Aus dem DRK-Blutspendedienst Niedersachsen, Sachsen-Anhalt, Thüringen, Oldenburg und Bremen, Institut Dessau
Einfluss der Mobilisierung und Apherese peripherer hämatopoetischer Progenitorzellen auf den
Aktivierungszustand des zellulären und plasmatischen Hämostasesystems bei gesunden Spendern
D i s s e r t a t i o n
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Jörg-Peter Schmidt aus Wittenberg
Hannover 2007
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 28.09.2007
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Müller
Referent: PD Dr. med. Hans-Gert Heuft
Koreferent: Prof. Dr. med. Matthias Eder
Tag der mündlichen Prüfung: 28.09.2007
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Hans-Heinrich Kreipe Prof. Dr. Andreas Klos
Prof. Dr. Matthias Eder
Ich möchte an dieser Stelle Herrn Prof. Dr. Thomas Müller ganz herzlich für die stets hilfreiche und förderliche Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit danken.
Gleichfalls danke ich Herrn Dr. Hartmut Kroll für seine Unterstützung bei der Bearbeitung der Thematik.
Des Weiteren gilt mein Dank allen Mitarbeitern der Institute Dessau und Oldenburg des DRK-Blutspendedienstes NSTOB, die mir bei der Umsetzung der Aufgabenstellungen geholfen haben, insbesondere Dr. Andrea Döscher, Sandra Bartzik und Rena Danneberg.
Auch möchte ich mich bei allen Spendern, die Ihr Einverständnis zur Teilnahme an den Untersuchungen gegeben haben, bedanken. Ohne sie wäre die Bearbeitung der Thematik nicht möglich gewesen.
Nicht zuletzt danke ich meiner Frau Christine sowie meinen Kindern Juliane und Lorenz, die mir für die nicht unerhebliche Zeit der Bearbeitung der Dissertation viel Verständnis entgegen gebracht haben.
Abkürzungsverzeichnis
ADP Adenosin-5’-Diphosphat APC Aktiviertes Protein C
aPTT Aktivierte partielle Thromboplastinzeit AT Antithrombin
AUCmax Area under Curve (maximal) CD Cluster of Differentiation
DIC Disseminated intravascular coagulation, Disseminierte intravasale Gerinnung
DNA Desoxyribonucleic Acid, Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
G-CSF Granulozytenkolonie-stimulierender-Faktor GMP-140 Granule Membrane Protein 140
KG Körpergewicht
MFI Mittlere Fluoreszenzintensität
PCR Polymerase Chain Reaction, Polymerasekettenreaktion PE Phycoerythrin
PMN Polymorphnukleäre Leukozyten POD Peroxidase
PBSC Peripheral blood stem cells, periphere Blutstammzellen s.c. Subcutan
TAT Thrombin-Antithrombin-Komplex TF Tissue factor, Gewebsthromboplastin TRAP-6 Thrombin Receptor Activating Peptide 6 vWF Von Willebrand-Faktor
1 Inhaltsverzeichnis
2.1 Das plasmatische Hämostasesystem... 8
2.2 Faktor V-Mutation... 9
2.3 Thrombozytenaktivierung ... 10
2.3.1 Auslösung der Thrombozytenaktivierung ... 10
2.3.2 Signaltransduktion... 11
2.3.3 Degranulation... 11
2.3.4 Expression von P-Selektin und Gp53... 12
2.4 Herleitung der Fragestellungen ... 13
3.1 Allgemeiner Untersuchungsablauf... 19
3.2 Stammzellspender... 19
3.3 Vorbehandlung mit G-CSF ... 20
3.4 Stammzellapherese... 20
3.5 Probennahme... 21
3.6 Untersuchungen... 22
3.6.1 Globalparameter der Hämostase ... 22
3.6.2 In vivo Marker der Hämostase ... 23
3.6.3 sP-Selektin... 24
3.6.4 Faktor V-Mutation... 25
3.6.5 Durchflußzytometrische Untersuchungen ... 25
3.7 Stimulation der Thrombozyten ... 29
3.7.1 Adenosin-5’-Diphosphat-Lösung (ADP-Lösung) ... 29
3.7.2 Thrombin Receptor Activating Peptide 6-Lösung (TRAP-6-Lösung) .. 30
3.7.3 In vitro Stimulation der Thrombozyten... 30
3.8 Statistische Auswertungen ... 31
4.1 Blutbildveränderungen ... 33
4.2 Globalparameter der Hämostase ... 33
4.2.1 Thromboplastinzeit... 33
4.2.2 Partielle Thromboplastinzeit... 34
1 Inhaltsverzeichnis... 5
2 Einleitung... 7
3 Materialien und Methoden ... 19
4 Ergebnisse ... 33
4.2.3 Thrombinzeit ... 35
4.3 In vivo Marker der Hämostase ... 35
4.3.1 Prothrombinfragmente F1+2 ... 35
4.3.2 Thrombin-Antithrombin-Komplex... 36
4.3.3 D-Dimer... 37
4.4 sP-Selektin ... 38
4.5 Faktor V-Mutation... 39
4.6 Durchflußzytometrische Untersuchungen ... 39
4.6.1 Ermittlung der Sättigungskonzentration der Antikörper ... 40
4.6.2 Ermittlung der Agonisten-Konzentration, die die Thrombozyten maximal stimuliert... 42
4.6.3 Reproduzierbarkeit der Messergebnisse... 44
4.6.4 Einfluss von G-CSF auf die Thrombozyten ... 48
4.7 Einflüsse des Aphereseverfahrens... 55
4.7.1 Apherese... 55
4.7.2 Antikoagulation... 56
5.1 Einfluss von G-CSF auf die plasmatische Hämostase ... 59
5.2 Einfluss von G-CSF auf die zelluläre Hämostase... 65
5 Diskussion ... 59
6 Zusammenfassung... 75
7 Literaturverzeichnis ... 77
8 Abbildungsverzeichnis... 84
9 Tabellenverzeichnis... 86
10 Lebenslauf ... 87
11 Erklärung ... 88
2 Einleitung
In den vergangenen Jahren hat die Transplantation allogener Blutstammzellen einen festen Platz in der Behandlung zahlreicher hämatologischer und onkologischer Erkrankungen eingenommen, wobei hier insbesondere die akuten und chronischen Leukämien zu nennen sind. Wesentlicher Bestandteil des Therapiekonzepts ist die im Rahmen der Konditionierung des Patienten stehende Myeloaplasie mit anschließender Transplantation hämatopoetischer Progenitorzellen. Die Myeloaplasie wird dabei einerseits über eine Kombination von Ganzkörperbestrahlung und cytostatischer Therapie oder aber über eine Kombination verschiedener alkylierender Chemotherapeutika erreicht. Durch die sich unmittelbar anschließende Transplantation der Vorläuferzellen wird die Grundlage für die hämatopoetische Rekonstitution des Patienten geschaffen. Bis diese erreicht ist, dauert es ungefähr zwei bis drei Wochen. Die transplantierten Progenitorzellen stammen dabei idealerweise von HLA-identen Spendern. Liegt ein Missmatch vor, ist die Prognose für das Angehen des Transplantats deutlich reduziert.
Beim Spender werden mittels spezifischer Wachstumsfaktoren die hämatopoetischen Progenitorzellen mobilisiert, wobei man hierunter die Ausschüttung der Zellen aus dem Knochenmark ins periphere Blut versteht. Danach können sie aus dem Blut über Apherese-Technik zur späteren Behandlung von Patienten isoliert werden.
Bei dem zur Mobilisation zum Einsatz kommenden rekombinanten hämatopoetischen Wachstumsfaktor handelt es sich um den Granulozytenkolonie-stimulierenden-Faktor (G-CSF), der als Granocyte® (Lenograstim) (Chugai Pharma, Frankfurt) bzw.
Neupogen® (Filgrastim) (Amgen GmbH, München) in Deutschland zur Verfügung steht.
Neben dem gewünschten Effekt der G-CSF-Verabreichung wurden als wesentliche Nebenwirkungen Knochenschmerzen, Splenomegalie und allgemeine Abgeschlagenheit beschrieben.1
Es gibt aber auch zahlreiche Hinweise dafür, dass die G-CSF-Mobilisierung einen passageren hyperkoagulablen Zustand hervorruft, wobei sowohl plasmatische als auch zelluläre Hämostase einbezogen sind. Sie beeinflussen sich dabei nicht nur gegenseitig, sondern sind untrennbar miteinander verbunden. Aus Gründen der
besseren Verständlichkeit sind die Grundzüge der beiden Systeme im Folgenden jedoch separat dargestellt.
2.1 Das plasmatische Hämostasesystem
Im Mittelpunkt des plasmatischen Gerinnungssystems steht die Bildung von Thrombin, welches dann die Umwandlung von löslichem Fibrinogen in ein Fibringerinsel anstößt. Dabei laufen eine Vielzahl von Interaktionen zwischen einzelnen Gerinnungsfaktoren in kaskadenartiger Weise ab. Das ausgehende Signal wird dabei sehr effizient übertragen und bis hin zum Endresultat potenziert.
Verstärkerschleifen sowie Konzentrierungsprozesse einzelner Faktoren auf Zelloberflächen haben daran wesentlichen Anteil.
Ausgangspunkt für den ablaufenden Gerinnungsprozess kann einerseits eine vermehrte Expression von mit Blut in Kontakt kommendem tissue factor (Gewebsthromboplastin) sein. An diesen bindet Faktor VIIa, der sich stets in geringer Menge im Blut findet. Der Komplex aus Tissue factor und Faktor VIIa wiederum überführt noch nicht aktivierten Faktor VII in seine aktive Form (Autoaktivierung).
Durch Faktor VIIa (VIIa/Tissue factor-Komplex) wird die weitere Aktivierung der Proenzyme Faktor X und Faktor IX zu Faktor Xa und Faktor IXa enorm gesteigert.
Cofaktor für die Faktor-IX-Aktivierung ist Faktor VIIIa. Dieser steht nach Abtrennung des von Willebrand-Faktors (vWF) vom zuvor mit Faktor VIII bestehenden Komplex zur Verfügung. Das ist z.B. der Fall, wenn vWF an Thrombozyten gebunden wird.
Eine unkontrollierte Aktivierung des Gerinnungssystems über den geringen Anteil des immer vorhandenen Faktor VIIa tritt nicht ein, da unter physiologischen Bedingungen durch Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) ein gegenregulatorischer Mechanismus besteht. Er bindet und inaktiviert relativ schnell den freien Faktor VIIa (VIIa/Tissue factor-Komplex) sowie Faktor Xa.2
Der Aktivierungsprozess läuft im Wesentlichen auf der Oberfläche von negativ geladenen Phospholipiden und somit auch auf Thrombozyten ab.
Nach Bindung des aktivierten Faktor X (Xa) auf der an Phospholipiden reichen thrombozytären Oberfläche kann dieser dort in Kombination mit Faktor Va und Ca2+
Prothrombin in Thrombin sowie die Prothrombinfragmente F1+2 spalten - Fragment eins enthält den Calcium- und Phospholipid-bindenden Anteil des Prothrombins.
3
Rückkopplung auf die Faktor VII-Aktivierung wirkt Thrombin auf das aus drei paarig angeordneten Polypeptidketten bestehende Fibrinogenmolekül ein. Von diesem werden daraufhin die Fibrinopeptide A und B abgespalten. Im Resultat entsteht ein Fibrinmonomer, das mit anderen Fibrinmonomeren zum Fibringerinsel polymerisiert.
Durch Faktor XIIIa erfolgt die Quervernetzung.4
Das Ausmaß von Gerinnungsprozessen wird durch negative Rückkopplungsmechanismen inhibiert. Hierzu rechnen Protein C/Thrombomodulin und verschiedene Inhibitoren wie Antithrombin (AT), Tissue factor pathway inhibitor oder α1-Proteinaseinhibitor. Dabei ist insbesondere dem Antithrombin eine entscheidende Bedeutung beizumessen. Neben Faktor IXa und Xa inhibiert es Thrombin. Letzteres liegt aufgrund des im peripheren Blut deutlichen Überschusses an Antithrombin fast ausschließlich als inaktivierter Thrombin-Antithrombin-Komplex (TAT-Komplex) vor. Da die Halbwertzeit dieses Komplexes mit <15 min jedoch relativ kurz ist, zeigt sich dieser nur wenige Stunden nach erfolgter Thrombinaktivierung in erhöhter Konzentration. Die Konzentration der TAT-Komplexe im Blut ist bei präthrombotischen Zuständen und DIC erhöht.3
Im Rahmen des Gerinnungsprozesses entstandene Fibrinpolymere können u.a.
durch das fibrinolytische Enzym Plasmin wieder gespalten werden. Die dabei entstehenden Fragmente unterscheiden sich in Abhängigkeit davon, auf welcher Stufe der Organisation sich das Fibringerinsel befand. War bereits ein quervernetztes Molekül entstanden, so werden nach Einwirkung von Plasmin neben den D- und E- Fragmenten auch D-Dimere frei. Diese sind zuvor für die Verknüpfung zweier γ-Ketten nach Einwirkung von Faktor XIIIa verantwortlich. Erhöhte Konzentrationen von D-Dimeren sprechen somit für eine vermehrt ablaufende Firbrinolyse, wie sie bei hyperkoagulablen Zuständen beobachtet wird.
Weitere Ausführungen zu dem äußerst komplexen System der Fibrinolyse finden sich in der Literatur.3, 5, 6
2.2 Faktor V-Mutation
Bei der Faktor V-Mutation (Faktor V-Leiden) handelt es sich um eine Punktmutation des Faktor V-Gen mit autosomal-dominantem Erbgang. Die Mutation betrifft den Austausch des Nukleotids Guanin an Position 1691 durch Adenin, was im Protein an
Position 506 zur Substitution von Glutamin an Stelle von Arginin führt.7 Dieser Austausch verhindert die proteolytische Inaktivierung von Faktor V durch aktiviertes Protein C. Diese Veränderung manifestiert sich als APC-Resistenz (Resistenz gegen aktiviertes Protein C). Durch die ungebremste Aktivität des Faktor V ist bei Merkmalsträgern das Thromboserisiko erhöht.8
Um einen zusätzlichen Einfluss dieser Mutation im Gerinnungssystem auf die von uns untersuchten Zusammenhänge auszuschließen untersuchten wir alle Spender auf das Vorliegen der Mutation.
2.3 Thrombozytenaktivierung
2.3.1 Auslösung der Thrombozytenaktivierung
Der Prozess der Aktivierung von Thrombozyten kann auf verschiedene Weisen in Gang gesetzt werden. Einerseits kann die Adhäsion an subendotheliale Matrix (Kollagen, von Willebrand-Faktor, Fibronektin) der Auslöser sein, andererseits aber auch die Bindung von löslichen Agonisten wie ADP, Thrombin, Kollagen, Arachidonsäure oder Epinephrin an entsprechende Rezeptoren der thrombozytären Oberfläche. Die Agonisten ihrerseits können entweder von defekten Endothelzellen stammen oder aber von bereits aktivierten Thrombozyten freigesetzt werden.9
Die Rezeptoren, über die der Aktivierungsprozess initialisiert wird, können im Ergebnis der Aktivierungsprozesse ihre Konformation ändern.10 Derartige Konformationsänderungen kann man u.a. bei den Integrinen beobachten. Integrine bestehen aus einer α- und einer β-Untereinheit, die nicht kovalent miteinander gebunden sind. Als transmembranöse Rezeptoren der Thrombozyten bestehen sie aus einer relativ großen extrazellulären Domäne, einer transmembranösen Domäne und einem kurzen zytoplasmatischen Abschnitt. Es sind verschiedene Integrinrezeptoren auf Thrombozyten bekannt, so der Kollagenrezeptor α2β1, der Fibronektinrezeptor α5β1, der Lamininrezeptor α6β1, der Fibrinogenrezeptor αIIbβ3 und der Vitronektinrezeptor αVβ3. Sie funktionieren letztendlich als bidirektionale Rezeptoren – einerseits zur extrazellulären und andererseits zur intrazellulären Seite hin.11, 12
Die Formänderung (shape change), die einsetzende Degranulation sowie die Konformationsänderung von Rezeptoren auf der thrombozytären Oberfläche sind Ausdruck der Aktivierung.
2.3.2 Signaltransduktion
Die Signaltransduktion wird durch Bindung von extrazellulären Liganden an Integrine eingeleitet. Sie führt dann zur Freisetzung intrazellulärer Botenstoffe, in deren Folge es zum Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration kommt. Die Regulation der Signaltransduktion ist von mehreren Faktoren abhängig. So wird sie einerseits von der quantitativen Expression des Integrins auf der Oberfläche beeinflusst. Aber auch die Konformationsänderung der extrazellulären Domäne und das Vorhandensein von Ionen für die Ligandenbindung haben regulatorischen Einfluss. Eine ganz
entscheidende Bedeutung kommt dem αIIbβ3-Integrin zu. Interaktionen mit von Willebrand-Faktor (vWF) und Fibronektin laufen über dieses Integrin.13
Ein großer Teil der Aktivatoren bindet über spezifische Rezeptoren, die auf ihrer
zytoplasmatischen Seite an G-Proteine gebunden sind. Die verschiedenen G-Proteine übertragen die Signale der spezifischen Rezeptoren an die
intrazytoplasmatischen Signalwege. G-Proteine bestehen aus einer GTP-bindenden α-Untereinheit und einem βγ-Heterodimer. Ist GDP an die α-Untereinheit gebunden, so befinden sie sich in inaktiviertem Zustand. Nach Bindung von GTP erfährt die α-Untereinheit eine Konformationsänderung und dissoziiert vom βγ-Heterodimer.
Damit ist die Voraussetzung geschaffen, dass Effektormoleküle reguliert werden können. Durch die an die α-Untereinheit gebundene GTP-ase wird das Molekül wieder in den Ausgangszustand zurück geführt und beide Einheiten des G-Proteins werden wieder verbunden.14
2.3.3 Degranulation
In der Folge der Signalübertragungen kommt es zur Degranulation. Dabei verschmelzen einerseits Teile der thrombozytären Granula mit der Plasmamembran und exprimieren Membranproteine auf der Oberfläche der Thrombozyten,
andererseit werden Inhaltsstoffe der Granula direkt in das Umgebungsmilieu sezerniert.
Bei den Granula wird zwischen den dichten Granula (dense bodies), den Lysosomen und den α-Granula unterschieden, die mehr oder weniger alle betroffen sind.
Dense bodies enthalten Substanzen, die nach Freisetzung in erster Linie den Aggregationsprozess fördern. Zu diesen Substanzen gehören Adenin-Nukleotide, Serotonin, Pyrophosphate und Calcium. Insbesondere dem freigesetzten ADP kommt beim Aktivierungsprozess der Thrombozyten eine entscheidende Bedeutung zu. Es ist einerseits für den Formwandel der Plättchen verantwortlich, andererseits spielt es eine wesentliche Rolle bei der Aggregation. Das Serotonin verstärkt zahlreiche Abläufe innerhalb des hämostatischen Systems und hat wahrscheinlich auch einen vasokonstriktorischen Effekt.
In den Lysosomen sind hydrolytische Enzyme gespeichert (u.a. Gp53).
Die quantitativ bedeutendsten Granula der Thrombozyten sind die α-Granula. Ihre Degranulation setzt schon auf relativ geringe Reize hin ein. Die Inhaltsstoffe spielen im weiteren Verlauf bei den Abläufen der Adhäsion, der Aggregation, der Hämostase
und der Inflammation eine entscheidende Rolle. Zu ihnen gehören neben von Willebrand-Faktor Fibronektin, Vitronektin und Thrombospondin, die
Gerinnungsproteine Faktor V und Faktor XI, Fibrinogen, Plasminogenaktivator- inhibitor-1 und ß-Thromboglobulin sowie verschiedene Plasmaproteine wie Immunglobuline, Albumin, Wachstumsfaktoren und Plättchenfaktor 4.15
2.3.4 Expression von P-Selektin und Gp53
P-Selektin (GMP-140) ist ein Membranbestandteil der α–Granula und wird primär nicht auf der Oberfläche von Thrombozyten exprimiert. Nach Aktivierung von Thrombozyten und der einsetzenden Degranulation wird das Glycoprotein in der Plasmamembran, d.h. auf der Oberfläche der Thrombozyten, nachweisbar. Es ist im Weiteren u.a. für die Vermittlung der Bindung an Monozyten und Neutrophile verantwortlich und induziert die Expression von tissue factor (TF) auf Monozyten.
Über TF wiederum ist eine unmittelbare Verknüpfung zum System der plasmatischen Hämostase hergestellt.16, 17 Die Bindung von P-Selektin an Monozyten und Neutrophile erfolgt über P-Selektin Glycoprotein Ligand-1 (PSGL-1), einem
auf Thrombozyten, hier jedoch in deutlich geringerer Menge.18 Des Weiteren kann P-Selektin direkt bei der Interaktion zwischen Plättchen über den GPIbα-IX-V Komplex mitwirken. Auf diesem Wege können weitere, auch primär noch
nicht aktivierte Thrombozyten angebunden und einbezogen werden.19
Zusätzlich zu dem auf der thrombozytären Oberfläche nachweisbaren P-Selektin findet sich dieses auch in freier Form im Plasma. Es geht auf die zuvor thrombozytär gebundene Form zurück, welche sich von der Oberfläche der Plättchen abgelöst hat, da es sich um keinen sehr stabilen Komplex handelt.17
Das lysosomale Membranprotein Gp53 findet sich nur in relativ geringer Dichte auf der Oberfläche von Thrombozyten. Im Zustand thrombozytärer Aktivierung ist es in wesentlich größerem Umfang hier nachweisbar, da es ebenfalls durch Degranulation der lysosomalen Speicher freigesetzt und nach Exocytose auf der Membran der Plättchen exprimiert wird. Es stellt somit einen Marker für den Nachweis eines Aktivierungszustandes dar.20 Die physiologische Funktion des Gp53 besteht in der transmembranösen Signaltransduktion. Auch kommen ihm Funktionen im Rahmen der Zellproliferationsprozesse sowie Zelldifferenzierung verschiedenster Zellen zu (z.B. NK-Zellen, Monozyten, B-Lymphozyten etc.). Verglichen mit den Dense bodies bzw. den Alpha-Granula sind die Lysosomen unempfindlicher auf Reize.20
2.4 Herleitung der Fragestellungen
Es wurden in der Literatur mehrere Fälle mit akuten arteriellen Thrombosen im Zusammenhang mit der Applikation von G-CSF beschrieben. Eine erste Fallbeschreibung findet sich im Jahr 1992.21 Conti beschrieb eine arterielle Thrombose in der Arteria poplitea bei einem Patienten unter Chemotherapie bei Blasen-Carcinom, die im zeitlichen Zusammenhang zur Applikation von G-CSF zu sehen war. Es lagen dabei keine cardiovaskulären Risikofaktoren vor. Einen weiteren Fall eines akuten thrombotischen Verschlusses eines arteriellen Gefäßes unter G-CSF beschrieb Lindemann.22 Begleitende Risikofaktoren des chemotherapierten Patienten waren eine Arteriosklerose mit zweimaligem Zustand nach Myocardinfarkt und ein nichtinsulinpflichtiger Diabetes mellitus. 1996 wurde von Kawachi eine Fallbeschreibung veröffentlicht, die ebenfalls eine akute Thrombosierung unter der Gabe von G-CSF aufzeigte. Bei dem 44 Jahre alten Patienten mit Non-Hodgkin-
Lymphom, bei dem keine cardiovaskulären Vorerkrankungen bekannt waren, war der distale Abschnitt der Aorta von einem solchen Ereignis betroffen.23 Erklärt wurde das Auftreten der Thrombose einerseits durch den G-CSF-bedingten Anstieg der Thrombozyten, andererseits durch einen aggregationssteigernden Einfluss von G-CSF.
Auch für gesunde Spender von Stammzellen sind Fälle thrombotischer Ereignisse im zeitlichen Zusammenhang zur Mobilisierung und Apherese beschrieben.24 Zum einen handelte es sich um eine 54-jährige Frau, bei der es zwei Tage nach unkomplizierter Stammzellapherese zu einer cerebrovaskulären Komplikation gekommen war, zum anderen um einen 64 Jahre alten Mann, der einen Myocardinfarkt nach der Sammlung von Stammzellen erlitt. Bei letzterem war anamnestisch eine Erkrankung der coronaren Gefäße bekannt. Der unmittelbare Zusammenhang zur G-CSF- Applikation konnte in beiden geschilderten Fällen jedoch nicht endgültig gesichert werden.
Dies gilt auch für die oben benannten Fälle bei Patienten. Letztendlich ist festzustellen, dass der tatsächliche Zusammenhang der thrombembolischen Ereignisse zur G-CSF-Behandlung weder eindeutig gesichert noch zuverlässig ausgeschlossen werden konnte.
Mögliche Zusammenhänge zwischen der Applikation von G-CSF und Veränderungen der Hämostase wurden bereits in zahlreichen Arbeiten untersucht. Das Hämostasesystem wurde dabei zumeist nicht in seiner ganzen Komplexität betrachtet, sondern jeweils Teilaspekte entweder des plasmatischen Systems oder aber der zellulären Hämostase.
Insbesondere zu den Veränderungen des plasmatischen Gerinnungssystems sind Veränderungen im Sinne einer Hyperkoagulabilität durch mehrere Arbeiten eindrucksvoll belegt, bei denen die Autoren signifikante Veränderungen für einzelne spezifische Marker fanden. So konnte Söhngen signifikante Erhöhungen von Faktor VIII und Fibrinogen sowie abfallende Aktivitäten von Protein C und Protein S bei gesunden Stammzellspendern nach vier Tagen G-CSF aufzeigen.25 Falanga konnte bei einer Studie mit 26 Spendern allogener Progenitorzellen signifikante Anstiege von F1+2, TAT-Komplex und D-Dimer nach der fünftägigen G-CSF- Behandlung belegen.26 Im Rahmen einer prospektiven Studie, in welche 20 gesunde Spender eingeschlossen waren, konnte gezeigt werden, dass durch die fünftägige
G-CSF-Applikation (Filgrastim) eine Aktivierung im Gerinnungssystem und des Endothels hervorgerufen wurde.27 Für das Gerinnungssystem konnte dieses ebenfalls über einen signifikanten Anstieg der Prothrombinfragmente F1+2, von TAT- Komplexen und D-Dimeren belegt werden, für das Endothel durch einen Anstieg von vWF:Ag. Andererseits zeigten sich die Inhibitoren der Gerinnung Antithrombin und Protein C vermindert. Alle Untersuchungen belegten die G-CSF-bedingte Hyperkoagulabilität.
Aber auch Untersuchung und Darstellung von Effekten nicht nur auf die plasmatische Hämostase, sondern auch auf den thrombozytären Aktivierungszustand innerhalb der selben Studie erfolgten. Sowohl Kuroiwa als auch LeBlanc konnten mit Ergebnissen von Studien eine G-CSF-bedingte Hyperkoagulabilität belegen.28, 29 In der Arbeit von Kuroiwa, der die Untersuchungen von zehn Spendern zu Grunde lag, war diese durch eine Erhöhung der TAT-Komplexe belegt. Für D-Dimere war keine Änderung nachweisbar. In der prospektiven Studie von LeBlanc, die an 22 Spendern hämatopoetischer Vorläuferzellen erfolgte, zeigten sich zusätzlich zu erhöhten TAT- Komplexen noch signifikante Erhöhungen der Prothrombinfragmente F1+2 und des vWF:Ag sowie ein Abfall der partiellen Thromboplastinzeit. Wie bereits angedeutet beschränkten sich diese beiden Arbeiten jedoch nicht auf die Untersuchung der plasmatischen Hämostase, sondern betrachteten auch die Veränderungen der zellulären Hämostase. Kuroiwa zeigte als Zeichen einer erhöhten thrombozytären Sekretion eine gestiegene Thromboxan B2-Konzentration. Diese wiederum ist Beleg der erfolgten Plättchenaktivierung. Auch zeigten die Thrombozyten ex vivo eine gesteigerte Aktivierbarkeit auf externe Stimuli (ADP 1µM, Kollagen 1 µg/ml), die aggregometrisch nachgewiesen wurde. LeBlanc untersucht die durch ADP induzierbare Aggregation und konnte Effekte bedingt durch G-CSF nachweisen, die in unmittelbarem Zusammenhang zum Zeitpunkt der Applikation des G-CSF standen.
Auf diese Ergebnisse soll an späterer Stelle noch eingegangen werden.
Eine ebenfalls erhöhte funktionelle Aktivität der Thrombozyten gesunder Spender nach vorheriger G-CSF-Zugabe (0,1 ng/ml, 1,0 ng/ml) in vitro im Vergleich mit einer Kontrollgruppe ohne G-CSF-Zugabe konnte Avenarius belegen.30 Die Erkenntnisse zeigten sich sowohl in Ansätzen ohne als auch mit zusätzlichem Stimulationsreiz (Kollagen, Epinephrin). Über die Untersuchung der ADP-induzierten Stimulation nach vorheriger G-CSF-Zugabe in vitro konnte Shimoda belegen, dass die Aggregationsfähigkeit abhängig von der G-CSF-Dosis bis zu 10 ng/ml steigt.31
Hierbei spielt der sich auf der Oberfläche der Thrombozyten befindliche G-CSF- Rezeptor offensichtlich eine wesentliche Rolle. Er konnte auch zeigen, dass zwar G-CSF über diesen Rezeptor keinen direkten Einfluss auf die Aggregation von Thrombozyten nimmt, wohl aber die Präinkubation mit diesem die sekundäre Plättchenaggregation bei niedrigen Konzentrationen Adenosindiphosphat (ADP) erhöht. In einer weiteren Arbeit untersuchte er bei gesunden Spendern die Thrombozyten 18 Stunden nach subcutaner Injektion von G-CSF (1 µg/kg). Die ADP- induzierte Aggregation war auch hier gesteigert.32 In der bereits erwähnten Studie von LeBlanc an 22 gesunden Spendern von hämatopoetischen Vorläuferzellen vor und nach G-CSF-Gabe fand sich ein Zusammenhang zwischen Aktivierungszustand der Thrombozyten und Zeitpunkt der G-CSF-Applikation. Waren bei anderen Autoren noch innerhalb der ersten 18 Stunden nach G-CSF-Verabreichung erhöhte Aggregationen der Thrombozyten nachweisbar, so war dieser Effekt schon nach 48 Stunden nicht mehr zu erkennen. Nach 96 Stunden hatte sich der Effekt ins Gegenteil gekehrt und die ADP-induzierte Plättchenaggregation in vitro fiel signifikant.29
Das Aphereseverfahren hat ebenfalls einen nicht unwesentlichen Einfluss auf den Aktivierungszustand der Thrombozyten. Ursächlich sind hierbei insbesondere Scherkräfte, die während der Apherese auf die Thrombozyten einwirken sowie der permanente Kontakt zu Fremdoberflächen. So wurden u.a. in einer Studie das in den Alpha-Granula gespeicherte P-Selektin (GMP-140) sowie Gp53 aus den lysosomalen Granula nach Thrombozytapherese auf der Oberfläche von Plättchen mittels der spezifischen monoklonalen Antikörper CD62p und CD63 nachgewiesen. Diese Veränderungen waren zu beobachten, obwohl das Aphereseverfahren im Mittel lediglich 62 min andauerte.33 In einer weiteren Arbeit stellte Gutensohn vergleichbare Daten, die die Erhöhung bei CD62p und CD63 zeigten, vor. Gleichzeitig belegt er in der Arbeit eine schnellere Sequestration von P-Selektin exprimierenden Thrombozyten noch während der Apherese. Den Mechanismus für die beschleunigte Elimination vermuten die Autoren in der Bindung an Monozyten und neutrophile Granulozyten.34
Zusammenhänge zwischen der Applikation von G-CSF und Veränderungen der plasmatischen und zellulären Hämostase sowie der Kombination mit dem im zeitlichen Zusammenhang durchgeführten Aphereseverfahren zur Gewinnung der mobilisierten hämatopoetischen Vorläuferzellen sind nicht hinreichend untersucht.
Durch die bekannten Veränderungen des plasmatischen Gerinnungssystems im Sinne einer Hyperkoagulabilität sind Synergieeffekte von plasmatischem und zellulärem Hämostasesystem in dieser Phase denkbar, zumal es Hinweise auch auf Veränderungen an den Thrombozyten gibt. Insbesondere bei zusätzlichem Vorliegen eines bekannten prokoagulatorischen Gerinnungsdefektes müsste dann die Zulassung von freiwilligen Spendern zur Gewinnung von peripheren Blutstammzellen kritischer betrachtet werden.
In der folgenden Arbeit wurde daher versucht, die komplex verzahnten Mechanismen der Gerinnung in Abhängigkeit von der G-CSF-Applikation zu erfassen und zu bewerten. Dafür erfolgte einerseits die Messung klassischer Marker der plasmatischen Gerinnung sowie andererseits von Markern der thrombozytären Aktivierbarkeit zu verschiedenen Zeitpunkten. Bzgl. der thrombozytären Veränderungen wurden der Basalwert sowie Werte nach Stimulation mit verschiedenen Agonisten definierter Konzentrationen untersucht. Folgende Zeitpunkte wurden für die Probennahme gewählt: 1. vor Beginn und 2. nach Abschluss der G-CSF-Stimulation, 3. während und 4. nach Abschluss der Apherese.
Durch den Vergleich der Ergebnisse für die verschiedenen Zeitpunkte sollten sich die wesentlichen Effekte erstens der G-CSF Behandlung und zweitens der Apherese unterscheiden lassen.
Hierfür wurden zwei verschieden Untersuchungsmodelle gewählt. Einerseits erfolgte die Darstellung von Veränderungen der Dosis-Wirkungs-Relation bei ex vivo- Stimulation der Thrombozyten. Das zweite Modell betrachtet die durch die Stimulantien erreichbaren maximalen Aktivierungszustände der Plättchen.
Um einen zusätzlichen Einfluss einer Faktor V-Mutation auf die von uns untersuchten Zusammenhänge auszuschließen, untersuchten wir alle Spender auf das Vorliegen der Mutation.
Vor den geschilderten Hintergründen war es das Ziel der Arbeit, folgende Fragen zu klären:
1. Lässt sich der bekannte Einfluss von G-CSF auf die plasmatische Hämostase bei gesunden Spendern von hämatopoetischen Progenitorzellen bestätigen?
2. Kommt es bedingt durch die subcutane Applikation von G-CSF bei den Spendern zu einer Änderung des Aktivierungszustandes in der zellulären Hämostase? Wird ein möglicher Effekt zusätzlich durch das Aphereseverfahren beeinflusst?
3. Ist bei bekanntem prokoagulatorischem Gerinnungsdefekt mit einem synergistischen Effekt zu rechnen?
3 Materialien und Methoden
3.1 Allgemeiner Untersuchungsablauf
Von gesunden freiwilligen Spendern für periphere Blutstammzellen wurden zu vier definierten Zeitpunkten vor sowie nach Applikation von G-CSF Blutproben entnommen, die sowohl auf die thrombozytären Aktivierungsmarker P-Selektin (CD62p) und Gp53 (CD63) untersucht wurden, auf den Parameter sP-Selektin sowie auf Globalparameter (Thromboplastinzeit, aPTT, Thrombinzeit) und in vivo Marker der plasmatischen Gerinnung (F1+2, TAT-Komplex, D-Dimer). Des Weiteren wurde das Vorliegen einer Faktor V-Mutation abgeklärt.
Die allogenen Stammzellapheresen wurden im Institut Dessau des DRK- Blutspendedienstes Niedersachsen, Sachsen-Anhalt, Thüringen, Oldenburg und Bremen (DRK-BSD NSTOB) durchgeführt. Die Spender wurden sowohl im Auftrag des Knochenmarkspenderregisters Sachsen-Anhalt e.V. als auch auswärtiger Spenderregister aufgeklärt, vorbehandelt und ihr Blut über Apheresetechnik separiert.
Die erste Probennahme erfolgte zum Zeitpunkt der Voruntersuchung (t0), also zwei bis vier Wochen vor der eigentlichen Apherese und somit vor Beginn der G-CSF- Stimulation. Nach Abschluss der G-CSF-Stimulation vor der Stammzellapherese (t1) wurde die zweite Probe entnommen. Weitere Probennahmen erfolgten während (t2) und nach Abschluss (t3) der Apherese.
Das Votum der Ethikkommission des Landes Sachsen-Anhalt zur Durchführung der Untersuchungen wurde im Vorfeld eingeholt.
3.2 Stammzellspender
Insgesamt wurden für die Studie 25 freiwillige Spender rekrutiert und über das geplante Vorgehen eingehend im ärztlichen Gespräch aufgeklärt. Alle Probanden erklärten schriftlich ihr Einverständnis zur Teilnahme an dem Untersuchungsprogramm. Die Teilnahme von fünf Spendern wurde nach der Aufklärung und noch vor der G-CSF Behandlung beendet, da die geplante Stammzelltransplantation abgesagt worden war. In die endgültige Auswertung
wurden somit 20 Spender (11 männlich, 9 weiblich) einbezogen. Das Durchschnittsalter lag bei 33,7 Jahren (23 - 51 Jahre).
3.3 Vorbehandlung mit G-CSF
Die medikamentöse Vorbehandlung zur Mobilisierung der Stammzellen erfolgte mittels s.c. Gabe von G-CSF (Granocyte®) (Chugai Pharma, Frankfurt) in einer Dosierung von 10 µg/kg KG über fünf Tage, verteilt auf zwei Dosen pro Tag. Der Tag der Stammzellapherese war als Tag fünf definiert. Die Applikation des G-CSF erfolgte jeweils morgens und abends, am Tag der Apherese bei Ausreichen einer Sammlung nur morgens. Bei Erfordernis einer Zweitseparation erfolgte diese am Tag sechs unter Fortführung der Gabe von G-CSF (eine Dosis am Abend des Tages fünf und eine weitere am Morgen des Tages sechs).
Die Spender wurden gebeten, auf Acetylsalicylsäure und andere nichtsteroidale Antiphlogistika zu verzichten und bei Bedarf nur Parazetamol als Schmerzmittel anzuwenden.
3.4 Stammzellapherese
Die Sammlung der peripheren Blutstammzellen erfolgte ausschließlich mittels dem Zellseparator Cobe-Spectra, Software 7.0 (Gambro BCT, Martinsried) unter manueller Einstellung des WBC-Programms. Der Zeitpunkt der Separation war jeweils der fünfte Tag der Applikation des G-CSF. Beginn war dabei für alle Erstapheresen zwischen 08.30 und 09.30 Uhr. Die reine Separationsdauer für diese lag bei 291 Minuten (252 – 300 Minuten). In 4 Fällen war zur Erreichung der durch die Transplantationsklinik geforderten Dosis am Folgetag eine weitere Separation mit einer mittleren Separationsdauer von 276 Minuten (223 – 300 Minuten) erforderlich.
Zur Antikoagulation für die Apherese wurde mit ACD-A (ACD-A-Lösung, Fresenius HemoCare GmbH, Bad Homburg, Deutschland) in einem Verhältnis Blut : ACD-A von 12:1 begonnen. Der Citratanteil wurde sukzessive bis auf ein Verhältnis von 14:1 reduziert, wobei die erstmalige Reduktion auf 13:1 nach Separation von etwa der Hälfte des insgesamt zu separierenden Vollblutvolumens erfolgte. Das gesamte separierte Vollblutvolumen lag im Durchschnitt bei 19,7 l (12,5 – 26,4 l).
Zur Vermeidung citratbedingter Nebenwirkungen erfolgte bei allen Spendern während der Apheresen die kontinuierliche Substitution von Calcium 10% in Ringer-
Lösung (500 ml Ringer-Lösung E156, Serumwerk Bernburg, Deutschland + 3 Ampullen Calcium-Sandoz 10 % (eine Ampulle a 10 ml enthält 0,5 g
Calciumgluconat Ph. Eur. 1 H2O und 0,875 g Calciumlactobionat 2 H2O), Novartis Consumer Health GmbH, München, Deutschland). Vor Beginn der Apherese erhielten die Spender je eine gelöste Brausetablette Magnesium (Magnesium®5 Brause, Hexal AG, Holzkirchen, Deutschland), Kalium (Kalinor®Brausetabletten, Abbott GmbH, Wiesbaden, Deutschland) sowie Calcium (Calcium-Sandoz®forte, Novartis Consumer Health GmbH, München, Deutschland) verabreicht.
3.5 Probennahme
Alle Proben wurden von liegenden Probanden entnommen, wobei die zuvor für maximal 30 Sekunden angelegte Venenstauung gelöst wurde. Die Befüllung der Probenröhrchen erfolgte unter minimalem Sog entweder über Punktionskanülen minimal 20 G bzw. über einen Discofix-Dreiwegehahn (Braun, Melsungen).
Vacutainer kamen nicht zum Einsatz.
Je nach erforderlichem Umfang wurden folgende Proben entnommen:
- citrat-antikoagulierte Monovette 3 ml (Sarstedt, Nümbrecht) - citrat-antikoagulierte Monovette 5 ml (Sarstedt, Nümbrecht) - EDTA-antikoagulierte Monovette 2,7 ml (Sarstedt, Nümbrecht)
Die EDTA-Blutprobe wurde dabei nicht zusätzlich abgenommen, sondern wird routinemäßig für die CD34-Bestimmung beim Spender genutzt. Die zusätzlichen Blutentnahmen zur Untersuchung beliefen sich somit auf 8 ml im Rahmen der Voruntersuchung und maximal 24 ml zum Apheresezeitpunkt.
Die Bearbeitung der citrat-antikoagulierten Proben für die durchflußzytometrischen Untersuchungen (3 ml) erfolgte innerhalb von 30 Minuten.
Die für die ELISA-Teste sowie die Globalteste der Gerinnung entnommenen citrat- antikoagulierten Proben wurden unmittelbar nach Entnahme zunächst für 30 Minuten in ein Eisbad gegeben und anschließend mit 2.000 G für 10 Minuten bei 4°C
zentrifugiert. Das danach abgehobene Plasma wurde für die weiteren Untersuchungen in drei Portionen alliquotiert (500 µl / 500 µl / Rest). Die beiden Alliquots a 500 µl wurden für die ELISA-Tests bei -80°C bis zu den Untersuchungen zwischengelagert, das dritte Alliquot für die Globalteste bei -30°C.
Aus den kernhaltigen Zellen des in eine EDTA-Monovette entnommenen Blutes wurde die DNA extrahiert und bei -25°C zwischengelagert.
3.6 Untersuchungen
3.6.1 Globalparameter der Hämostase
Die eingefrorenen und bei -30°C gelagerten Proben wurden vor Bearbeitung für 10 min bei 37°C inkubiert und gemischt. Nach 15-minütiger Ruhezeit erfolgt die Untersuchung der Proben.
Die Untersuchungen erfolgten mit dem Gerinnungsautomaten STA-R (Diagnostica Stago, Roche, Frankreich) im gerinnungsphysiologischen Labor des Städtischen Klinikums Dessau.
3.6.1.1 Thromboplastinzeit
Bei dem koagulometrischen Test erfolgt die Inkubation des Plasmas mit Thromboplastin und Calcium, wodurch der Gerinnungsprozess eingeleitet wird.
Bestimmt wird die Zeit bis zur Bildung eines Fibringerinsels in Sekunden. Die Angabe des Wertes erfolgt als Ratio: Gerinnungszeit des zu untersuchenden Plasmas : Gerinnungszeit Normalplasma.
3.6.1.2 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit
Der Gerinnungsprozess des zu untersuchenden Plasmas wird bei diesem Test durch Zugabe von Thromboplastinen, Oberflächenaktivator und Calcium erreicht. Die Zeit bis zur Bildung eines Fibringerinsels wird in Sekunden gemessen.
3.6.1.3 Thrombinzeit
Zum zu untersuchenden Plasma wird Thrombin gegeben. Die Zeit bis zur Bildung eines Fibringerinsels wird in Sekunden erfasst.
3.6.2 In vivo Marker der Hämostase
Die zuvor eingefrorenen und bei -80°C gelagerten Proben wurden vor Bearbeitung für 10 min bei 37°C inkubiert und gemischt. Nach 15-minütiger Ruhezeit erfolgt die Untersuchung der Proben. Die notwendigen Waschschritte erfolgten mit dem SLT Columbus Washer (Tecan, Deutschland), für die Messung der Ansätze wurde der Spectra Thermo Mikrotiterplattenreader (Tecan, Deutschland) eingesetzt.
Die Messungen erfolgten im gerinnungsphysiologischen Labor des Instituts Oldenburg des DRK-Blutspendedienst NSTOB.
3.6.2.1 Prothrombinfragmente F1+2
Die Untersuchungen wurden mit dem Enzygnost®F1+2 micro (Dade Behring, Marburg) durchgeführt.
Bei dem zweistufigen Immunassay binden in der ersten Phase vorhandene F1+2- Antigene an entsprechende Antikörper, die an der Oberfläche der Mikrotitrationsplatte fixiert sind. Nach Auswaschen werden in einer zweiten Reaktion Peroxidase-konjugierte Antikörper gegen Human-Prothrombin an die freien F1+2- Determinanten gebunden. Nach Auswaschen überschüssiger Enzym-konjugierter Antikörper wird die gebundene Enzymaktivität photometrisch gemessen.
3.6.2.2 Thrombin-Antithrombin-Komplex
Es kam der Enzygnost®TAT micro (Dade Behring, Marburg) zum Einsatz, bei dem es sich ebenfalls um einen zweistufigen Immunassay handelt. Während der ersten Inkubation binden Thrombin-Antithrombin-Komplexe (TAT) an Thrombin-Antikörper, die an der Oberfläche einer Mikrotitrationsplatte fixiert sind. In einer zweiten Reaktion
erfolgt nach Auswaschen die Anbindung von Peroxidase-konjugiertern Antikörpern gegen Human-AT an freie AT-Determinanten. Überschüssige Enzymkomponenten werden im Anschluß ausgewaschen. Der Nachweis der TAT-Komplexe erfolgt photometrisch nach Zugabe des Chromogens o-Phenylendiamin.
3.6.2.3 D-Dimer
Die Bestimmung erfolgte unter Nutzung von Asserchrom®D-Dimer (Roche), welcher gleichermaßen über eine zweistufige Immunreaktion läuft. Im ersten Schritt werden D-Dimere an auf einem Mikrotitrationsstreifen fixierten spezifischen Antikörper (F (ab’)2 Anti-D-Dimer) gebunden. Nach einem Waschschritt erfolgt in der zweiten Phase des Tests die spezifische Bildung von Komplexen mit POD-markierten FDP-D-Antikörpern. Vor der photometrischen Auswertung nach Zugabe von Chromogen (o-Phenylendiamin) erfolgt noch ein Waschschritt, in dem nichtgebundenes POD-Konjugat entfernt wird.
3.6.3 sP-Selektin
Die zuvor eingefrorenen und bei -80°C gelagerten Proben wurden vor Bearbeitung für 10 min bei 37°C inkubiert und gemischt. Nach 15-minütiger Ruhezeit erfolgt die Untersuchung der Proben.
Für die Bestimmung setzten wir den Human soluble P-Selectin Immunoassay (R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt) ein. Es handelt sich um einen zweistufigen Ansatz. In der ersten Phase erfolgt die Bindung von sP-Selektin an einen spezifischen Antikörper für sP-Selektin, welcher auf einem Mikrotitrationsstreifen fixiert ist. Anschließend an einen Waschschritt erfolgt die Anlagerung eines Peroxidase-konjugierten Antikörpers gegen diesen Komplex. Die photmetrische Messung erfolgt nach einem weiteren Waschschritt.
Für die notwendigen Waschschritte wurde ein SLT Columbus Washer (Tecan, Deutschland), für die Messung der Ansätze wurde der Spectra Thermo Mikrotiterplattenreader (Tecan, Deutschland) eingesetzt.
3.6.4 Faktor V-Mutation
Zunächst wurde die DNA isoliert. Dieses erfolgte mittels magnetischer Beads (GenoPrepTM, Genovision, Wien, Österreich) aus 350 µl EDTA-Blut unter Verwendung des GenoM6-Automaten (GenoPrepTM, Genovision, Wien, Österreich).
Die Konzentrationsbestimmung der DNA erfolgte UV-photospektrometrisch (GeneQuant RNA/DNA Calculator, Pharmacia) bei einer Wellenlänge von 260 nm.
Die isolierte DNA wurde bis zur PCR-Untersuchung bei -25°C zwischengelagert.
Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 20 µl durchgeführt. Der Ansatz setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen: 10 x Puffer (100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,8), MgCl2 (2,5 mM) (jeweils von Applied Biosystems, Forster City, USA), den spezifischen Primern (je Primer 500 nM) (Biospring, Frankfurt, Deutschland), dNTP’s (250 µM) (Invitrogen), AmpliTaq Gold (1U) (Applied Biosystems, Forster City, USA) sowie 100 ng DNA.
Eingesetzte Primer:
Wildtyp: 5’-CAG ATC CCT GGA CAG ACG
Mutation: 5’-CAG ATC CCT GGA CAG ACA
Gemeinsamer Primer: 5’-TGT TAT CAC ACT GGT GCT TAA
Das Temperaturprofil der PCR, welche mittels TC9600 Zykler (Applied Biosystems, Forster City, USA) durchgeführt wurde, war 95°C für 10 min, 35 x (94°C für 30 sec, 60°C für 45 sec, 72°C für 45 sec) und 72°C für 3 min.
Die abschließende Detektion der PCR-Produkte erfolgte im Agarose-Gel und die Visualisierung und die Dokumentation mit dem Kodak Digital Science System, Software Version 3.6.
3.6.5 Durchflußzytometrische Untersuchungen
3.6.5.1 Durchflußzytometrie
Mit der Durchflußzytometrie ist es möglich, Einzelzellen auf Grundlage bestimmter Eigenschaften zu kategorisieren. Hierbei werden einerseits Streulichteigenschaften und Größe der Zellen betrachtet, andererseits Fluoreszenzeigenschaften nach Bindung entsprechend markierter monoklonaler Antikörper. Da auch
Antikörperkombinationen zum Einsatz kommen ist es möglich, Klassifizierungen auf der Grundlage von Koexpressionen vorzunehmen.
Die Messungen erfolgen mittels eines Durchflußzytometers. In diesem wird die zu untersuchende Zellsuspension hydrodynamisch focussiert, d.h. die Zellen werden perlschnurartig aufgereiht und üblicherweise an einem Argon-Laser vorbei geführt.
Das Licht dieses Lasers hat eine Wellenlänge von 488 nm. Trifft das Licht auf die Zellen kommt es in Abhängigkeit von Größe und Granularität der Zellen zur Streuung des Lichtes. Dabei beeinflusst die Größe über die Ablenkung des Lichts in Vorwärtsrichtung (FSC) und die Granularität über die Ablenkung in Seitwärtsrichtung (SSC). Im Ergebnis entsteht ein zweidimensionales Bild, das Bewertungen zur Zellpopulation ermöglicht.
Wurde die zu untersuchende Zellsuspension mit fluoreszenzmarkierten monoclonalen Antikörpern inkubiert und konnten diese sich spezifisch an Zellen binden, so werden diese nunmehr sekundär auf den Zellen gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe bei Passage des Laserlichts zur Emission von Licht spezifischer Wellenlänge angeregt. Dieses wird nach elektronischer Verstärkung über Detektoren erfasst. Die emitierte Wellenlänge ist spezifisch für die einzelnen zum Einsatz kommenden Fluorochrome. Gemessene Fluoreszenzintensitäten korrelieren unmittelbar mit nachgewiesener Antigenmenge. Die Darstellung der Daten erfolgt anhand der mittleren Fluoreszenzintensität (mean fluorescent intensity, MFI).
Die Messergebnisse können alternativ anhand des prozentualen Anteils der für das nachzuweisende Ereignis positiven Zellen charakterisiert werden.
Entsprechend eingerichtetem Messprotokoll können einzelne Messparameter zueinander in Beziehung gesetzt werden. Eine Eingrenzung der zur Darstellung kommenden und damit bei der quantitativen Auswertung berücksichtigten Zellen erfolgt über das Setzen von gates. Sie werden durch bestimmte Eigenschaften der Zellen definiert.
Bei der Untersuchung der thrombozytären Aktivierung nach Stimulation kamen beide oben genannten Varianten der Darstellung der Messergebnisse zum Tragen. Mit der Auswertung über die mittlere Fluoreszenzintensität wurde die veränderte Dichte der Aktivierungsmarker auf der thrombozytären Oberfläche wiedergegeben.
Bei der zweiten Variante erfolgte die Angabe des prozentualen Anteils der Thrombozyten, die für den zu untersuchenden Aktivierungsmarker positiv waren.
Während die Auswertung über den prozentualen Anteil von aktivierten Thrombozyten die der Wahl bei nur schwacher Stimulation und damit nur geringem Anteil an für den Aktivierungsmarker positiven Zellen ist, ist die Methode der Messung der mittleren Fluoreszenzintensität bei starken Aktivierungszuständen zu bevorzugen.35
Die durchflußzytometrischen Messungen erfolgten bei unseren Untersuchungen mit dem Coulter EPIX XL-MCL, System II, Version 3.0 der Firma Beckman Coulter. Es erfolgten arbeitstägliche Kontrollen mittels Flow-CheckTM Fluorespheres (Beckman- Coulter, USA) und Flow-SetTM Fluorespheres (Beckman-Coulter, USA).
Flow-CheckTM Fluorespheres ist eine Suspension fluoreszierender Mikrokügelchen von gleichförmiger, stabiler Größe und Fluoreszenzintensität. Mit ihnen werden arbeitstäglich die optische Justierung sowie die Flüssigkeitssysteme des Durchflußzytometers überprüft.
Auch bei den Flow-SetTM Fluorespheres handelt es sich um eine Suspension fluoreszierender Mikrokügelchen gleicher und stabiler Größe und Fluoreszenzintensität. Sie dienen der Standardisierung der Scatter- und Fluoreszenzparameter des Durchflußzytometers.
3.6.5.2 Antikörper
Für die Messungen kamen die monoklonalen Antikörper CD41-PE (Immunotech, Frankreich, Clone P2), CD62p-FITC (Immunotech, Frankreich, Clone CLB-Thromb/6) sowie CD63-FITC (Immunotech, Frankreich, Clone CLB-gran12) zum Einsatz.
a) CD41, das spezifisch am Fibrinogenrezeptorkomplex der Thrombozyten anlagert, wurde als Detektionsantikörper für die Thrombozyten eingesetzt.
b) CD62p ist ein spezifischer Marker für Aktivierungszustände von Thrombozyten, da er an das aus den Alpha-Granula freigesetzte P-Selektin (GMP-140) bindet.
c) CD63 ist ebenfalls ein spezifischer Marker thrombozytärer Aktivierungszustände, der an Gp53, welches den lysosomalen Granula zugehörig ist, bindet.
Entsprechend internationalem Konsensus-Protokoll erfolgt die Markierung des thrombozytären Detektionsantikörpers mit Phycoerythrin (PE), die der Aktivierungsmarker mit Fluoreszeinthiocyanat (FITC).35
Für die bei allen Reaktionsansätzen mitgeführten Isotypen-Kontrollen wurde IgG1- FITC (Immunotech, Frankreich, Clone 679.1Mc7) eingesetzt.
3.6.5.3 Auswertung der Messergebnisse
In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der durchflußzytometrischen Untersuchungen auf verschiedene Arten dargestellt und ausgewertet. Einerseits erfolgte die quantitative Auswertung des basalen Aktivierungszustandes der Thrombozyten zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten. Des weiteren wurde auch die maximale Aktivierbarkeit der Thrombozyten auf die Stimulationsreize in Form von definierten ADP- bzw. TRAP-6-Konzentrationen zur Beurteilung der untersuchten Einflüsse herangezogen. Sie sind ein Ausdruck für das vorhandene Aktivierungspotential der Thrombozyten.
Da die Abhängigkeit der gemessenen Aktivierungszustände von der Konzentration einer sigmoidalen Dosis-Wirkungsrelation entsprach, wurden die EC50-Konzentrationen, welche eine halbmaximale Stimulation auslösen, berechnet.
Diese EC50-Konzentrationen stellten ein gutes Maß für die Empfindlichkeit der Thrombozyten auf die verschiedenen Stimuli dar. Die Berechnung geschah durch Anpassung der mit den verschiedenen Konzentrationen eines Stimulus gemessenen Werte an folgende Gleichung: y = ymax / [1+ (Stimulus Konz./EC50 )b], wobei y der jeweils gemessene Wert der Thrombozytenaktivität ist (Abb.1).
0 5 10 15 20 25 30 35
0,1 1 10 100 1000
prozent. Fluoreszenz
Konzentration ADP 0
5 10 15 20 25 30 35
0,1 1 10 100 1000
0 5 10 15 20 25 30 35
0,1 1 10 100 1000
0 5 10 15 20 25 30 35
0,1 1 10 100 1000
Abb.1 Exemplarische Darstellung der Daten eines Probanden für die Messung von CD62p unter ADP vor und nach Mobilisation und Sammlung der Stammzellen, angepasst an die Formel
y = ymax / [1+ (Stimulus Konz./EC50 )b]
t0 (blau) Zeitpunkt der Voruntersuchung, t1 (rot) nach Abschluss der G-CSF-Stimulation vor der Stammzellapherese, t2 (grün) während und t3 (violett) nach Abschluss der Apherese
3.7 Stimulation der Thrombozyten
3.7.1 Adenosin-5’-Diphosphat-Lösung (ADP-Lösung)
1 mg Adenosin-5’-diphosphat (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) mit einem Molekulargewicht von 427,2 g/mol wurde in 2,34 ml aqua dest gelöst, anschließend hiervon 2,1 ml mit 4,9 ml aqua dest weiterverdünnt, so dass eine Stammlösung von 300 µM vorlag. Im Weiteren erfolgte die Aliquotierung der Stammlösung in Portionen a 60 µl, welche bei -30°C eingefroren wurden.
Aus der hiermit hergestellten Stammlösung mit einer Konzentration von 300 µM ADP wurden je nach Reaktionsansatz die erforderlichen Konzentrationen ADP durch weitere Verdünnungsschritte mit aqua dest hergestellt:
a) 20 µl (300 µM) entnehmen + 10 µl aqua dest = 30 µl (200 µM) b) 15 µl (300 µM) entnehmen + 15 µl aqua dest = 30 µl (150 µM)
c) 20 µl (300 µM) entnehmen + 55 µl aqua dest = 75 µl (80 µM) (= Lösung A) d) von A 20 µl (80 µM) entnehmen + 12 µl aqua dest = 32 µl (50 µM)
e) von A 10 µl (80 µM) entnehmen + 30 µl aqua dest = 40 µl (20 µM) f) von A 10 µl (80 µM) entnehmen + 70 µl aqua dest = 80 µl (10 µM) g) von A 6 µl (80 µM) entnehmen + 154 µl aqua dest = 160 µl (3 µM)
3.7.2 Thrombin Receptor Activating Peptide 6-Lösung (TRAP-6-Lösung)
5 mg TRAP-6 (H-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-OH) (BACHEM, Heidelberg) mit einem Molekulargewicht von 748,9 g/mol wurde in 6,676 ml NaCl gelöst, so dass eine Stammlösung von 1 M vorlag. Im Weiteren erfolgte die Aliquotierung der Stammlösung in Portionen zu jeweils 50 µl, welche bei -30°C eingefroren wurden.
Aus der Stammlösung wurden je nach Reaktionsansatz die erforderlichen Konzentrationen TRAP-6 durch weitere Verdünnungsschritte mit NaCl hergestellt:
a) 15 µl (1 M) entnehmen + 35 µl isotone Nacl-Lösung = 50 µl (300 µM) b) 15 µl (1 M) entnehmen + 60 µl isotone NaCl-Lösung = 75 µl (200 µM) c) 10 µl (1 M) entnehmen + 90 µl isotone NaCl-Lösung = 100 µl (100 µM) (= Lösung A)
d) von A 20 µl (100 µM) + 20 µl isotone NaCl-Lösung = 40 µl (50 µM) e) von A 10 µl (100 µM) + 30 µl isotone NaCl-Lösung = 40 µl (25 µM) f) von A 10 µl (100 µM) + 90 µl isotone NaCl-Lösung = 100 µl (10 µM)
3.7.3 In vitro Stimulation der Thrombozyten
Zunächst erfolgte die Einstellung der Thrombozyten in der zu untersuchenden Probe auf ca. 20.000 / µl entsprechend Tabelle 1. Hierfür werden auf 37°C vorgewärmte PBS-Pufferlösung (pH 7,2) und BSA 0,1% verwendet.
Thrombozyten/µl Blutprobe PBS-Puffer
<150x103 200 µl 800 µl
150-300x103 100 µl 900 µl
>300x103 50 µl 950 µl
Tabelle 1
Thrombozyteneinstellung auf ca. 20.000 / µl im Untersuchungsmaterial
Jeweils 36 µl Probematerial (s. 3.5) wurden ohne Stimulus (Basalwert) bzw. nach Stimulation mit 4 µl ADP bzw. TRAP-6-Lösung in verschiedenen Konzentrationen für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Im Einzelnen wurden hierbei folgende Konzentrationen verwendet:
ADP – 0 µM, 3 µM, 10 µM, 20 µM, 50 µM, 80 µM, 150 µM, 200 µM TRAP-6 – 0 µM, 10 µM, 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM, 300 µM.
Anschließend erfolgte für alle Reaktionsansätze die Zugabe von 6 µl CD41-PE (Detektionsantikörper) und der spezifischen Aktivierungsmarker. Hierbei wurden je eine TRAP-6-stimulierte Reihe mit 6 µl CD62p-FITC bzw. 20 µl CD63-FITC sowie eine ADP-stimulierte Reihe mit 6 µl CD62p-FITC versetzt und anschließend für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Abschließend wurde der Ansatz mit 2 ml Pufferlösung (PBS-Puffer mit 1mg/ml BSA (=0,1%), 4°C) abgestoppt.
3.8 Statistische Auswertungen
Die in der Arbeit aufgeführten Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten wurden jeweils mit Hilfe des Programms Microsoft Excel berechnet.
Prüfungen auf das Vorliegen von Signifikanz bei Unterschieden von Messwerten erfolgten mit dem gepaarten zweiseitigen Student’s t-test.
Für die Darstellung von Ergebnissen wurde u.a. auf Boxplots zurückgegriffen. Bei dieser Darstellung zeigt der Strich in der Box den Median an. Der Mittelwert ist nicht
dargestellt. Die Box selber stellt den Interquartilenabstand dar. Ausreißer (>1,5 Box- Längen) sind als Kreise dargestellt, Extremwerte (>3 Box-Längen) sind als Kreuze eingetragen. Dünne waagerechte Linien zeigen die jeweils höchsten bzw. niedrigsten Nichtausreißer an.
Die statistische Auswertung erfolgte mittels SPSS für Windows (Version 11.5.1). Die Kurvenanpassungen wurden mit dem Programm Deltagraph (Version 5.4) vorgenommen.
4 Ergebnisse
4.1 Blutbildveränderungen
Nach der Gabe von G-CSF stiegen beim Spender die im peripheren Blutbild gemessenen Leukozyten signifikant an. Lag der Mittelwert für die Probanden zum Zeitpunkt der Voruntersuchung noch bei 6,6 x 103/µl (4,2 – 9,2) stieg er nach fünftägiger Behandlung auf 44,1 x 103/µl (32,0 – 64,4) (p<0.001), um bis zum Ende der Apherese auf einen Wert von 39,4 x 103/µl (21,5 – 61,9) (p<0.005) zu fallen. Der mittlere Gehalt an Progenitorzellen (CD34+) betrug nach G-CSF-Stimulation 76,4/µl (18 – 185). Die Thrombozytenzahlen im peripheren Blut unterschieden sich mit 224 x 109/l (171 – 295) vor und 234 x 109/l (141 – 350) nach G-CSF nicht. Unter der Apherese war der Wert auf 102 x 109/l (74 – 158) (p<0.001) abgefallen.
4.2 Globalparameter der Hämostase
4.2.1 Thromboplastinzeit
Der Vergleich der Werte für die Thromboplastinzeit (Quick) zeigte Veränderungen, zwischen t1 mit 88,4 % (78 – 106) und t2 mit 79,6 % (70 – 99) (p<0,001) sowie t2 und t3 mit 78,1 % (68 – 98) (p=0,006) (Abbildung 2).
T3 T2
T1 T0
Quick [%]
110
100
90
80
70
60
Abb.2 Thromboplastinzeit vor und nach Mobilisation und Sammlung der Stammzellen bei 20 Spendern
t0 Zeitpunkt der Voruntersuchung, t1 nach Abschluss der G-CSF-Stimulation vor der Stammzellapherese, t2 während und t3 nach Abschluss der Apherese
Darstellung des Interquartilenabstand (□), Median (-), höchster und niedrigster Nichtausreißer (┬/┴)
4.2.2 Partielle Thromboplastinzeit
Für die partielle Thromboplastinzeit stellt sich beim Vergleich der Werte für den Zeitpunkt nach G-CSF-Verabreichung mit den Werten des Ausgangszustandes ein signifikanter Abfall dar. Lag der Wert zum Zeitpunkt t0 noch bei 31,6 s (29 – 36), so war er bei t1 28,6 s (27 – 32) (p<0,001). Während der Apherese stieg der Wert auf 29,8 s (27 – 34) zur Zeit t2 (p<0,001) sowie 30,0 s (26 – 34) bei t3 an (Abbildung 3).
P < 0,001 P = 0,006
T3 T2
T1 T0
partielle Thromboplastinzeit [s]
38
36
34
32
30
28
26 24
Abb.3 Partielle Thromboplastinzeit vor und nach Mobilisation und Sammlung der Stammzellen bei 20 Spendern t0 Zeitpunkt der Voruntersuchung, t1 nach Abschluss der G-CSF-Stimulation vor der Stammzellapherese, t2 während und t3 nach Abschluss der Apherese
Darstellung des Interquartilenabstand (□), Median (-), höchster und niedrigster Nichtausreißer (┬/┴)
4.2.3 Thrombinzeit
Für die Thrombinzeit konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Ergebnissen zu den einzelnen Untersuchungszeitpunkten nachgewiesen werden (t0 16,6 s (15 – 19); t1 16,6 s (15 – 18); t2 16,9 s (15 – 19); t3 17 s (15 – 17)).
4.3 In vivo Marker der Hämostase
4.3.1 Prothrombinfragmente F1+2
Für die Prothrombinfragmente F1+2 zeigte sich ein signifikanter Anstieg nach der Behandlung mit G-CSF. Lag der Mittelwert vor G-CSF (t0) noch bei 0,49 nmol/l (0,24 – 0,96), so erreichte er nach G-CSF (t1) 0,97 nmol/l (0,57 – 1,81) (p<0,001). Im Verlauf der Apherese fiel der Wert auf 0,79 nmol/l (0,43 – 1,85) (t2) (p<0,001) und in
P < 0,001
P < 0,001
der zweiten Phase der Apherese war keine signifikante Änderung mehr zu verzeichnen. Der Wert lag hier bei 0,75 nmol/l (0,49 – 1,6) (t3) (Abbildung 4).
T3 T2
T1 T0
Prothrombinfragmente F1+2 [nmol/l]
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
Abb.4 Prothrombinfragmente F1+2 vor und nach Mobilisation und Sammlung der Stammzellen bei 20 Spendern
t0 Zeitpunkt der Voruntersuchung, t1 nach Abschluss der G-CSF-Stimulation vor der Stammzellapherese, t2 während und t3 nach Abschluss der Apherese
Darstellung des Interquartilenabstand (□), Median (-), höchster und niedrigster Nichtausreißer (┬/┴),
>1,5 Box-Längen (○), > 3 Box-Längen (x)
4.3.2 Thrombin-Antithrombin-Komplex
Ein signifikanter Anstieg für diesen Wert konnte beim Vergleich der Messwerte von t0 und t1 belegt werden. Der Mittelwert stieg von 3,4 ng/ml (1,5 – 6,9) auf 4,2 ng/ml (2,0 – 7,7) (p=0,002). Ein weiterer Anstieg war unter der Apherese zu verzeichnen.
Der Wert stieg auf 6,4 ng/ml (3,5 – 13,3) zur Zeit t2 (p=0,002). Danach kam es mit 6,5 ng/ml (3,3 – 13,2) bei t3 an zu keiner signifikanten Änderung mehr (Abbildung 5).
P < 0,001 P < 0,001
T3 T2
T1 T0
Thrombin-Antithrombin-Komplex [ng/ml]
16 14 12 10 8 6 4
2 0
Abb.5 Thrombin-Antithrombin-Komplex TAT vor und nach Mobilisation und Sammlung der Stammzellen bei 20 Spendern
t0 Zeitpunkt der Voruntersuchung, t1 nach Abschluss der G-CSF-Stimulation vor der Stammzellapherese, t2 während und t3 nach Abschluss der Apherese
Darstellung des Interquartilenabstand (□), Median (-), höchster und niedrigster Nichtausreißer (┬/┴),
>1,5 Box-Längen (○)
4.3.3 D-Dimer
Es konnte bei den D-Dimeren ebenfalls ein signifikanter Anstieg nach der Zeit der Vorbehandlung nachgewiesen werden. Der Ausgangswert t0, der bei 102 ng/ml (13 – 263) lag, erhöhte sich signifikant auf 190 ng/ml (67 – 596) zum Zeitpunkt t1 (p<0,001). Im Verlauf der Stammzellseparation fiel der Wert zum Zeitpunkt t2 wiederum signifikant auf 159 ng/ml (63 – 533) (p<0,001). In der letzten Phase bis
zum Zeitpunkt t3 zeigte sich mit 164 ng/ml (55 – 568) kein signifikanter Unterschied (Abbildung 6).
P = 0,002 P = 0,002
T3 T2
T1 T0
D-Dimer [ng/ml]
700
600
500
400
300
200
100 0
Abb.6 D-Dimer vor und nach Mobilisation und Sammlung der Stammzellen bei 20 Spendern
t0 Zeitpunkt der Voruntersuchung, t1 nach Abschluss der G-CSF-Stimulation vor der Stammzellapherese, t2 während und t3 nach Abschluss der Apherese
Darstellung des Interquartilenabstand (□), Median (-), höchster und niedrigster Nichtausreißer (┬/┴),
>1,5 Box-Längen (○)
4.4 sP-Selektin
Für sP-Selektin fand sich im Vergleich t0 zu t1 ein signifikanter Anstieg der Werte. Sie stiegen von 31,1 ng/ml (20,2 – 45,6) auf 52,8 ng/ml (36,2 – 75,8) (p<0,001). Der während der Apherese zu verzeichnende Abfall war bis zum Zeitpunkt t2 signifikant (46,7 ng/ml (30,6 – 63,6)) (p<0,001), nicht jedoch zwischen t2 und t3 (45,7 ng/ml (27,4 – 66,6)) (Abbildung 7).
P < 0,001 P < 0,001
