Isolierung und Kristallisation von α1-Foetoprotein aus einem primären Leberzellcarcinom

F.-G. Lehmann u. D. Lehmann: Isolierung und Kristallisation von o^-Foetoprotein 309 Z. klin. Chem. u. klin. Biochem.

9. Jg., S. 309—313, Juli 1971

Isolierung und Kristallisation

von o^-Foetoprotein aus einem primären Leberfcellcarcinom

)

II. Mitteilung

Von F.-G. LEHMANN und DOROTHEE LEHMANN

Medizinische Universitätsklinik (Direktor: Prof. Dr. G. A. Martini) Marbnrg\Labn

(Eingegangen am 10. Februar 1971)

Die Reindarstellung und Kristallisation von <xrFoetoprotein gelingt aus hepato2ellulären Karzinomen durch Hitzefällung, Calcium- phosphatgelabsorption, fraktionierte Ammoniumsulfatpräzipitation, Anionenaustauscherchromatographie, Gelfiltration und fraktionierte Immunabsorption mit IgG-Präparationen gegen Verunreinigungen, die in den ersten kristallinen Präparaten enthalten sind. Aus 1000 g Tumorgewebe werden 57,1 mg Reinsubstanz bei einer Ausbeute von 8,8% isoliert. Das reine a1-Foetoproteinpräparat zeigt in der Poly- acrylamidgelelektrophorese und immunologisch mit monospezifischen Plasmaantiseren und Hyperimmunseren gegen Hepatomplasma, Hepatomextrakt, verschiedene Foetoproteinpräparate, foetale Leber und normale Leber als einzige Verunreinigung Gc-Globulin in einer Konzentration unter 1%; völlige Reinheit kann durch weitere Immunabsorption erzielt werden.

Oi^-Foetoprotein: 77, Isolation and crystallisation from a primary liver cell carcinoma

ocj-Foetoprotein was isolated and crystallized from primary liver cell carcinoma by heat precipitation, calcium phosphate gel absorption, fractionated ammonium sulfate precipitation, anion exchange chromatography on DEAE-A 50-Sephadex, gel filtration on Sephadex G 100 and unspecific stepwise immune-absorption with IgG-preparations to the impurities of the first crystalline o^-Foetoprotein-pre- paration. 57.1 mg pure foetoprotein was obtained from 1000 g tumor with a yield of 8.8%.

In polyacrylamide gel electrophoresis and in immunological studies with 24 monospecific antisera to human plasma proteins and hyper- immune sera to normal plasma, hepatoma plasma, hepatoma crude extract, foetal and normal liver and different crystalline and pure

«j-Foetoproteins, the pure foetoprotein preparation shows only Gc-Globuline as impurity in a concentration lower than 1%. Complete purity is achieved by further immune-absorption with Aati-Gc-Globulin-IgG.

Tumorantigene haben in den letzten Jahren zunehmend Bedeutung in Untersuchungen zur Karzinogenese und Tumorimmunologie gewonnen (Übersichten bei l, 2).

Eine biochemische, immunologische oder biologische Charakterisierung menschlicher Tumorantigene setzt jedoch die Reindarstellung dieser Substanzen voraus.

Foetoproteine sind als Tumorantigene besonders inter- essant, da sie nicht nur in maligne degenerierten Geweben, sondern auch in normaler foetaler mensch- licher Leber synthetisiert werden können. Die Auf- klärung der Ursache der Neosynthese dieser Foeto- proteine in Karzinomen könnte wesentliche Erkennt- nisse über maligne Tumoren vermitteln. Wir haben kürzlich über die Isolierung und Kristallisation eines menschlichen Tumorantigens, des a

-Foetoproteins, aus dem Plasma eines Patienten mit primärem Leber- zellkarzinom berichtet (3). Im folgenden wird die Reindarstellung und Kristallisation von a^-Foeto protein aus dem Tumorgewebe im quantitativ-bio- chemischen Verfahren beschrieben.

Material und Methoden

Wir bezogen komplettes Freundsches Adjuvans von Biological Laboratories, Baltimore, Agar-Noble von Difco, Detroit, Agarose

J) Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Le 205/4).

von Behring, Marburg, DEAE A 50-Sephadex und Sephadex G-100 von Pharmacia, Uppsala und DEAE-Cellulose, Typ S-S 50, von Serva Heidelberg. Die Chemikalien stammten von Merck, Darmstadt.

Anti-Humanserum vom Kaninchen, Anti-Kaninchen-Serum vom Esel, Anti-Kaninchen-y-Globulin von der Ziege, sowie 24 mono- spezifische Antiseren gegen Humanplasmaproteine bezogen wir von Behring, Marburg; Anti-Kaninchen-yA-Globulin, Anti-Ka- ninchen-yG-Globulin und Anti-Kaninchen-yM-Globulin stamm- ten von Miles-Seravac, Lausanne.

Monospezifisches Anti-c^-Foetoprotein vom Kaninchen (Charge 1818) wurde von Herrn Dr. S. BAUDNER (Behringwerke Mar- burg/L) präpariert und uns liebenswürdigerweise zur Verfügung gestellt (3).

Weitere Antiseren erhielten wir durch Immunisierung nach dem in 1. c. (3) angegebenen Schema sowohl mit kristallinem otj-Foeto- protein aus dem Plasma unseres Patienten mit primärem Leber- zellkarzinom als auch mit kristallinem o^-Foetoprotein aus dem Tumprgewebe, über dessen Reindarstellung im folgenden be- richtet wird. Anti-Hepatomplasma-Serum und Anti-Heptatom- Serum gewannen wir durch Immunisierung von Kaninchen mit Plasma oder Tumorextrakt des Patienten.

Anti-„Humanalbumin"-IgG stellten wir aus eigenen Antiseren gegen Humanalbumin „reinst" der Firma Behring, Marburg, durch Fällung mit Ammoniumsulfat und Chromatographie über DEAE-Cellulose her; das gewonnene IgG-Präparat war poly- valent und enthielt Antikörper gegen mindestens 12 Plasma- proteine vom Präalbumin- bis zum 0-Globulin-Bereich (3).

Anti-„«2-Antithrombin"-IgG wurde ebenfalls durch Fällung mit Ammoniumsulfat und Chromatographie über DEAE-Cellulose aus einem Antiserum gegen stark angereichertes iv²-Antithrombin der Fa. Behring (Charge 1763) hergestellt. Diese IgG-Fraktion war ebenfalls unspezifisch und zeigte Antikörper gegen min- destens 10 Proteine des <xrbis /?-Globulinbereiches.

Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 9. Jahrg. 1971 / Heft 4 ₄₁

310

Methoden

Eiweiß wurde mit dem Biuretreagenz nach BEISENHERZ (4) ge- messen; in hämoglobinhaltigen Extrakten wurde die Modifi- kation von BODE, GOEBELL und STÄHLER (5) angewandt. Die Ammoniumsulfatmolarität der Proteinlösungen w'urde während der Aufarbeitung durch Messung mit NESSLERS Reagenz nach BEISENHERZ (4) kontrolliert. ccrFoetoprotein wurde quantitativ durch radiale Immundiffusion nach MANCINI (6), wie in 1. c. (3) angegeben, bestimmt. Calciumphosphatgel wurde nach den An- gaben von KEILIN und HARTREE (7) hergestellt. Die Doppel- diffusion erfolgte nach OÜCHTERLONY (8), die Immunelektro- phorese nach GRABAR und WILLIAMS (9) in der Mikromodi- fikation von SCHEIDEGGER (10) und die zweidimensionale im- munelektrophoretische Analyse nach LAURELL (11) mit den Modifikationen von CLARKE und FREEMAN (12) und PFLEIDERER, LINKE und REINHARDT (13). Die Polyacrylamidgelelektrophorese wurde als Flachdiskelektrophorese, System Desaga, Heidelberg, mit dem PufTersystem nach ALLEN (persönliche Mitteilung) der Fa. Ortec, Oak Ridge/Tenn., nach ALLEN, MOORE und DILWORTH (14) von Herrn Dr. R. QUAST (Hygiene-Institut der Universität Marburg) in 4proz., 6proz. und Sproz. Polyacrylamidgel durch- geführt. Die Färbung erfolgte mit 0,25proz. Coomassie-Brillant- Blau (Serva, Heidelberg), die Auswertung mit dem Vitatron UFD-Densitometer.

Isolierung von o^-Foetoprotein

Alle Reinigungsschritte wurden bei 4° in der Kühlzelle mit 0,2M S0rensenpuffer, der l rmr EDTA enthielt, pH 7,5, durchgeführt, soweit keine anderen Angaben gemacht werden.

Rohextrakt

Die 3150 g schwere Leber eines 49jährigen Patienten (Ja. Fr.) mit histologisch gesichertem primären Leberzellkarzinom auf dem Boden einer kleinknotigen Leberzirrhose wurde 48 Stdn.

post exitum durch Autopsie gewonnen. Das Tumorgewebe wurde makroskopisch von gesundem Lebergewebe freipräpariert (Tu- morgewicht 2130 g) und bis zur Aufarbeitung bei —20° einge- froren. Das Rohhomogenat wurde nach dem Auftauen durch Extraktion von 1000 g Tumorgewebe in dem dreifachen Volumen demineral. Wasser im Starmix (l g Tumorgewebe in 3 ml H2O) und Abzentrifugieren bei 3000 g gewonnen.

7. Reinignngsschritt·. Hit%efällung

Der Rohextrakt wurde 10 Min. auf 50° erhitzt, danach im Eisbad gekühlt und bei 3000 £ abzentrifugiert.

2. Reinignngsschritt: Calcinmphospbatgelabsorption

In den Überstand wurden 30 mg Calciumphosphatgel (bezogen auf Trockengewicht) nach KEILIN und HARTREE pro ml Protein- lösung über 30 Min. bei 4° eingerührt; o^-Foetoprotein wurde an das Gel gebunden; das Gel wurde bei 3000£ abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Durch einmalige Zugabe des zwei- fachen Volumens 0,5M S0rensenpuffer mit l EDTA, pH 7,5, (zwei Teile Puffer auf einen Teil Gel) wurde o^-Foetoprotein nach Homogenisierung über 5 Min. im Starmix durch die Phos- phationen aus der Bindung an das Gel verdrängt; Gel und (x.L- Foetoprotein enthaltender Überstand wurden bei 3000 £ ge- trennt.

3. Reinigung!schritt: Fraktionierte AmMoninmsidfatfällung

Dieser Überstand des 3000 ^-Zentrifugates wurde durch Zugabe festen Ammoniumsulfates bis 40% gesättigt und über Nacht ge- rührt; nach Sedimentierung des Niederschlages bei 12000£ wurde der Überstand bis 70% mit (NH4)2SO4 gesättigt, 4 Stdn. gerührt und erneut bei 12000 £ abzentrifugiert. Das Sediment wurde in einem kleinen Volumen Puffer aufgenommen und 48 Stdn. bei ständigem Pufferwechsel gegen , S0rensenpuffer mit 50 EDTA, pH 7,5, dialysiert.

4. Reinignngsschritt: Anionenanstanscherchromatographie

Nach Entfernung denaturierten Proteins bei 12000 £ wurde das Dialysat auf eine mit , S0rensenpuffer mit 50 * EDTA,

6 9Eluat ((]

Abb. l

4. Reinigungsschritt: Chromatographie an einer DEAE-A50-Se- phadexsäule (07,2cm, h = * 5 Ö c m ; V = 1630 ml). Nachweis des a^Foetoprotein im Mikroouchterlonytest. per schraffierte Bereich

des Eluates wurde bei der Aufarbeitung vereinigt -, Protein NaCl

pH 7,5, äquilibrierte PEAE-A50-Sephadex-Säule aufgetragen.

Die Säule wurde zunächst mit dem Äquilibrierungspuffer aus- gewaschen. Die an DEAE-Sephadex gebundenen Proteine wurden sodann mit einem linearen flachen NaCl-Gradienten eluiert (Mischgefäß: 10 l , S0rensenpuffer mit 50 /JM EDTA, pH 7,5;

Gradientengefäß 10 l Puffer wie im Mischgefäß, der 0,5M NaCl enthielt). o^-Foetoprotein wurde durch Aus testen der einzelnen Fraktionen im Mikro-OucHTERLONY^Test gegen monospezi- fisches Antiserum im letzten Proteingipfel zusammen mit dimerem Albumin gefunden (Abb. 1). Die oc^Foetoprotein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, durch Zugabe festen (NH4)2SO4

bis 70% Sättigung ausgefällt, bei 30000 £ abzentrifugiert und in einem kleinen Volumen Puffer aufgenommen.

5. Reinignngsschritt: Gelfiltration

Die Proteinlösung wurde auf eine mit 0,2M S0rensenpuffer mit l mM EDTA, pH 7,5, äquilibrierte Sephadex-G 100-Säule auf- getragen und mit dem Äquilibrierungspuffer eluiert. o^-Foeto- protein erschien im zweiten Proteingipfel (Abb. 2). Die ent- sprechenden Fraktionen wurden wiederum vereinigt und < - Foetoprotein durch langsame Zugabe festen Ammoniumsulfates bei pH 7,35 bei etwa 60% Sättigung auskristallisiert. Das Roh kristallisat wurde durch weitere Zugabe von Ammoniumsulfat bis 70% Sättigung, Zentrifugation bei 30000 g und Aufnahme in Puffer konzentriert und gegen Puffer wie oben angegeben dialysiert.

Eluat [ml]

Abb. 2

5. Reinigungsschritt: Gelfiltration an einer Sephadex-G 100-Säule (07,2cm, h -80 cm) Elution mit 0,2M Sorensenpuffer pH 7,5.

Kritisch für das Auflösungsvermögen ist der Auftrag eines kleinen Volumens (unter 30 ml Proteinlösung). Der schraffierte Bereich zeigte m Mikroouchterlonytest gegen Anti^-Foetoproteinserum «i-Foeto- protein an; bei der Aufarbeitung wurden diese Fraktionen des Eluates

vereinigt

Z. klin. Chem. u. klin. Bioc^em. / 9. Jahrg. 1971 / Heft 4

F.-G. Lehmann u. D. Lchmann: Isolierung und Kristallisation von cxj-Foetoprotein 311 6. Reinigungsscbritt: 1. Immunabsorption

Die Entfernung der in der ersten kristallinen Präparation ent- haltenen Verunreinigungen erfolgte durch zwei aufeinander- folgende unspe2ifischc Immunabsorptiönen. Das Prinzip besteht in der stufenweisen Absorption der Verunreinigung durch spe- zifische IgG-Antikörper. Die überschüssigen oder unspezifischen IgG-Globuline werden anschließend durch fraktionierte Am- moniumsulfatfällungen bis 40%, 45% und 50% aus der Protein- lösung entfernt; (Xj-Foetoprotein präzipitiert in unserem Puffer- system bei pH 7,5 auf dieser Reinigungsstufe erst zwischen 55 und 65% Sättigung. Die Antigen-Antikörper-Komplexe und die Ammoniumsulfatpräzipitate werden jeweils mit Puffer bzw. mit Puffer, der 40%, 45% oder 50% (NH^SO, enthält, gewaschen, um mitgerissenes o^-Foetoprotein zurückzugewinnen. Die tech- nischen Einzelheiten sind in 1. c. (3) angegeben. Die erste Immun- absorption wurde mit Anti-„Humanalbumin"-IgG im Aquivalenz- bereich zwischen Albumin und Anti-Albumin-IgG durchgeführt (Abb. 3b). Das Präparat enthielt vorwiegend Antikörper gegen Albumin und weiterhin Antikörper gegen 12 Proteine des «,-/?- Globulinbereiches. Das Ergebnis dieser Absorption ist aus Ab- bildung 3b, Abbildung 4 und Tabelle 2 ersichtlich. Das 91% reine (Xi-Foetoproteinpräparat kristallisierte erneut bei 60% (NH4)2SO4- Sättigung bei pH 7,4; die Kristalle wurden bei 36000 £ ab- zentrifugiert, in Puffer aufgenommen und (NH4)2SO4-frei dialysiert.

7. Rrinigimgsschritt: 2. Immunabsorption

Die zweite Immunabsorption wurde nach demselben Prinzip mit Anti-„a'2-Antithrombin"-IgG durchgeführt. Dieses Präparat, das durch Immunisierung mit angereichertem <x2-Antithrombin £e~ wonnen worden war, enthielt als „Verunreinigung" Antikörper gegen mehr als 10 Proteine im c^-, <x2- ™\& ß-Globulinbereich.

Darunter waren auch Antikörper gegen die vier noch in unserem Präparat nachgewiesenen Verunreinigungen (Gc-Globulin, Coeru- loplasmin, o^-B-Glycoprotein und ein unbekanntes Protein mit

der elektrophoretischen Wandcrungsgcschwindigkeit von Gc- Globulin l—l, siehe Tab. 2), wovon Gc-Globulin und Coerulo- plasmin auch immunelektrophoretisch nachgewiesen werden konnten (Abb. 3a). Nach Entfernung überschüssiger bzw. un- spezifischer IgG-Immunglobuline durch fraktionierte Ammonium-

T

Abb. 3

6. und 7. Reinigungsschritt: Unspezifische Immunabsorption. Oben:

Abb. 3a: Immunelektrophorese gegen unabsorbiertes a2-Antithrom- bin-IgG, oberes Loch: arFoetoprotein nach 6 Reinigungsschritten (zweite Kristalle), unteres Loch: «i-Foetoprotein nach 7 Reinigungs- schritten (dritte Kristalle); das immunelektrophoretisch nachweis- bare Gc-Globulin und Coeruloplasmin ist nach der Absorption ver- schwunden; ,-B-Glykoprotein und „Gc-X-Globulin" sind vor der Immunabsorption nur im Makro-Ouchterlony entdeckbar. Unten (Abb. 3b): Immunelektrophorese gegen unabsorbiertes Anti-Human- albumin-IgG, oberes Loch: *i-Foetoprotein nach 5 Reinigungs- schritten (erste Kristalle), unteres Loch: arFoetoprotein nach 6

Reinigungsschritten (zweite Kristalle) Siehe auch Abb. 4 und Tab. 2

Abb. 4

Polyacrylamidgelelektrophorese-diagramme verschie- dener Aufarbeitungsschritte bei der Isolierung von

«t-Foetoprotein aus einem Hepatom. Zur Identifizie- rung der Verunreinigungen: siehe Tab. 2. In den zweiten Kristallen befinden sich etwa 7% Gc-Globulin, etwa l—2% Coeruloplasmin, unter 1% «r-B-Glyko- protein und unter l % „Gc-X-Globulin". In den dritten Kristallen beträgt die Verunreinigung an Gc- Globulin knapp 1%. arFoetoproteingehalt in den zweiten Kristallen 91 %, in den dritten Kristallen 99%

Rohextrakt nach Hitzeschritt nach Calciumphosphatgel

nach (NH;)2S04-Fällung nach DEAE-Sephadex nach Gelfittration I.Kristalle

nach 1. Immunabsorption

Z.Kristalle nach Z.Immunabsorption 3. Kristalle Wanderungsstrecke

Z. klin. Chem. u. Idin. Biochem./9. Jahrg. 1971/Heft4 _41*

312

Tumorextrakt Hitzeschritt Calciumphosphatgel

i* * / 40% Überstand Ammornumsulfat | 70o/0 Sediment Anionenaustauscherchromatographie Gelfiltration (Erste Kristalle)

1. Immunabsorption (Zweite Kristalle) 2. Immunabsorption (Dritte Kristalle)

ml ' 26102780

33703120 20055 38,623

3,2

mg Protein 61500 29900 15100 10500

8650333 15087,6

57,7

% 10048,6

17,124,5 14,10,54

0,140,24 0,09

mg ötj-Foetoprotein 650523 276312 200122 11179,9

10080,5 48,042,5 30,818,8 17,113,8 8,8

Sulfatfällungen wurden erneut bei 62% Sättigung weiße nadei- förmige Kristalle mit Seidenglanz erhalten, die gewaschen und in physiol. Natriumchloridlösung aufgenommen wurden.

Ergebnisse und Diskussion

Nach der Kristallisation und Reindarstellung von oc^- Foetoprotein aus menschlichem Plasma wird nun über die Kristallisation und Isolierung eines mensch- lichen Tumorantigens aus dem Tumorgewebe selbst berichtet. ö^-Foetoprotein kann nach unseren heutigen Kenntnissen im Erwachsenenalter als Tumorantigen betrachtet werden; bei normalgewichtigen Neuge- borenen ist dieses Protein nach 14 Tagen und bei Frühgeburten spätestens 4 Wochen post partum in biologischen Flüssigkeiten und Leberextrakten nicht mehr nachweisbar; die Neosynthese von oc-^Foeto- protein konnte bisher nur bei Teratoblastomen, pri- mären Leberzellkarzinomen und in seltenen Fällen auch in entdifferenzierten Magenkarzinomen nachgewiesen werden. Unsere Reinigung nach sieben Isolierungs- schritten ergibt ein 99% reines Produkt bei einer Aus- beute von 8,8% (siehe Tab. 1). Aus einem Kilogramm Tumorgewebe konnten 57,1 mg Reinsubstanz ge-

Tab. 2

Immunologisch nachweisbare Verunreinigungen in kristallinen ar Foetoproteinpräparaten aus Hepatomgewebe nach 6 bzw. 7 Reini- gungsschritten mit monospezifischen Plasmaproteinantiseren

(OucHTERLON -Test; Makro verfahren) Monospezifisches

Antiserum gegen

Albumin Präalbumin o^-Lipoprotein Saures «i-Glykoprotein o^-Antitrypsin

^-B-Glykoprotein Prothrombin

,-T-Glykoprotein G c - G l o b u l i n

„Gc-X-Globulin"*) Äj-Antichymotrypsin Inter-Ä-Trypsininhibitor Äo-Antithrombin Haptoglobin C o e r u l o p l a s m i n

«2-MakrogIobuIin

«²-HS-Glykoprotein Zn-«2-Glykoprotein CM-Esterase-Inhibitor Transferrin

Plasminogen 02-Glykoprotein j 02-Glykoprotein II /3,-Glykoprotein I I I

Klassifika- «j-Foetoprotein tions-Nr.

SCHULTZEnach u. HERE-

MANS (19) 2. Kristalle 3. Kristalle

.

0

10 02 0 11 012 0 13 +

Te 0

00 0 00 0 0 0 00 00 00 00

00 0

wonnen werden. Immunologisch konnte als einzige Verunreinigung Gc-Globulin mit 24 monospezifischen Antiseren gegen Humanplasmaproteine erkannt werden (Tab. 2). In der Polyacrylamidgelelektrophorese konnte ebenfalls nur eine einzige Verunreinigung, die weniger als 1% des Gesamtproteingehalts der Reinsubstanz ausmacht, gefunden werden. Diese Verunreinigung liegt an der Stelle des Gc-Globulins. Mit Hyperimmun- gegen den Tumorextrakt — das Ausgangs- seren

*) Unbekanntes Protein mit der elektrophoretischen Wanderungs- geschwindigkeit von Gc-Globulin I—l, welches nach völliger Ab- sorption mit Anti-Gc-Serum nachweisbar ist. Wir danken Herrn Dr. S. BAUDNER (Behringwerke, Marburg/L), der einen Teil der Untersuchungen liebenswürdigerweise durchgeführt hat.

material der Aufarbeitung — gegen das reine aus dem Tumorgewebe isolierte ^-Foetoprotein, gegen das Plasma des Patienten, gegen reines <x

Feotoprotein aus menschlichem Plasma, gegen normales menschliches Plasma, gegen foetalen Leberextrakt oder gegen einen Extrakt aus normaler Erwachsenleber konnten weitere Verunreinigungen nicht gefunden werden.

Die Ausbeute von etwa 10% läßt sich wesentlich ver- bessern, wenn der zweite Isolierungsschritt so abge- wandelt wird, daß oc

Foetöprotein nicht an das Cal- ciumphosphatgel gebunden wird. Dies kann dadurch erreicht werden, daß der Tumorrohextrakt nicht in deionisiertem Wasser, sondern in , Sorensenpuffer, der 50 EDTA enthält, bei einem pH von 7,5 ge- wonnen wird. Der relativ große Verlust bei der Elution des a^-Foetoproteins aus dem Gel kann so vermieden werden. Eine lOOproz. Reinheit unseres Präparates ist durch Absorption mit Anti-Gc-Globulin-IgG zu er- zielen. Im übrigen zeigt das Aufarbeitungsprotokoll, daß mit jedem Isolierungsschritt 50% der Fremdproteine entfernt werden; der kritische Schritt neben der An- ionenaustauscherchromatographie ist die Immunab- sorption mit Antikörpern gegen die im ersten und zweiten kristallinen Präparat noch enthaltenen Ver- unreinigungen. Unsere Ergebnisse zeigen, daß Im- niunpräzipitationen eine hochspezifische Anreicherung im quantitativ-biochemischen Maßstab ergeben; beim sorgfältigen Waschen aller Immunpräzipitate ist der Verlust an ö^-Foetoprotein bei diesem Schritt gering.

Eine weitere Vereinfachung ist durch Anwendung von unlöslichen Immunabsorbentien oder quervernetzten IgG-Präparationen, z. B. nach der Methode von AVRA- MEAS (15) zu erwarten, da diese leicht nach Bindung der Verunreinigungen durch einfache Zentrifugation ent- fernt werden können. Die von uns verwendeten un- spezifischen IgG-Globuline gegen Humanalbumin und a:

-Antithrombin können durch Anti-Humanplasma- IgG oder eine IgG-Präparation ersetzt werden, die durch Immunisierung mit dem Überstand einer 45%

Ammoniumsulfatfällung normalen menschlichen Plas-

Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 9. Jahrg. 1971 / Heft 4

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Die biochemische, immunologische und biologische Charakterisierung des reinen Glykoproteins, über die an anderer Stelle berichtet wird, kann möglicherweise erste Aufschlüsse über den Mechanismus der Neo- synthese von Foetoproteinen in maligne degenerierten Geweben bringen. Für die klinische Diagnostik ist

durch Standardisierung mit eingewogenen lyophili- sierten Präparaten eine vollquantitative Bestimmung von o^-Foetoprotein im Serum, Ascites, Tumorextrakten, usw. möglich; durch Gewinnung hochtitriger mono- spezifischer Antiseren ist darüber hinaus eine Ver- besserung der Diagnostik mit Ausschluß falschpositiver Ergebnisse durch unspezifische Präzipitationen möglich.

Wir danken Herrn Dr. S. BAUDNER, Behringwerke Marburg/Lahn, für die Überlassung von oc^-Foetoproteinserum und für die Hilfe bei der immunologischen Charakterisierung der Verunreinigungen in kristallinen cx¹-Foetoproteinpräparationen mit monospezi- fischen Humanplasma-Antiseren, Herrn Dr. R. QUAST (Hygiene- Institut der Universität Marburg, Direktor: Prof. Dr. R. SIEGERT) für die Durchführung der Polyacrylamidgelelektrophorese und Herrn Priv.-Doz. Dr. P. SCHMITZ-MOORMANN (Pathologisches Institut der Universität Marburg, Direktor: Prof. Dr. W. HORT) für die Durchführung der Autopsie und die histologischen Unter- suchungen.

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Dr. med. Frank-Günter Lehmann und Dorothee Lehmann Med. Univ. Klinik

355 Marburg/Lahn Mannkopffstr. 1

Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 9. Jahrg. 1971 / Heft 4