Aus der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und der
Abteilung für Neuroanatomie, Institut für Anatomie
des Universitätsklinikums Eppendorf
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Lektinhistochemische Untersuchungen am Hinterdarm des Haushuhnes unter besonderer Berücksichtigung ausgewählter immunrelevanter Darmbereiche
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med.vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Ilka Pohlmeyer aus Langenhagen
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. U. Neumann
Univ.-Prof. Dr. med. U. Schumacher
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. U. Neumann 2. Gutachter: PD Dr. Liebler-Tenorio
Tag der mündlichen Prüfung: 04.06.2002
Meiner Familie
Abkürzungsverzeichnis
I. Einleitung 13
II. Literaturübersicht
1. Überblick über die Gliederung des Literaturteiles 14 2. Histologie des Dünn- und Dickdarmes sowie der Bursa cloacalis
des Huhnes unter besonderer Berücksichtigung der Schleimhaut 15 2.1. Dünn- und Dickdarm 15 2.1.1 Grundstruktur 15 2.1.2. Tunica mucosa intestini 15 2.1.2.1. Epithel 15 2.1.2.2. Lamina propria mucosae 18 2.1.2.3. Lamina muscularis mucosae 19 2.1.3. Submucosa 19 2.1.4. Tunica muscularis 19 2.1.5. Tunica serosa mit Subserosa 20 2.1.6. Besonderheiten einzelner Darmabschnitte 20 2.2. Bursa cloacalis 22 2.2.1. Allgemeines 22 2.2.2. Tunica mucosa bursalis 22 2.2.3. Tunica muscularis bursalis 24 2.2.4. Tunica serosa bursalis 24 3. Lektine und Lektinhistochemie 25 3.1. Definition 25 3.2. Historisches 25 3.3. Struktur und Bindungstellen der Lektine 26 3.4. Einteilung der Lektine 28 3.5. Funktion von Lektinen in vivo 30 3.6. Lektinhistochemie 30 3.6.1. Allgemeines 30
3.6.2. Lektinhistochemische Untersuchungen am Hühnerdarm 32 4. Kohlenhydrathaltige Strukturen im Darm des Haushuhnes 34 4.1. Zuckerreste im Mucus 34 4.1.1. Allgemeines 34 4.1.2. Struktur der Glykoproteine 34 4.1.3. Bedeutung von Zuckerresten im Mucus für die Lektinhistochemie 37 4.2. Zuckerstrukturen der Zelle 37 4.2.1. Die Glycocalix 37 4.2.1.1. Allgemeines 37 4.2.1.2. Glykoproteine 37 4.2.1.3. Glykolipide 38 4.2.1.4. Proteoglykane und Glykosaminoglykane 38 4.2.2. Intrazelluläre Zuckerstrukturen 41 4.2.2.1. Glykosylierung im endoplasmatischen Retikulum 41 4.2.2.2. Glykolysierung im Golgi-Apparat 42 4.2.3. Bedeutung von Zuckerstrukturen der Zelle für die Lektinhistochemie 43 4.3. Zuckerstrukturen des Bindegewebes 43 4.3.1. Allgemeines 43 4.3.2. Proteoglykane und Glykosaminoglykane 44
4.3.3. Kollagene 44
4.3.4. Adhäsive Glykoproteine 44 4.3.5. Bedeutung von Zuckerstrukturen des Bindegewebes für die
Lektinhistochemie 45 5. Funktion und Bedeutung von Kohlenhydratresten auf der
epithelialen Oberfläche des Darms 46
5.1. Kohlenhydrate als Rezeptoren für Mikroorganismen 46 5.2. Kohlenhydrate als Zielstrukturen bei der oralen oder kloakalen
Vakzinierung 48
5.3. Kohlenhydrate im Rahmen der antiadhäsiven Therapie 49 6. Abschließende Betrachtung des Literaturteiles 50
1.2. Lektine 51
2. Methodik 53
2.1. Organentnahme und Fixierung 53 2.2. Dehydrierung und Paraffineinbettung 53 2.3. Anfertigung der Paraffinschnittte 55 2.4. Histologie (Hämalaun-Eosin-Färbung) 55 2.5. Lektinhistochemie 57 2.5.1. Vorbereitung der Präparate 57 2.5.2. Entparaffinierung und Rehydrierung 57 2.5.3. Trypsinbehandlung 59 2.5.4. Lektininkubation 59 2.5.5. Inkubation mit alkalischer Phosphatase 59 2.5.6. Entwicklung der alkalischen Phophatase mit chromogenem Substrat 60 2.5.7. Gegenfärbung, Eindeckung und Auswertung 60 2.6. Kontrollen 60 2.6.1. Überprüfung der Zuckerspezifität (Zuckerhemmung) 60 2.6.1.1. Überprüfung der Zuckerspezifität mit Gal, Glc, Man, GlcNAc
und GalNAc 60
2.6.1.2. Überprüfung der Zuckerspezifität mit Chitotriose 61 2.6.1.3. Überprüfung der Spezifität für Neuraminsäure 61 2.6.2. Negativ-Kontrolle 62
IV. Ergebnisse 63
1. Ergebnisse der histologischen Untersuchungen (HE-Färbung) 63 1.1. Proximales Jejunoileum 63 1.2. Dottersackstiel (Meckelsches Divertikel) 63 1.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 64 1.4. Bursa cloacalis 65 2. Lektinhistochemische Untersuchungen 65 2.1. Anfärbung mit Artocarpus-integrifolia-Agglutinin (AIA) 65
2.1.1. Proximales Jejunoileum 65 2.1.2. Dottersackstiel 70 2.1.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 70 2.1.4. Bursa cloacalis 70 2.2. Anfärbung mit Cheledonium-majus-Agglutinin II (CMA II) 72 2.2.1. Proximales Jejunoileum 72 2.2.2. Dottersackstiel 72 2.2.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 72 2.2.4. Bursa cloacalis 74 2.3. Anfärbung mit Concanavalin A (Con A) 74 2.3.1. Proximales Jejunoileum 74 2.3.2. Dottersackstiel 75 2.3.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 75 2.3.4. Bursa cloacalis 75 2.4. Anfärbung mit Conarva 77 2.4.1. Proximales Jejunoileum 77 2.4.2. Dottersackstiel 77 2.4.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 77 2.4.4. Bursa cloacalis 78 2.5. Anfärbung mit Datura-stramonium-Agglutinin (DSA) 78 2.5.1. Proximales Jejunoileum 78 2.5.2. Dottersackstiel 80 2.5.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 81 2.5.4. Bursa cloacalis 81 2.6. Anfärbung mit Lycopersicon-esculentum-Agglutinin (LEA) 83 2.6.1. Proximales Jejunoileum 83 2.6.2. Dottersackstiel 83 2.6.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 84 2.6.4. Bursa cloacalis 84 2.7. Anfärbung mit Maackia-amurensis-Agglutinin (MAA) 84 2.7.1. Proximales Jejunoileum 84 2.7.2. Dottersackstiel 87
2.8.1. Proximales Jejunoileum 89 2.8.2. Dottersackstiel 89 2.8.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 90 2.8.4. Bursa cloacalis 90 2.9. Anfärbungen mit Maclura-pomifera-Agglutinin (MPA) 90 2.9.1. Proximales Jejunoileum 90 2.9.2. Dottersackstiel 92 2.9.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 92 2.9.4. Bursa cloacalis 92 2.10. Anfärbung mit Sambucus-nigra-Agglutinin I (SNA I) 94 2.10.1. Proximales Jejunoileum 94 2.10.2. Dottersackstiel 94 2.10.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 94 2.10.4. Bursa cloacalis 95 2.11. Anfärbung mit Urtica-dioica-Agglutinin (UDA) 95 2.11.1. Proximales Jejunoileum 95 2.11.2. Dottersackstiel 95 2.11.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 95 2.11.4. Bursa cloacalis 96 2.12. Anfärbung mit Wisteria-floribunda-Agglutinin (WFA) 98 2.12.1. Proximales Jejunoileum 98 2.12.2. Dottersackstiel 98 2.12.3. Basales Caecum mit Tonsillae caecales 98 2.12.4. Bursa cloacalis 99 2.13. Anfärbung mit Triticum-vulgaris-Agglutinin (WGA) 99 2.13.1. Proximales Jejunoileum 99 2.13.2. Dottersackstiel 101 2.13.3. Basales Caecum einschließlich Tonsillae caecales 101 2.13.4. Bursa cloacalis 102
3. Ergebnis der Bindungskontrollen (Zuckerhemmung) 102
4. Negativkontrollen 105
V. Diskussion 106
1. Ziel der Arbeit 106
2. Kritik der Methodik 106
3. Diskussion der Ergebnisse 107
3.1. Diskussion der Ergebnisse der histologischen Untersuchungen 107 3.2. Lektinhistochemische Untersuchungen 109
3.2.1. Allgemein 109
3.2.2. Jejunoileum 110
3.2.3. Dottersackstiel 112
3.2.4. Caecum 113
3.2.5. Bursa cloacalis 116
3.2.6. Vergleich gleicher histologischer Strukturen innerhalb verschiedener Organe 118
4. Abschlussbetrachtung 120
VI. Zusammenfassung 125 VII. Summary 127 VIII. Literaturverzeichnis 129
IX. Anhang 150
1. Hühnerbruteier 150
2. Zusammensetzung verwendeter Reagenzien 150
3. Chemische Substanzen und Fertigpräparate 154
4. Verwendete Geräte 157
Abb. Abbildung
ABC Avidin-Biotin-Complex AP alkalische Phosphatase Asn Asparagin
°C Grad Celsius d Tag(e)
FAE follikelassoziertes Epithel Fuc Fucose
g Gramm
GAG Glycosaminoglycan Gal Galaktose
GalNAc N-Acetyl-Galaktosamin GALT gut-associated lymphoid tissue Glc Glucose
GlcN Glucosamin
GlcNAc N-Acetyl-Glucosamin GlcUA Glucuronsäure
h Stunde(n) HE Hämalaun-Eosin IdUA Iduronsäure
IFE Interfollikuläres Epithel Kap. Kapitel
Man Mannose mM Millimol mg Milligramm µg Mikrogramm µl Mikroliter min Minute(n)
NANA N-Acetyl-Neuraminsäure/Sialinsäure
Xyl Xylose s. siehe Ser Serin sek Sekunde(n) Tab. Tabelle
TBS Tris-buffered saline Thr Threonin
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan vergl. vergleiche
> größer als
< kleiner als
I. Einleitung
Erkrankungen des Verdauungsapparates beim Nutzgeflügel spielen eine ökonomisch bedeutsame Rolle. Als Auslöser dieser Erkrankungen kommen neben abiotischen Stressoren virale, bakterielle und parasitäre Erreger infrage. Kohlenhydratreste in der Schleimschicht des Darmepithels und auf den Oberflächen der Epithelzellen können dabei als Rezeptoren für verschiedene Mikroorganismen fungieren (SHARON u. LIS, 1993). Folge dieser kohlenhydratvermittelten Adhäsion kann zum einen die Eliminierung entsprechender Erreger über unspezifische und spezifische Anteile der körpereigenen adaptiven Immunabwehr sein.
Zum andern kann die Adhäsion beim Versagen der adaptiven Abwehrmechanismen zum Durchbrechen der Gastrointestinalbarriere führen und so den ersten Schritt zur Erkrankung des Organismusdarstellen.
Somit sind genauere Kenntnisse über diese Kohlenhydratreste sowohl im Hinblick auf Pathogenesemechanismen, aber auch hinsichtlich ihrer Funktion als potentielle Zielstrukturen für die orale Vakzination (KRAEHENBUHL et al., 1997) und probiotisch wirksame Bakterien (TUOMOLA et al., 2001) sowie für den Einsatz von Kohlenhydraten zur antiadhäsiven Therapie (SHARON, 1997) wünschenswert.
Die nähere Charakterisierung derartiger Kohlenhydratanteile ist histochemisch möglich durch Verwendung markierter Lektine (pflanzliche oder tierische Proteine oder Glycoproteine mit agglutinierenden Eigenschaften), die an bestimmte Zuckerreste binden. Auf diese Weise ist eine genauere histochemische Analyse der Glykolysierung in den einzelnen Darmabschnitten erreichbar.
Bisher liegen nur wenige lektinhistochemische Untersuchungen für den Bereich des Hühnerdarmes vor. Ziel dieser Arbeit ist, die Bindungsfähigkeit bestimmter Lektine in ausgewählten immunrelevanten Darmabschnitten (Jejunoileum, Dottersackstiel, Caecum und Bursa cloacalis) des Haushuhnes (Gallus gallus domesticus) zu untersuchen und so Grundlagen für die nähere Beschreibung von Zuckerstrukturen im Darm zu schaffen.
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II. Literaturübersicht
1. Überblick über die Gliederung des Literaturteiles
Der Literaturteil beginnt zunächst mit einer Übersicht zur Histologie des Darmes sowie der Bursa cloacalis des Haushuhnes (Kapitel 2). Daran schließt sich eine allgemeine Betrachtung über Lektine, die Geschichte ihrer Entdeckung, ihre Struktur, Einteilung und Funktion sowie über Lektinhistochemie an (Kapitel 3). In Kapitel 4 wird auf das Vorkommen von körpereigenen Kohlenhydratresten im Darm eingegangen und damit ein Überblick über die lektinhistochemisch anfärbbaren intra- und extrazellulärer Strukturen gegeben. Kapitel 5 setzt sich mit der Funktion und der Bedeutung dieser Zuckerreste auf der Oberfläche des Darmepithels auseinander. Die zusammenfassende Betrachtung fasst die für diese Arbeit relevanten Aussagen zusammen (Kapitel 6).
2. Histologie des Dünn-und Dickdarmes sowie der Bursa cloacalis des Huhnes unter besonderer Berücksichtigung der Schleimhaut
2.1. Dünn- und Dickdarm 2. 1.1. Grundstruktur
Dünn- und Dickdarm lassen sich unter makroskopischen Aspekten in folgende Abschnitte gliedern: Der Dünndarm unterteilt sich in das Duodenum, das Jejunum und das Ileum, letztere nomenklatorisch zum Jejunoileum zusammengefasst. Der Dickdarm besteht aus den paarigen Blinddärmen und dem Enddarm (Rectum, früher auch als Colo-Rectum bezeichnet) (HODGES, 1974; VOLLMERHAUS u. SINOWATZ,1992; CERNÝ, 1993). Der histologische Aufbau der Darmwand folgt in allen Abschnitten einem einheitlichen Grundschema (CALHOUN, 1954; HODGES, 1974), auf das im folgenden näher eingegangen wird. Die histologischen Besonderheiten einzelner Darmbereiche werden in Kap. 2.6.
erläutert.
Die Wand des Darmrohres ist in vier Schichten aufgebaut. Die innerste dieser Schichten ist die Tunica mucosa intestini. Ihr folgt die schwach ausgebildete Tela submucosa, dann die Tunica muscularis und schließlich die Tunica serosa (McLELLAND, 1979).
2.1.2. Tunica mucosa intestini 2.1.2.1. Epithel
Die Tunica mucosa intestini überzieht als einschichtiges hochprismatisches Epithel sowohl die Darmzotten (Villi intestinales) als auch die Krypten (Glandulae intestinales). Das Schleimhautepithel setzt sich aus den Hauptzellen (auch Saumzellen genannt (CERNÝ, 1993)), den schleimbildenden Becherzellen und den enteroendokrinen (früher:
enterochromaffinen) Zellen zusammen. Sie alle werden an der Basis der Krypten durch
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Mitose produziert und wandern dann entlang der Kryptwände bis zur Spitze der Zotten (HODGES, 1974; McLELLAND, 1979; VOLLMERHAUS u. SINOWATZ, 1992).
Die am häufigsten vorkommenden Zellen des Epithels sind die Hauptzellen. Hierbei handelt es sich um resorbierende, hochprismatische Epithelzellen, die etwa 50 µm hoch und 8-10 µm breit sind. An ihrer freien Oberfläche sind sie mit einem aus Mikrovilli bestehenden Bürstensaum ausgestattet. Im Bereich dieser Mikrovilli überzieht die Glycocalix die Oberfläche der Zelle. Unmittelbar unter diesem Bürstensaum befindet sich die Zone des Schlussnetzes (terminal web), in der auch die Verbindungen zu Nachbarzellen zu lokalisieren sind. Derartige Verbindungen liegen in Form von tight junctions (Zonula occludens), intermediate junctions (Zonula adhaerens) und Desmosomen vor. Der Kern der Hauptzellen ist groß (etwa 10 µm) und von ovaler oder länglicher Form. Er befindet sich in der Regel im basalen Drittel der Zelle. Apikal des Kernes liegt der Golgi-Apparat mit seinen Transportvesikeln, im Lichtmikroskop als eine Aufhellung im Zytoplasma erkennbar. Neben dem Golgi-Apparat befinden sich weitere Zellorganellen wie Mitochondrien oder das endoplasmatische Reticulum im Zytoplasma. In der Tiefe der Krypten sind die Hauptzellen weniger hoch, das Zytoplasma ist basophil und der Bürstensaum weniger deutlich entwickelt als im Zottenbereich (HODGES, 1974).
Die schleimsezernierenden Becherzellen liegen verstreut zwischen den Hauptzellen und kommen im wesentlichen im Bereich der Krypten vor. Auf den Zotten sind sie dagegen weniger zahlreich. Ihr Name bezieht sich auf ihr becherförmiges Aussehen durch einen schmalen basalen Bereich und einen breiten, mit Schleimgranula gefüllten, oberen Anteil. Der Zellkern liegt in unmittelbarer Nähe der Basalmembran im basalen Anteil der Zelle. Der Kern ist im Vergleich zu dem der Hauptzellen etwas kleiner. Ein Mikrovillisaum fehlt den Becherzellen. Je nach Füllungszustand können die Zellen breit und hell oder schmal und dunkel erscheinen (HODGES, 1974).
Bei den enteroendokrinen Zellen handelt es sich um pyramidale oder spindelförmige Zellen, die vor allem in den basalen Anteilen der Schleimhaut vorkommen und im Darm - verglichen mit Drüsen- und Muskelmagen - eher selten anzutreffen sind. Sie sitzen mit ihrer breiten Basis der Basalmembran auf und haben keinen oder nur über ihre schmale Spitze Kontakt zur
luminalen Oberfläche. Ihr Nukleus ist etwas kleiner und runder als der der Hauptzellen.
(HODGES, 1974). Um enteroendokrine Zellen voneinander zu unterscheiden, bedarf es spezieller histochemischer Methoden. Im Darm des Haushuhnes sind enterochromaffine Zellen (EC, Produkt: Motilin), agyrophile Zellen, D-Zellen (Produkt: Somatostatin), Enteroglucagon-, Sekretin-, Neurotensin- und VIP (vasoactive intestinal peptid)-Zellen beschrieben. Auch APP (avian pancreatic polypeptid)-Zellen konnten im Darm bei frisch geschlüpften Küken nachgewiesen werden, jedoch nicht bei erwachsenen Tieren (HODGES, 1981).
Als weitere Zellart wurden beim Huhn globuläre Leukozyten oder Schollenleukozyten beschrieben. BJERREGAARD (1975) rechnet sie zu den intraepithelialen lymphoiden Zellen und bezeichnet diese Zellen auch als granuläre Zellen. Sie liegen zwischen den epithelialen Zellen in der basalen Hälfte des Epithels. Ihre Form ist rund oder oval, die Größe variiert. Der Nukleus ist klein und von irregulärer Form, im Zytoplasma befinden sich die charakteristischen globulären, PAS-positiven Einschlüsse. Ihre Funktion ist bisher ungeklärt.
Es wird jedoch vermutet, dass diese Zellen zur lokalen Infektionsabwehr beitragen. So beschreiben KITAGAWA et al. (1988) die große Ähnlichkeit der globulären Leukozyten zu natürlichen Killerzellen. Die zu den sezernierenden Epithelzellen zählenden Panethschen Körnerzellen konnten dagegen erst bei wenigen Vogelarten (z. B. bei Enten), nicht jedoch bei den Galliformes, nachgewiesen werden (HODGES, 1974; McLELLAND, 1979).
Die Epithelzusammensetzung der dem GALT (gut-associated lymphoid tissue) zuzurechnenden lymphatischen Einrichtungen (wie Peyersche Platten, Tonsillae caecales, Meckelsches Divertikel oder Bursa cloacalis) unterscheidet sich von der anderer Darmbereiche: Neben dem oben beschrieben Epithel ist hier ein flaches Lymphoepithel [auch follikelassoziertes Epithel, FAE (JEURISSEN et al., 1999)] ausgebildet. Dieses ist durch das reichliche Vorkommen intraepithelialer Lymphozyten, einer deutlich geringeren Zahl an Becherzellen, einer diskontinuierlichen Basalmembran und den sogenannten M-Zellen (membranous oder microfold cells) (BEFUS et al., 1980; BURNS, 1982) gekennzeichnet.
KATO et al. (1992) bezeichnen diese Zellen beim Huhn auch als M-Zell-ähnliche Zellen. Die M-Zellen sind mit den umgebenden Epithelzellen über tight junctions und Desmosomen verbunden. Von BYE et al. (1984) wird eine Entwicklung aus undifferenzierten Kryptzellen
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angenommen, LUPETTI et al. (1990) gehen dagegen von einem mesenchymalen Ursprung dieser Zellen aus. KATO et al. (1992) finden dagegen Hinweise auf eine Transformation der M-Zellen aus absorptiven Epithelzellen. M-Zellen unterscheiden sich von Hauptzellen durch die deutliche Reduktion der Anzahl und Höhe der Mikrovilli an der apikalen Fläche. Weiter erscheint das Zytoplasma dunkler als das der übrigen Epithelzellen, und die Zellmembranausläufer bilden tiefe extrazelluläre Taschen, in denen intraepitheliale Lymphozyten eingebettet liegen. Beim Menschen und den bisher untersuchten Säugerspeziesbesteht die Aufgabe der M-Zellen im Transport spezifischer Antigene vom Darmlumen in das unter den M-Zellen liegende lymphatische Gewebe (NEUTRA et al., 1996;
NEUTRA; 1998), beim Huhn wird diese Funktion ebenfalls vermutet (SCHAT u. MYERS, 1991; JEURISSEN et al., 1999).
2.1.2.2. Lamina propria mucosae
Unterhalb des Epithels schließt sich die Lamina propria mucosae an, die auch den bindegewebigen Kern der Darmzotten bildet. Innerhalb dieser Schicht befinden sich neben Blut- und Lymphgefäßen, Nerven und Muskelfasern auch Lymphozyteneinlagerungen, letztere insbesondere im Duodenum, Diverticulum vitellinum und in den Caeca. Bei älteren Tieren werden im allgemeinen mehr Lymphozyten angetroffen als bei jüngeren (CALHOUN, 1954).
Auch im distalen Anteil des Ileums befinden sich reichlich Lymphozyteneinlagerungen (Lymphonoduli aggregati), die nach BEFUS et al. (1980) den Peyerschen Platten der Säugetiere entsprechen. Während bei frisch geschlüpften Küken mit dem bloßem Auge noch keine dieser Platten erkennbar sind, können bei 10 Tage alten Küken bereits bei 50 % der Tiere ein oder zwei Peyersche Platten identifiziert werden. Im Alter von 16 Wochen sind dann fünf (bis acht) scharf vom umgebenden Gewebe abgegrenzte Peyersche Platten nachweisbar. Später verringert sich ihre Zahl aufgrund altersabhängiger Involution wieder (BEFUS et al., 1980). Besonders zu beachten sind weiterhin die Tonsillae caecales (Ileozäkalplatten) an der Ileozäkalverbindung. Diese bestehen hauptsächlich aus Lymphozyten in Form von Keimzentren oder diffusen lymphoidem Gewebe, aber auch aus Lymphoblasten, Plasmazellen und deren Vorläufern. Weiterhin treten Mastzellen,
Retikulumzellen und Makrophagen in diesen Lymphfollikeln auf (ROSE, 1981; BURNS, 1982; HODGES, 1984). Der Umriss der Zotten ist in den Tonsillae caecales breiter und im Gegensatz zu den übrigen Darmbereichen eher blatt- als fingerförmig. Sowohl die Peyerschen Platten als auch die Tonsillae caecales stellen Strukturen des darmassoziierten lymphatischen Gewebes da.
2.1.2.3. Lamina muscularis mucosae
Auf diese Bindegewebsschicht folgt die Lamina muscularis mucosae. Sie setzt sich zusammen aus einer inneren Muskelschicht mit longitudinalem Verlauf und einer äußeren Ringmuskelschicht. Ausgehend von der inneren Muskelschicht strahlen einzelne Muskelzellen in die Darmzotten ein. Die äußere Ringmuskelschicht bildet die Grenze zur Tela submucosa (CALHOUN, 1954; VOLLMERHAUS u. SINOWATZ, 1992; CERNÝ, 1993).
2.1.3. Submucosa
Die ausgesprochen schwach entwickelte Submucosa trennt die Muskelschichten der Lamina muscularis mucosae und der Tunica muscularis. Diese Bindegewebsschicht enthält den Plexus submucosus (Meissner), gelegentlich auch lymphatisches Gewebe und Nervenfasern.
Duodenaldrüsen kommen im Gegensatz zum Säuger beim Huhn nicht vor (CALHOUN, 1954; HODGES, 1974; VOLLMERHAUS u. SINOWATZ, 1992).
2.1.4. Tunica muscularis
Die Tunica muscularis intestini setzt sich aus einer inneren stärkeren Ringmuskelschicht (Stratum circulare) und einem außen liegenden schwächeren Stratum longitudinale zusammen. Zwischen diesen beiden Schichten liegen der Plexus myentericus (Auerbach) sowie elastische Fasern und Blutgefäße. Die Dicke der Muskelschicht insgesamt nimmt im
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distalen Verlauf zu (CALHOUN, 1954; HODGES, 1974; VOLLMERHAUS u. SINOWATZ, 1992).
2.1.5. Tunica serosa mit Subserosa
Die äußerste Schicht des Darmrohres bilden die bindegewebige Tela subserosa mit den in ihr befindlichen Nerven, Blut- und Lymphgefäßen sowie die aus einem einschichtigem Plattenepithel bestehende Tunica serosa. Die Tunica serosa grenzt als Peritoneum viscerale den Darm zur Bauchhöhle ab und geht über in das Mesenterium des Darmes (CALHOUN, 1954; HODGES, 1974; VOLLMERHAUS u.SINOWATZ, 1992).
2.1.6. Besonderheiten einzelner Darmabschnitte
Obwohl die oben beschriebene Grundstruktur auf die gesamte Länge des Darmrohres anwendbar ist, so gibt es doch zwischen den einzelnen Darmabschnitten aus histologischer Sicht einige Unterschiede, auf die im folgenden näher eingegangen werden soll.
Im distalenVerlauf des Dünndarmes werden die Zotten nach und nach kürzer und breiter; die Krypten verlieren an Tiefe. Die Anzahl der Becherzellen nimmt in kaudaler Richtung zu, während die der enteroendokrinen Zellen abnimmt.
Der Übergang von Jejunum zu Ileum wird durch das Diverticulum vitellinum (Meckelsches Divertikel) definiert. Es handelt sich hierbei um den Rest des embryonalen Dottersacks (VOLLMERHAUS u. SINOWATZ, 1992). Eine makroskopisch sichtbare Öffnung des Divertikels zum Darmlumen besteht nur bei sehr jungen Tieren, bei Tieren im Alter zwei bis sechs Wochen hat die Öffnung nur noch einen Durchmesser von etwa 100 µm. Die Verbindung zum Darm besteht aus einer dicken Schicht Bindegewebe und Muskulatur (JEURISSEN et al, 1988). Der histologische Aufbau des Diverticulum vitellinum folgt im übrigen der Struktur der Darmwand. Im Dotterstiel befindet sich altersabhängig lymphatisches Gewebe in der Lamina propria. Während bei ein- bis zweitägigen Tieren noch
kein lymphatisches Gewebe vorhanden ist (CALHOUN, 1954; OLAH et al., 1984), können im Alter von zwei Wochen bereits Ansammlungen lymphatischer Zellen beobachtet werden.
Mit zunehmendem Alter kommt es zur Ausbildung lymphatischer Aggregate ähnlich denen der Peyerschen Platten oder der Tonsillae caecales. Gleichzeitig wird das Epithel mit Lymphozyten infiltriert und die Zahl der Becherzellen reduziert. Etwa ab der sechsten Lebenswoche treten auch lymphozytäre Keimzentren auf (OLAH et al., 1984; JEURISSEN et al, 1988). Daneben soll das Diverticulum vitellinum während der Regression des Dottersackes zwischen der zweiten und siebten Lebenswoche als Ort extramedullärer Myelopoese fungieren (OLAH u. GLICK, 1984). OLAH et al. (1984) fanden außerdem granulareiche Zellen, die sie als “sekretorische Zellen” (engl.: secretory cells) bezeichnen, deren Funktion jedoch bisher ungeklärt ist.
Im Bereich der ileo-caecalen Verbindung wird durch die Muskulatur der Lamina muscularis mucosae ein Sphinkter gebildet. Kaudal dieses Sphinkters beginnt der Dickdarm mit der Mündung der beiden Caeca. Im proximalen Bereich der Caeca ist die Lamina muscularis mucosae besonders dünn, teilweise kaum erkennbar. Das Schleimhautepithel macht hier zwei Drittel der gesamten Wanddicke aus, die Villi intestinales sind gut entwickelt, während die Krypten nur von geringer Tiefe sind. In der Tunica propria befinden sich viele lymphoide Zellen und Lymphfollikel sowohl an der Basis als auch in den Villi intestinales selbst. Die Becherzellen der Schleimhaut sind in diesem proximalen Abschnitt besonders zahlreich. Im Mittelteil des Blinddarmes erscheint die Darmwand dünner. Die Ringmuskulatur der Tunica muscularis ist hier besonders gut ausgebildet. Im mittleren und im distalen Abschnitt des Blinddarmes bildet die Schleimhaut Plicae. Die Zotten sind kurz. Das lymphatische Gewebe in der Lamina propria enthält nur wenige Lymphfollikel. Im distalen Bereich des Zäkums sind die Plicae weniger gut entwickelt als im Mittelteil, die Zotten noch kürzer. Kleine Lymphfollikel und eosinophile Granulozyten befinden sich in der Lamina propria und in der Submucosa. Das Verhältnis von Becherzellen zu Hauptzellen verkleinert sich im Verlauf des Blinddarmes und ist im distalen Bereich am kleinsten (CALHOUN, 1954; HODGES, 1974).
Eine bei nur 25 % der Tiere vorkommende Struktur wurde 1996 von KITAGAWA et al.
beschrieben: Das apikale Caecal-Diverticulum. Hierbei handelt es sich um eine im Querschnitt runde oder halbrunde Vorwölbung an der Apex caeci. Histologisch betrachtet besteht diese vor allem aus gut entwickelten Lymphfollikeln in der Lamina propria mucosae
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und der Submucosa, überzogen von Follikelassoziiertem Epithel mit eingelagerten M-Zellen oder zumindest M-Zell-ähnlichen Zellen. Die Muskelschichten sind im Bereich des apikalen Caecal-Diverticulums allgemein sehr schwach entwickelt (KITAGAWA et al., 1996).
Das histologische Bild des Rectums ist abhängig vom Füllungsgrad dieses Darmabschnittes.
So erscheinen die Villi intestinales bei gefülltem Darm kurz und dick, die Krypten abgeflacht.
Während der Kontraktion sind dagegen lange Villi zu erkennen, die das Lumen des Darmes weitgehend ausfüllen. Auch in diesem Darmabschnitt ist die Lamina propria von lymphatischem Gewebe und kleinen Lymphfollikeln infiltriert, wobei die Follikel fast immer in unmittelbarer Nähe der Lamina muscularis mucosae liegen. Die zelluläre Zusammensetzung des Epithels entspricht der oben genannten, die Hauptzellen werden jedoch zum Großteil von gefüllten Becherzellen überlagert (HODGES, 1974).
2.2. Bursa cloacalis 2.2.1. Allgemeines
Die Bursa cloacalis (Fabricii) ist der Ort der B-Zell-Prägung beim Vogel. Das blind endende, unpaare Organ liegt dorsal der Kloake und steht über den Bursastiel (Collum bursae cloacalis) mit dem Proctodeum in Verbindung (WAIBL u. SINOWATZ, 1992). Die Bursa cloacalis ist zum Zeitpunkt des Schlupfes bereits gut entwickelt und nimmt danach rasch an Größe zu.
Den größten Umfang erreicht sie drei bis sechs Wochen nach dem Schlupf. Mit zwei bis drei Monaten beginnt die Rückbildung der Bursa, mit Eintritt der Geschlechtsreife ist die Involution vollendet (ROSE, 1981). Neben der Funktion als primäres lymphatisches Organ soll die Bursa cloacalis auch als Teil des GALT fungieren (SCHAT u. MYERS, 1991).
2.2.2. Tunica mucosa bursalis
Die Mucosa der Bursa cloacalis ist durch primäre Längsfalten (Plicae bursales) und durch weitere Sekundärfalten gegliedert. Die Anzahl der Längsfalten wird von verschiedenen Autoren in einem Bereich zwischen zehn und 15 angegeben (HODGES, 1974; OLAH u.
GLICK, 1978; ROSE, 1981; WAIBL u. SINOWATZ, 1992; DAVENPORT u. ALLEN, 1995). Das Schleimhautepithel besteht aus einem mehrreihigen Zylinderepithel (CALHOUN, 1954; BOCKMANN u. COOPER, 1973; HODGES, 1974; NAUKKARINEN et al., 1978;
DAVENPORT u. ALLEN, 1995). Dieses Zylinderepithel wird von hochprismatischen Zellen mit einem dichten Mikrovillisaum (CALHOUN, 1954; BOCKMANN u. COOPER, 1973;
HODGES, 1974; NAUKKARINEN et al., 1978; DAVENPORT u. ALLEN, 1995) sowie von Becherzellen (CALHOUN, 1954; HODGES, 1974) gebildet. HODGES beschreibt weiter nicht näher benannte ovale Zellen mit rundem bis ovalem Kern und PAS-positiven Einschlüssen im hellen Zytoplasma.
In diesem auch als interfollikuläres (NAUKKARINEN et al., 1978; OLAH u.GLICK, 1992) oder absorptives Epithel (DAVENPORT u. ALLEN, 1995) bezeichneten Epithel liegen die Zellen des follikelassozierten Epithels (FAE) eingestreut (BOCKMANN u. COOPER, 1973, NAUKKARINEN et al., 1978; SCHAT u. MYERS, 1991; OLAH u. GLICK, 1992;
DAVENPORT u. ALLEN, 1995). Das FAE wölbt sich domartig über den subepithelialen Lymphfollikeln vor. Die Zellen des FAE tragen im Gegensatz zum interfollikulären Epithel nur wenige Mikrovilli und besitzen eine vielfach gefaltete apikale Zellmembran sowie ein dichtes Zytoplasma mit zahlreichen Vesikeln und Vakuolen (BOCKMANN u. COOPER, 1973; OLAH u. GLICK, 1992; DAVENPORT u. ALLEN, 1995). Die Fältelung der apikalen Zellmembran führte zur Bezeichnung microfold cells bzw. M-Zellen (vergl. Kap. 2.2.2.).
Neben diesen Zellen finden OLAH und GLICK (1992 u. 1993) noch eine weitere Zellart im FAE, die sie als sekretorische dendritische Zellen bezeichnen. Es handelt sich hierbei um granulareiche, runde bis langgezogene Zellen. Ihre Funktion ist noch nicht geklärt, wird aber mit der B-Lymphozytenreifung in Verbindung gebracht. Im Gegensatz zum interfollikulären Epithel besitzt das FAE keine durchgehende Basalmembran (NAUKKARINEN et al., 1978;
OLAH u. GLICK, 1992; DAVENPORT u. ALLEN, 1995).
Unterhalb des Epithels enthalten die Bursafalten Folliculi lymphatici. Ihre Zahl wird von OLAH und GLICK (1978) auf etwa 8.000 bis 12.000 für die gesamte Bursa cloacalis geschätzt. In den Lymphfollikel lassen sich deutlich Rinde (Cortex) und Mark (Medulla) unterscheiden. Die Medulla besteht dabei vor allem aus Lymphoblasten, die in das retikuläre Netz eingebettet sind. Lymphozyten, Makrophagen und gelegentlich Mastzellen kommen ebenfalls vor (HODGES, 1974; ROSE, 1981; WAIBL u. SINOWATZ, 1992). Von der
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deutlich dunkler erscheinenden Rindenschicht ist das Mark durch Retikulumzellen und Retkulinfasern getrennt (CALHOUN, 1954; ROSE, 1981). Der Cortex besteht aus kleinen, dichtgepackten Lymphozyten. Im Gegensatz zur Medulla ist die Rindenschicht stark kapillarisiert (CALHOUN, 1954; HODGES, 1974; ROSE, 1981; WAIBL u. SINOWATZ, 1992). Bindegwebige Septen (Septa interfollicularia) trennen die einzelnen Follikel voneinander. Zusammen mit einigen Muskelfasern bildet das Bindegewebe außerdem in jeder Bursafalte stützende Trabekel (CALHOUN, 1954; HODGES, 1974).
2.2.3. Tunica muscularis bursalis
Unterhalb der Schleimhaut schließt sich die Muskelschicht der Bursa cloacalis an. Während CALHOUN (1954) eine innere longitudinale und eine äußere zirkuläre Muskelschicht beschreibt, kann HODGES (1974) diesen Verlauf der Muskelfasern nicht bestätigen. In der Regel besteht die Tunica muscularis jedoch aus zwei oder mehr Muskelschichten, zwischen denen sich Blutgefäße befinden. Einige Muskelfasern ziehen gemeinsam mit kleinen Blutgefäßen von der Tunica muscularis in den bindegewebigen Kern der Bursafalten.
2.2.4 Tunica serosa bursalis
Die äußerste Schicht der Bursawand wird von einer dünnen Serosa und dem subserösen Bindegewebe gebildet (CALHOUN, 1954; HODGES, 1974; ROSE, 1981).
3. Lektine und Lektinhistochemie
3.1. Definition
Der Begriff der Lektine umfasst in Anlehnung an einen Definitionsversuch von GOLDSTEIN et al. (1980) kohlenhydratbindende Proteine nichtimmunogenen Ursprungs, welche die Fähigkeit haben, Zellen zu agglutinieren oder Polysaccharide bzw. Glykokonjugate zu präzipitieren (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) (DIXON, 1981). Diese Definition hat sich heute gegen die Vorschläge anderer Autoren (FRANZ, 1990) weitgehend durchgesetzt (BROOKS et al., 1997).
3.2. Historisches
Die ersten Berichte über hämagglutinierende Pflanzeninhaltsstoffe stammen von STILLMARK (1888). Im Rahmen seiner Dissertationsarbeit beobachtete er das Zusammenklumpen von Erythrozyten durch das toxische Ricin, einem Extrakt aus den Samen von Ricinus communis. In den folgenden Jahren wurden weitere toxische Phytagglutinine sowie Hämagglutinine bakterieller, viraler und tierischer Herkunft entdeckt. EHRLICH (1891a u. b) verwendete Ricin und Abrin (aus Abrus precatorius) in seinen Untersuchungen über das Immunsystems als Antigene und konnte mit ihrer Hilfe Erkenntnisse über die Bildung und Spezifität von Antikörpern erlangen. Die Reversibilität der Hämagglutination durch pflanzliche Agglutinine wurde durch LANDSTEINER (1902) nachgewiesen.
Zusammen mit RAUBITSCHEK gelang LANDSTEINER 1908 erstmals die Isolierung von nicht-toxischen Phytagglutininen, die nach ihrer Herkunft zunächst als Phasine (von Phaseolus vulgaris) bezeichnet wurden. Im Jahre 1936 machten SUMMER und HOWELL die Beobachtung, dass das Lektin Concanavalin A (aus Canavalia ensiformis) nicht nur die Agglutination von Erythrozyten verursacht, sondern auch Stärkegranula verklumpt sowie Mukoproteine und Glykogen präzipitiert. Gleichzeitig wiesen sie eine Inhibition der Hämagglutination durch Sucrose nach. Hieraus wurde erstmals die Schlußfolgerung gezogen, dass es sich bei den Lektinrezeptoren um Kohlenhydratgruppen handeln könnte. Unabhängig
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voneinander beschrieben sowohl RENKONEN (1948) als auch BOYD und REGUERA (1949) die unterschiedliche Stärke der Hämagglutination in Abhängigkeit von der jeweiligen Blutgruppe und wiesen somit für bestimmte Lektine eine Blutgruppenspezifität nach. BOYD verwendete gemeinsam mit SHAPLEIGH 1954 erstmals den Terminus Lektin [abgeleitet von legere (lateinisch): auswählen], der ältere Bezeichnungen wie Phytagglutinine, Phythämagglutinine, Phasine, Normalantikörper, natürliche Antikörper oder antikörperähnliche Substanzen verdrängt und sich bis heute gehalten hat (ROTH, 1978, S.8;
KOCOUREK, 1986; SHARON, 1987).
3.3. Struktur und Bindungsstellen der Lektine
Obwohl die über hundert heute bekannten Lektine zum Teil große strukturelle Vielfalt aufweisen, bestehen dennoch einige grundlegende Gemeinsamkeiten. So müssen Lektine definitionsgemäß Zellen agglutinieren bzw. zuckerhaltige Strukturen präzipitieren können.
Somit muß jedes Lektin mindestens zwei Zuckerbindungsstellen pro Molekül enthalten (Multivalenz). Durch diese Definition werden Proteine immunogenen Ursprungs ausgenommen: Lektine sind damit klar von spezifischen Antikörpern zu trennen (SHARON, 1977; ALROY, 1984; SHARON 1987). Im Gegensatz zu den sich strukturell untereinander sehr ähnelnden Antikörpern, d.h. Immunoglobulinmolekülen, variieren Lektine stark in Bezug auf Molekulargewicht, Aminosäurenzusammensetzung, Metallionenbedarf und dreidimensionaler Struktur. Das Molekulargewicht der Lektine schwankt zwischen etwa 30.000 bis zu 400.000. In der Regel sind sie aus zwei bis vier Untereinheiten zusammengesetzt. Einige Lektine (bspw. Horseshoe crab lectin) bestehen jedoch aus über 20 Untereinheiten. Meist enthält jede Untereinheit eine Zuckerbindungsstelle. Im Regelfall sind die Zuckerbindungsstellen der verschiedenen Untereinheiten eines Lektins identisch. Es sind jedoch auch Ausnahmen mit verschiedenen Zuckerbindungsstellen innerhalb eines Lektins bekannt (SHARON, 1987).
Bis auf wenige Ausnahmen wie Concanavalin A (Con A), Wheat germ agglutinin (WGA) oder Peanut agglutinin (PNA) sind die meisten Lektine Glykoproteine. Die Bedeutung dieser
Glykosylierung ist noch nicht geklärt. Offenbar hat sie keinen Einfluß auf die Bindungsfähigkeit der Lektine (SHARON, 1987).
Die Zuckerspezifität der Lektine ist grundsätzlich festgelegt durch jenes Monosaccharid, welches im Vergleich zu anderen die lektinbedingte Hämagglutination bzw. Präzipitation am wirksamsten hemmt. Hierbei ist jedoch zu beachten, dass viele Lektine eine stärkere Bindung mit Oligosacchariden als mit Monosacchariden eingehen. Für einige Lektine sind sogar ausschließlich Inhibitoren in Form von Oligosacchariden bekannt (SHARON, 1977, ALROY, 1984; GOLDSTEIN u. PORETZ, 1986; SHARON, 1987; SHARON u. LIS, 1995;
BROOKS et al., 1997, S. 8 - 12).
In der Regel erfolgt die Bindung der Lektine an die terminalen Glykosylgruppen der Polysaccharide oder Glykoproteine. Ausnahmen bilden z. B. Con A, dass auch an interne Mannose- (Man) Strukturen bindet oder das WGA, welches neben terminalen Zuckern auch interne N-Acetylgalaktosamin- (GalNAc) Reste erkennt (GOLDSTEIN u. PORETZ, 1986).
Einige Lektine sind außerdem in der Lage, Zucker einschließlich der mit ihnen verknüpften Aminosäurestränge zu erkennen (SHARON, 1987).
Die stets reversible Bindung (vergl. auch LANDSTEINER 1902) erfolgt neben Van der Waals-Kräften und hydrophoben Wechselwirkungen vor allem über Wasserstoffbrückenbindungen. Im allgemeinen werden hierbei einige strukturelle Variationen am C2-Atom des gebunden Zuckers toleriert. Bezüglich der Stellung der Hydroxylgruppen am C3- und C4-Atom besteht dagegen nur eine geringe Toleranz. Ebenfalls häufig in die Bindung einbezogen werden die Hydroxylgruppen vom C6-Atom und etwas seltener auch die am C5- Atom (GOLDSTEIN und PORETZ, 1986; SHARON, 1994; SHARON u. LIS, 1995).
Die dreidimensionale Struktur der Zuckerbindungsstelle ist bisher erst bei wenigen Lektinen vollständig geklärt. So bilden die Untereinheiten einiger aus Leguminosen isolierter Lektine (z.B. Con A oder Pisum sativum agglutinin (PSA)) eine kuppelförmige Gestalt mit einer flachen Kavität an der Spitze dieser Kuppel. Diese taschenförmige Kavität stellt die Zuckerbindungsstelle dar. Bei den bisher untersuchten Leguminosenlektinen sind an der Bindung neben anderern immer die Aminosäuren Asparagin, Aspartat und Glycin beteiligt
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(invarianter Anteil). Solche invarianten Anteile sind im Bindungsbereich verschiedener Lektinfamilien feststellbar, allerdings jeweils mit einer anderen Aminosäurenzusammensetzung. Daneben wird die räumliche Struktur der Bindungstasche auch durch die Anordnug einer Reihe von variablen Aminosäuren bestimmt. Im Falle der Leguminosenlektine sind indirekt außerdem die Metallionen Mn2+ und/oder Ca2+ an der Bindung beteiligt, indem sie auf die Positionierung der Aminosäuren einwirken. Auch für etliche andere Lektine sind Metallionen für die Bindung von Zuckern unentbehrlich, zum Teil wie bei dem oben genannten Beispiel aus strukturellen Gründen, zum Teil auch als direkter Bindungspartner für den Zucker (kalziumabhängige C-Typ-Lektine der Tiere) (SHARON, 1994).
Der Vollständigkeit halber sei erwähnt, dass neben den zuckerspezifischen Bindungsstellen in einigen Lektinen auch Bindungsstellen für kohlenhydratfreie Liganden vorkommen (GOLDSTEIN u. PORETZ, 1986).
3.4. Einteilung der Lektine
Heute werden die Lektine in der Regel nicht mehr nach ihrer Herkunft sondern nach ihrer Zuckerspezifität geordnet. So teilen GOLDSTEIN u. PORETZ (1986) die Lektine in folgende Gruppen auf (Zucker, wenn nicht anders vermerkt, in D-Konfiguration
)
:1. Glucose (Glc)- bzw. Mannose (Man)-bindende Lektine 2. N-Acetylglucosamin (GlcNAc)-bindende Lektine
3. N-Acetylgalactosamin (GalNAc)- bzw. Galactose (Gal)-bindende Lektine 4. L-Fucose (L-Fuc)-bindende Lektine
5. Sialinsäure (NANA)-bindende Lektine
Ähnliche Einteilungen nehmen auch andere Autoren vor (SHARON, 1994).
Die einzelnen Gruppen weisen sich durch folgende Besonderheiten aus: Die Glc- bzw. Man- bindenden Lektine stammen in der Regel aus den Samen von Leguminosen. Auch Con A, das
bekannteste und zugleich besterforschte Lektin stammt aus dieser Gruppe. Die meisten Glc- oder Man-bindende Lektine bestehen aus vier Untereinheiten: zwei leichten α-Ketten und zwei schweren β-Ketten. Die Lektine dieser Gruppe benötigen Metallionen (v. a. Mn2+
und/oder Ca2+) für die Zuckerbindung. Ihr Aminosäurenstrang ist reich an sauren und hydroxylierten Aminosäuren, enthält jedoch wenig oder gar keinen Schwefel. Alle zu dieser Gruppe gehörenden Lektine sind mitogen für Lymphozyten.
Die Gruppe der GlcNAc-bindenden Lektine setzt sich aus sehr verschiedenen Lektinen zusammen, die eine vorrangige Spezifität für GlcNAc oder seine (β1-4) gebundenen Oligomere aufweisen. In diese Gruppe gehören die Lektine der Solanaceae, Leguminosae und Gramineae. GlcNAc wird neben den Lektinen dieser Gruppe auch von einigen Vertretern der bereits beschriebenen Man- bzw. Glc-Lektine gebunden; allerdings fällt bei den letzteren die Bindung bedeutend schwächer aus.
In die Gruppe der GalNAc- bzw Gal-bindenden Lektine gehören die ältesten bekannten Phytagglutinine wie die Lektine aus Ricinus communis oder Abrus precatorius. Bis auf wenige Ausnahmen handelt es sich bei Vertretern dieser Gruppe um Glykoproteine, die für die Zuckerbindung ebenfalls Mn2+ und/oder Ca2+ benötigen.
Die L-Fuc-bindenden Lektine wurden aus sehr unterschiedlichen Quellen isoliert. Sie wurden sowohl in Pflanzen als auch in Pilzen und Tieren gefunden. Das bekannteste Lektin aus dieser Gruppe ist Ulex europaeus I agglutinin (UEA I).
Als letzte Gruppe wurde die NANA-bindende Gruppe der Lektinen beschrieben. Die meisten Vertreter dieser Gruppe stammen von Invertebraten, wenige Ausnahmen auch von Pflanzen.
Die NANA-bindenden Lektine zeichnen sich häufig durch eine große Zahl von Untereinheiten (> 20) aus (GOLDSTEIN u. PORETZ, 1986).
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3.5. Funktionen von Lektinen in vivo
Die biologischen Funktionen der Lektine ist nach wie vor weitgehend ungeklärt. Einige Lektine sollen zum pflanzlichen Abwehrsystem gehören. So können bestimmte Lektine an Hyphen von Pilzen binden, deren Wachstum inhibieren und so den pflanzlichen Keim schützen (BROOKS et al., 1997, S. 15). Desweiteren sollen sie an der wasser- und raumsparenden Packung von Speicherproteinen in den Proteinkörpern von Leguminosensamen mitwirken. Auch die Fixierung von stickstoffbindenden Bakterien an Pflanzenwurzeln soll über Lektinvermittlung zustande kommen (ROTH, 1978, S. 9, FRANZ, 1990). Neben den Lektinen pflanzlichen Ursprungs sind auch Lektine mikrobieller Herkunft bekannt, die der Adhäsion dieser Mikroorganismen an ihre Zielzellen dienen. Diese mikrobiellen Adhäsine spielen eine bedeutende Rolle in der Zell-Zell-Interaktion, so zum Beispiel bei der Anheftung von Mikroorganismen an epitheliale Oberflächen oder auch bei der Bindung zwischen beispielsweise Bakterien und phagozytierenden Zellen (MIRELMAN u. OFEK, 1986; SHARON u. LIS, 1993; LINDHORST, 2000) Auch im Säugetierorganismus können Lektine nachgewiesen werden. Das bekannteste ist das GAL-spezifische Lektin der Leber, dessen Funktion in der Eleminierung gealterter Glykoproteine liegen soll. Zuletzt sei noch erwähnt, dass viele pflanzliche Lektine eine mitogene Wirkung auf Lymphozyten (insb.
T- Lymphozyten) ausüben (FRANZ, 1990).
3.6. Lektinhistochemie 3.6.1. Allgemeines
Mit zunehmendem Interesse an der Glykobiologie (insbesondere im Zusammenhang mit Zell-Zell-Erkennung, rheumatoiden Erkrankungen und der Krebsforschung) gewann auch die Lektinhistochemie mehr und mehr an Bedeutung. Angewendet wird sie zur Lokalisation von Kohlenhydratresten verschiedener Glykokonjugate wie Glykoproteinen, Glykolipiden u.s.w..
Die zuckerspezifischen Lektine lassen sich ähnlich mono- oder polyklonalen Antikörpern bei Zell- und Gewebepräparaten anwenden. Sie werden sowohl bei licht- und elektronenmikroskopischen Arbeiten als auch zur Sichtbarmachung von elektrophoretisch
aufgetrennten Glykoproteingemischen eingesetzt. Lektine stellen somit ein nützliches Werkzeug für die Charakterisierung und die Erforschung der Funktionen von Glykokonjugaten dar. Mittlerweile werden bereits über hundert Lektine kommerziell vertrieben [BROOKS et al, 1997, S.16 - 17].
Lektinhistochemie kann nach BROOKS et al. (1997) definiert werden als Bindung eines Lektins an einen gewebsgebundenen Kohlenhydratrest, dargestellt mittels eines sichtbaren Markers. Hieraus folgen die Grundvoraussetzungen für die lichtmikroskopische Lektinhistochemie:
1. ein passendes Lektin,
2. die Erhaltung der Kohlenhydratstruktur im Zell- oder Gewebepräparat und 3. ein sichtbarer Marker.
Der Erhalt der Kohlenhydratstruktur ist dabei stark abhängig von der Art der Präparation (z.
B. Kryostatschnitt, Paraffineinbettung) der zu untersuchenden Zellen oder Geweben. So kommt es bei der Vorbereitung eines Präparates zur Paraffineinbettung zur Herauslösung aller Lipide und damit auch zum Verlust der Glykolipide des zu untersuchenden Gewebes. Zur Sichtbarmachung der Bindungen kommen Enzyme (enzymatische Umwandlung eines chromogenen Substrates in ein farbiges Endprodukt) oder fluoreszierende Marker in Frage.
Bei der direkten Methode wird ein direkt mit dem Marker konjugiertes Lektin verwendet.
Indirekte Methoden arbeiten beispielsweise mit markierten Antikörpern, die gegen das Lektin gerichtet sind, oder mit biotinkonjugierten Lektinen, die über markiertes Avidin sichtbar gemacht werden. Auch die Verwendung biotingekoppelter Antikörper ist möglich. Zur Überprüfung der Bindungspezifität wird neben der Lektinfärbung eine Zuckerhemmung durchgeführt. Hierbei soll die Zugabe des entsprechenden Monosaccharids die Lektinbindung hemmen. Es ist jedoch zu beachten, dass eine vollständige Hemmung nicht immer zustande kommt. Oft ist nur eine verminderte Bindung zu beobachten. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass viele Lektine besser an Oligosaccharide als an Monosaccharide binden.
Desweiteren sollte eine Negativkontrolle durch eine Färbeprozedur unter Auslassung von Lektinen durchgeführt werden (BROOKS et al., 1997, S. 45 - 98).
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3.6.2. Lektinhistochemische Untersuchungen am Hühnerdarm
Arbeiten über lektinhistochemische Untersuchungen am Hinterdarm des Haushuhnes liegen bisher von folgenden Autoren vor: SUPRASERT et al. (1987), SUPRASERT und FUJIOKA (1988), ALROY et al. (1989), KATO et al. (1992), ZHOU et al. (1995), JEURISSEN et al.
(1999) sowie KITAGAWA et al. (2000). Während sich die drei erstgenannten Arbeiten sowie die von ZHOU et al. (1995) mit der Verteilung von Kohlenhydraten an der luminalen Epitheloberfläche in verschiedenen Darmabschnitten (SUPRASERT et al. (1987): Colon;
SUPRASERT u. FUJIOKA (1988): Caecum; ALROY et al. (1989): Duodenum, Jejunum, Ileum, Caecum, Colon; ZHOU et al. (1995): Ileum) allgemein beschäftigen, zielen die Untersuchungen von KATO et al. (1992), JEURISSEN et al. (1999) und KITAGAWA et al.
(2000) auf die Detektierung von M-Zellen in den Tonsillae caecales des Huhnes ab. Die drei letztgenannten Autoren kommen dabei zu höchst unterschiedlichen Ergebnissen; weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet erscheinen sinnvoll.
Einen Überblick über die bisher am Hinterdarm des Haushuhnes zur Untersuchung eingesezten Lektine gibt Tabelle I (s. S. 33).
Lektine Abkürzung Referenzen Anguilla anguilla AAA JEURISSEN et al. (1999)
Arachis hypogea PNA SUPRASERT et al. (1986), SUPRASERT u.
FUJIOKA (1988), ALROY et al. (1989), KATO et al. (1992), JEURISSEN et al. (1999),
KITAGAWA et al. (2000) Artocarpus integrifolia AIA, Jacalin KITAGAWA et al. (2000)
Canavalia ensiformis Con A SUPRASERT et al. (1986), SUPRASERT u.
FUJIOKA (1988), ALROY et al. (1989), KATO et al. (1992), ZHOU et al. (1995), KITAGAWA et al. (2000)
Datura stramonium DSA KITAGAWA et al. (2000)
Dolichos biflorus DBA SUPRASERT u. FUJIOKA (1988), ALROY et al.
(1989), KATO et al. (1992), KITAGAWA et al.
(2000)
Glycine max SBA ALROY et al. (1989), KATO et al. (1992), ZHOU et al. (1995), JEURISSEN et al. (1999), KITAGAWA et al. (2000)
Griffonia simplicifolia GS-I, BS-I ALROY et al. (1989), KATO et al. (1992), KITAGAWA et al. (2000)
Griffonia simplicifolia GS-II, BS-II JEURISSEN et al. (1999), KITAGAWA et al.
(2000)
Lens culinaris LCA ALROY et al. (1989), KATO et al. (1992), KITAGAWA et al. (2000)
Limax flavus LFA SUPRASERT u. FUJIOKA (1988) Lotus tetragonolobus LTA JEURISSEN et al. (1999)
Lycopersicon esculentum LEA KITAGAWA et al. (2000)
Phaseolus vulgaris E PHA-E KATO et al. (1992), KITAGAWA et al. (2000) Phaseolus vulgaris L PHA-L KATO et al. (1992), KITAGAWA et al. (2000) Pisum sativum PSA KATO et al. (1992), KITAGAWA et al. (2000) Ricinus communis RCA-I SUPRASERT et al. (1986), SUPRASERT u.
FUJIOKA (1988), ALROY et al. (1989), KATO et al. (1992), ZHOU et al. (1995)
RCA-120 KITAGAWA et al. (2000) Solanum tuberosum STA KITAGAWA et al. (2000)
Sophora japonica SJA KATO et al. (1992), KITAGAWA et al. (2000) Triticum vulgaris WGA SUPRASERT u. FUJIOKA (1988), ALROY et al.
(1989), KATO et al. (1992), ZHOU et al. (1995), JEURISSEN et al. (1999), KITAGAWA et al.
(2000)
s-WGA ALROY et al. (1989), KATO et al. (1992), KITAGAWA et al. (2000)
Trythrica cristagalli ECL KITAGAWA et al. (2000)
Ulex europaeus UEA-I SUPRASERT u. FUJIOKA (1988), ALROY et al.
(1989), KATO et al. (1992), ZHOU et al. (1995), JEURISSEN et al. (1999), KITAGAWA et al.
(2000)
Vicia villosa VVA KITAGAWA et al. (2000)
Tab. I: Lektinhistochemische Untersuchungen am Hühnerdarm: Literaturübersicht
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4. Kohlenhydrathaltige Strukturen im Darm des Haushuhnes
Lektine als kohlenhydratbindende Proteine oder Glykoproteine können in Abhängigkeit ihrer Bindungsspezifitäten an verschiedene Zuckerverbindungen (Glykokonjugate) binden. Im Folgenden wird ein kurzer Überblick über die im Darm des Haushuhnes zu erwartenden Glykokonjugate gegeben.
4.1. Zuckerreste im Mucus 4.1.1. Allgemeines
Bei gastrointestinalem Mucus handelt es sich um ein visköses Gel mit zweischichtigem Aufbau: einer der Schleimhaut fest anhaftenden wasserunlöslichen Schicht und einer zähen, aber mobilen flüssigeren Schicht (ALLEN et al., 1984). Der Mucus setzt sich zusammen aus Glykoproteinen, Wasser, verschiedenen Makromolekülen, Elektrolyten, Mikroorganismen und abgeschilferten Zellen. Hauptbestandteil des Mucus sind die Muzine, die als Mucusglykoproteine von den Becherzellen sezerniert werden (NEUTRA u. FORSTNER, 1987).
Der Proteinanteil der Muzine ist im Vergleich zu anderen Glykoproteinen sehr klein und beträgt unter Berücksichtigung tierartlicher Unterschiede etwa 20-30 %. Auf den Kohlenhydratanteil entfallen dementsprechend 70 - 80 % (WEHRMEYER, 1986; NEUTRA u. FORSTNER, 1987).
4.1.2. Struktur der Glykoproteine
Grundgerüst der Muzine ist die aus Aminosäuren gebildete Peptidkette. Innerhalb dieser Peptidkette lassen sich regelmäßig zwei Bereiche unterscheiden. Einer dieser Bereiche ist hochglykolisiert und enthält neben anderen Aminosäuren auffallend viel (über 50 mol %)
Prolin, Threonin und Serin (PTS-Region). Der andere Bereich, im Vergleich zur PTS-Region ein kürzerer Abschnitt der Peptidkette, ist dagegen nur wenig glykolisiert und stellt einen sogenannten nackten Polypeptidstrang dar, der deutlich weniger Serin und Threonin besitzt.
In diesem Bereich werden durch die Aminosäure Cystein Disulfidbrücken zu anderen Glykoproteinmonomeren oder zu bestimmten Bindungspeptiden ausgebildet, was die Polymerenbildung begünstigt (NEUTRA u. FORSTNER, 1987; VAN KLINKEN, 1998).
Obwohl die Strukturen der auf diesem Polypeptidstrang aufsitzenden Kohlenhydrate in Art, Anzahl und Kombination der Monosaccharide erhebliche Variationen aufweisen, gibt es dennoch einige Gemeinsamkeiten im Aufbau der Muzine: Für die Bindung der Oligosaccharidketten an den Peptidstrang kommen prinzipiell zwei Möglichkeiten in Frage.
Die erste ist die O-glykosidische Bindung im Bereich der PTS-Region. Hierbei stellt stets das α-glykosidisch an Serin oder Threonin gebundene GalNAc das Bindeglied zwischen Protein- und Kohlenhydratanteil - das sogenannte oligosaccharid core - dar. Da die auf diese Art gebundenen Glykoproteine den Hauptbestandteil des Mucus bilden, werden sie auch als mucin-like glycoproteins bezeichnet. Diese mucin-like glycoproteins sind allerdings auch andernorts anzutreffen, wie z. B. als Bestandteil der Zellmembranen. Für die Core-Region dieser Glykoproteine vom Muzintyp wurden verschiedene Strukturen nachgewiesen. Die häufigsten sind die folgenden vier:
Core 1: Gal (β1-3) GalNAc - Ser /Thr
Core 2: GlcNAc (β1-6)
GalNAc - Ser/Thr Gal (β1-3)
Core 3: GlcNAc (β1-3) GalNAc - Ser/Thr
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Core 4: GlcNAc (β1-6)
GalNAc - Ser/Thr GlcNAc (β1-3)
(NEUTRA u. FORSTNER, 1987; MONTREUIL, 1987; KOBATA u. TAKASAKI, 1992).
Auf die core region folgt die sog. backbone region. Sie setzt sich bei allen Glykoproteinen vom Muzintyp aus Gal und GlcNAc zusammen. Die Bindung kann dabei auf zweierlei Weise stattfinden: Gal (β1-3) GlcNAc oder Gal (β1-4) GlcNAc.
Die Monosaccharide der Peripherie werden im Gegensatz zu den β-gebundenen Zuckern der core und backbone region α-glykosidisch verknüpft. Bei allen O-Glykanen sind dies Gal, GalNAc, Fuc und NANA.
Somit setzt sich der Zuckeranteil im O-glykosidischen Bereich aller Mucusglykoproteine insgesamt aus fünf verschiedenen Monosacchariden zusammen: Gal, GalNAc, GlcNAc, Fuc und NANA. Bei den sulfatierten Muzinen liegt zusätzlich noch ein an Gal, GalNAc oder GlcNAc gebundener Sulfatrest vor (NEUTRA u. FORSTNER, 1987).
Die zweite Möglichkeit für die Bindung von Oligosaccharidketten an den Polypeptidstrang ist die N-glykosidische Bindung. Während SCHACHTER und WILLIAMS (1982) über das Fehlen dieses Bindungstyps in den Muzinen berichten, beschreiben DEKKER und STROUS (1990) sie im Bereich der cysteinreichen Region, die im Vergleich zur PTS-Region nur wenig glykolisiert ist (VAN KLINKEN, 1998). Die N-glykosidische Bindung erfolgt im Gegensatz zur O-glykosidischen als dolicholabhängige Verknüpfung von GlcNAc mit der Aminogruppe von Asparagin. Bei den N-Glykanen werden grundsätzlich drei verschiedene Typen unterschieden: Der erste ist der mannosereiche Typ, der neben GlcNAc nur Man in verzweigter Form besitzt. Der komplexe Typ enthält zudem auch andere Zucker wie Gal, Fuc und NANA. Der hybride Typ stellt eine Intermediärform der beiden erstgenannten dar und enthält strukturelle Anteile des mannosereichen und des komplexen Typs (MONTREUIL, 1987; KOBATA u. TAKASAKI, 1992
)
.4.1.3. Bedeutung von Zuckerresten im Mucus für die Lektinhistochemie
Aufgrund des hohen Gehaltes an Glykoproteinen im Mucus ist bei Untersuchungen mit markierten Lektinen entsprechender Bindungsfähigkeit eine Anfärbung der intestinalen Schleimschicht sowie der Muzingranula in den Becherzellen zu erwarten. Durch die Verwendung von Lektinen unterschiedlicher Spezifität kann die Verteilung der Mono- bzw.
Oligosaccharide und somit potentieller Rezeptoren für Viren, Bakterien und Protozoen im Mucus näher bestimmt werden.
4.2. Zuckerstrukturen der Zelle 4.2.1. Die Glycocalix
4.2.1.1. Allgemeines
Neben den Muzinen ist die Glycocalix der Zelle eine weitere zuckerreiche Struktur. Sie wird gebildet aus Kohlenhydratketten der in die Zellmembran eingebetteten Glykoproteine, Glykolipide und Proteoglykane, zum Teil auch durch die Zuckerreste von Glykoproteinen und Proteoglykanen aus dem Extrazellularraum, die der Zelloberfläche anhaften. Diese Kohlenhydrate überziehen die Außenseite der gesamten Lipiddoppelmembran als sogenannter cell coat (ALBERTS et al., 1994, S. 502).
4.2.1.2. Glykoproteine
Glykoproteine sind wesentlicher Bestandteil der zuckerhaltigen Komponente der Glycocalix.
Es handelt sich um die bereits beschriebenen O- oder N-glykolysierten Glykoproteine (s.
1.2.). Im Gegensatz zu den Muzinen überwiegen die N-glykolysierten Glykoproteine im Bereich der Zelloberfläche. O-Glykane spielen nur eine untergeordnete Rolle.
38
4.2.1.3. Glykolipide
Bei den Glykolipiden handelt es sich in der Regel um Sphingoglykolipide (im Gegensatz zu den Glyceroglykolipiden). Deren Grundbaustein bildet das Ceramid, bestehend aus Sphingosin und einer Fettsäure. Zur Bildung von Glykolipiden wird die terminale Hydroxylgruppe des Sphingosins mit einem oder mehreren Monosacchariden verknüpft. Bei den Monosacchariden kann es sich um Glc, Gal, GalNAc und NANA handeln. Die Grundstruktur der Glykolipide lässt sich vereinfacht durch folgende Formel darstellen:
CH3(CH2 )12-CH=CH-CH(OH)-CH-CH2-O-Zucker |
NH Acyl Acyl = Fettsäure
Insgesamt machen die Glykolipide etwa 5 % der Lipidmoleküle der äußeren Zellmembranschicht aus (KOBATA u. TAKASAKI, 1992; ALBERTS et al., 1994, S.483 f.).
Die Verankerung der Glykolipide in der Zellmembran erfolgt dabei durch den hydrophoben Ceramidanteil. Bis heute sind über hundert Sphingoglykolipide bekannt (SANDHOFF u.
LEINEKUGEL, 1990).
4.2.1.4. Proteoglykane und Glykosaminoglykane
Die dritte Strukturkomponente der Glycocalix stellen die Proteoglykane dar. Proteoglykane sind definiert als Proteine, die eine oder mehrere kovalent gebundene Glykosaminoglykanketten (früher: Mukopolysaccharidketten) enthalten. Die Glykosaminoglykane sind in der Regel über Hydroxylgruppen der Aminosäuren an den Proteinanteil gebunden, wobei es sich bei der Aminosäure meist um Serin, seltener um Threonin handelt. Lediglich die Glykosaminoglykane vom Typ Keratansulfat I sind N- glykosidisch mit Asparagin verknüpft. Dieser Typ ist Bestandteil der Cornea und kommt im Bereich des Darms nicht vor. Hyaluronsäure ist als einziges Glykosaminoglykan nicht an ein Protein gebunden, wobei auch Ausnahmen von dieser Regel vorkommen (CARSON, 1992).
Die Grundstruktur der Glykosaminoglykane beinhaltet Polysaccharidketten aus unverzweigten Disaccharideinheiten, wobei die Disaccharide alternierend eine Uronsäure und ein Hexosamin (Ausnahme: Keratansulfat) enthalten. Alle Glykosaminoglykane zeichnen sich außerdem durch ihre hohe negative Ladung (in der Regel durch kovalent gebundene Sulfatreste) und durch ihr hohes Molekulargewicht aus (KJELLÉN u. LINDAHL, 1991;
CARSON, 1992).
Die Grundstrukturen der fünf Glykosaminoglykan-Subklassen (GAG-Typen) sind in Tabelle II wiedergegeben. Bei den GAG-Typen Heparin/Heparansulfat, Keratansulfat und Hyaluronsäure besteht der Aminozucker aus GlcNAc, Chondroitinsulfat und Dermatansulfat enthalten dagegen GalNAc. Bei der Uronsäure handelt es sich entweder um Iduronsäure oder Glucuronsäure. Lediglich Keratansulfat enthält statt der Uronsäure Gal. Mit Ausnahme von Hyaluronsäure erhalten die Glykosaminoglykane zusätzlich negative Ladungen durch kovalent verknüpfte Sulfatgruppen (CARSON, 1992).
Beispiele für Proteoglykane der Zelloberfläche sind u.a. die Syndecan- (GAG-Typ:
Chondroitinsulfat oder Hyaluronsäure) oder Betaglycan-Familie (GAG-Typen:
Chondroitinsulfat oder Dermatansulfat) (KJELLÉN u. LINDAHL, 1991; HARDINGHAM u.
FOSANG, 1992; ALBERTS et al., 1994, S. 977 f.). Die Bindung der Proteoglykane an die Zelloberfläche erfolgt mittels verschiedener Mechanismen, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll. Als Beispiel sei lediglich die Bindung über Inositolphosphat oder über den Proteinanteil als hydrophoben Anker genannt (CARSON, 1992).
GAG-Typ Polymerer Anteil mit repetierenden Disaccharideinheiten Protein-Bindungsregion
Heparin/
Heparansulfat (H/HS)
6-SO3
|
-(α1-4) IdUA (α1-4) GlcN (α1-4) GlcUA (β1-4) GlcNAc (α1-4) GlcUA (β1-3) | |
2- SO3 SO3 oder Ac
Gal (β1-3) Gal (β1-4) Xyl (β) Ser
Dermatansulfat (DS)
-(β1-4) IdUA (α1-3) GalNAc (β1-4) GlcUA (β1-3) GalNAc (β1-4) GlcUA (β1-3) | |
2-SO3 4-SO4
Gal (β1-3) Gal (β1-4) Xyl (β) Ser
Chondroitinsulfat (CS)
-(β1-4) GlcUA (β1-3) GalNAc (β1-4) GlcUA (β1-3) |
4- oder 6-SO3
Gal (β1-3) Gal (β1-4) Xyl (β) Ser
Keratansulfat (KS)
-(β1-4) GlcNAc (β1-3) Gal (β1-4) GlcNAc (β1-3) Gal (β1-4) | |
6-SO3 6-SO3
Typ I (Cornea):
GlcNAc (β1-2) Man (α1-3 od. 6) Man (β1-4) GlcNAc (β1-4) GlcNAc (β) Asn
Typ II (Knorpel):
GalNAc (α) Ser oder Thr
| (β1-3) Gal (α2-3) Sial
Hyaluronsäure (HA)
-(β1-4) GlcUA (β1-3) GlcNAc (β1-4) GlcUA (β1-3) GlcNAc (β1-4)-
Tab. II : Glycosamin-Subklassen (GAG-Typen) (nach Carson, 1992)
4.2.2. Intrazelluläre Zuckerstrukturen
Das Vorkommen intrazellulärer Zucker lässt sich anhand der Biosynthesewege für Glykoproteine, Glykolipide und Proteoglykane verdeutlichen:
4.2.2.1. Glykosylierung im endoplasmatischen Reticulum
Nach der Synthese des zentralen Protein- bzw. Ceramidanteiles können erste Glykosylierungsschritte bereits im endoplasmatischen Reticulum (ER) stattfinden. Dies ist der Ort der N-Glykolisierung der Glykoproteine. Hierbei werden zunächst an der cytosolischen Seite der ER-Membran zwei GlcNAc- und fünf Man-Reste an das Carrierlipid Dolichol gebunden. Als Donatoren der Zuckerreste dienen nukleotidaktivierte Zucker. Nach einem sogenannten „Membranflipping“ werden auf der luminalen Seite des ER dann weitere vier Man- und drei Glc-Einheiten angefügt, so dass letztendlich ein aus zwei GlcNAc, neun Man und drei Glc bestehendes dolicholgebundenes Vorläuferoligosaccharid vorliegt. Dieses Vorläuferoligosaccharid wird über eine entsprechende Transferase en bloc an die NH2- Gruppe der Aminosäure Asparagin gebunden. Das Asparagin des Proteins muss dabei in der Sequenz Asparagin-X-Serin oder Asparagin-X-Threonin (X = beliebige Aminosäure) liegen.
Da die Übertragung des Vorläuferoligosaccharids sofort nach Eintritt des Asn ins Lumen des ER, also noch während der Proteinbiosynthese erfolgt, wird dieser Vorgang auch als co- translationaler Prozess bezeichnet. Anschließend folgt in einem sogenannten Trimmprozess die Abspaltung von drei Glc-Resten und mindestens einer Man-Einheit vom Vorläuferoligosaccharid. Das Ergebnis dieses Trimmprozesses ist ein N-Glykan vom mannosereichen Typ (KORNFELD u. KORNFELD, 1985; HIRSCHBERG u. SNIDER, 1987; ABEIJON u. HIRSCHBERG, 1992; KOBATA u. TAKASAKI, 1992; NOIVA et al., 1992; ALBERTS et al., 1994, S. 589 - 591).
Mit der Bildung des Ceramids beginnt auch die Biosynthese der Glykolipide im ER. Ob auch die Glykolysierung mit Bildung eines Glucosyl- oder Galaktosylceramid bereits hier oder wie die nachfolgenden Schritte erst im Golgi-Apparat stattfindet, ist noch nicht endgültig geklärt (SUZUKI et al., 1984, COSTE et al. 1985, 1986).
42
4.2.2.2. Glykosylierung im Golgi-Apparat
Die im ER gebildeten Strukturen gelangen über Transportvesikel zur cis-Seite des Golgi- Apparates, einem weitereren Ort der Glykolysierung. Hier kann eine weitere Prozessierung der im ER gebildeten mannosereichen N-Glykane zur Bildung von hybriden und komplexen N-Glykanen führen. Zu diesem Zweck werden der vorhandenen Oligosaccharidkette weitere GlcNAc-, Gal- und NANA-Reste, gelegentlich auch Fuc-Reste angefügt. Die Abspaltung einiger Man-Einheiten ist ebenfalls möglich. Als Zuckerdonatoren dienen auch hier nukleotidaktivierte Monosaccharide (KOBATA und TAKASAKI, 1992; ALBERTS et al., 1994, S. 604 - 608).
Auch die O-Glykane werden im Golgi-Apparat synthetisiert. Im Gegensatz zu den N- Glykanen erfolgt hier jedoch als erster Schritt kein en bloc Transfer einer Oligosaccharidkette, sondern die posttranslationale Verknüpfung eines einzelnen nukleotidaktivierten GalNAc mit den Aminosäuren Serin oder Threonin. Inwieweit auch hier eine Sequenzabhängigkeit besteht ist noch nicht gänzlich geklärt. Auffallend ist jedoch der hohe Gehalt an Prolin in der Nähe der Bindungsstellen (JENTOFT, 1990; KOBATA u.
TAKASAKI, 1992). Auf den ersten Verknüpfungsschritt folgen während des Transports von der cis- zur trans-Seite des Golgiapparates weitere Anheftungen von Monosacchariden mittels verschiedener Glykosyltransferasen, die zur Bildung von core, backbone und peripherer Region führen (HIRSCHBERG u. SNIDER, 1987; NEUTRA u. FORSTNER, 1987;
KOBATA u. TAKASAKI, 1992).
Die stärkste Glykolysierung findet bei den Proteoglykanen statt. Auch hier wird zunächst eine kurze Oligosaccharidkette als Proteinbindungsregion auf das Coreprotein übertragen, allerdings nicht im ER, sondern im Golgi-Apparat. Erst anschließend werden die weiteren Zuckerreste einzeln mittels spezifischer Transferasen an diese Region geknüpft. Neben der Polymerisierung findet auch die Sulfatierung der Proteoglykane und Glykoproteine im Golgiapparat statt (KJELLÉN u. LINDAHL, 1991; CARSON, 1992).
Eine Ausnahme bildet die Hyaluronsäure. Sie wird als proteinfreies Glykosaminoglykan durch einen Enzymkomplex in der Plasmamembran synthetisiert (PREHM, 1984).
Wie bereits erwähnt, ist der Ort des Beginns der Glykolysierung von Glykolipiden nicht eindeutig geklärt; die nachfolgende Addition von Gal, GalNAc und NANA ist aber ebenfalls in den Golgi-Zisternen lokalisiert (SANDHOFF u. LEINEKUGEL, 1990).
Nach Beendigung der Glykolysierung werden die Glykoproteine, Proteoglykane und Glykolipide über Transportvesikel an der trans-Seite des Golgiapparates ausgeschleust, wobei der Zuckeranteil stets in das Lumen der Vesikel gerichtet ist. Über diese Transportvesikel erreichen die Zuckerstrukturen schließlich ihren jeweiligen Bestimmungsort: die Zelloberfläche, sekretorische Vesikel (z.B. Schleimgranula) oder die Lysosomen (NEUTRA u. FORSTNER, 1987; SANDHOFF u. LEINEKUGEL, 1990; CARSON 1992).
4.2.3. Bedeutung von Zuckerstrukturen der Zelle für die Lektinhistochemie
Auf zellulärer Ebene sind bei der lichtmikroskopischen Lektinhistochemie Markierungen der Zelloberfläche (Glycocalix) möglich. Im Darmbereich ist insbesondere eine Anfärbung der luminalen Oberfläche der Epithelzellen (Bürstensaum) zu erwarten. Intrazellulär können Anfärbungen im Bereich des Golgi-Apparates und des ER auftreten. Für diese Arbeit sind vor allem die Glykokonjugate an der Zelloberfläche in Hinblick auf ihre mögliche Rezeptorfunktion von Interesse.
4.3. Zuckerstrukturen des Bindegewebes 4.3.1. Allgemeines
Bindegewebe setzt sich aus Bindegewebszellen und extrazellulärer Matrix zusammen. Diese interzelluläre Substanz besteht aus den Bindegewebsfasern und der Grundsubstanz. Die Grundsubstanz enthält die bereits beschriebenen Proteoglykane bzw. Glykosaminoglykane. In ihnen sind die fibrillären Proteine der Bindegewebsfasern Kollagen und Elastin sowie adhäsive Glykoproteine wie Fibronektin und Elastin eingelagert.
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4.3.2. Proteoglykane und Glykosaminoglykane
Der extrazelluläre Raum wird hauptsächlich durch die hochmolekularen Aggregate aus Glycosaminoglykanen und Proteoglykanen ausgefüllt. Die Grundstrukturen entsprechen den bereits unter Kap. 4.1.4. beschriebenen (vergl. Tab. II.) (HEINEGÅRD u. PAULSSON,1984;
ALBERTS et al., 1994, S. 971 - 977).
4.3.3. Kollagene
Kollagen besteht aus drei umeinander gewundenen Polypetidketten (Tripelhelix), die sich vor allem aus Glycin, Prolin, Hydroxyprolin und Hydroxylysin zusammensetzten. Hydroxylysin kann im ER glykolysiert werden (KIVIRIKKO u. MYLLYLÄ, 1984). Die Kohlenhydrateinheiten bestehen dabei aus Gal oder einem Disaccharid aus Glc und Gal, wobei die Bindung O-glykosidisch zwischen dem C1-Atom der Gal und der Hydroxylgruppe von Hydroxylysin erfolgt. In den Kollagenvorläufern, den sog. Prokollagenen, kommen auch N-glykosylierte Bereiche vor (mannosereicher Typ). Diese Bereiche werden im weiteren Verlauf der Biosynthese des Kollagens abgespalten (MILLER, 1984). Aufgrund der unterschiedlichen Molekularstrukturen werden derzeit 15 verschiedene Kollagentypen (z. B.
faserbildende, basalmembranbildende oder fibrillassoziierte Typen) unterschieden. Die verschiedenen Typen sind dabei unterschiedlich stark glykolysiert (VAN DER REST u.
GARRONE, 1991). Im Gegensatz zu Kollagen enthält Elastin kein Hydroxylysin und ist nicht glykolisiert (ALBERTS et al., 1994, S. 984).
4.3.4. Adhäsive Glykoproteine
Neben den Kollagenen sind auch adhäsive Glykoproteine in die Grundsubstanz eingelagert.
Das bekannteste unter ihnen ist Fibronektin, ein großes Glykoprotein aus zwei über ein Disulfidbrückenpaar verbundenen Untereinheiten. Der Kohlenhydratanteil ist N-glykosidisch an den Proteinanteil geknüpft. Neben dem Fibronektin befinden sich Laminin, Entactin und zahlreiche weitere Glykoproteine in der extrazellulären Matrix (HAKOMORI et al., 1984).
