressionsanalysen mit FFPE-Proben aufgrund ihrer degradierten oder fragmentierten RNA (RIBEIRO-SILVA et al. 2007; BASS et al. 2014; NAM et al. 2014; WEBSTER et al.
2015) häufig weniger verlässliche Ergebnisse (YANG et al. 2006; WEBSTER et al. 2015). In einer Studie von 2008 konnte dagegen festgestellt werden, dass die Analyse von FFPE-
Literaturübersicht
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Proben des Menschen mittels Branched DNA Assay verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse liefert (KNUDSEN et al. 2008).
Da über die genetischen Grundlagen von Mammatumoren des Hundes bisher wenig bekannt ist, bietet der Multiplex Branched DNA Assay die Möglichkeit, eine große Anzahl an Targets und, aufgrund des schnellen und einfachen Arbeitsablaufs (KNUDSEN et al. 2008), auch eine große Anzahl an Proben zu messen, um für die Tumorentwicklung relevante Gene zu detektieren. Gleichzeitig ermöglicht die Sensitivität des Assays eine differenzierte Betrachtung von Tumorsubtypen. Basierend auf der Literatur soll der Branched DNA Assay beim Menschen auch für FFPE-Proben geeignet sein (YANG et al. 2006; KNUDSEN et al.
2008). Ein Vergleich zwischen kryokonservierten und FFPE-Proben im Mammagewebe des Hundes wurde bisher noch nicht durchgeführt.
Material und Methoden
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13 3. Material und Methoden
3.1 Kryokonservierte Proben
In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 119 kryokonservierte Proben untersucht, die im Rahmen von Mammatumor-Operationen in den Jahren 2003 bis 2011 in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (n=105) und im Jahr 2014 in der Kleintierklinik des Tierärztlichen Instituts der Georg-August-Universität Göttingen (n=11), sowie in der Kleintierpraxis Dr. M. Schilling, Bielefeld (n=3) entnommen wurden. Die Gewebeproben wurden in ca. 1x1cm große Stücke zugeschnitten und in 1,8ml Kryoröhrchen (Nunc™, Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland) in flüssigem Stickstoff schockgefrostet. Anschließend wurden die Proben bei -80°C in einer Gewebebank gelagert.
Für die histopathologische Klassifizierung wurde ein Stück der kryokonservierten Proben in 10% gepuffertes Formalin gegeben, in Paraffin eingebettet und im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover routinemäßig verarbeitet. Nach der Anfertigung von 3-4 µm Schnitten wurde mit Hämatoxylin-Eosin angefärbt und die Proben gemäß einer modifizierten Klassifizierung nach GOLDSCHMIDT et al. (2011) histopathologisch befundet. Nähere Information zu der Rassenverteilung und des Kastrationsstatus der Patienten, sowie zu den histopathologischen Diagnosen der Proben sind der Studie 1 zu entnehmen.
3.2 Formalin-fixierte, paraffin-eingebettete Proben
Das FFPE-Gewebe beinhaltete 180 Proben, welche in den Jahren 1993 bis 2000 in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover operativ entfernt und im dortigen Institut für Pathologie routinemäßig histopathologisch befundet wurden. Dafür wurden die Proben in 10% gepuffertes Formalin gegeben und dann in Paraffin eingebettet.
Die anschließende Lagerung der FFPE-Blöcke erfolgte bei Raumtemperatur. Für die vorliegende Arbeit erfolgte am Institut für Pathologie eine zusätzliche Befundung der Proben nach einer Klassifizierung von GOLDSCHMIDT et al. (2011). Nähere Information zu der Rassenverteilung und des Kastrationsstatus der Patienten, sowie zu den histopathologischen Diagnosen der Proben sind der Studie 1 zu entnehmen.
Material und Methoden
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14 3.3 Zellkultur-Proben
Gewebeproben für die Zellkultur stammten von 10 Mammatumoren (4 benigne und 6 maligne) und 6 nicht-neoplastichen Mammageweben, welche in den Jahren 2014 und 2015 im Rahmen von Mammatumor-Operationen in der Kleintierklinik des Tierärztlichen Instituts der Georg-August-Universität Göttingen (n=11), der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (n=2) und der Kleintierpraxis Dr. M. Schilling, Bielefeld (n=3) entnommen wurden. Die Proben wurden bis zu ihrer Weiterverarbeitung in Hank’s Lösung (Hank‘s Balanced Salt Solution, Biochrom GmbH, Berlin, Deutschland) gelagert. Je nach Größe des Tumors wurden zusätzlich kleine Stücke abgeteilt, schockgefrostet und bei -80°C gelagert.
Für die Isolation der Zellen wurden die Gewebeproben unter sterilen Kautelen zuerst mechanisch zerkleinert und anschließend mit 0,26%iger Kollagenase (4ml, 200U/ml, Collagenase NB 8 Broad Range, SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland) enzymatisch behandelt. Die Einwirkung der Kollagenase erfolgte im Inkubator (5%CO2, 37°C) für 1 bis 2 Stunden bis die Zellen dissoziiert waren. Anschließend wurden die Zellen mit Medium 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland) gewaschen und bei 1000 rpm 10 Minuten zentrifugiert (Raumtemperatur, Universal 230R centrifuge, Hettich, Lauenau, Deutschland). Das Zellpellet wurde in Zellkulturflaschen (25cm2, TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz) mit Medium 199 mit 20% fetalem Kälberserum (Biochrom GmbH, Berlin, Deutschland) und 2% Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml / 10.000 µg/ml, Biochrom GmbH) überführt und bei 37°C, 98% relativer Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 kultiviert. Sobald eine Konfluenz der Zellen von ca. 80% erreicht war, wurden die Zellen nach enzymatischer Ablösung (1ml TrypLE™ Express Enzyme no phenol red, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland) in zwei neue Zellkulturflaschen passagiert.
Abhängig vom Wachstum der Zellen wurden Zellkulturen, die Passage 20 (P.20) oder darüber hinaus erreicht hatten, als „Zelllinien“ bezeichnet. Erreichten die Kulturen die Passage 20 nicht, wurden sie „Primärkultur“ genannt.
Für die histopathologische Klassifizierung der Zellkulturen wurden Zellpellets angefertigt, in 4%igem Paraformaldehyd gelagert und in Paraffin eingebettet. Anschließend wurde von den eingebetteten Proben im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Material und Methoden
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Hannover 3-4 µm Schnitte angefertigt, mit Hämatoxylin-Eosin angefärbt und gemäß einer modifizierten Klassifizierung nach GOLDSCHMIDT et al. (2011) bewertet. Nähere Information zu der Rassenverteilung und des Kastrationsstatus der Patienten, sowie zu den histopathologischen Diagnosen der Proben sind der Studie 2 zu entnehmen.
3.4 RNA-Isolierung
Vor der RNA-Isolierung wurden die kryokonservierten Proben mithilfe des TissueLyser II (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) und 5mm großen Edelstahl-Beads homogenisiert.
Anschließend wurde die RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) isoliert. Dabei wurde ein zusätzlicher DNA-Verdau mit dem RNase-free DNase Set (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) und der RQ1 RNase-free DNase (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) durchgeführt.
Von den FFPE-Blöcken wurden mit einem Mikrotom 20µm-Schnitte hergestellt. Diese wurden in RNAse freie Eppendorf Röhrchen gegeben und das Paraffin mit einer Deparaffinisierungs-Lösung (Deparaffinization Solution, Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) entfernt. Anschließend wurde die RNA mit dem AllPrep DNA/RNA FFPE Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) isoliert.
Die isolierte RNA der kryokonservierten und der FFPE-Proben wurde mit dem Synergy Multi Mode Reader, der Take3 Micro-Volume Plate und der Gen5™ Reader Control und Data Analysis Software (Biotek, Bad Friedrichshall, Deutschland) quantifiziert. Die Lagerung der RNA erfolgte bei -80°C bis zum weiteren Gebrauch.
3.5 Zellpellets
Für die Genexpressionsanalyse wurden von den Zellkulturen Zellpellets angefertigt. Dafür wurden die Zellen zuerst enzymatisch aus den Zellkulturflaschen abgelöst (1ml TrypLE™
Express Enzyme no phenol red, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland), mit phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) gewaschen und in 15ml Polypropylen-Röhrchen überführt (CELLSTAR® Centrifuge Tubes, Polypropylene, Steril, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland). Anschließend wurden die Zellen mithilfe eines Zellometers (Cellometer Auto T4, Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA) gezählt, zentrifugiert (1000 rpm, 10 min) und in RNAse-freie
Material und Methoden
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Eppendorf-Röhrchen (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) überführt, welche bei -80°C gelagert wurden. Je nach Wachstum der Zellen wurden Pellets der Passage 0-3 (im Weiteren bezeichnet als P.0), Passage 5-10 (P.10), Passage 15-20 (P.20) und Passage 30 (P.30) untersucht. Von den Zellpellets wurden anschließend als Vorbereitung für die Genexpressionsanalyse mithilfe einer Lösung zur Zelllyse (Working Lysis Mixture, Affymetrix, Santa Clara, USA) Zelllysate vorbereitet, um eine finale einheitliche Konzentration von 400 Zellen/µl zu erreichen.
3.6 Multiplex Branched DNA Assay
Die Genexpression wurde mit dem QuantiGene 2.0 Plex Assay (Affymetrix, Santa Clara, USA) und dem Luminex100/200TM-System (Luminex Corporation, Austin, Texas, USA) analysiert. Für jedes Gen (BRCA1, BRCA2, ESR1, FOXO3, GATA4, GHR, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR, PRLR, PTEN, und TP53) und die Housekeeping-Gene Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase 1 (HPRT1) und Beta-actin (ACTB), welche als Referenzgene dienten, wurden von Affymetrix spezifische bead-basierte Oligonukleotid Probe Sets hergestellt. Das Assay wurde nach Herstellerangaben durchgeführt (Affymetrix, Santa Clara, USA). Die Proben wurden mit dem Luminex100/200TM-System (Luminex Corporation, Austin, Texas, USA) ausgelesen. Dabei ist das detektierte Signal (dargestellt als mittlere Fluoreszenz-Intensität, MFI) von jedem Bead proportional zu der Menge der Target-RNA in der Probe.
3.7 Housekeeping-Gene
Die Housekeeping-Gene (HKG) GAPDH, HPRT1 und ACTB wurden in der vorliegenden Arbeit genutzt, um die Genexpression der Targetgene zu normalisieren. Die Auswahl basierte auf für Studien beim Menschen empfohlenen Referenzgenen (DE KOK et al. 2005;
MAJIDZADEH et al. 2011; KILIC et al. 2014). Wie in anderen Studien bereits durchgeführt oder empfohlen (LYNG et al. 2008; YIM et al. 2010), wurde in der vorliegenden Arbeit der Mittelwert der HKG für die Normalisierung der Daten genutzt.
Material und Methoden
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17 3.8 Daten-Analyse und statistische Analyse
Die mediane Fluoreszenz wurde zuerst vom Hintergrund abgezogen und anschließend zum Mittelwert der Housekeeping-Gene (GAPDH, HPRT1 und ACTB) normalisiert. Nach Herstellerangaben wurden Proben, welche Signale unterhalb der Nachweisgrenze (Hintergrund plus 3 mal Standardabweichung des Hintergrunds) aufwiesen, von der Analyse ausgeschlossen.
Die statistische Auswertung wurde mithilfe des SAS Enterprise Guide 7.1 (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA) durchgeführt. Für die Analyse der Hormonrezeptor- Genexpression wurden die Daten auf Normalverteilung getestet. Da keine Normalverteilung vorlag, wurde der Mann-Whitney-U-Test für den Vergleich der Genexpression in den verschieden gelagerten Proben und in den verschiedenen Diagnosegruppen durchgeführt. Der Vergleich der Genexpression zwischen Originalgewebe und den Passagen der kultivierten Zellen erfolgte mittels t-Test für gepaarte Proben. Die Genexpression in den kultivierten Zellen wurde als „niedrig“ bezeichnet, wenn die normalisierten Expressions-Level unterhalb von 0,1 lagen.
Ergebnisse
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18 4. Ergebnisse
4.1 Studie 1
Das folgende Manuskript wurde in dem Journal „PLoS ONE“ am 20.09.2016 publiziert (doi:10.1371/journal.pone.0163311).
Hormone Receptor Expression Analyses in Neoplastic and Non-neoplastic Canine Mammary Tissue by a Bead Based Multiplex Branched DNA Assay: A Gene Expression Study in Fresh Frozen and Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Samples
Annika Mohr1,2, Florenza Lüder Ripoli1,2, Susanne Conradine Hammer1,2, Saskia
Willenbrock1, Marion Hewicker-Trautwein3 , Zdzisław Kiełbowicz4, Hugo Murua Escobar1,2, Ingo Nolte1*
1: Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany
2: Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, Rostock, Germany
3: Institute of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany
4: Department and Clinic of Veterinary Surgery, Faculty of Veterinary Medicine, Wroclaw University of Environmental and Life Sciences, Wrocław, Poland
* Corresponding author
E-mail: ingo.nolte@tiho-hannover.de
Abstract
Immunohistochemistry (IHC) is currently considered the method of choice for steroid hormone receptor status evaluation in human breast cancer and, therefore, it is commonly utilized for assessing canine mammary tumors. In case of low hormone receptor expression,
Ergebnisse
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IHC is limited and thus is complemented by molecular analyses. In the present study, a multiplex bDNA assay was evaluated as a method for hormone receptor gene expression detection in canine mammary tissues. Estrogen receptor (ESR1), progesterone receptor (PGR), prolactin receptor (PRLR) and growth hormone receptor (GHR) gene expressions were evaluated in neoplastic and non-neoplastic canine mammary tissues. A set of 119 fresh frozen and 180 formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) was comparatively analyzed and used for assay evaluation. Furthermore, a possible association between the hormone receptor expression in different histological subtypes of canine malignant mammary tumors and the castration status, breed and invasive growth of the tumor were analyzed. The multiplex bDNA assay proved to be more sensitive for fresh frozen specimens. Hormone receptor expression found was significantly decreased in malignant mammary tumors in comparison to non- neoplastic tissue and benign mammary tumors. Among the histological subtypes the lowest gene expression levels of ESR1, PGR and PRLR were found in solid, anaplastic and ductal carcinomas. In summary, the evaluation showed that the measurement of hormone receptors with the multiplex bDNA assay represents a practicable method for obtaining detailed quantitative information about gene expression in canine mammary tissue for future studies.
Still, comparison with IHC or quantitative real-time PCR is needed for further validation of the present method.
Ergebnisse
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20 4.2 Studie 2
Das folgende Manuskript wurde bei dem Journal „BMC Cancer“ am 17.08.2016 zur Publikation eingereicht.
Longitudinal analysis of 20 tumor-associated genes in non-neoplastic and neoplastic canine mammary tissues and their corresponding cultivated cells
A. Mohr1,2, S. C. Hammer1,2, F. L. Ripoli1,2,S. Willenbrock1, M. Hewicker-Trautwein3, B.
Brenig4, H. Murua Escobar1,2, I. Nolte1*
1: Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30559 Hannover, Germany; annika.mohr@tiho-hannover.de (AM);
susanne.conradine.hammer@tiho-hannover.de (SCH); florenza@ripoli.com.br (FLR);
willenbrock@preclinics.com (SW); hugo.murua.escobar@med.uni-rostock.de (HME);
ingo.nolte@tiho-hannover.de (IN)
2: Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, D-18057 Rostock, Germany
3: Institute of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30559 Hannover, Germany; marion.hewicker-trautwein@tiho-hannover.de (MHT)
4: Institute of Veterinary Medicine, Georg-August-University Göttingen, D-37077 Göttingen, Germany; bbrenig@gwdg.de (B.B.)
* Corresponding author: I. Nolte (ingo.nolte@tiho-hannover.de) Abstract
Background: Cell lines are widely used as in vitro models to identify potential therapeutic targets and several canine mammary cell lines have been established in the last years. As long term cell cultivation leads to genetic alterations, clonal selection could reduce the identity of stable cell lines to original tissues. Therefore, the usage of primary cultures and early passages bears significant potential as these are considered to closely resemble the biological behavior in original samples. Referring to promising targets for human breast cancer, several genes were already investigated in canine mammary tumors. However, the gene expression in cultivated cells of canine mammary neoplastic and non-neoplastic origin in comparison to the
Ergebnisse
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original tissue has not previously been evaluated. Modulations of key pathways resulting from cultivation conditions reduce the value of in vitro systems. Thus, the expression stability among cultivation periods is the key to defining the actual value of cell lines.
Methods: Therefore, in the present study, gene expression of 20 tumor-associated genes (BRCA1, BRCA2, ESR1, FOXO3, GATA4, GHR, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR, PRLR, PTEN, and TP53) analysis was performed using a multiplex branched DNA assay (QuantiGene Plex Assay) in six non- neoplastic, ten neoplastic mammary tissues and thereof isolated cultivated cells (until passage 30). Differences in gene expression between cultivated cells and corresponding original tissue were analyzed using the t-test for paired samples. Thereby, stable primary cultures or cell lines derived from canine mammary tumors suitable for the development of novel treatment options should be identified.
Results: HMGA1, HMGB1, MYC and PTEN were the genes which showed stable expression levels and no significant differences between cultured cells and the original neoplastic tissue.
HMGB1 and PTEN exhibited high and stable expression levels (>0.1) in all neoplastic primary cultures or cell lines. Regarding HMGA1, solely one of ten and for MYC three of ten neoplastic primary cultures or cell lines showed high and stable expression levels.
Conclusion: The identified cell cultures could serve for future studies analyzing the value of targeted therapeutic approaches for canine mammary tumors.
Keywords: canine mammary tumors; cell lines; primary cultures; gene expression Background
The usage of research cell lines is an important tool to identify and evaluate potential therapeutic targets [1, 2]. In the dog, several mammary cell lines have been established in the last years, enclosing benign mammary tumors [3] as well as mammary carcinomas [4-7] to initiate studies about the pathobiology of canine mammary tumors and to evaluate adjuvant medical treatment options. The advantages of established cell lines are easy handling and the possibility of replacing these from frozen stocks [1]. Therefore, in principal, they represent an infinite source for studying potential initiation or progression factors within a stable system [2]. However, long term cultivation leads to genetic alteration in cultured cells [1] possibly
Ergebnisse
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due to shorter population-doubling times and consequently the higher frequency of mutational changes in comparison to the original corresponding tissue [8]. Thus, cell lines might lose the clinical starting situation leading to the necessity for viable alternatives, such as the usage of primary cultures [9]. Although the majority of primary cultures have a limited lifespan [10], their advantage is the close resemblance to the primary tumor’s biological behavior when compared to established cell lines [11]. Furthermore, primary cultures can be generated from individual patients to analyze patient-specific differences characterizing tumor behavior and potentially predict responsiveness [12].
Referring to promising targets for human breast cancer, several genes were already investigated in canine mammary tumors, such as hormone receptors [13], BRCA1 and BRCA2 [14], TP53 [15]; PTEN [16-18]; PFDN5 [17, 19]; MYC [18] and HER2 [20]. However, their expression in primary cultures or cell lines of canine mammary neoplastic and non-neoplastic origin in comparison to the original tissue has not been evaluated yet.
Therefore, the aim of the present study was to analyze the expression of 20 tumor-associated genes (BRCA1, BRCA2, ESR1, FOXO3, GATA4, GHR, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR, PRLR, PTEN, and TP53) in non- neoplastic and neoplastic canine mammary tissue and thereof isolated cultivated cells using a multiplex branched DNA (bDNA) assay. The combination of bDNA assay and xMAP® Luminex® magnetic beads enables amplification-free and quantitative determination of up to 100 genes from one sample [21]. Herein, the assay was applied to detect possible similarities or changes between the corresponding original tissue and the cultivated cells, as well as to determine the expression levels of the analyzed targets in cultivated cells. Thereby, primary cultures or cell lines derived from canine mammary tumors which mirror the original tissue and exhibit a stable expression of target genes should be identified which could be suitable for the development of novel treatment options.
Methods
Sample population
Samples were taken from 10 canine mammary tumors (CMT) and 6 non-neoplastic mammary tissues (CNT) that were aseptically obtained from dogs during routine surgery at the Clinic
Ergebnisse
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for Small Animals, Institute of Veterinary Medicine, Georg-August-University of Goettingen (n=11), at the Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation (n=2) and the veterinary practice of Dr. M. Schilling, Bielefeld, Germany (n=3). The samples were maintained in Hank’s balanced salt solution (Biochrom GmbH, Berlin, Germany).
Diagnosis was confirmed by histopathological evaluation according to Goldschmidt [22]
(Tables 1 and 2). Of 10 samples, small parts were snap frozen using liquid nitrogen and archived for long-term storage at -80 °C until further usage.
Table 1: Reached passage (P.) of the primary cultures and information about their origin
Original tissue
P.0 P.10 P.20 P.30 Diagnosis Age at diagnosis
Breed Castration status Non-neoplastic: n=3
CNT1 (DT14/05
S2)
x x x
normal mammary
tissue 11
Poodle
intact
CNT4 (DT14/07 R)
x x
normal mammary
tissue 10
German wirehaired
pointer intact
CNT6 (DT14/08R)
x x x lobular
hyperplasia 8 Borzoi intact
Canine mammary tumors: malignant n=2
CMT8 (DT14/07T)
x x x x
(P.16)
simple tubular
carcinoma 10
German wirehaired
pointer intact
CMT9 (DT14/09T)
x x x
invasive simple tubular
carcinoma 12
Crossbreed
neutered
Ergebnisse
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Table 2: Reached passage (P.) of the cell lines and information about their origin
Original tissue
P.0 P.10 P.20 P.30 Diagnosis Age at diagnosis
Breed Castration
status Non-neoplastic: n=3
CNT2 (DT14/05R)
x x x x
normal mammary
tissue 11
Poodle
intact
CNT3
(DT14/06 R) x x x x x
normal mammary
tissue 6 Rhodesian
Ridgeback intact
CNT5
(T124) x x x x lobular
hyperplasia 9
Cocker
Spaniel intact
Canine mammary tumors: benign n=4;
malignant n=4
CMT1 (DT14/04 T)
x x x x x
simple
adenoma 6
Jack Russell
Terrier intact
CMT2 (DT14/10T)
x x x x
benign
mixed tumor 7
Crossbreed
neutered
CMT3 (DT15/02T)
x x x x
benign
mixed tumor 10
Golden
Retriever intact
CMT4 (T121)
x x x complex
adenoma 11 Cocker
Spaniel intact
CMT5 (T126)
x x x x
carcinoma arising in a benign tumor
9
Russian
Terrier intact
CMT6 (DT14/06 T)
x x x x x
carcinoma
complex type 6 Rhodesian
Ridgeback intact
CMT7 (DT14/06
Ts)
x x x x x
carcinoma
complex type 6 Rhodesian
Ridgeback intact
CMT10 (T120A)
x x x
carcinoma complex type
8
Crossbreed
intact
Ergebnisse
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25 Cell culture
Samples were disaggregated, using a combination of mechanical disruption and short-term enzymatic treatment with 4 mL of 0.26 % collagenase (200 U/mL, Collagenase NB 8 Broad Range, SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) maintained in a humidified incubator (5 % CO2 at 37 °C) until tissue dissociation. Cells were then washed using Medium 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) and centrifuged (1000 rpm, 10 min, at room temperature; Universal 230R centrifuge, Hettich, Lauenau, Germany). Cells were cultivated in 25 cm2 culture flasks (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) in Medium 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) supplemented with 20% fetal calf serum (Biochrom GmbH, Berlin, Germany), 2 % penicillin/streptomycin (10.000 U/mL / 10.000 µg/mL, Biochrom GmbH) and incubated at 37 °C, 98 % relative humidity and 5 % CO2. When confluence was attained, the cells were subcultured after enzymatic dissociation (1 mL TrypLE™ Express Enzyme no phenol red, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany). Depending on the growth of the cells, cultivated cells that reached passage 20 (P.20) and above were further referred to as “cell lines”, whereas cultivated cells below P.20 were referred to as “primary “cultures”, respectively.
Cell pellets
Of the cultivated cells, pellets of passages 0-3 (P.0), passages 5-10 (P.10), passages 15-20 (P.20) and passage 30 (P.30) were prepared if possible depending on the growth of the cells (Tables 1 and 2). Cells were enzymatically dissociated (1 mL TrypLE™ Express Enzyme), washed with 5 mL of phosphate buffered saline (Biochrom GmbH, Berlin, Germany) and transferred to 15 mL polypropylene tubes (CELLSTAR® Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany). Afterwards, they were counted using a Cellometer (Cellometer Auto T4, Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA), centrifuged (1000 rpm, 10 min), transferred to RNAse free Eppendorf Cups (Eppendorf, Hamburg, Germany) and stored at -80°C until further usage.
Sample preparation
Cell lysates were prepared using a Working Lysis Mixture (supplied by the QuantiGene 2.0 Plex Assay from Affymetrix, Santa Clara, USA) following manufacturer’s instructions to
Ergebnisse
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determine a final concentration of 400 cells/µL. Tissue samples were homogenized with 5 mm stainless steel beads using the TissueLyser II (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). The RNA was isolated with the RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) with an additional step of digestion using the RNase-free DNase Set (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) according to the manufacturer’s protocol. Additionally, genomic DNA was digested using RQ1 RNase-free DNAse (Promega GmbH, Mannheim Germany). Total RNA was quantified using Synergy multi-mode reader utilizing the Gen5™ Reader Control, the Take3 Micro-Volume Plates and Data Analysis Software (Biotek, Bad Friedrichshall, Germany) and stored at -80 °C until further usage.
Analysis and statistical analysis
The gene expression was determined using the QuantiGene 2.0 Plex Assay (Affymetrix). For each gene (BRCA1, BRCA2, ESR1, FOXO3, GATA4, GHR, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR, PRLR, PTEN, and TP53) specific bead-based oligonucleotide probe sets were custom designed by Affymetrix. The genes and their respective accession numbers are shown in Table 3. The assay was performed according to the manufacturer’s protocol. The samples were analyzed using a Luminex®
100/200™ System (Luminex Corporation, Austin, Texas, USA). The signal (expressed as mean fluorescence intensity, MFI) of each bead is proportional to the amount of target RNA in the sample. The RNA levels of the housekeeping genes Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase 1 (HPRT1) and Beta- actin (ACTB) were measured to normalize the RNA levels of the target genes. Gene expression was defined as “low” if the normalized expression levels were lower than 0.1.
Following manufacturer’s instructions, samples below the limit of detection (background plus 3 standard deviations of the background) had to be excluded from the analysis.
Statistical analysis was performed using the SAS Enterprise Guide 7.1 (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA). Differences between gene expression of original tissue samples and cultivated cells at different passages were determined by using the t-test for paired samples.
Ergebnisse
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Table 3: List of genes and Accession Numbers used for the QuantiGene Plex Assay
Symbol Accession Number
Analyzed genes
BRCA1 NM_001013416 BRCA2 NM_001006653 ESR1 NM_001286958 FOXO3 XM_003639400 GATA4 NM_001048112
GHR NM_001003123
HER2 NM_001003217 HMGA1 NM_001003387 HMGA2 XM_005625590 HMGB1 NM_001002937 MAPK1 NM_001110800 MAPK3 NM_001252035 MCL1 NM_001003016
MYC NM_001003246
PFDN5 NM_001251949
PGR NM_001003074
PIK3CA XM_545208
PRLR XM_536502
PTEN NM_001003192 TP53 NM_001003210 Housekeeping genes
ACTB XM_536888
GAPDH NM_001003142 HPRT1 NM_001003357
