Die Auswirkung der Translokation t(8;21) auf das Adhäsions- und Aggregationsverhalten von AML M2 Leukämiezelllinien

Aus der Abteilung Hämatologie, Hämostaseologie und Onkologie (Leiter: Prof. Dr. med. A. Ganser)

im Zentrum Innere Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover

Die Auswirkung der Translokation t(8;21) auf das Adhäsions- und Aggregationsverhalten von AML M2 Leukämiezelllinien

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Anja Kratochwille aus Gehrden

Hannover, 2007

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 09.07.2008.

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Gerhard Heil Referent/Referentin: PD Dr. med. Kathrin Seidemann

Korreferent: PD Dr. med. Zhixiong Li

Tag der mündlichen Prüfung: 09.07.2008

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Karl Welte

Frau Prof.’in Dr. Sylvia Glüer Prof. Dr. Dietrich Peest

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1. Die Hämatopoese 1

1.1.1. Das Stammzellmodell 1

1.1.2. Das Knochenmark 2

1.1.3. Interaktion hämatopoetisches Mikroenvironment - hämatopoetische

Vorläuferzellen 3

1.1.4. Zytokine 4

1.1.5. Rezeptoren 5

1.1.5.1. Integrine 6

1.1.5.2. Immunglobulin-Supergen-Familie 7

1.1.5.3. Zytokinrezeptoren 8

1.2. Akute myeloische Leukämien 9

1.2.1. Entstehung von Leukämien 9

1.2.2. Diagnostik und Einteilung der akuten myeloischen Leukämie 9 1.2.3. Therapie der akuten myeloischen Leukämie 12 1.2.4. Prognostische Faktoren bei den akuten myeloischen Leukämien 12 1.2.5. Genetische Veränderungen bei akuten myeloischen Leukämien 13 1.2.6. Die Translokation t(8;21) bei den akuten myeloischen Leukämien 13 1.2.7. Die Fusionspartner der Translokation t(8;21): AML1 und ETO 14 1.2.8. Das Fusionsprotein AML1/ETO und seine pathophysiologische

Bedeutung 16

2. Zielsetzung 19

3. Material und Methoden 20

3.1. Zellkultur 20

3.1.1. Zelllinien 20

3.1.2. Transfektion der HL60 Zellen 20

3.1.3. Zellkulturbedingungen 21

3.1.4. Viabilitätsbestimmung 21

3.1.5. Stimulation der Zellen 22

Inhaltsverzeichnis II

3.1.5.1. Stimulation der Zellen für den Adhäsionsassay 22 3.1.5.2. Stimulation der Zellen für die homologe Aggregation 22 3.2. Nachweis des Fusionstranskriptes AML1/ETO mittels reverser

Transkriptase (RT) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 23

3.2.1. Isolation von Ribonukleinsäuren 23

3.2.2. cDNA-Synthese 23

3.2.3. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 24

3.2.3.1. PCR-Ansatz für die erste Amplifikation (First-Round PCR) 25 3.2.3.2. PCR-Ansatz für die zweite Amplifikation (nested PCR) 25 3.2.3.3. Reaktionsprotokoll für die erste Amplifikation 26

3.2.3.4. Reaktionsprotokoll für die nested PCR 26

3.2.3.5. Primersequenzen 26

3.3. Durchflusszytometrie-Analyse der Oberflächenmarker von Kasumi-1,

HL60 und den AML-1/ETO+ Klonen 27

3.4. Adhäsionsassay 27

3.4.1. Beschichtung der Platte mit Fibronektin 27

3.4.2. Ansatz des Adhäsionsassays 28

3.4.3. Auswertung des Adhäsionsassays 28

3.5. Homologe Aggregation 29

3.5.1. Ansatz der homologen Aggregation 29

3.5.2. Auswertung der homologen Aggregation 29

4. Ergebnisse 31

4.1. Expression von AML-1/ETO in den HL60 Klonen 31

4.2. Durchflusszytometrie-Analyse (FACS) der Oberflächenmarker von

Kasumi-1, HL60, sowie der Klone von HL60 32

4.3. Adhäsion an Fibronektin 33

4.3.1. Adhäsion ohne Stimulation 33

4.3.2. Adhäsionsassay an Fibronektin unter Stimulation mit IFNγ

und TNFα 36

4.4. Aggregationsassay 42

4.4.1. Aggregation ohne Stimulation 42

4.4.2. Aggregationsassay unter Stimulation mit TNFα und IFNγ 47

Inhaltsverzeichnis III

5. Diskussion 58

5.1. Akute myeloische Leukämie mit Translokation t(8;21) 58

5.2. Zelllinien 58

5.3. Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion 59

5.4. Adhäsionsassay an Fibronektin 59

5.4.1. Funktionsmoleküle der Adhäsion an Fibronektin 59 5.4.2. Vergleich des Adhäsionsverhalten der Wildtypen Kasumi-1

und HL60 60

5.4.3. Adhäsionsverhalten der t(8;21) positiven HL60 Klone 61 5.4.4. Adhäsion unter Stimulation mit INFγ und TNFα 62

5.5. Homologe Aggregation 63

5.5.1. Funktionsmoleküle der homologen Aggregation 63 5.5.2. Vergleich des Aggregationsverhalten zwischen den Wildtypen

Kasumi-1 und HL60 64

5.5.3. Aggregationsverhalten der t(8;21) positiven Klone 65 5.5.4. Aggregation unter Stimulation mit INFγ und TNFα 66

6. Zusammenfassung 68

7. Literaturverzeichnis 70

8. Lebenslauf 83

9. Danksagung 85

10. Erklärung 86

1. Einleitung 1

1. Einleitung

1.1. Die Hämatopoese

1.1.1. Das Stammzellmodell

Der Begriff der Hämatopoese bezeichnet den Vorgang der Blutzellbildung aus einer pluripotenten Stammzelle. Die Entwicklung der hämatopoetischen Zellen erfolgt in drei Stufen: Durch die Wirkung verschiedener Wachstumsfaktoren, den sogenannten Colony Stimulating Factors (CSFs), und Interleukinen kann die Stammzelle proliferieren und sich über die verschiedenen determinierten Vorläuferzellen in adulte erythropoetische, granulozytäre, lymphozytäre oder thrombozytäre Zellen ausdifferenzieren [Metcalf, 1977;

Groopman et al., 1989; Levésque et Simmons, 1999]. Die pluripotente Stammzelle ist in der Lage mit Hilfe der sogenannten Selbsterneuerungskapazität durch Replikation das blutbildende System zu erhalten. Ein wesentlicher Mechanismus dieses Ausreifungsprozesses wird durch eine rezeptorvermittelte Wechselwirkung zwischen den Vorläuferzellen und der Umgebung im Knochenmark vermittelt. Während dieses Ausreifungsprozesses verlieren die differenzierten Zellen allerdings die Pluripotenz der ursprünglichen Stammzelle, beziehungsweise der Vorläuferzellen. Anhand von morphologischen und zytochemischen Kriterien sowie durch die Expression von bestimmten Oberflächenantigenen, welche in bestimmten Reifungsstadien der Zelle expremiert werden, ist es möglich, einzelne Zellen hinsichtlich ihrer Ausreifungslinie (zum Beispiel lymphatisch oder myeloisch) und ihres Ausreifungsgrades zu charakterisieren und identifizieren. In vitro kann dies über flusszytometrische Analysen der Blutzellen erkannt und ihnen dann bestimmte Genexpressionsprofile zugeordnet werden [Foon et Todd, 1986; Nathan, 1987; Akashi et al., 2000]. Welchen Differenzierungsweg die Tochterzellen einer Stammzelle einschlagen wird entsprechend dem physiologischen Bedarf variabel gesteuert [Potten et Loeffler, 1990]. Somit kann zum einen unter normalen körperlichen Bedingungen eine “steady-state”-Hämatopoese durch die pluripotente Stammzelle aufrechterhalten werden. Zum anderen ist es dem hämatopoetischen System möglich bei Stress auf den Organismus, wie traumatischen oder inflammatorischen Prozessen, mittels einer Gruppe hormonartiger Polypeptide, den

1. Einleitung 2

sogenannten Zytokinen, die Produktion der benötigten Blutzellen zu vervielfachen und somit dem veränderten Bedarf an bestimmten Blutzellen gerecht zu werden [Moore, 1991].

1.1.2. Das Knochenmark

Die Blutbildung findet beim Erwachsenen in den Markhöhlen der Knochen, im sogenannten roten Knochenmark, statt, welches von einem venösen Sinussystem durchzogen ist. Zwischen den Spongiosabälkchen befindet sich somit ein extravasaler Raum, in dem sich die hämatopoetischen Zellen, abgegrenzt vom peripheren Blut, entwickeln können [Lichtman, 1981].

Charakteristische Zellverbände mit entsprechender Zellzusammensetzung bilden die eigentlichen Blutbildungsstätten. Zu diesen gehören unter anderem erythroblastische Zellanreicherungen, in denen sich Erythrozyten im engen Zusammenhang mit Muttermakrophagen entwickeln. Ebenso gibt es granulozytäre Zellverbände, die aus granulozytären Vorläuferzellen, Lymphozyten und überlagernden Stromazellen bestehen.

Ferner existieren noch Zellansammlungen, in denen sich hauptsächlich Fettzellen, Fibrozyten und Makrophagen ansiedeln, aus denen innerhalb von zwei bis drei Wochen myeloide Zellen entstehen können [Allen et al., 1990; Blazsek et al., 1990]. Ein Netzwerk aus heterogenen Stromazellen durchzieht diese Blutbildungsstätten und sezerniert eine extrazelluläre Matrix (ECM) [Klein et al., 1995]. Die ECM besteht unter anderem aus Proteinen wie Collagen I, III und IV, Laminin, Chondroitinsulfat, Thrombospondin, Haemonectin, Heparansulfat, Hyaluronsäure und Fibronektin [Zuckermann, 1984; Gordon, 1988; Allen et al., 1990;

Heremans et al., 1990; Long et Dixit, 1990; Kjellen et Lindahl, 1991]. Im Zusammenspiel mit den hämatopoetischen Wachstumsfaktoren bilden die Stromazellen und die extrazelluläre Matrix das sogenannte hämatopoetische Mikroenvironment [Lévesque et Simmons, 1999].

Diese ist als eine strukturierende, supportive und integrative Schicht für die Differenzierung, Proliferation und Migration von hämatopoetischen Zellen entscheidend [Dexter et al., 1977;

Zuckermann et Wicha, 1983; Cashman et al., 1985]. Die hämatopoetischen Vorläuferzellen werden über verschiedene stromazelluläre Interaktionsmechanismen mit dem hämatopoetischen Mikroenvironment an den Stellen mit höheren Wachstumsfaktor- konzentrationen stabilisiert, so dass eine Differenzierung und Proliferation sowie deren Regulation ermöglicht wird [Lesley et al., 1993; Bendall et al., 1993].

1. Einleitung 3

Die Migration aus dem blutbildenden Mark in das periphere Blutsystem als Endstadium der Blutbildung wird den hämatopoetischen Zellen normalerweise erst nach ihrer vollständigen Ausdifferenzierung ermöglicht [Klein et al., 1995].

1.1.3. Interaktion hämatopoetisches Mikroenvironment - hämatopoetische Vorläuferzellen

Die Kontakte der Vorläuferzellen und adulten Blutzellen mit Strukturen des hämatopoetischen Mikroenvironment sind vielschichtig. Sie spielen eine Rolle bei der Lokalisation von hämatopoetischen Vorläuferzellen im Mikroenvironment, der Regulation der Blutbildung über Zytokine und Matrix, dem “Homing” von Stammzellen, das heißt dem Auffinden des Knochenmarkes und das dortige Ansiedeln von Stammzellen im Rahmen einer Knochenmarktransplantation und dem Ausschleusen der adulten Blutzellen aus dem Marksinussystem. Auch für die transendotheliale Emigration aus dem peripheren Gefäßsystem in Entzündungsgebiete und die Stimulation der antiinflammatorischen Zellfunktionen lymphoider und myeloider Zellen sind Kontakte mit anderen Zellen oder der Matrix entscheidend [Collins, 1995].

Zelluläre Interaktion im Knochenmark kann man grob in drei Kategorien unterteilen:

- Zell/Zell-Interaktion - Zell/ECM-Interaktion

- Zell/Wachstumsfaktor-Interaktion.

Jede dieser einzelnen Interaktionsmuster besitzt eine funktionelle Bedeutung für die reifenden und reifen Blutzellen. In vivo ist die Situation komplexer, da die einzelnen Interaktionen untereinander verknüpft sind [Long, 1992]. Beispiele für die Interaktionen siehe Abb. 1.1.

1. Einleitung 4

Abb. 1.1: Interaktionen Mikroenvironment-Vorläuferzellen [nach Long, 1992]

1.1.4. Zytokine

Um Informationen zwischen Zellen weiterzuleiten und auszutauschen, bedient sich der Organismus interzellulärer Mediatoren, den sogenannten Zytokinen. Diese hormonartigen Proteine werden von verschiedenen Zellarten gebildet und können in löslichen und membrangebundenen Formen zur Aktivierung von Zellen beitragen.

Plasmalösliche Zytokine sind hormonartige Polypeptide, die vorwiegend Zellen in der direkten Umgebung durch eine parakrine oder autokrine Sekretion beeinflussen [Schrader, 1992].

Zu der Gruppe der löslichen Zytokine zählt man die Wachstumsfaktoren, die Interleukine (IL), Tumor Nekrose Faktor (TNF), Transforming-growth-factor (TGF), Platelet-derived- growth-factor (PDGF) und die Interferone [Moore, 1991].

Wichtig ist auch die Rolle der Zytokininteraktion für die Modulation der Immunantwort auf eine Infektion oder ein Trauma. Sie verstärken oder inhibieren im Rahmen dessen lokale oder systemische Reaktionen durch Einwirkung auf die Migration, Proliferation und Differenzierung der Regulator- und Effektorzellen des Immunsystems [Schrader, 1992].

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1. Einleitung 5

Im Rahmen der Hämatopoese dient die Interaktion der Zytokine in erster Linie der Unterhaltung der sogenannten “steady-state”-Hämatopoese [Miyajima et al., 1992]. Die Zytokine, die gleichermaßen die Teilung und Differenzierung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen und die Funktion von reifen Zellen regulieren, sind hauptsächlich die Wachstumsfaktoren (G-CSF, GM-CSF, CSF-1) und IL-3 [Metcalf, 1989]. Ohne die Anwesenheit dieser Zytokine kommt es zum Zelltod (Apoptose), wodurch sie somit auch auf die Lebensdauer der Blutzellen Einfluß nehmen [Williams et al., 1990b].

Eine Vielzahl von Zytokinen liegen nicht nur in einer löslichen, sondern auch in einer an die Zellmembran gebundenen Form vor, wie zum Beispiel IL-1, TNF-α, M-CSF, SCF und CD23.

Möglicherweise besitzen diejenigen Zytokine, welche membrangebunden sind, andere physiologische Aufgaben [Matsushima et al., 1986; Rettenmeier et al., 1987; Rettenmeier, 1989; Flanagan et al., 1991].

1.1.5. Rezeptoren

Für die komplexen Interaktionsmuster benötigen die Zellen spezielle Oberflächenstrukturen, die zum einen in der Lage sind, den Zellkontakt (die Adhäsion) zu vermitteln, als auch Signale von anderen Zellen oder Proteinen zu empfangen und sie in das Zellinnere weiterzuleiten.

Diese charakteristischen Rezeptoren sind meist integrative Oberflächenmoleküle, die die zelluläre Interaktion mit der Zellumgebung ermöglichen. Unterschiedliche Rezeptoren auf den Blutzellen ermöglichen dabei natürlich unterschiedliche Funktionen. Auf den Blutzellen im Knochenmark werden beispielsweise Integrine, Superimmunglobuline, als auch Kadherine, Sialomucine und CD44-Moleküle expremiert, wobei den Integrinen eine wichtige Rolle zukommt [Hirsch et al., 1996; Lévesque et al., 1996]. Für die Transmigration aus den Gefäßen durch das Endothel in Entzündungsgebiete sind Selektine, aber auch Integrine und Superimmunglobuline von entscheidender Bedeutung [Collins, 1995]. Da gerade den Integrinen und Superimmunglobulinen für die Reifung und Funktion der hämatopoetischen Zellen eine bedeutende Rolle zuzukommen scheint, wird auf sie im weiteren Verlauf genauer eingegangen.

1. Einleitung 6 1.1.5.1. Integrine

Die Integrine sind eine Familie von Glycoproteinen, die aus nicht kovalent gebundenen Heterodimeren (α- und β-Ketten) aufgebaut sind und nach der Konfiguration ihrer β- Untereinheit entsprechend unterteilt werden [Hynes, 1987].

Unter den Integrinen sind die β₁-Integrine, “very late activation antigen” (VLA) genannten Integrine, die bedeutendsten Rezeptoren für die Adhäsion an die extrazelluläre Matrix im Knochenmark. Hierbei binden VLA-1, -2, -3 und insbesondere VLA-6 an Laminin, VLA-1, -2 und -3 an Kollagen und VLA-3, -4 und VLA-5 an Fibronektin [Bendall et al., 1993]. Eine stadienspezifische Adhäsion hämatopoetischer Zellen an das Stroma und die ECM ist bereits seit längerem bekannt [Clark et al., 1992]. Über die Adhäsion der Integrine an die Proteine der ECM kann das Wachstum und die Differenzierung der Blutzellen reguliert werden, denn durch die Bindung an die Rezeptoren werden Signale von der ECM in die Zelle weitergeleitet.

So proliferieren beispielsweise Myoblasten durch die Bindung an Fibronektin, stoppen aber das Wachstum durch die Bindung an Laminin [Giancotti et Ruoslathi, 1999; Lévesque et al., 1996].

Die drei Mitglieder der β₂-Untergruppe (LFA-1, Mac-1 und p150,95) besitzen die gleiche β- Einheit aber unterschiedliche α-Ketten [Hynes, 1992]. LFA-1 bindet zum Beispiel an die

“intercellular adhesion molecule”-1, -2 und -3 Rezeptoren (ICAM-1, -2, -3), die sich unter anderem auf Endothelzellen befinden (siehe Tabelle 1). Gerade diese Bindung ist wichtig für die Transmigration der Leukozyten durch das Gefäßendothel in den extravaskulären Raum im Rahmen einer Immunantwort, da nach der lockeren Anhaftung am Gefäßendothel durch die Selektine die β₂-Integrine mit den ICAM-Rezeptoren die feste Adhäsion vermitteln [Collins, 1995; Springer, 1990; Springer, 1994]. Bei der β2-Integrin-Defizienz, dem Leukozyten- Adhäsions-Defizit (LAD) beispielsweise, kommt es dementsprechend zu Wundheilungsstörungen und gehäuften Infekten.

Weiterführende Untersuchungen haben gezeigt, dass ein Zusammenwirken der verschiedenen Adhäsionsrezeptoren bei der Adhäsion im Knochenmark stattfindet [Bendall et al., 1993].

Tabelle 1.1 zeigt einige Beispiele von Integrinen mit ihren Bindungspartnern und ihren Herkunftszellen.

1. Einleitung 7

Molekül Größe (kD)

Namen Bindet an Expression durch

α4β1 150/130 VLA-4, CD49d/CD29

VCAM-1 Fibronektin

B- und T-Zellen, Monozyten α4β7 150/120 LPAM-1 MadCAM-1, VCAM-1 B- und T-Zellen

αLβ2 180/95 LFA-1, CD11a/CD18 ICAM-1,-2 und -3 B- und T-Zellen, Monozyten, PMN

αMβ2 165/95 Mac-1,CR3, CD11b/CD18

ICAM-1,iC3b, Fibrinogen, Faktor X

Monozyten, PMN αXβ2 150/95 P150/95,

CD11c/CD18

iC3b, Fibrinogen Monozyten, PMN Tab. 1.1: Die Integrinfamilie (Auswahl einiger Vertreter) [nach Collins, 1995]

1.1.5.2. Immunglobulin-Supergen-Familie

Die Proteine der Immunglobulin-Supergen-Familie weisen mehrere immunglobulinartige Domänen auf, welche aus einem Dimer von zwei antiparallelen β-Strängen besteht [Williams et Barclay, 1988]. Zu dieser Familie gehören unter anderem der T-Zell-Rezeptor, die Immunglobuline, die MHC-I- und -II -Moleküle, CD4 und CD8 sowie die Zell-Adhäsions Moleküle (CAM) [Long et Dixit, 1990]. ICAM-1 und ICAM-2 (intercellular adhesion molecule-1 und -2) sind ebenfalls dieser Familie zuzuordnen und fungieren als Adhäsionsrezeptoren und Bindungspartner für LFA-1 (siehe auch 1.1.5.1.). Durch ihre Expression auf Endothelzellen spielen sie daher eine Rolle bei der Immunantwort. Des Weiteren sind die Moleküle der Immunglobulin-Supergen-Familie auch zur homotypischen Adhäsion fähig. Das heißt sie besitzen die Fähigkeit an gleiche Zellen zu binden.

ICAM-1 ist auch auf hämatopoetischen Vorläuferzellen zu finden. Bei 50% der granulo- zytären Vorläuferzellen konnte ICAM-1 gefunden werden. Der Rezeptor geht allerdings während des Reifungsprozesses verloren [Arkin et al., 1991].

1. Einleitung 8

Tab. 1.2: Die Immunglobulin-Supergen-Familie (Auswahl) [nach Collins, 1995]

1.1.5.3. Zytokinrezeptoren

Die Wirkung der Zytokine und Wachstumsfaktoren wird hauptsächlich über Tyrosin-Kinase- Rezeptoren vermittelt.

Die Phosphorylierung von Tyrosinresten spielt eine entscheidende Rolle in der Signal- transduktion vieler wichtiger Zellfunktionen wie Zellaktivierung, Zellzyklusprogression, zytoskeletale Veränderungen, Zellbewegung, Zelldifferenzierung und Apoptose. Es werden Rezeptor- und Nicht-Rezeptor-Kinasen unterschieden.

Die Tyrosin-Kinase-Rezeptoren verfügen alle über einen ähnlichen Aufbau mit einer Liganden bindenden extrazellulären Domäne, einem transmembranösen Anteil und einem intrazellulären Tyrosinkinase tragenden intrazellulären Bereich. Ungefähr zwanzig verschiedene Klassen werden anhand des intrazellulären Bereiches unterschieden. Einige der Rezeptoren werden auf hämatopoetischen Zellen gefunden und zum Teil auch mit Pathogenese von Leukämien in Verbindung gebracht. Zum Bespiel wurden Mutationen des Klasse-III-Rezeptors c-KIT (PDGF Rezeptor Familie) mit Core-Binding-Factor-Leukämien, solche mit dem Karyotyp inv(16) oder t(8;21), assoziiert.

Insgesamt können Zytokine mit den Adhäsionsrezeptoren synergieren und proliferative und differenzielle Signale in die Zelle weiterleiten [Coulombel et al., 1997; Reilly, 2003].

Molekül Größe (kD)

Expression auf Ig Domäne Bindet an Funktion

ICAM-1 (CD54)

90-115 Endothelzellen, hämatopoetische Vorläuferzellen

5

LFA-1, Mac-1

Adhäsion, Aktivierung/ Arrest, Transmigration

ICAM-2 (CD102)

55-65 Endothelzellen,

Lymphozyten 2 LFA-1 Adhäsion, Aktivierung/ Arrest VCAM-1

(CD106)

110 Endothelzellen, Makrophagen, andere

7

VLA-4, LPAM-1

Adhäsion, Aktivierung/ Arrest

MadCAM-1 58-66 Endothelzellen

3

LPAM-1, L-Selektin (CD62L)

Adäsion, Aktivierung/ Arrest

PECAM-1 (CD31)

120-130 Endothelzellen, Thrombozyten, Lymphozyten

6

PECAM-1 Transmigration

1. Einleitung 9

1.2. Akute myeloische Leukämien

1.2.1 Entstehung von Leukämien

Akute Leukämien sind heterogene maligne Erkrankungen der Hämatopoese, die aus der klonalen Proliferation einer transformierten hämatopoetischen Vorläuferzelle entstehen.

Dabei verlieren die malignen Zellen (Blasten) ihre physiologische Eigenschaft zur Differenzierung in adulte Blutzellen bei anhaltender Fähigkeit zur Proliferation. Daraus resultiert die Anreicherung der Blasten im Knochenmark, im peripheren Blut und eventuell in extramedullären Organen sowie die Verdrängung der normalen Hämatopoese. Letztendlich kommt es zur hämatopoetischen Insuffizienz mit dem klinischen Bild der Anämie, Granulozytopenie und Thrombopenie.

Unbehandelt führt eine akute Leukämie innerhalb weniger Monate zum Tode, meist infolge von Infektionen oder Blutungen [Vellenga et al., 1987; Athens et Ward, 1993].

Die akuten Leukämien werden anhand der Herkunft der Zellen in lymphatische und myeloische Formen unterteilt.

1.2.2. Diagnostik und Einteilung der akuten myeloischen Leukämie (AML)

Die akute myeloische Leukämie ist dementsprechend charakterisiert durch die Akkumulation einer großen Anzahl von abnormalen Zellen der myeloischen Reihe (sogenannte Blasten), die ihre Differenzierungsfähigkeit in funktionelle reife Granulozyten oder Monozyten verloren haben [Filakow et al., 1987].

Bei der Beurteilung von Ausstrichen des peripheren Blutes und Knochenmarkes werden die akuten myeloischen Leukämien anhand von morphologischen und zytochemischen (Per- oxidase, Esterase) Kriterien der dominierenden Blastenpopulation charakterisiert. Weiterhin gelingt es mit Hilfe der Immuntypisierung eine weiterführende Klassifizierung der Blasten anhand der Expression charakteristischer zytoplasmatischer und membranständiger Antigene vorzunehmen (siehe auch 1.1.1.). Gemäß der French-American-British-Klassifikation (FAB) unterteilt man die Leukämien durch die erwähnten morphologischen und zytochemischen Untersuchungen in die Subtypen FAB MO-M7 (siehe Tabelle 1.3) [Bennet et al., 1985; Foon et Todd, 1986; Freedman et Nadler, 1987; Bene et al., 1995].

1. Einleitung 10

FAB Bezeichung

M0 AML ohne Ausreifung

M1 AML mit minimaler morphologischer Ausreifung M2 AML mit morphologischer Ausreifung

M3 Akute Promyelozytenleukämie M4 Akute myelomonozytäre Leukämie M5a/b Akute Monoblasten-/Monozytenleukämie M6 Akute Erythroleukämie

M7 Akute Megakaryoblastenleukämie

Tab. 1.3: FAB-Klassifikation der akuten myeloischen Leukämie [nach Bennet et al., 1985]

Zusätzlich stehen noch weitere diagnostische Möglichkeiten zur Verfügung, wie die Elektronenmikroskopie, die molekularbiologische Untersuchung und die Zytogenetik, bei der Veränderungen des genetischen Materials aufgezeigt werden können. In der WHO-Klassifi- kation sind diese neuen Untersuchungsmöglichkeiten eingeflossen, so dass anhand von Morphologie, Enzymchemie, Immunologie, klinischen Daten und genetischen Merkmalen die akuten Leukämien über die FAB-Klassifikation hinaus weiter differenziert werden können (siehe Tab. 1.4) [Vardiman et al., 2002].

1. Einleitung 11

Akute myeloische Leukämie mit wiederkehrenden genetischen Abnormalitäten Akute myeloische Leukämie mit t(8;21)(q22;q22), (AML1/ETO)

Akute myeloische Leukämie mit abnormer Knochenmarkeosinophilie und in16(p13q22) oder t(16;16)(p13;q22), (CBFβ/MYH11)

Akute Promyelozytenleukämie mit t(15;17)(q22;q12), (PML/RARα) und Varianten Akute myeloische Leukämie mit 11q23 (MLL) Abnormalitäten

Akute myeloische Leukämie mit mehrreihiger Dysplasie Mit vorhergehendem MDS oder MDS/MPD

Ohne Vorhergehendem MDS oder MDS/MPD, aber mit Dysplasie in mindestens 50% der Zellen in zwei oder mehr myeloischen Reihen

Akute myeloische Leukämie und Myelodsyplastisches Syndrom, therapieassoziiert Alkylierende Substanzen/Bestrahlungs-assoziierte Form

Topoisomerase II Inhibitoren-assoziierte Form (einige können lymphoid sein) Andere

Akute myeloische Leukämien, die nicht anders klassifiziert werden Akute myeloische Leukämie, minimal differenziert

Akute myeloische Leukämie ohne Ausreifung Akute myeloische Leukämie mit Ausreifung Akute myelomonozytäre Leukämie

Akute monoblastäre/akute monozytäre Leukämie

Akute Erythroleukämie (erythromyelozytär oder rein erythrozytär) Akute megakaryoblastäre Leukämie

Akute Leukämie mit Basophilie Akute Panmyelose mit Myelofibrose Myeloisches Sarkom

Tab. 1.4: WHO-Klassifikation der akuten myeloischen Leukämie [nach Vardiman et al., 2002]

1. Einleitung 12

1.2.3. Therapie der akuten myeloischen Leukämie (AML)

Die Therapie der AML erfogt heute in kurativer Absicht mit dem Ziel einer vollständigen Eradikation des leukämischen Klons und damit einer Heilung des Patienten. Die dafür benötigte Chemotherapie gliedert sich hierfür in mehrere Abschnitte: Unter der Induktions- therapie wird die komplette Remission (CR) angestrebt, das heißt die Reduktion der leukämischen Zellmassen unter die Nachweisgrenze von <5% Blasten im normozellulären Knochenmark, das Verschwinden eventuell vorhandener extramedullärer leukämischer Manifestationen und die Rekonstruktion einer normalen Hämatopoese mit Normalisierung des peripheren Blutbildes. Die Induktionstherapie wird als Kombinationschemotherapie verabreicht. Ziel der anschließend verabreichten Postremissionstherapie ist die vollständige Vernichtung aller im Körper verbliebenen Leukämiezellen. Alternativ anwendbar ist hier die subletale Chemo- und/oder Strahlentherapie mit anschließender autologer oder allogener Stammzelltransplantation [Heil et al., 1997; Heil et Ganser, 1998].

1.2.4. Prognostische Faktoren bei den akuten myeloischen Leukämien

Der Therapieerfolg hängt von individuellen Prognosefaktoren ab. Neben dem Alter und dem Ansprechen auf die Chemotherapie (Chemosensitivität der Leukämiezellen), der anfänglichen Leukozytenzahl sowie dem eventuellen Vorhandensein einer vorbestehenden hämato- logischen Erkrankung (im Sinne einer sekundären Leukämie), ist der Karyotyp der Leukämiezellen für die Prognose von entscheidender Bedeutung. In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einem komplexen Karyotypen (drei oder mehr Aberrationen), mit –5/del(q5) oder mit inv(3) eine schlechtere Prognose haben und somit einer Hochrisikogruppe zuzuordnen sind. Einer intermediären Risikogruppe sind beispielsweise Patienten mit einem normalen Karyotypen oder mit t(9;11) zuzuordnen. Im Gegensatz dazu zeigen Patienten mit t(8;21) und inv(16) eine hohe Rate an kompletten Remissionen (ca. 90%) mit einer vergleichsweise günstigen Langzeitprognose [Bloomfield et al., 1998; Bullinger et al., 2004]. Trotz der günstigen Ergebnisse erleidet dennoch ein deutlicher Prozentsatz der Patienten ein Leukämierezidiv, an dessen Folgen der Patient schließlich verstirbt.

1. Einleitung 13

1.2.5. Genetische Veränderungen bei akuten myeloischen Leukämien

Die Entstehung einer Leukämie ist nach gegenwärtigem Vertändnis durch kumulierende genetische Veränderungen in hämatopoetischen Stamm- oder Vorläuferzellen charakterisiert [Golub, 1999]. Diese Veränderungen können die Chromosomenzahl (numerische Aberrationen, z.B. Monosomien und Trisomien), die Lokalisation der Gene auf den Chromosomen und damit die Reihenfolge des Ablesens der Gene (strukturellen Aberrationen, z.B. Translokationen und Inversionen) oder lokale Veränderungen eines Genes (Punktmutation) betreffen.

Bei der Translokation wird zum Beispiel ein Teilstück des Genoms aus einer Ursprungslokalisation herausgeschnitten und an einer anderen Stelle auf einem anderen Chromosom wieder eingebaut. Die neu verbundenen Genabschnitte können nun als ein neues, unphysiologisches Gen fungieren.

Häufig sind bei solchen Veränderungen Genabschnitte betroffen, die für die Hämatopoese wichtige regulative Gene enthalten. Dies können beispielsweise Protoonkogene oder Transkriptionsfaktoren sein. Wird die genetische Information dieser Gene nun an einem anderen Platz beziehungsweise in einem anderen Zusammenhang abgelesen, können die neu kodierten Proteine sich in Struktur und Funktion von den ursprünglichen Proteinen unterscheiden und die physiologische Hämatopoese dadurch beeinflussen [Nucifora et Rowley, 1995; Look, 1997]. Einige dieser genetischen Transformationen konnten gezielt mit bestimmten malignen hämatologischen Veränderungen in Zusammenhang gebracht werden.

Verschiedene genetische Veränderungen können dabei zum Teil bestimmten Subgruppen der AML zugeordnet werden. So kann die inv(16) bei der AML FAB M4 mit abnormen Eosinophilen (M4Eo), die t(15;17) bei der AML FAB M3 und die t(8;21) bei der AML FAB M2 in einem relativ hohen Prozentsatz gefunden werden [Greef et Hagemeijer, 1996].

1.2.6. Die Translokation t(8;21) bei akuten myeloischen Leukämien

Die Translokation t(8;21) ist neben der inv(16) und der t(15;17) die häufigste strukturelle chromosomale Abnormalität bei AML [Greef et Hagemeijer, 1996]. Die Leukämien mit der Translokation t(8;21) haben in ca. 90% der Fälle eine M2-Morphologie nach der FAB- Klassifikation, beziehungsweise ca. 20% der M2-Leukämien weisen eine t(8;21) auf.

Allerdings ist die Translokation t(8;21) auch in Leukämien der Gruppe M1 und M4 und bei

1. Einleitung 14

Myelodysplastischen Syndromen in geringer Häufigkeit zu finden. Morphologisch charak- teristisch für die AML-Blasten mit Translokation t(8;21) ist die Größe, zytoplasmatische Vakuolen, Auftreten eines einzelnen Auer-Stäbchens und zahlreiche dysplastische Granula, eine Pseudo-Pelger-Huet-Anomalie und eine Knochenmarkseosinophilie. Immuno- phänotypisch zeigt sich eine Expression von CD19, CD56 und CD34. CD2 und CD7 werden dagegen selten expremiert und für CD33 sind die Blasten negativ [Hurwitz et al., 1992].

Leukämien mit Translokation t(8;21) treten häufiger bei jüngeren Patienten auf und sind mit dem Auftreten von extramedullärer Leukämiemanifestationen und Myelosarkomen assoziiert.

Therapeutisch zeigen Leukämien mit der Translokation t(8;21) ein gutes Ansprechen auf Chemotherapie und ein relativ langes krankheitsfreies Überleben [Andrieu et al., 1996;

Appelbaum et al., 1998; Schlenk et al., 2004].

1.2.7. Die Fusionspartner der Translokation t(8;21): AML1 und ETO

Bei der Translokation t(8;21) wird das AML1-Gen von Chromosom 21q22 mit dem ETO- Gen auf Chromosom 8q22 fusioniert. Das gebildete Hybridgen auf Chromosom 8 wird als RUNX1/CBFA2T1 oder nach der alten Nomenklatur als AML1/ETO bezeichnet [Sakakura et al., 1994]. Durch die Expression dieses Fusionsgenes resultiert ein abnormes Fusionsprotein.

Das Protein kann mit den physiologischen Aufgaben des ursprünglichen AML1-Proteins interferieren [LoCoco et al., 1997]. AML1 wird hauptsächlich von hämatopoetischen Zellen expremiert und kodiert einen heterodimerisierenden Transkriptionsfaktor [Sawyers, 1997;

Golub, 1999].

AML1 besteht aus 250 Aminosäuren [Wang et al., 1997]. AML1 kodiert die α-Untereinheit des sogenannten Core-Binding-Factor (CBF), einem Transkriptionskomplex. Die β- Untereinheit dieses heterodimeren Transkriptionsfaktors wird von dem CBFβ-Gen auf Chromosom 16 kodiert. In dem Transkriptionskomplex ist die α-Untereinheit für die Bindung an die DNA verantwortlich. Eine mittlere Domäne aus 118 Aminosäuren der N-terminalen Region von AML1 weist eine Homologie mit dem Drosohpila melanogaster-Segmentations- Gen runt auf (runt homolgy domain, RHD). Über diese RHD bindet der Core-Binding-Factor, der Transkriptionskomplex, an eine spezifische DNA-Zielsequenz, die in einer Reihe von humanen Promotor- und Enhancerregionen vorkommt [Greef et Hagemeijer, 1996; LoCoco et al., 1997]. Zielgene, deren Transkription durch die Bindung von AML1/CBFβ an diese Region beeinflußt werden, sind unter anderen die Gene des T-Zellrezeptors, des Interleukin-3

1. Einleitung 15

(IL-3), des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden-Faktors (GM-CSF), der Myelo- peroxidase, der Neutrophilen Elastase, des Anti-Apoptosegens bcl-2 und des Kolonie- stimulierenden-Faktors-1 (M-CSF) [Shoemaker et al., 1990; Hsiang et al., 1993; Meyers et al., 1993; Zhang et al., 1994; Nuchprapyoon et al., 1994; Takahashi et al., 1995; Okuda et al., 1998; Shikami et al., 1999].

Daneben bindet AML1 an die Transkriptionskoaktivatoren p300 und CBP über seine C- terminale Region. Diese Proteine interagieren mit einer Histon-Acetyltransferase und regulieren somit die Transkription durch Remodulieren der Chromatinstruktur und Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren. Die C-terminale Region von AML1 scheint damit ebenso entscheidend zu sein für die Zelldifferenzierung und Transkriptionsaktivierung [Wang et al., 1997; Kitabayashi et al., 1998; Wang et al., 1998].

AML1 und damit der Core-Binding-Factor ist neben der t(8;21) noch an anderen Genrearrangements in humanen Leukämien beteiligt, was seine bedeutende funktionelle Rolle in der Hämatopoese unterstreicht (siehe Tabelle 1.4) [Golub, 1999] .

Translokation Gene Fusionsprotein Phänotyp

t(8;21) (q22;22) AML1 (21q22) ETO, MTG8 (8q22)

AML1/ETO AML FAB M2

t(12;21) (p13;q22) TEL (12p13) AML1 (21q22)

TEL/AML1 prä-B-ALL

t(3;21) (q26;q22) AML1 (21q22) EVI (3q26)

AML1/EVI CML, MDS

t(3;21) (q26;q22) AML1 (21q22) EAP (3q26)

AML1/EAP CML, MDS

t(3;21) (q26;q22) AML1 (21q22) MDS (3q26)

AML1/MDS MDS

inv(16) (p13;q22) CBFb (16q22) MYH11 (16p13)

CBFb/MYH11 AML FAB M4 Eo

Tab. 1.5: Übersicht über die wichtigsten strukturellen chromosomalen Aberrationen, in denen AML1 oder CBFβ involviert sind

ETO, als humanes Homolog des Drosophila Nervy Protein, kommt in mindestens zwei Isoformen vor: MTG8a mit 577 Aminosäuren und MTG8β mit 604 Aminosäuren. ETO scheint durch eine besonders starke Expression im Gehirn an der Entwicklung von Nervengewebe beteiligt zu sein [Sacchi et al., 1998].

1. Einleitung 16

ETO enthält 2 Zinkfinger-Regionen, drei Prolin/Serin/Threonin-reiche Regionen und die sogenannte PEST-Region, die für eine rasche intrazelluläre Degradation verantwortlich ist.

ETO interagiert durch seine Zinkfinger-Regionen mit den Co-Repressoren N-CoR und SMRT und rekrutiert die Histon-Deacetylasen (HDAC). Die HDAC führen durch eine verminderte Acetylierung der Histone zu einer weniger gut zugänglichen Chromatinstruktur und somit zu einer Repression der Transkription [Wang et al., 1997; Gelmetti et al., 1998; Lutterbacher et al., 1998; Miyamoto et al., 2000].

1.2.8. Das Fusionsprotein AML1/ETO und seine pathophysiologische Bedeutung

Bei der Translokation t(8;21)(q22;q22) kommt es zur Fusion des die N-terminalen 177 Aminosäuren kodierenden Abschnittes des AML1-Gens - einschließlich der DNA- und CBFβ-bindenden runt-Domäne und dem nahezu gesamten Anteil des ETO-Gens (C-terminale 575 Aminosäuren) auf dem Chromosom 8 [Miyoshi et al., 1993].

Bei der Fusion bleiben einige der Funktionen beider Gene erhalten, andere wiederum gehen verloren. So wird zum Beispiel bei der Translokation das p300-bindende C-terminale Ende von AML1 mit ETO ausgetauscht und geht verloren. Das resultierende AML1/ETO Fusionsprotein ist demnach zur Rekrutierung von p300 nicht mehr fähig. Allerdings behält das Fusionsgen seine Fähigkeit mit CBFβ den Transkriptionskomplex zu bilden und kann immer noch an seine DNA-Zielsequenz binden. Auch die transkriptionssupprimierende ETO- Eigenschaft, den N-CoR/SMRT CoR-Komplex zu bilden und HDAC zu aktivieren, bleiben dem Fusionsgen erhalten.

Das neue Protein, entstanden aus dem Fusionsgen AML1/ETO, scheint sich durch die Rekrutierung des Co-Repressor-Komplexes wie ein Transkriptionsrepressor zu verhalten, indem es zu einer Deacetylierung von Histionen und dadurch zu einer Veränderung der Chromatinstruktur von AML1-Zielgenen führt (siehe Abb. 1.2) [Downing et al., 1993; Frank et al., 1995; Gelmetti et al., 1998; Downing, 1999].

1. Einleitung 17

Abb. 1.2.: Beeinflussung von AML1 durch ETO [modifiziert nach Löwenberg et al., 1999]

Zudem ist es AM1/ETO möglich, über die runt-Domäne im Sinne eines kompetitiven Verdrängungsmechanismus mit dem Wildtyp AML1/CBFβ um die DNA-Bindungsstelle zu konkurrieren und damit die Transkription oben beschriebener Zielproteine zu beeinflussen [Meyers et al., 1993; Frank et al., 1995].

Zusätzlich scheint AML1/ETO aber auch die Transkription anderer, nicht AML1 regulierter Gene, zu unterdrücken, wie die C/EBP-ß vermittelte Transkription, ein Transkriptionsfaktor, der durch das CPBA-Gen kodiert wird. Untersuchungen haben gezeigt, dass in t(8;21) positiven Leukämien C/EBP-ß herunterreguliert wird. Auch Transfektionsexperimente und tierexperimentelle AML1/ETO-knock-in-Studien konnten zeigen, dass durch die Expression von AML1/ETO die Entwicklung einer normalen Hämatopoese sowie die Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen verhindert wird, was mit einer Verminderung des C/EBPα- Transkriptionsfaktors einhergeht. C/EBP-ß scheint daher ein wichtiger Faktor für die granulozytäre Differenzierung zu sein, zumal gezeigt werden konnte, dass in AML1/ETO positiven Zellen die Expression von C/EBP-ß die granulozytäre Differenzierung triggern kann. Der exakte Mechanismus der Unterdrückung der C/EBP-ß Expression durch das Fusionsprodukt AML1/ETO ist derzeit noch nicht genau bekannt [Pabst et al., 2002].

Zielgene ...TGTGGT...

Koaktivatoren CBFββββ

AML1 AML1

Zielgene ...TGTGGT...

CBFββββ Sin3A N-CoR

HDAC

AML1/ETO

Co-Repressor Komplex AML1/ETO

1. Einleitung 18

Untersuchungen haben gezeigt, dass AML1/ETO die Leukämogenese durch Blockierung der Zellproliferation oppositioniert, was schließlich zur Apoptose führt [Yergeau et al., 1997;

Burel et al., 2001].

Auch tierexperimentelle AML1-knock-out-Untersuchungen haben die Bedeutung von AML1 für die Hämatopoese unterstrichen. In AML1-knock-out-Mäusen zeigte sich ein schwerer Defekt der embryonalen Leberhämatopoese mit einem Fehlen von Vorläuferzellen aller drei Zellreihen [Okuda et al., 1996].

Allerdings zeigten tierexperimentelle Versuche, dass AML1/ETO-positive Zellen in SCID- Mäusen nicht in der Lage waren eine Leukämie zu induzieren [Okuda et al., 1998].

Wie genau die molekularen Besonderheiten von AML1/ETO zur Änderung der Hämatopoese führen, ist derzeit noch nicht eindeutig.

2. Zielsetzung 19

2. Zielsetzung

Die akuten Leukämien zeichnen sich durch einen Differenzierungsstopp der maligne transformierten Vorläuferzellen bei anhaltender Proliferation aus. Dadurch kommt es zu einer Anhäufung der leukämischen Blasten, die zu einer Hemmung der normalen Hämatopoese führen, an deren Folgen der Patient unbehandelt innerhalb weniger Wochen verstirbt.

Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Hemmung der Differenzierung unter anderem durch eine gestörte Zell-Zell-Interaktion der leukämischen Blasten und/oder durch eine Hemmung der Interaktion der Leukämiezellen mit der extrazellulären Matrix des Knochenmarkes zustande kommt. Die Tatsache, dass die Interaktion der Leukämiezellen mit der Matrix gestört ist, kommt auch darin zum Ausdruck, dass die Leukämiezellen im Unterschied zu den Vorläuferzellen die Blut-Knochenmarkschranke passieren können und im peripheren Blut erscheinen.

Es gibt Hinweise, dass strukturelle und/oder numerische Chromosomenveränderungen, die bei bis zu 70% der akuten Leukämien nachweisbar sind und teilweise mit einem charakteristischen Phänotyp der Leukämie einhergehen, zu einer Störung der zellulären Interaktion führen können. Obwohl die pathophysiologische Bedeutung dieser chromosomalen Veränderung im Rahmen der Leukämogenese noch nicht verstanden wird, konnte zwischenzeitlich deren prognostische Bedeutung eindeutig belegt werden.

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluß der aus der Translokation t(8;21) resultierenden Genveränderung auf die Zell-Zell-Interaktion von Leukämiezellen und deren Interaktion mit der extrazellulären Matrix zu untersuchen.

Als Untersuchungsmaterial dienten Zellen der Leukämiezelllinie Kasumi-1. Es wurde bewußt auf diese Zelllinie zurückgegriffen, da alle Zellen dieser Zelllinie die Translokation t(8;21) aufweisen und die Zellen unter standardisierten Bedingungen kultiviert und expandiert werden können. Als Kontrolle dienten Zellen der Leukämiezelllinie HL60, die keine t(8;21) Translokation aufweisen, sowie Subklone dieser Zelllinie, die sich nach der Transfektion mit der mRNA der t(8;21) Translokation in die Zellen durch die Expression des resultierenden Fusionsproduktes auszeichnen. Untersucht werden sollte zum einen die homologe Aggregation der Zellen um Informationen über die Zell-Zell-Interaktion der Zellen zu erhalten. Des Weiteren sollte die Interaktion der Zellen mit der extrazellulären Matrix des Knochenmarks untersucht werden. Dazu wurde die Adhäsion der Leukämiezellen an Fibronektin, dem wohl wichtigsten extrazellulären Matrixprotein des Knochenmarks, gewählt.

3. Material und Methoden 20

3. Material und Methoden

3.1. Zellkultur

3.1.1. Zelllinien

Sowohl für den Adhäsionsassay als auch für den Aggregationsassay wurden Zellen der akuten myeloblastischen Leukämiezelllinie Kasumi-1 mit Translokation t(8;21) und Zellen einer anderen myeloblastischen Leukämiezelllinie HL60 verwendet [Asou, 1991;

Collins, 1977]. Beide Zelllinien wurden von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkultur GmbH (DSMZ), Braunschweig, bezogen. Ebenso verwendet wurden transfezierte Klone der Zelllinie HL60 mit dem Fusionstranskript AML1/ETO.

3.1.2. Transfektion der HL60 Zellen

Bei der Transfektion wird die Oberflächenspannung der Zellmembranen durch die Elektroporation verändert und die Zellmembranen dadurch durchlässig gemacht. So können nun Plasmide, die die gewünschten DNA-Sequenzen tragen, in die Zellen gelangen und somit diese DNA-Sequenz in die DNA-Stränge der Gastzelle einbauen. Die genetisch veränderte Zelle expremiert nun die eingebaute Sequenz.

Bei der Transfektion der HL60 Zellen wurden 10⁷ HL60 Zellen mit 5 µg Plasmid-DNA pcAML1/ETO oder pcAM/Bam über eine Elektroporation (Gene pulser II, BIORAD) transfeziert. Ein pcDNA3 Vektor wurde als negative Kontrolle benutzt. Zur Herstellung des Vektors pcAML1/ETO wurde die komplette cDNA von AML1/ETO in den pcDNA3 Expressionsvektor (Invitrogen) unter Kontrolle des CMV-Promoters (pcAML1/ETO) kloniert. Für den Vektor pcAM/Bam wurde zunächst eine Deletionsmutante von AML1/ETO ohne das c-terminale Ende mit den Bindungsstellen für N-CoR und mSin3 durch dessen Verdau mit dem Restriktionsenzym BamHI hergestellt. Das daraus resultierende DNA-Fragment wurde dann in die BamHI-Schnittstelle von dem pcDNA3- Vektor kloniert (pcAM/Bam). Nach der Elektroporation (Transfektion) wurden die Zellen auf 96-Loch (Well)-Platten (Nunc) verteilt und in Gegenwart von 1500 µg/ml des

3. Material und Methoden 21

Antibiotikums Genticine (G418) kultiviert. Die transfezierten Plasmide enthalten ein Antibiotika-Resistenz- Gen. In Kultur mit einem Antibiotikum wurden so die Zellen, in denen sich die DNA- Sequenz eingebaut hat, selektiert. Die so stabilen G418 resistenten Klone wurden in der Suspensionskultur mit der gleichen Konzentration von G418 gezüchtet und auf deren AML1/ETO Expression mittels einer RT- PCR getestet.

Hergestellt wurden die Plasmide und die Klone durch Dr. rer. nat. Stefan Nagel, Abt.

Hämatologie und Onkologie, Medizinische Hochschule Hannover.

3.1.3. Zellkulturbedingungen

Beide Zelllinien wurden in RPMI 1640-Medium (GIBCO) unter Zusatz von 10%

fetalem Kälberserum (FKS) (Seromed), 1 mM L-Glutamin, 50 mg Streptomycin/Penicillin und 5% CO₂ in 50 ml Zellkulturflaschen (Falcon) im Inkubator bei 37°C kultiviert. In regelmäßigen Abständen wurden die Zellen abzentrifugiert und auf frisches Medium aufgebracht, wobei die Zellkonzentration 10⁶ Zellen pro ml betrug.

Die Klone von HL60 wurden jeweils mit G418 kultiviert.

3.1.4. Viabilitätsbestimmung

Zur Viabilitätsbestimmung in einem Parallelansatz wurden nach der Spülung mit PBS 150µl Zellsuspension mit 50µl Trypanblau versetzt und zwei Minuten inkubiert. Die toten Zellen nahmen das Trypanblau auf und färbten sich blau. Die toten wie die lebenden Zellen wurden in der Neubauer Zählkammer getrennt ausgezählt und nach der Formel ungefärbte Zellen

Viabilität % =  x 100 Gesamtzahl der Zellen

die Viabilität bestimmt.

3. Material und Methoden 22 3.1.5. Stimulation der Zellen

Sowohl die Adhäsion als auch die homologe Aggregation wurden mit nicht stimulierten als auch mit stimulierten Zellen durchgeführt, um die Induzierbarkeit der Adhäsionsmoleküle zu überprüfen.

3.1.5.1. Stimulation der Zellen für den Adhäsionsassay

Der Adhäsionsassay wurde in RPMI-1640 Medium unter Zusatz von 10% FKS, 1% l- Glutamin, 1% Streptomycin/Penicillin und bei den Klonen G418 mit Interferon γ und Tumor Nekrose Factor α (Sigma) stimuliert. Die Konzentrationen betrugen hierbei:

Interferon γ: 500 U/10⁶ Zellen/ml Tumor Nekrose Faktor α: 50 ng/10⁶ Zellen/ml

Die Zellen wurden in 10 ml Flaschen (Falcon) im Inkubator über 48 Stunden kultiviert.

Nach der Stimulation wurde der Adhäsionsassay wie im folgenden beschrieben durchgeführt.

3.1.5.2. Stimulation der Zellen für die homologe Aggregation

Auch die homologe Aggregation wurde unter Stimulation mit Interferon γ und Tumor Nekrose Faktor α durchgeführt. Stimuliert wurde jeweils mit den Konzentrationen:

Interferon γ: 500 U/2x10⁶ Zellen/ml Tumor Nekrose Faktor α: 50 ng/2x10⁶ Zellen/ml

Die Stimulationsfaktoren wurden direkt in den Ansatz gegeben, der dann wieder für 20 und 48 Stunden inkubiert wurde.

3. Material und Methoden 23

3.2. Nachweis des Fusionproduktes AML1/ETO mittels reverser Transkriptase (RT) Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

3.2.1. Isolation von Ribonukleinsäuren

Für die Isolation der Ribonukleinsäuren wurden vor dem Auspipettieren der Ansätze 2x10⁶ Zellen der jeweiligen Klone in einem Eppendorfhütchen auf 1 ml TRIZOL^ gebracht und mittels mehrfachen Resuspendierens mit einer Pipette das Zellpellet homogenisiert und lysiert. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 200 µl Chloroform (Fluka) dazugegeben. Nach Mischen auf dem Vortexter (Jürgens) und 10-minütiger Phasentrennung bei Raumtemperatur erfolgte eine 15-minütige Zentrifugation mit 14000 Umdrehungen/ Minute. Danach wurde die in der oberen wässrigen Phase befindliche RNA vorsichtig von der organischen Phase abgenommen und in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Anschließend erfolgte die RNA- Präzipitation mit 500 µl bei –20° Celsius aufbewahrtem Isopropanol (Roth). Nach Mischung auf dem Vortexter, Präzipitation bei Raumtemperatur, erneuter Zentrifugation bei 14000 Umdrehungen/Minute und erneuter Abnahme des Überstandes erfolgte eine Resuspension des RNA-Pellets mit 70% Ethanol (Riedel de Haen) sowie eine erneute Zentrifugation bei 11000 Umdrehungen/Minute. Danach wurde der Überstand vollständig abgenommen und das RNA Pellet in 20 Minuten unter laufendem Abzug bei Raumtemperatur getrocknet und schließlich in 50 µl Aqua injektabilia (Braun) aufgenommen.

3.2.2. cDNA-Synthese

Zur cDNA-Synthese mit dem Ziel, aus der isolierten RNA mittels der Reversen Transkriptase (hier mit der Reversen Transkriptase aus dem Moloney-Murine- Leukemia-Virus) [Houts et al., 1979] den komplementären DNA-Strang zu synthetisieren, wurden 5 µg RNA eingesetzt. Der Reaktionsansatz enthielt folgende Reagenzien:

1x First Strand Puffer (GIBCO BRL)

DTT (GIBCO BRL) 10 mM

dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (GIBCO BRL) je 5 mM

Random Primer (GIBCO BRL) 15 ng

RNAse Inhibitor RNA-Guard^ 33,4 Units (U)

3. Material und Methoden 24

BSA (Pharma Biotec) 3 µg

M-MLV-Reverse Transkriptase (GIBCO BRL) 200 U

Nach Denaturierung der RNA bei 70° Celsius für 10 Minuten wurde sie dem Reaktionsansatz hinzugegeben. Darauf folgte die Synthesephase bei 37° Celsius über 60 Minuten und anschließend eine Trennung der DNA-Stränge durch Denaturierung bei 95° Celsius für 5 Minuten. Alle Reaktionsschritte wurden mit einem Thermocycler (Perkin Elmar, Biometra, Landgraf) durchgeführt.

3.2.3. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Bei der Polymerase–Kettenreaktion (PCR) werden spezifische DNA-Sequenzen nach vorhergehender exponentieller Amplifikation derselben nachgewiesen. Die eigentliche Reak-tion beruht auf einen sich wiederholenden Reaktionszyklus, der sich in drei Abschnitte gliedert. Zunächst erfolgt die Denaturierung der DNA durch Erhitzen auf 90° Celsius, danach binden sich bestimmte DNA-Primer an ihre komplementären Sequenzen (Annealing) und als letztes erfolgt die Synthese des neuen DNA-Stranges mit Hilfe der DNA-Polymerase [Saiki et al., 1988].

Mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde das Fusionsprodukt AML1/ETO in den Klonen nachgewiesen, welches als Voraussetzung für das Arbeiten mit AML1/ETO positiven Zellen diente. Die PCR zur Erfassung des Fusionstranskriptes AML1/ETO wurde als sogenannte nested PCR durchgeführt. Das heißt, nach einer Amplifikation mit äußeren Primern wurde ein Teil der Reaktionsprodukte in einer zweiten PCR mit inneren, sogenannten nested Primern erneut amplifiziert, wodurch sowohl Spezifität als auch Sensitivität gesteigert wurde. Die Positionierung der Primer innerhalb der AML1/ETO cDNA ist der Abbildung 2.1. zu entnehmen.

3. Material und Methoden 25

Abb. 2.1.: Positionierung der Primer [nach Downing et al., 1993]

3.2.3.1. PCR-Ansatz für die erste Amplifikation (First-Round PCR)

Das Gesamtvolumen des PCR-Ansatzes betrug 50 µl und enthielt folgende Reagenzien:

1x PCR-Puffer (PE Biosystems) mit 1,5 mM MgCl2

Forward-Primer 8211 (Fa. Carl Roth) 0,2 µM Reverse-Primer 8212 (Fa. Carl Roth) 0,2 µM DNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (GIBCO BRL) je 200 µM Ampli-Taq^-Polymerase (PE Biosystems) 1,5 U

Dem Reaktionsansatz wurde 1 µl cDNA hinzugefügt, mit Mineralöl überschichtet und zur Reaktion gebracht.

3.2.3.2. PCR-Ansatz für die zweite Amplifikation (nested PCR)

Das Gesamtvolumen des PCR-Ansatzes betrug 50µl und enthielt folgende Reagenzien:

1x PCR-Puffer (PE Biosystems) mit 1,5 mM MgCl2

Forward Primer 8213 (Fa. Carl Roth) 0,4 µM Reverse-Primer 8214 (MWG Biotech) 2,0 µM DNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (GIBCO BRL) je 200 µM Ampli-Taq^-Polymerase (PE Biosystems) 1,25 U

3. Material und Methoden 26

Dem Reaktionsansatz wurden 2 µl des Reaktionsproduktes der ersten PCR hinzugefügt, mit Mineralöl (Sigma) überschichtet und zur Reaktion gebracht.

3.2.3.3. Reaktionsprotokoll für die erste Amplifikation 3 Minuten initiale Denaturierung bei 94°C;

35 Zyklen mit 1 Minute 94°C (Denaturierung), 1 Minute 57°C (Annealing), 2 Minuten 72°C (Amplifikation);

anschließend 10 Minuten 72°C, abkühlen auf 4°C.

3.2.3.4. Reaktionsprotokoll für die nested PCR 3 Minuten initiale Denaturierung bei 94°C;

35 Zyklen mit 1 Minute 94°C (Denaturierung), 1 Minute 55°C (Annealing), 2 Minuten 72°C (Amplifikation);

anschließend 10 Minuten 72°C, abkühlen auf 4°C.

3.2.3.5. Primersequenzen

8211

5`- AGC CAT GAA GAA CCA GG - 3`

8212

5`- AGG CTG TAG GAG AAT GG - 3`

8213

5`- TAC CAC AGA GCC ATC AAA - 3`

8214

5`- ATG GCT CGT GCC ATT AG - 3`

3. Material und Methoden 27

3.3. Durchflusszytometrie-Analyse der Oberflächenmarker von Kasumi, HL60 und den AML1/ETO

Klonen

Die Expression von Oberflächenmarkern auf Zellen von HL60, Kasumi-1 und den Klonen wurde mittels einer durchflusszytometrischen Untersuchung analysiert. Dafür wurden 10⁷ Zellen in PBS-Suspension gegeben. Bei 37°C wurden die Zellen mit einem 20% Puffer inkubiert und so die unspezifischen Bindungen geblockt. Nach der Inkubation der Zellen wurde direkt in die Lösung die mit Fluoresceinisothiocyanat- oder Phycoerythrin markierte monoklonalen Antikörper in die Zellsuspension gegeben, und bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Nach Waschen der Zellen konnte die Untersuchung am EPICSscan (Coulter Electronics, Krefeld, Germany) erfolgen. Die Antikörper wurden über Beckton Dickinson bezogen. Benutzt wurden Antikörper gegen Oberflächenmarker, die auf hämatologischen Zellen gefunden und zur Bestimmung des Reifestadiums herangezogen werden können. Benutzt wurde ein Antikörperpanel gegen folgende Oberflächenmarker: CD4, CD8, CD45, CD14, CD2, CD15, CD33, CD5, CD19, CD7, CD10, CD3, CD11b, HLA-DR; CD13, CD34, CD49d, CD1a, CD54, CD11c, CD11a, CD18, gam/del, alph/beta. Die Untersuchung wurde von dem zytologischen Labor der Abteilung für Hämatologie und Onkologie der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt.

3.4. Adhäsionsassay

Mit dem Adhäsionsassay sollte das Verhalten der beiden Zelllinien Kasumi-1 und HL60 und der Klone mit dem Fusionstranskript AML1/ETO in Bezug auf ihre Adhäsion an Fibronektin überprüft werden.

3.4.1. Beschichtung der Platte mit Fibronektin

Um die Adhäsion an Fibronektin zu ermöglichen, wurde in die Hälfte der Löcher (Wells) einer unbeschichteten non-tissue-culture-grade 96-Loch-Platte (NUNC) je 15 µl Fibronektin (GIBCO) pro Well auspipettiert. Die andere Hälfte der Wells diente als Negativkontrolle und blieb unbeschichtet. Das Fibronektin lag in einer Konzentration von 0,2 mg/ml in PBS gelöst vor.

3. Material und Methoden 28

Danach wurde die 96-Loch-Platte bei 3500g für 20 Minuten zentrifugiert, so daß das Fibronektin danach in einer dünnen Schicht über das Well verteilt vorlag. Bei Bedarf mußte dieser Vorgang verlängert oder wiederholt werden, bis eine gleichmäßige Verteilung im Well erreicht wurde. Bei Zimmertemperatur trocknete das Fibronektin dann über Nacht zu einer weißen, salzkrustenartigen Schicht an dem Boden der Wells an.

3.4.2. Ansatz des Adhäsionsassays

Um die unspezifischen Bindungen für den Assayansatz sowohl der mit Fibronektin beschichteten Wells, als auch der Wells der Negativkontrolle zu blockieren, wurde die Platte mit 100 µl/Well 5%igen BSA (Bovines Serum Albumin) in PBS für vier Stunden im Inkubator bei 37°C inkubiert. Nach Abnahme der BSA-Lösung und Waschen mit PBS wurden im dreifachen Ansatz 100 µl Zellsuspension in RPMI-1640 Medium ohne FKS in den Konzentrationen 2x10⁵/Well, 1,5x10⁵/Well, 1x10⁵/Well und 0,5x10⁵/Well auspipettiert. Danach erfolgte eine Inkubation der Platte im Inkubator bei 37°C für zwei Stunden.

Nach der Inkubation wurden die Wells dreimalig mit PBS (GIBCO) gespült. Bei jedem Waschvorgang wurde das PBS mit einer Mehrkanalpipette (Eppendorf) vorsichtig zweimal resupendiert, um so die nicht adhärierten Zellen herauszulösen. Nach dem Waschvorgang sollten in den Wells der Negativkontrolle keine Zellen mehr vorhanden sein. Anschließend wurden die in den Wells adhärierten Zellen mit 150 µl 0,06%

Formaldehyd fixiert.

3.4.3. Auswertung des Adhäsionsassays

Nach der Fixierung der Zellen wurden zur Quantifizierung der adhärierten Zellen an zwei repräsentativen Stellen die adhärierten Zellen im Well in einer 20-fachen Vergrößerung abfotografiert:

Well

Repräsentative Stellen

Nach dem Auszählen der Zellen auf den Fotos wurden die ausgezählten Zellen mit der Formel

3. Material und Methoden 29 n x AWell

Zellen/ Well =

Vergrößerung des Bildes durch den Fotoapperat

wobei: n = Mittelwert der ausgezählten Zellen AWell = Fläche des Wells

verrechnet, um die Anzahl der Zellen im Well zu erhalten.

3.5. Homologe Aggregation

Mit dem Assay sollte die homologe Aggregation der Wildtypen Kasumi und HL60 sowie die Beeinflussung derselben durch das Fusionstranskript AML1/ETO in den Klonen untersucht werden.

3.5.1 Ansatz der homologen Aggregation

Die homologe Aggregation wurde wiederum mit den Wildtypen HL60 und Kasumi als auch mit den AML1/ETO transfezierten Klonen durchgeführt.

Von der jeweiligen Zelllinie wurden für den Ansatz 100 µl Zellsuspension in eine 96- Loch-Platte (Falcon) auspipettiert. Angesetzt wurde eine Konzentration von 2x10⁶ Zellen/ml in RPMI (GIBCO) (2x10⁵ Zellen pro Ansatz). In einem Parallelansatz wurde durch Zugabe von 0,1% NaEDTA die homologe Aggregation verhindert.

Der Ansatz wurde für jeweils 20 und 48 Stunden im Inkubator (Heraeaus) bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.

3.5.2. Auswertung des Aggregationsassays

Um den unterschiedlichen Grad der Aggregation zu veranschaulichen, wurde anhand eines indirekten Scores [Rothlein et al., 1986] der Anteil der aggregierten Zellen an der Gesamtzahl ermittelt.

3. Material und Methoden 30

Dazu erfolgte die Auswertung des Aggregationsassays wiederum durch Abfotografieren der Wells an zwei representativen Stellen mit einer 10fachen Vergrößerung und Auszählen der freien, nicht aggregierten Zellen auf diesen Fotos. Gezählt wurden sowohl die Zellen aus dem eigentlichen Ansatz, als auch aus dem durch NaEDTA in der Aggregation gehinderten Parallelansatz. Aus den Mittelwerten der beiden Fotos eines jeden Wells konnte der prozentuale Wert der aggregierten Zellen mit Hilfe der Formel freie Zellen

% Aggregation = ( 1- ___________________ ) x 100 alle Zellen

errechnet werden.

4. Ergebnisse 31

4. Ergebnisse

4.1. Expression von AML1/ETO in den HL60 Klonen

Der Nachweis einer Expression des in die Zellen der Zelllinie HL60 inkorporierten Fusionproduktes AML1/ETO wurde über eine Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten- reaktion (RT-PCR) geführt. Mit der RT-PCR läßt sich eindrucksvoll die Expression der AML1/ETO RNA (Fusionstranskript) in den HL60 Klonen anhand des Nachweises einer charakteristischen Bande für AML1/ETO darstellen (Abb. 4.1.).

NC

18 26

Abb. 4.1.: Beispiel einer PCR von Klon 18 und 26 mit positivem

Nachweis des AML1/ETO Transkript (Pfeil

)

Mit dem Nachweis wurde der Erfolg der Inkorporation, beziehungsweise Transfektion des Fusionsproduktes in den HL60 Klonen erbracht und über den Zeitraum der Kultivierung verfolgt. Für die Analysen wurden zwei Klone gewählt (Klon 18 und 26), bei denen sich die Persistenz des Fusionsproduktes in den Zellen bestätigt hatte.