Aus der Klinik für Hämatologie, Hämostaseologie, Onkologie und Stammzelltransplantation der Medizinischen Hochschule Hannover
Differenzierung von AML-Zellen und deren Expressionsanalyse hinsichtlich langer nicht-kodierender RNA
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Iyas Hamwi aus Lüdenscheid
Hannover 2015
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 14.01.2016 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum Betreuer: Prof. Dr. med. Michael Heuser Referent: PD Dr. med. Jan-Henning Klusmann Korreferent: PD Dr. med. Johan Lorenzen
Tag der mündlichen Prüfung: 14.01.2016 Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Tobias Welte Prof. Dr. med. Carlos Guzman PD Dr. med. Frank Gossé
„Nur wer sein Ziel kennt, findet den Weg―
Lao-Tse
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
1.1. Akute Myeloische Leukämie ... 1
1.1.1. Definition ... 1
1.1.2. Ätiologie ... 1
1.1.3. Epidemiologie ... 2
1.1.4. Klinik, Symptome und klinische Befunde der AML ... 4
1.1.5. Einteilung der AML ... 6
1.1.6. Risikostratifizierung der AML ... 9
1.1.7. Therapie der AML ... 10
1.2. AML M3 Akute Promyelozytenleukämie ... 15
1.3. ATRA ... 18
1.4. Therapie der APL t(15;17) (q22;q21) ... 21
1.5. Nicht-kodierende RNAs ... 22
1.6. Konzept, Ablauf und Zielsetzung der Arbeit ... 27
2. Material und Methoden ... 29
2.1. Zellkultur ... 29
2.1.1. Steriltechnik ... 29
2.1.2. HL60, NB4 Zellen ... 29
2.1.3. Auftauen der Zellen ... 31
2.1.4. Zellzählung ... 32
2.1.5. Kultivierung der Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von ATRA . 32 2.1.6. Kultivierung der Zellen mit ATRA (1 µM) und DSMO (0,1 %) ... 34
2.1.7. Cytospin ... 35
2.1.8. Färbung nach Pappenheim ... 35
2.1.9. Lichtmikroskopische Darstellung der Zellen ... 36
2.2. Durchflusszytometrie (FACS) ... 36
2.3. Wiederholung der Zellkultivierung ... 38
2.4. RNA Extraktion und Analyse ... 38
2.4.1. RNA Extraktion mittels TRIzol® ... 38
2.4.2. quantitative RNA Analyse mittels NanoDrop® ... 40
2.4.3. qualitative RNA Analyse mittels Bionanalyzer von Agilent® ... 41
2.5. Expressionsprofilerstellung mittels Microarrayanalyse ... 43
2.5.1. Aufbau und Prinzip des RNA-Microarrays NCodeTM Human
Non-coding RNA ... 44
2.5.2. Materialien für die Microarrayversuche ... 46
2.5.3. Ablauf der Microarrayanalyse ... 47
2.5.4. Probenvorbereitung ... 47
2.5.5. Probenmessung ... 51
2.5.6. Hybridisierung der cRNA mit dem Microarray ... 52
2.5.7. Waschen der Microarrays ... 53
2.5.8. Scannen der Microarrays ... 54
2.6. Wiederverwendung benutzter Arrays ... 55
2.7. Auswertung der generierten Daten ... 56
3. Ergebnisse ... 58
3.1. Zellwachstum von HL60 und NB4 Zellen anhand der Zellzahl ... 58
3.2. Zellwachstum und Differenzierung anhand der Lichtmikroskopie ... 61
3.3. Immunphänotypisierung der APL Zellen unter Differenzierungsinduktion ... 66
3.5. RNA Messung über NanoDrop® ... 77
3.6. RNA Validierung mittels Agilent® Bioanalyzer ... 79
3.7. Messung der amplifizierten und fluoreszenzmarkierten cRNA-Proben über NanoDrop® ... 81
3.8. Kurzübersicht über die auszuwertenden Daten ... 83
3.9. Qualitätskontrolle ... 83
3.9.1. Agilent® Scanner Qualitätsanalyse der hybridisierten cRNA Proben ... 83
3.9.2. Qualitätskontrolle der Arrayanalysen mittels R® Boxplos der Expressionsintensitäten ... 87
3.10. Unsupervised Clustering ... 92
3.10.1. Datenanalyse mittels Gene Pattern® ... 92
3.10.2. Datenanalyse mittels R® ... 99
3.10.2.1. Heat maps für NB4 ... 100
3.10.2.2. Heat map für HL60 ... 103
3.11. p-Wert Verteilung ... 106
3.12. principal component analysis ... 110
3.13. Datenanalyse mittels gene set enrichment analysis GSEA® ... 112
3.14. Identifikation der lnc-RNAs mithilfe des Genome Browsers® ... 117
4. Diskussion ... 123
4.1. Inhibition der Proliferation von NB4 und HL60 Zellen durch ATRA ... 124
4.2. Differenzierung der HL60 und NB4 Zellen mit ATRA ... 125
4.3. Qualitative sowie quantitative Analyse der extrahierten RNA ... 126
4.3.1. Qualitätskontrolle der Microarrayexperimente ... 127
4.3.2. Qualitätsparameter der wiederverwendeten Arrays... 128
4.4. Unsupervised Clustering der NB4 und HL60 Zellen mittels Gene Pattern® sowie R® ... 129
4.5. Gene set enrichment Analyse GSEA® ... 130
4.6. Supervised clustering mittels R® ... 131
4.7. Potentielle Funktionen der differentiell exprimierten lncRNAs nach ATRA Stimulation von APL Zellen ... 132
4.8. Ausblick ... 138
5. Zusammenfassung ... 140
6. Literaturverzeichnis ... 144
7. Abkürzungsverzeichnis... 154
8. Geräteliste ... 157
Publikationen ... 159
Lebenslauf ... 161
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 6 und 7 der Promotionsordnung ... 164
Danksagung ... 165
Anhang ... 166
1
1. Einleitung
1.1. Akute Myeloische Leukämie 1.1.1. Definition
Die Geschichte der Leukämie und ihre Definition reichen ca. 200 Jahre in die Vergangenheit. 1811 entdeckte Peter Cullen einen Patienten mit ungewöhnlichem
„milchigen Blut― (Kampen KR, 2012). 1845 beschrieb Rudolf Ludwig Karl Virchow erstmalig einen Patienten mit „weißem Blut― und führte 1847 dafür den Begriff
„Leukämie― – weißes Blut – ein (Piller G, 1993). Heute geht man davon aus, dass die akute myeloische Leukämie (AML) eine klonale Erkrankung einer hämatopoetischen Vorläuferzelle darstellt, welche somatische Mutationen trägt, die wiederum zu Fehlregulationen von Differenzierung und Proliferation dieser Zelle führen (Shlush LI, 2014; Fröhling S, 2005).
1.1.2. Ätiologie
In den meisten Fällen ist die äußere Ursache für die Entstehung einer AML unbekannt (Buske C, 2010). Bereits 1928 entwickelte Woodman zwei verschiedene Theorien hinsichtlich der Entwicklung einer Leukämie, die Tumortheorie und die Infektionstheorie (Woodman HM, 1928). Erstere beschreibt in Analogie zu soliden (bösartigen) Tumoren genetische Veränderungen hinsichtlich des unkontrollierten Wachstums sowie der Metastasierung der Leukämie. Letztere erkannte Ähnlichkeiten der klinischen Symptome der Leukämie zu viralen Infektionen. Die Entstehung einer Leukämie aus einer viralen Infektion wurde seinerzeit auch von Virchow vermutet.
In einigen Fällen erscheint die Exposition mit bestimmten Substanzen wie z.B.
Alkylanzien, Antimetaboliten oder ionisierende Strahlung mit einer höheren Inzidenz von AML assoziiert zu sein (Sill H, 2011). Als weitere prädisponierende Faktoren scheinen auch genetische Veränderungen mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit für die Entstehung einer AML verantwortlich zu sein. Menschen mit Down-Syndrom haben ein deutlich erhöhtes Risiko, eine AML zu entwickeln (Roberts I, 2013). Als häufigste exogene Ursache bezüglich der Entstehung einer AML scheint aktuell jedoch die vorherige Therapie mit zytostatischen Substanzen zu sein. Hierbei scheinen Alkylanzien sowie Topoisomerase-II-Inhibitoren eine wichtige Rolle zu spielen. Therapieassoziierte akute myeloische Leukämien machen aktuell ca. 6 – 8
% aller Fälle von AML aus (Leone G, 1999; Leone G, 2011).
2 1.1.3. Epidemiologie
Inzidenz
Die AML macht ca. 25 % aller Leukämien sowie ca. 75 - 80 % aller akuten Leukämien bei Erwachsenen aus (Deschler B, 2006) siehe dazu Tabelle 1 (Daten übernommen aus dem Zentrum für Krebsregisterdaten des Robert Koch Instituts;
http://www.krebsdaten.de/Krebs/DE/Content/Krebsarten/Leukaemien/leukaemien_no de.html).
Tabelle 1: Anteile der verschiedenen Leukämieformen an allen Neuerkrankungen C91-95, Deutschland, 2009-2010
ALL CLL AML CML Sonstige
Männer 8 % 40 % 24 % 10 % 18 %
Frauen 8 % 34 % 30 % 10 % 18 %
Die akute myeloische Leukämie ist eine seltene Erkrankung. Die weltweite jährliche Inzidenz beträgt altersabhängig im Durchschnitt ca. 3,7 Patienten pro 100.000 Einwohner, wobei die Inzidenz mit steigendem Alter ansteigt und einen leicht erhöhten Wert für Männer aufweist. So liegt die geschätzte Inzidenz der AML bei Erwachsenen Männern bei 4,3 pro 100.000 und für Frauen bei 2,9 pro 100.000 Einwohner (Lutz JM, 2003). Die Inzidenz der Erkrankung wird in einer großen schwedischen Studie mit Einschluss von über 9000 Patienten über 32 Jahre mit 3-4 pro 100.000 Einwohner beschrieben (Derolf A R, 2009).
Das mittlere Erkrankungsalter der Patienten liegt bei ca. 70 bis 75 Jahren (Lowenberg B, 1999; Estey, 2006). Siehe dazu auch Tabelle 2, welche die Inzidenzen der Erkrankungen in den unterschiedlichen Patientenaltern gestaffelt anzeigt. Hier wurden die Patienten einbezogen, welche in den genannten AML- Studiengruppen behandelt wurden und in Vergleich zu internationalen Datenbanken gesetzt. Es zeigt sich eine deutliche Zunahme der Inzidenz im höheren Alter (Messerer D, 2003). Die besten Daten hierzu finden sich im schwedischen Register (Juliusson G, 2012). In Ermangelung von gültigen AML-Inzidenzen für die Bundesrepublik wurden zum Vergleich Zahlen aus dem saarländischen Krebsregister angeführt. Es ist das Register mit der längsten vollzähligen Erhebungsphase seit 1970 in Deutschland (Becker N, 2010).
3
Tabelle 2: Inzidenzen der AML Erkrankungen nach Alter und Datenbank der Erfassung;
Inzidenzen (x 100.000 der Bevölkerung)
Alter AML Studien AML Intergroup
und AML BFM 98
The Leukemia Research Fund UK 1984-1999
SEER White 1995 – 1999
Netherlands Cancer Registry 1994 – 1998
Saarland 1980 - 1999
m w m w m w m w m w
15-19 0,8 0,5 0,8 0,6 0,9 - 1,1 0,7 0,3 0,5
20-24 0,6 0,8 0,7 0,9 1,3 1,1 1,0 0,8 0,4 0,5
25-29 0,7 0,7 1 0,5 1,1 0,9 1,0 0,8 0,8 0,9
30-34 1,0 1,0 1 1 1 1,0 0,7 1,5 1,2 1,7
35-39 1,0 1,2 1,1 1,1 1,3 1,2 1,0 1,9 0,6 1,1 40-44 1,3 1,3 1,4 1,5 1,9 1,8 1,7 1,9 1,7 1,5 45-49 1,7 1,8 1,6 1,8 2,1 2,3 2,4 2,1 3,0 2,0 50-54 2,3 1,7 2,8 2,7 4,0 3,3 3,5 2,9 2,4 1,6 55-59 3,7 3,3 4,2 2,9 4.9 4,6 4,4 4,7 4,0 2,4 60-64 4,0 3,1 6,5 3,9 8,3 6,5 9,2 4,5 6,2 3,3 65-69 4,3 3,6 8,5 5,5 14,8 8,7 10,9 6,9 8,4 4,7 70-74 4,1 3,2 11,7 7,5 21,6 11,8 14,0 7,7 11,8 4,9 75-79 3,7 1,5 14,6 7,9 25,8 14,6 23,0 13,4 9,9 8,8
>=80 1,8 0,9 - - 28,3 17,9 21,0 12,6 14,7 5,6
Die Inzidenz der AML scheint in den ersten drei Lebensdekaden nahezu konstant zu sein, nimmt aber mit höherem Alter exponentiell zu (Wingo P A, 1999). Die aktuellen Schätzungen für Deutschland legen eine nahezu unveränderte Erkrankungsrate für Leukämien bei Erwachsenen in den letzten 10 Jahren nahe (Haberland J, Bertz J, 2006).
Die Inzidenz der kindlichen AML liegt in Deutschland bei jährlich ca. 0,7 pro 100.000 Einwohner, seit 1980 scheint sie stabil zu sein. (Kaatsch P, 2004)
Mortalität
Trotz der niedrigen Inzidenz der AML hat die Erkrankung aufgrund ihrer hohen Mortalität einen hohen Einfluss auf die Überlebensstatistiken von bösartigen Erkrankungen (Deschler B, 2006).
4 Nach den Daten des größten Krebsregisters der USA, dem Surveillance, Epidemiology and End Results Program des National Cancer Instituts, liegt die Mortalität der AML aktuell bei 2,7 pro 100.000 Einwohner.
Laut Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland zeigt sich die aktuelle Mortalität der Leukämien für fast sämtliche deutsche Bundesländer im Vergleich zum Jahre 1995 tendenziell fallend (www.gekid.de). Die sich ständig verbessernden Therapien im Sinne einer steigenden Effektivität als auch besseren Verträglichkeit sind als Ursache hierfür heranzuziehen (Bertuccio, Bosetti et al.
2012).
Überleben
Das Überleben der Patienten mit AML hängt von verschiedenen Faktoren ab, als patientenspezifischer Faktor ist das Alter der Patienten entscheidend. Büchner et al.
teilte die Patienten in zwei Altersklassen mit der Grenze von 60 Jahren ein. Patienten in einem Alter < 60 Jahren wiesen ein Langzeitüberleben von < 40 % auf, bei Patienten, welche älter als 60 Jahren sind, sind es nur noch < 20 % (Büchner T, 2005; Krug U, 2011).
Das Geschlecht der Patienten scheint eine untergeordnete Rolle hinsichtlich der 5- Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit zu spielen, bei Frauen beträgt sie ca. 26 % bei Männern ca. 21 %. (Howlader N, 2010)
1.1.4. Klinik, Symptome und klinische Befunde der AML
Die meisten klinischen Symptome der akuten myeloischen Leukämie sind durch die Verdrängung der normalen Hämatopoese im Knochenmark sowie durch Infiltration von extramedullären Organen zu erklären. Die klinische Manifestation der Erkrankung geht der Diagnosestellung meist lediglich wenige Wochen voraus.
Tabelle 3 fasst die meisten Symptome der AML zusammen (Buske C, 2010).
5
Tabelle 3. Klinische Symptome einer AML
Symptom/ Befund Häufigkeit
Abgeschlagenheit, Schwäche Häufig Belastungsdyspnoe, Tachykardie, Blässe Häufig
Fieber, Infektion 30 - 40 %
Kopfschmerzen 25 %
Lymphadenopathie/ Hepatosplenomegalie 10 - 20 %
Petechien 17 %
Ekchymosen 17 %
Zahnfleischbluten 13 %
Gewichtsverlust 13 %
Kutane Infiltrate 10 %
Appetitlosigkeit 7 %
Zerebrale und pulmonale Symptome durch Hyperleukozytose
5 %
Nachtschweiß 5 %
Gingiva-Hyperplasie 3 %
Chlorom 2 %
Epistaxi 2 %
Wie Tabelle 3 zu entnehmen ist, können die Symptome unspezifisch sein und die Diagnosestellung somit erschweren. Nicht selten wird die AML als schwere Infektionserkrankung verkannt (Zhao N, 2014). Die Beschwerden der Patienten können schleichend aber auch plötzlich auftreten. Ca. 50 % der Patienten geben als Leitsymptom eine Leistungsminderung an (Wetzler M, 2001). Die durch die Verdrängung der normalen Hämatopoese entstehende Panzytopenie mit Leukozytopenie, Anämie und Thrombozytopenie lässt die häufigsten Symptome meist retrospektiv erklären. Ersteres ist für die Infektanfälligkeit verantwortlich, die Anämie bedingt die körperliche Schwäche und die Thrombozytopenie erklärt die Blutungsstigmata, wie z.B. Petechien. Speziell die Promyelozytenleukämie kann zu einer Gerinnungsstörung bis hin zur disseminierten intravasalen Koagulopathie (DIC) mit gleichzeitig bestehenden Mikrothrombosierungen sowie schweren Blutungssymptomen führen.
Bei Erstdiagnose liegt die mittlere Leukozytenzahl im Blut etwa bei 15.000 /µl. Bei 25 bis 40 % der Patienten beträgt die Anzahl der weißen Blutkörperchen weniger als
6 5.000 /µl, bei ca. 20 % liegt sie bei über 100.000 /µl. Letzteres kann bei zerebraler Manifestation Symptome eines Schlaganfalls mit Lähmungen oder Taubheit der Extremitäten hervorrufen. Die Leukämiezellen (sog. Blasten) im Blut, welche zu einer Leukozytose führen, stellen keinesfalls normal funktionierende Abwehrzellen dar. Sie sind abnorme Leukozyten, die keine positive Funktion im menschlichen Körper erfüllen. In den allermeisten Fällen zeigen sich bei Erstdiagnose Leukämiezellen im peripheren Blut. In nur weniger als 5 % aller Fälle sind diese nicht im Blut nachweisbar. Hier ist meist die Knochenmarkbiopsie zielführend (Lowenberg B, 1999; Wetzler M, 2001).
1.1.5. Einteilung der AML
Die akute myeloische Leukämie ist eine heterogene Erkrankung. Die Einteilung kann auf sehr unterschiedliche Weise vorgenommen werden. Lange Zeit wurde die AML nach rein morphologischen Kriterien eingeteilt und zwar nach der FAB-Klassifikation (Bennett J M, 1985). Tabelle 4 trägt diese Aufteilung der AML in 10 verschiedene Untergruppen und deren Häufigkeit zusammen (Buske C, 2010).
Tabelle 4: French American British Group (FAB)-Klassifikation
FAB-Subtyp Häufigkeit
M0 Minimal differenzierte Leukämie 3,9 %
M1 Myeloblastische Leukämie ohne Reifung 18,8 %
M2 Myeloblastische Leukämie mit Reifung 33,9 %
M3 Hypergranulierte Promyelozytenleukämie 3,8 %
M3v Minimal granulierte Promyelozytenleukämie 0,9 % M4Eo Vermehrung abnormer Eosinophiler im Knochenmark 5,8 %
M4 Myelomonozytäre Leukämie 18 %
M5 Monozytäre Leukämie 10,2 %
M6 Erythroleukämie (DiGuliemo-Krankheit) 4,3 %
M7 Megakaryoblastische Leukämie 0,2 %
Diese Einteilung behielt über lange Zeit ihre Gültigkeit und wurde mehrfach erweitert.
Bereits seit 1999 existiert neben o.g. Einteilung der AML auch eine WHO Klassifikation derselbigen. Hier wird die AML zusätzlich nach den Kriterien der
7 vorkommenden genetischen Veränderungen und der Atiologie unterteilt. Tabelle 5 fasst die wesentlichen Kriterien zusammen (Harris NL, 1999).
Tabelle 5: WHO-Klassifikation der AML von 1999
I. AML mit wiederholter zytogenetischer Translokation AML mit t(8;21)(q22;q22); AML1(CBFα)/ETO
Akute Promyelozyten Leukämie (AML mit t[15;17][q22;q12] und Varianten; PML/RARα) AML mit abnormen Knochenmark-Eosinophilen (inv[16][p13q22] oder t[16;16][p13q22]
CBFβ/MYH11)
AML mit 11q23-(MLL)-Veränderungen II. AML mit Dysplasie multipler Zellreihen
mit vorherigem myelodysplastischen Syndrom ohne vorheriges myelodysplastisches Syndrom
III. AML und myelodysplastisches Syndrom, therapieinduziert alkylantieninduziert
epipodophyllotoxininduziert andere Formen
IV. sonstige AML minimal differenziert ohne Reifung mit Reifung
akute myelomonozytäre Leukämie akute monozytäre Leukämie akute erythroide Leukämie
akute megakaryozytäre Leukämie basophile Leukämie
akute Panmyelose mit Myelofibrose
Schnell wurde erkannt, dass verschiedene AML-Untergruppen der FAB Klassifikation in bestimmten Häufigkeiten genetische Veränderungen aufweisen. So ist die Häufigkeit der Inversion 16 (inv (16)) bzw. Translokation 16;16 (t(16;16)) mit dem Fusiostranskript CBFβ/MYH11 in 100 % aller M4Eo Leukämien wiederzufinden. Eine häufige Assoziation besteht auch zwischendem Vorhandensein der Translokation t(15;17) mit dem molekulargenetischen Fusionsgen PML/RARα bei der AML M3. Hier beträgt die Koinzidenz 98 % (Buske C, 2010).
8 Die Prognose eines Patienten mit AML wird in starkem Maße vom Karyotyp der leukämischen Blasten bestimmt. Um diesem entscheidenden Kriterium gerecht zu werden und um neu entdeckte genetische Veränderungen mit einzubeziehen, wurde 2008 die aktuelle Version der WHO Klassifikation der AML veröffentlicht (Vardiman J W, 2008). Eine vereinfachte Version nach Swerdlow findet sich in der Tabelle 6.
Tabelle 6: WHO-Klassifikation der AML nach (Swerdlow 2008) AML mit rekurrenten genetischen Aberrationen
1. AML mit balancierten Translokationen AML mit t(8;21)(q22;q22); RUNX1T1
AML mit inv(16)(p13.1;q22) oder t(16;16)(p13.1;q22); CBFβ/MYH11 Akute Promyelozytenleukämie mit t(15;17)(q22;q12); PML/RARα AML mit t(9;11); MLLT3-MLL
AML mit t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP2142
AML mit inv(3)(q21;q26.2) oder t(3;3)(q21;q26.2); RPN-EVI1 AML mit t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL
2. AML mit Genmutationen AML mit mutiertem NPM1 AML mit mutiertem CEBPA
AML mit Myelodysplasie-assoziierten Eigenschaften Therapieassoziierte myeloische Neoplasien
AML ohne weitere Spezifizierung Minimal differenzierte AML AML mit Reifung
Akute myelomonozytäre Leukämie
Akute monoblastäre und monozytäre Leukämie Akute erythroide Leukämie
Akute megakaryozytäre Leukämie Akute basophile Leukämie
Akute Panmyelose mit Myelofibrose
Diese aktuell geltende WHO Klassifikation hat bei ständiger Neuentdeckung weiterer an der AML beteiligter Gene keinen Anspruch auf Vollständigkeit und entwickelt sich entsprechend den Ergebnissen der Leukämieforschung (Vardiman J W, 2009;
Döhner H, 2010).
9 1.1.6. Risikostratifizierung der AML
Die Prognose einer Erkrankung (unter der heutigen „adäquaten― Therapie) bestimmt das Risikoprofil. Die Prognose der AML hängt von verschiedenen Faktoren ab. Der wichtigste Faktor den Verlauf der AML hinsichtlich des Therapieansprechens sowie der Überlebenswahrscheinlichkeit bei Erstdiagnose der Erkrankung wird jedoch bestimmt von den genertischen Aberrationen der Blasten. Weitere untergeordnete Faktoren sind u.a. Alter, Höhe der Leukozyten bei Erstdiagnose, sekundäre Genese der AML und natürlich der Therapierbarkeit des Patienten, die u. a. von Komorbiditäten abhängt. Während der Therapie spielt natürlich auch das Ansprechen der Erkrankung bezüglich des Risikos eine entscheidende Rolle. Die Risikodefinition der AML ist nicht einheitlich, sie variiert von Studie zu Studie. Ein Konsens kann jedoch die Einteilung des Medical Research Council (MRC) und des European LeukemiaNet (ELN) darstellen, siehe hierzu Tabelle 7 (Grimwade D, 1998;
Döhner H, 2010).
Tabelle 7: Einteilung in prognostische Gruppen nach MRC und ELN (mod. nach Oberacker T, 2012)
Prognose MRC ELN
Günstig t(15;17) t(8;21)
inv(16)/t(16;16)
t(8;21)
inv(16)/ t(16;16)
normaler Karyotyp + (biallelische) CEBPA-Mutation normaler Karyotyp + NPM1mutiert/FLT3-ITDnegativ Intermediär Normaler Karyotyp, andere
nichtkomplexe Karyotypen
Intermediär 1:
Normaler Karyotyp mit - NPM1mutiert/FLT3-ITDpositiv - NPM1wildtyp/FLT3-ITDpositiv - NPM1wildtyp/FLT3-ITDnegativ Intermediär 2:
t(9;11)
zytogenetische
Veränderungen, die nicht zur Hoch- oder Niedrigrisikogruppe gehören
Ungünstig abn(3q) -5/del(5q) -7
Komplexer Karyotyp (≥5 unabhängige Aberrationen
inv(3); t(3;3) t(6;9)
Komplexer aberranter Karyotyp (≥3 nicht-rekurrente Aberrationen)
10 Hieraus wird klar, dass der genetischen Analyse der Blasten bei Erstdiagnose eine entscheidende Rolle zukommt. Weniger als 50 % der AML-Fälle weisen einen normalen Karyotop auf und sind somit der intermediären Risikogruppe zuzuordnen.
Eine Übersicht über die relativen Häufigkeiten zytogenetischer Veränderungen mit Unterscheidung von AML-Patienten unter und über 60 Jahren ergibt sich aus Tabelle 8 (Buske C, 2010).
Tabelle 8: Relative Häufigkeit zytogenetischer Aberrationen bei Diagnosestellung der AML Gesamt (%) Unter 60 Jahre (%) Über 60 Jahre (%)
t(8;21) 4,6 7,1 2,3
t(15;17) 4,5 6,5 2,7
inv(16)/ t(16;16) 4,3 5,5 3,2
t(11q23) 2,0 3,3 0,8
normaler Karyotyp 47,6 47,8 47,4
andere Aberrationen 15,7 10,6 20,1
Trisomie 8* 3,0 2,6 3,4
Monosomie 7* 1,2 0,6 1,9
del(5q)* 0,9 0,8 0,9
inv(3)/ t(3;3) 1,5 2,4 0,8
komplex aberrant 14,7 12,8 16,5
* ohne weitere Aberrationen
Auffällig ist der erhöhte Anteil anderer, bisher nicht klassifizierter Aberrationen sowie komplex aberranter Veränderungen im höheren Alter. Letzteres schlägt sich in einer Prognoseverschlechterung der AML im Alter nieder.
1.1.7. Therapie der AML
Bei der Therapie der AML muss wie bei den Therapien bösartiger Neubildungen solider Organe prinzipiell zwischen der kurativen (in der Regel intensiven) und der palliativen (in der Regel milden) Therapie unterschieden werden. Eine Stadieneinteilung, wie sie bei Tumoren solider Organe existiert und anhand derer die Therapie bestimmt wird, existiert bei der AML nicht. Die Anzahl der Blasten z.B. im Knochenmark oder im peripheren Blut kann nicht im Sinne einer Stadieneinteilung zur Bemessung der Therapieintensität herangezogen werden. Entscheidend für
11 diese Frage sind Wunsch des Patienten sowie u.a. Vorerkrankungen, Organfunktionswerte und Allgemeinzustand (Ganser A, 1994; Dombret H, 2009).
Ziel der kurativen Induktionstherapie der AML ist es, eine komplette Remission (CR) zu erzielen. Um dies zu erreichen, sind ein bis zwei Chemotherapiezyklen notwendig.
Von diesen Induktionszyklen werden Konsolidationszyklen unterschieden, deren Ziel die Eradikation der leukämischen Stammzellen und somit die Langzeitheilung ist. Die Leukämie sollte nach der Induktionstherapie idealerweise lichtmikroskopisch nicht mehr nachweisbar sein. Eine allgemein anerkannte Definition der kompletten Remission findet sich in Cheson et al. 1999. Die komplette Remission beinhaltet:
Neutrophilenzahl > 1.000 /µl Thrombozytenzahl > 100.000 /µl Blasten im Knochenmark < 5 % Keine extramedulläre Beteiligung
Heutzutage definiert man auch eine molekulare Vollremission, bei der kein molekulargenetischer Nachweis einer initial detektierbaren molekulargenetischen Veränderung der Blasten mehr möglich ist (MRD negativ). MRD bezeichnet hierbei die minimale Resterkrankung („minimal residual disease―) und ist mittels heutiger medizinischer Detektionsverfahren (z.B. next-generation sequencing) ein weitaus sensitiverer Marker für die leukämische Resterkrankung als die alleinige lichtmikroskopische Analyse (Kayser S, 2015).
Zielsetzung einer palliativen Tumortherapie ist es, Symptome der Leukämieerkrankung zu minimieren, ohne jedoch durch aggressive Therapie die Tumorfreiheit zu erzwingen. Der Erhalt der Lebensqualität steht hier im Vordergrund.
Eine verträgliche sowie wirkungsvolle Therapie scheint in vielen Fällen der palliativen AML-Therapie Azazytidine oder auch niedrig-dosiertes Cytarabin zu sein (Fenaux P, 2010).
Allgemein sollte jedoch festgehalten werden, dass die optimale Therapie von Patienten mit AML innerhalb von Studien erfolgen sollte.
12 Induktionschemotherapie
Die Induktionschemotherapie basiert wie vor ca. 40 Jahren auf den zwei zytotoxischen Medikamenten Cytosin-Arabinosid (Ara-C, Cytarabin) und ein Anthrazyklin (Daunorubicin, Idarubicin, oder auch Mitoxantrone) (Boiron M, 1969;
Ellison R R, 1968). Bereits durch die Therapie mit einer der beiden Substanzklassen konnte seinerzeit der Entdeckung jeweils eine CR Rate von 30 – 40 % erzielt werden. Durch die Kombination beider Substanzen stieg die Rate auf > 50 %.
Ersteres stellt ein Pyrimidinanalogon des körpereigenen Cytosins dar, welches über einen Nukleosidtransportsystem in die Leukämiezelle transportiert und zu einem geringen Teil in Ara-CTP umgewandelt wird. Hier konkurriert es mit dCTP um den Einbau in die DNA, wird in letztere eingebaut und führt zu Strukturdefekten sowie zu Kettenabbruch und Apoptose und hemmt darüber hinaus die DNA-Polymerase (Schütte J, 2010; Stahlmann R, 2001). Das Daunorubicin gehört zu der Gruppe der Alkylantien (Fromm M F, 2007). Es wurde ursprünglich aus Streptomyces peucetius isoliert. Daunorubicin wirkt v.a. in der S-Phase des Zellzyklus durch Interkalation in die DNA und RNA, Hemmung der Topoisomerase II sowie durch Bildung freier Radikale (Boiron M, 1969; Stahlmann R, 2001; Mulrooney D A, 2009). Idarubicin ist analog zu Daunorubicin ein DNA-Interkalator. Ebenfalls zu den Anthrazyklinen gehörend unterscheidet es sich vom Daunorubicin durch eine felhlende Methoxigruppe (Kimby E, 2001). Hierdurch verbessert sich die Fettlöslichkeit dieses Medikamentes und damit die Aufnahme in die Zelle. Ähnlich wie Daunorubicin hemmt Idarubicin die Topoisomerase II (Shadman M, 2015). Mitoxantrone ist ein zytostatisches Antibiotikum der Gruppe der Anthracenedione (Schütte J, 2010). Es zählt wie Daunorubicin und Idarubicin zu den Anthrazyklinen. Es lagert sich durch Wasserstoffbrückenbindungen an die DNA und verursacht durch Interkalation Quervernetzungen und DNA-Strangbrüche. Zusätzlich wird die Bildung von RNA beeinträchtigt und die Topoisomoerase II durch Mitoxantrone gehemmt. Die Wirkung von Mitoxantrone auf die Zelle ist hierbei zellzyklusunabhängig (Jaime-Perez J C, 2015).
Cytosin-Arabinosid sowie ein Anthrazyklin sind fester Bestandteil der initialen Therapie der AML. Das am häufigsten verwendete Schema ist das sog. 7 + 3 Schema. Es beinhaltet die kontinuierliche Gabe von Cytarabin 100 – 200 mg/m² über 7 Tage sowie die Gabe von Daunorubicin in der Dosis ≥ 60 mg/m² an drei Tagen (Buske C, 2010). Mehrere Studien evaluierten die optimale Dosierung beider
13 Medikamente, so konnte nachgewiesen werden, dass eine Hochdosis-AraC Gabe in der Induktionstherapie keinen signifikanten Vorteil gegenüber der üblichen Dosierung von 100 – 200 mg/m² hinsichtlich der CR-Raten (80 vs. 82 %) oder des overall survivals (OS) (40 vs. 42 %) erbringt (Löwenberg B, 2011).
Fernandez et a. konnten 2009 nachweisen, dass eine intensivierte Daunorubicindosis tatsächlich ein besseres Outcome hinsichtlich des OS 46,8 vs.
34,6 % führt erzielen kann. Dies wurde für die intensivierte Daunorubicindosis von 90 mg/m² im Gegensatz zu 45 mg/m² lediglich für jüngere Erwachsene mit AML gezeigt werden. Hiergegen wies die kürzlich veröffentlichte Studie mit Einschluss von 1206 Patienten jedoch keinen signifikanten Benefit einer intensivierten Dosis von 90 mg/m² Daunorubicin im Vergleich zu 60 mg/m² weder hinsichtlich der Vollremissionsrate noch Gesamtüberlebens. Auch in der Subgruppenanalyse konnte kein Benefit verzeichnet werden (Burnett A K, 2015).
Abhängig vom Ansprechen auf die erste Induktionschemotherapie folgt im Weiteren ein zweiter Induktionszyklus oder eine Konsolidationschemotherapie mit erhöhter Cytarabin-Dosis.
Experimentelle Studien legen bei einigen Patienten einen weiteren positiven Effekt durch die Gabe von ATRA zusätzlich zur Induktionschemotherapie nahe. Es scheint, dass Patienten, welche bei einem normalen Karyotyp eine NPM1-Mutation bei Fehlen einer FLT-ITD aufweisen von der Gabe von ATRA profitieren (Schlenk R F, 2009). Bereits 2009 konnten Heuser et al. im Mausmodell zeigen, dass ATRA das ereignisfreie sowie das Gesamtüberleben von Mäusen mit AML signifikant verbessern kann. Gleichzeitige Überexpression von MN1 schmälerte jedoch diesen Effekt (Heuser M, 2009). Auch konnte kürzlich in vitro gezeigt werden, dass Arsentrioxid in Kombination mit ATRA die Apoptose von NPM1 mutierten AML Blasten induzieren können (Martelli M P, 2015).
Von immenser Bedeutung zeigt sich jedoch die Therapie mit ATRA bei Patienten mit Promyelozytenleukämie. Hierauf wird später genauer eingegangen.
Abhängig vom Risikoprofil der AML, des Ansprechens der Erkrankung auf die Induktionstherapie sowie das Alter des Patienten stehen verschiedene Therapiekonzepte der AML nach erfolgter Induktionstherapie zur Verfügung (Buske C, 2010).
14 Intensive zytostatische Konsolidationschemotherapie mit oder ohne autologe
Stammzelltransplantation
myeloablative Therapie mit folgender allogener Stammzelltransplantation
Konsolidationschemotherapie
Nach erfolgreicher Induktionstherapie mit dem Erreichen der kompletten Remission schließt sich für Patienten mit günstigem und intermediärem Risikoprofil die Konsolidationschemotherapie an. Ohne eine Postremissionstherapie ist ein Rezidiv der AML nach spätestens 4 bis 6 Monaten unvermeidbar (Cassileth PA, 1988).
Hinsichtlich dieser wurden zahlreiche Studien durchgeführt mit der Frage nach den geeigneten Substanzen und der erforderlichen Dosis. Bereits 1994 konnten Mayer et al. in einer dreiarmigen Studie zeigen, dass 4 Zyklen mit je 6 Gaben Hochdosis-Ara- C 3000 mg/m² niedrigeren Dosierungen von Ara-C deutlich überlegen sind. Es zeigte sich ein medianes 4-Jahres-Überleben von 46 % im Vergleich zu 35 % in der Patientengruppe, welche ebenfalls 4 Zyklen Ara-C erhielt, jedoch nur 5 Gaben in einer Dosierung von 400 mg/m². Der dritte Therapiearm beinhaltete 4 Zyklen zu je 5 Gaben Ara-C in einer Dosierung von 100 mg/m². Diese zeigten lediglich eine mediane 4 Jahresüberlebenswahrscheinlichkeit von nur 31 %. Mindestens zwei Zyklen Hochdosis-AraC sind notwendig, um eine Verbesserung der Langzeitergebnisse zu erzielen (Elonen E, 1998).
Bloomfield et al. konnten 1998 erstmalig den prognostischen Einfluss von zytogenetischen Veränderungen der AML-Blasten in der Postremissionsphase zeigen. Die Patienten wurden abhängig von zytogenetischen Veränderungen der Blasten in drei Gruppen unterschieden: 1) core binding factor (CBF), 2) normaler Karyotyp und 3) andere zytogenetische Veränderungen. Abhängig von vorliegender Veränderung zeigte sich auch das Ansprechen der AML-Patienten in der Konsolidationstherapie hinsichtlich der Dauer der kompletten Remission unterschiedlich. CBF-AML Patienten zeigten eine deutlich längere Remissionsdauer als Patienten mit einem normalen Karyotyp oder mit anderen zytogenetischen Veränderungen. Basierend auf dieser Publikation erfolgte seither die risikostratifizierte Postremissionskonsolidationstherapie (Bloomfield C D, 1998).
Hinsichtlich der Cytarabindosis in der Konsolidationstherapie konnte im weiteren Verlauf gezeigt werden, dass eine Dosis von 1000 mg/m² zweimal täglich bei
15 geringeren Nebenwirkungen hinsichtlich des Gesamtüberlebens genauso effektiv ist wie höhere Dosierungen (Löwenberg B, 2013).
Myeloablative Therapie mit allogener Stammzelltransplantation
Bei unzureichendem Ansprechen der Patienten auf die erste Induktionschemotherapie im Sinne des Nicht-Erreichens der CR sowie bei Hochrisiko-AML-Patienten ist in der Regel die Durchführung einer allogenen Stammzelltransplantation nach myeloablativer oder nach myelosuppressiver zytostatischer Chemotherapie die Therapie der Wahl (Appelbaum F R, 2009). Auch bei einem Rezidiv der Erkrankung nach initial gutem Ansprechen ist die allogene Stammzelltransplantation die einzig kurative Therapieoption (Schmid C, 2006).
Hierbei werden dem Patienten nach einer Konditionierungschemotherapie entweder periphere Stammzellen eines Familien- oder Fremdspenders, Knochenmarkstammzellen oder Stammzellen aus Nabelschnurblut transfundiert. Die jeweiligen Stammzellen siedeln sich im Knochenmark des Empfängers an und bilden die neue Hämatopoese (Engraftment) (Martin P J, 2009). Verschiedene Konditionierungsregime werden heutzutage prinzipiell in zwei Gruppen unterschieden. Myeloablative Therapieregime beinhalten Chemotherapeutika in Dosierungen, welche auf eine komplette Eradikation der Leukämogenese sowie der Hämatopoese im Knochenmark abzielen, die Toxizität auf andere Organe ist in der Regel als hoch einzustufen (Bensinger W I, 2009). Nicht-myeloablative Konditionierungsregime – auch Konditionierung mit reduzierter Intensität (RIC) genannt – haben nicht die vollständige Eradikation aller Leukämiezellen zum Ziel.
Die gezielte Immunsuppression des Empfängers dient hier als Voraussetzung für das Engraftment der Spenderzellen. Konditionierungsregime mit reduzierter Intensität weisen zudem eine geringere Organtoxizität auf und eignen sich daher auch für Patienten höheren Alters oder für Patienten mit bestimmten Organvorerkrankungen (Buske C, 2010).
1.2. AML M3 Akute Promyelozytenleukämie
Die Akute Promyelozytenleukämie (APL; AML M3) unterscheidet sich deutlich hinsichtlich der Pathogenese und Therapie von den anderen Leukämieformen.
Erstmalig erschienen ist der Begriff der Promyelozytenleukämie 1931 jedoch ohne Bezug zur klinischen Manifestation oder zur Morphologie der Leukämiezellen
16 (Mathews V, 2001). Hillestad definierte 1957 als erster die APL als klinisch pathologische Entität (Schwarz J, 2008). Im Gegensatz zu den anderen Leukämieuntergruppen der FAB-Klassifikation, deren Altersgipfel zwischen 70 und 75 Jahren liegt, beträgt das mittlere Alter der Patienten mit APL ca. 40 – 50 Jahre, nach dem 60. Lebensjahr nimmt die Inzidenz wieder ab. Es zeigt sich kein Unterschied zwischen Männern und Frauen (Vickers M, 2000). War sie in Zeiten vor Einführung der ATRA-Therapie die Leukämieform mit der ungünstigsten Prognose, so weisen Patienten mit APL heutzutage ein sehr gutes Outcome auf (Warrell R P Jr, 1993; Lo-Coco F, 2013).
Die APL macht ca. 5 - 10% aller Leukämien aus, charakteristisches Merkmal sind neben der Morphologie von Promyelozyten die sogenannten Auerstäbchen, welche sich im Zytoplasma der Zelle befinden. Im Knochenmark kommen häufig sog. Faggot Zellen vor, diese beinhalten Bündel von Auerstäbchen, welche unregelmäßig im Zytoplasma verteilt sind. Gefürchtet ist die Promyelozytenleukämie aufgrund der lebensbedrohlichen Gerinnungsstörungen, die bei dieser Erkrankung auftreten können. Die Promyelozyten der APL exprimieren u.a. Annexin, welches als Rezeptor für Tissue-type Plasminogenaktivator und Plasminogen wirkt und somit zu einer Hyperfibrinolyse führen kann. Zusätzlich enthalten sie Granula mit prokoagulatorischer Funktion, welche zu einer Verbrauchskoagulopathie führen kann. Die umgehende Therapieeinleitung sowie ggf. supportive Gabe von Blut- oder Gerinnungsprodukten sind unabdingbar (Buske C, 2010; Vickers M, 2000).
Neben der klassischen Form der APL gibt es eine Variante, die AML M3v.
Morphologisch stellen sich die Blasten dieser Leukämieform mit nur minimaler Granulation dar. Sie macht ca. 0,8 % der gesamten AML-Fälle aus (Buske C, 2010).
Molekulare Grundlagen der APL
Zytogenetisch lassen sich in beinahe allen Fällen der AML M3 und AML M3v die Translokation t(15;17) in den Zellkernen der Blasten nachweisen. Die Translokation beschreibt den genetischen Austausch von Chromosomen oder deren Abschnitten.
t(15;17) bedeutet im vorliegenden Fall, dass Genabschnitte des Chromosoms 15 und des Chromosoms 17 miteinander ausgetauscht wurden. Die Genabschnitte, die beteiligt sind, können genauer beschrieben werden, es sind 15q22 und 17q21. Durch diese Translokation entsteht ein Fusionsgen das sog. Promyelozyten Leukämie (PML) / Retinoic Acid Receptor α (RARα) – Hybridgen, siehe dazu Abbildung 1.
17
Abbildung 1: Fusionsgen PML-RARα nach Jacobi T, 2008
Diese Translokation der DNA erzeugt nach Transkription und Translation ein Fusionsprotein PML/RARα, welches mit der Funktion des normalen RARα-Proteins interferiert. RARα ist ein Transkriptionsfaktor und bildet physiologischerweise mit dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR) ein Heterodimer, welches an Zielgene von RXR/RARα bindet. Hier kann der Komplex durch ATRA aktiviert werden und somit die Genexpression regulieren (Grignani F, 1998; HE LZ, 1998)
Die Fusionsproteine PML/RARα beinhalten Teile des Retinsäurerezeptors α und Teile des PML Proteins. Letztere vermitteln die Oligomerisierung des Fusionsproteins mit weiteren Fusionsproteinen. Es folgt ein komplexer Mechanismus, welcher die Transkription von Differenzierungsmechanismen der Zellen hemmt und zu einer Proliferation führt. Das Fusionsprotein PML/RARα bindet entweder als Homodimer zusammen mit einem weiteren Fusionsprotein PML/RARα oder in vivo als Heterodimer mit dem Retinoid-X-Rezeptor an typische Retinsäurerezeptor- Bindungssequenzen und an verstreute repetitive Sequenzen der DNA. Die Oligomere des Fusionsproteins assoziieren mit DNA-Methyltransferasen (DNMTs).
Letztere methylieren CpG-Inseln in Promotorregionen und verhindern somit die Transkription der betreffenden Gene. Histonedeacetylasen binden an den Proteinkomplex. Acetylreste der Histone halten das Chromatin in einer offenen, aktiven Form. Nach Abspaltung der Acetylreste durch die Histondeacetylasen geht das Chromatin in eine geschlossene, inaktive Form über. Es werden Lysinreste des Histons 3 durch die Methyltransferase SUV39H1 sowie das Protein EZH2 des Polycomb Komplexes an Position 9 und 27 methyliert. Nun bindet Polycomb- Repressor-Komplex 1 (PRC1) an das mehrfach methylierte Histon 3. Durch diese Veränderungen wird nun die Transkription wichtiger Gene für die Differenzierung der Zellen nachhaltig unterdrückt (Carbone R, 2006; Halftermyer J, 2011). Es kommt zu
PML RARα
15q22 17q21
PML RARα
Fusionsgen PML-RARα
18 einem Arrest der Differenzierung der Vorläuferzellen, welche sich unkontrolliert teilen, vermehren und somit die APL bilden.
Es sei noch angemerkt, dass in ca. 2 % der Promyelozytenleukämie die Ursache in anderen Translokationen von Genen zu finden sind, u.a. sind dies die Translokationen t(11;17)(q23;q21), t(11;17)(q13;q21) sowie t(5;17)(q35;q21). Die beiden erstgenannten Translokationen beziehen hierbei statt des PML-Gens das Gen ZBTB16 ein, die letztgenannte Translokation involviert das NPM1-Gen. Der Translokationspartner ist in diesen Fällen ebenfalls die RARα-Domäne, doch es zeigt sich nur ein geringes Ansprechen auf ATRA.
1.3. ATRA
ATRA (all-trans-retinoic acid), auch Tretinoin genannt, ist ein Derivat der Vitamin A Säure und zählt zu den nicht-aromatischen Retinoiden. Seine chemische Struktur leitet sich von Retinol ab und ist in Abbildung 2 dargestellt (mod. nach Adam O, 2001).
Abbildung 2: ATRA
IUPAC-Name:
3,7-Dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexenyl) nona-2,4,6,8-tetraensäure
ATRA ist eine körpereigene Substanz. Sie entsteht durch enzymatische Oxidation aus Vitamin A, welches mit der Nahrung aufgenommen wird. ATRA spielt im menschlichen Körper eine große Rolle, es reguliert mindestens 169 Gene (Wang ZY, 2003).
Der erste klinische Einsatz von ATRA in der Therapie der AML lässt sich bis 1986 zurückverfolgen. Es wurde in China Patienten mit APL verabreicht (Wu X, 1993). Es zeigten sich prompte Erfolge, an denen Castaigne et al. 1988 in Frankreich anknüpften. Bei 14 von 22 Patienten mit APL konnte seinerzeit mit Hilfe von ATRA die CR erreicht werden (Castaigne S, 1990). ATRA ist derzeit nur als oral
19 applizierbares Medikament erhältlich. Dabei zeigt sich sowohl in experimentellen Studien als auch in klinischen Untersuchungen eine wirksame sowie sichere Konzentration von 1 µmol/l im Patientenblut (Breitman T R, 1981; Warrel Jr R P, 1991; Agadir A, 1995).
ATRA übt seine physiologische Wirkung in der Hämatopoese über den Transkriptionsfaktorenkomplex RARα/RXR aus. Dieser Komplex aus RARα und RXR setzt sich an bestimmte Positionen der DNA und kann über Aktivierung durch ATRA die Genexpression regulieren. Dabei entfaltet ATRA seine Wirkung auf mehreren Ebenen der Hämatopoese. Nicht immer scheint es nur die Differenzierung zu induzieren. Abbildung 3 zeigt mögliche Wirkpunkte von ATRA in der Hämatopoese auf (entnommen aus Thienemann F, 2006).
Abbildung 3: Wirkung von ATRA in der Hämatopoese
Vereinfachtes Schema der Hämatopoese mit Angriffspunkten von ATRA, wobei (+) einen fördernden und (-) einen inhibitorischen Effekt darstellt (mod. nach Thienemann F, 2006 und Babina M, 2003)
In Abwesenheit von ATRA rekrutiert RARα Korepressoren, welche die Transkription von bestimmten Genen verhindern (Glass CK, 2000).
Stammzelle CD34+
CFU-ME Myeloischer
Vorläufer
CFU-GM Myeloblast
Promyelozyt Myelozyt Neutrophiler Granulozyt
Mastzelle Promyelozyt
Myelozyt Monozyt
Makrophage Basophiler
Granulozyt
Eosinophiler Granulozyt
CD13+ CD34+ c-kit+
?
?
?
ATRA
ATRA
ATRA ATRA
ATRA ATRA ATRA
+
+ + -
+ -
-
- -
20 Im Falle der APL setzen sich Komplexe aus PML/RARα und RXR an die DNA und hemmen über einen komplexen Mechanismus die Genexpression. Es kommt zum Differenzierungsstopp von Zellen. Der PML/RARα-Komplex ist in vivo bei physiologischer Konzentration von ATRA dominant gegenüber dem physiologisch vorkommenden RARα. Wird nun die Konzentration von ATRA erhöht, so verändert sich die Konfiguration des PML/RARα-RXR Komplex. Es werden Methyltransferasen akquiriert, welche die Histone acetylieren und somit die Chromatinstruktur wieder in eine offene Form überführen. Dies ermöglicht dem Transkriptionsapparat, wieder seine Funktion aufzunehmen (Warrel R P Jr, 1993). ATRA führt somit zur Differenzierung von APL-Zellen zu Granulozyten, welche den Oberflächenmarker CD11b vermehrt exprimieren (Lanotte M, 1991).
ATRA reguliert u.a. die Transkription von Genen, welche für die Zelldifferenzierung von entscheidender Bedeutung sind. Wie erwähnt, übt ATRA seine Wirkung über die
Beeinflussung des physiologischerweise vorkommenden
Transkriptionsfaktorkomplexes RARα/RXR aus. Die Annahme liegt also nahe, dass ATRA nicht nur die Differenzierung von APL-Zellen beeinflussen kann, sondern ebenfalls andere Leukämiezellen, denen ein Differenzierungsblock zugrunde liegt, durch Induktion der Reifung über RARα/RXR in reifere Zellen überführen und somit auch in Abwesenheit der Translokation t(15;17) zur Therapie einer Leukämie beitragen kann. Dies konnte bereits 1997 durch James et al. nachgewiesen werden (James S Y, 1997). In zahlreichen Untersuchungen konnte initial kein klinischer Benefit in der Therapie von Nicht-APL-AML Patienten mit ATRA gezeigt werden (Estey E H, 1999; Belhabri A, 2002). Schlenk et al. konnten 2004 jedoch an einem Kollektiv von 242 Nicht-APL-AML Patienten im Alter von ≥ 61 Jahren zeigen, dass sich die additive Therapie mit ATRA zur konventionellen Chemotherapie in der Induktions- und Konsolidationschemotherapie positiv hinsichtlich der CR-, der EFS- und OS-Raten auswirkt (Schlenk F S, 2004). Es scheint, dass mehrere Faktoren für die Wirkung von ATRA bei Nicht-APL-AML Patienten eine Rolle spielen. So erhöht eine Überexpression des Transkriptionsfaktors MN1 in leukämischen Blasten deren Resistenz gegenüber der Therapie mit ATRA. In experimentellen Studien konnten Heuser et al. nachweisen, dass die Fusion von VP16 an MN1 das onkogene Potential von MN1 deutlich reduzieren kann und somit die Suszeptibilität der Zellen für die Therapie mit ATRA erhöht (Heuser M, 2007). Außerdem sprechen AML- Patienten mit NPM1-Mutation auf ATRA an (Schlenk R F, 2009). Diese klinische
21 Beobachtung konnte kürzlich durch in vitro Beobachtungen erklärt werden (Martelli M P , 2015)
Es sei noch erwähnt, dass ATRA medizinisch auch in Erkrankungen der Haut verwendet wird. Hier wird durch ATRA die Mitosetätigkeit der Zellen an Epithelzellen stimuliert. Therapeutische Gebiete dieser Verwendung sind u.a. Akne.
1.4. Therapie der APL t(15;17) (q22;q21)
Basierend auf den Ergebnissen zahlreicher Untersuchungen hinsichtlich der enormen Wirksamkeit von ATRA in der APL, stellt die Retinsäure heutzutage einen festen Bestandteil der Therapie dar. Als Monotherapie kann ATRA selbst bei ca. 80 - 90 % aller Patienten mit APL eine CR induzieren, diese zeigt sich jedoch in der Regel nicht von Dauer (Grignani F, 1994; Tallman M S, 1997).
Die APL wurde bereits innerhalb der italienischen GIMEMA sowie der spanischen PETHEMA Studien nach einem Risiko Score nach Sanz eingeteilt, siehe dazu Tabelle 9 (Sanz M A, 2000).
Tabelle 9: Risiko Score nach Sanz
Niedrig Intermediär hoch
Leukozyten /µl < 10.000 ≤ 10.000 > 10.000
Thrombozyten /µl > 40.000 ≤ 40.000
Diese Risikostratifizierung hat auch heute in der Prognosebestimmung und in der Erstlinientherapie von APL-Patienten ihre Bedeutung, auch wenn sich die angewendeten Therapieschemata geändert haben. Therapeutisch entscheidend ist die Einteilung hinsichtlich der Leukozytenzahl, wobei die Grenze bei 10.000 Leukozyten / µl liegt.
Analog der DGHO Leitlinie (deutsche Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie) werden Patienten mit einem niedrigen sowie intermediären Risiko sowohl in der Induktions- sowie Konsolidierungstherapie mit ATRA und einem Anthrazyklin oder mit ATRA in Kombination mit Arsentrioxid behandelt. Letztere Kombination stellt eine zytostatikafreie Therapieform der APL dar. Dabei hat sich in mehreren Studien gezeigt, dass diese Therapieform der chemotherapiehaltigen nicht unterlegen ist, wahrscheinlich ist sie sogar mit einer besseren Prognose verbunden (Dayyani F, 2011; Lo-Coco F, 2013). Patienten mit einer Hochrisiko-APL erhalten sowohl in der
22 Induktions- als auch in der Konsolidierungstherapie eine Kombination aus ATRA, einem Anthrazyklin sowie Cytarabin. Nach erfolgter Therapie wird das Monitoring der Erkrankung mittels RT-PCR auf Genebene durchgeführt. Ein Rezidiv oder ein primäres Nicht-Ansprechen der Therapie ist sehr selten. Hier stellen ATRA und Arsentrioxid sowie die folgende Stammzelltransplantation die empfohlenen Therapieempfehlungen dar.
War die APL vor Einführung von ATRA noch aufgrund der Gerinnungskomplikationen die gefürchtetste Form der AML, so zeigt sich in aktuellen Studien ein Überleben von ca. 99 % nach 2 Jahren (Lo-Coco F, 2013).
Arsentrioxid
Arsentrioxid (ATO) ist in der therapeutischen Medizin bereits lange Zeit bekannt.
Anwendungen findet es in der Dermatologie in der Therapie der Psoriasis sowie als Insektengift. Hinsichtlich der Therapie der APL wurde Arsentrioxid 2004 wiederentdeckt (Shen Z X, 2004). Der genaue Wirkmechanismus, über den Arsentrioxid seine Wirkung bei APL ausübt, ist (noch) unbekannt. ATO scheint dosisabhängig zu wirken. In niedriger Dosis führt es zur Differenzierung der APL- Zellen über Interaktion mit dem PML-RARα-RXR Komplex. Es kommt zur Acetylierung der Histone und Freisezten der Chromatinstruktur, welches die Transkription ermöglicht. Eine hohe Dosis der Substanz (> 0,5 µM) führt durch Verminderung des mitochondrialen Transmembranpotenzials zur Apoptose (Zhou G B, 2005). Zudem kann ATO das Onkoprotein PML-RARα degradieren (Shen Z X, 2004). Im Gegensatz zu ATRA kann durch Arsentrioxid eine Remission der APL sogar auf molekularer Ebene erzielt werden (Zheng W L, 2007).
Für medizinische Zwecke existiert Arsen in der oralen sowie parenteralen Applikationsform. Dabei scheint die Wirkung der oralen Medikation in Form von As4S4 der intravenösen Substanz Arsen-trioxid nicht unterlegen (Zhu H H, 2013).
1.5. Nicht-kodierende RNAs
Das genetische Material der Zelle befindet sich im Zellkern. Dieser trägt die sogenannten Chromosomen, welche aus DNA bestehen. Die DNA ist ein langer Doppelstrang. Jeder dieser Stränge besteht jeweils aus den Ribosezuckern der Purinbasen (Guanin und Adenin) sowie den Ribosezuckern der Pyrimidinbasen (Thymin und Cytosin). Die Reihenfolge der aneinandergereihten Basen bestimmt den
23 genetischen Inhalt der DNA. Beide DNA Einzelstränge verhalten sich komplementär zueinander, sodass jeweils eine Purinbase des einen Stranges nicht-kovalent an eine Pyrimidinbase des komplementären Stranges bindet. Dabei bindet sich Guanin nicht-kovalent an Cytosin und Thymin an Adenin. Die Reihenfolge der Basen eines Stranges bestimmt damit die Reihenfolge des anderen und umgekehrt.
Die genetische Information der DNA wird somit repräsentiert durch die unterschiedliche Reihenfolge der Basen. Zur weiteren Umsetzung der genetischen Information bedient sich die Zelle der Durchführung der sog. Transkription.
Bestimmte DNA-Abschnitte eines Stranges werden dabei von einem komplexen Set aus verschiedenen Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren ausgelesen und die Information in einer neu entstandenen RNA weitergegeben. Dieser neu entstandene RNA-Strang ist komplementär zum template-Strang des DNA-Doppelstrangs der zum Ablesen diente, und entspricht in der Basensequenz dem kodogenen Strang (bis auf den Einbau von Uracil statt Thymin). Die RNA besteht aus einem Einzelstrang an Purin- und Pyrimidinbasen, es sind Adenin und Guanin sowie Cytosin und Uracil.
Kodiert der abgelesene Abschnitt der DNA ein Peptid oder Protein, so wird der neu entstandene Basenstrang zur messenger RNA (mRNA). Die mRNA, gibt die genetische Information bei der sog. Translation über Ribosomen weiter. Hier entstehen abhängig von der Basenfolge der mRNA bestimmte Peptide, die sich aus Aminosäuren zusammensetzen. Kodiert ein bestimmter Teil der DNA kein Peptid oder Protein, so entsteht eine sog. nicht-kodierende RNA (non coding RNA, ncRNA).
Die Information von ncRNA wird nicht über Ribosomen in ein Peptid übersetzt.
Vielmehr übernehmen ncRNAs zahlreiche zum größten Teil noch unbekannte regulatorische Funktionen, u.a. beeinflussen sie die Transkription anderer Gene und die weitere Verarbeitung von transkribierter mRNA.
Unter den bereits bekannten ncRNAs finden sich u.a. t-RNA, rRNA. Die Struktur sowie Funktion dieser ncRNAs sind gut beschrieben. Im Laufe der weiteren Erforschung von ncRNAs wurden weitere Klassen entdeckt und benannt. Es sind u.a.
miRNAs, snRNAs und snoRNAs. Diese RNAs gehören aufgrund ihrer geringen Anzahl von Nukleotiden < 200 zu den kurzen nicht-kodierenden RNAs. Auch sie üben eine Vielzahl regulatorischer Funktionen im Körper aus, welche z.T. noch nicht hinlänglich erforscht wurden. In dieser Arbeit soll nicht unerwähnt bleiben, dass die Klasse der miRNAs (micro RNA) ebenfalls eine in vielen Fällen bereits bekannte Rolle in der Hämatopoese und Leukämogenese spielt. Hinsichtlich der myeloischen
24 Leukämie scheint speziell die miRNA-223 eine herausragende Rolle zu spielen (Kuchenbauer F, 2011; Fazi ,2011).
Definition der langen nicht-kodierenden RNA
Die nicht-kodierenden RNAs stellen eine heterogene Gruppe von Nukleotiden dar.
Abhängig von der Länge der ncRNA, d.h. von der Anzahl der Basen des ncRNA Stranges, werden lange nicht-kodierende RNAs (long non coding RNA, lncRNA) von kürzeren ncRNAs (u.a. t-RNA, rRNA, miRNA, snRNA) unterschieden. Dabei liegt die Grenze der Basenanzahl, um ein lncRNA zu definieren, bei > 200 Nukleotiden (Wilusz J E, 2009; Perkel J M, 2013). Hinsichtlich der proteinkodierenden Funktion von lncRNAs lässt sich aktuell festhalten, dass diese auch in geringem Maße vorhanden sein kann, die meisten lncRNAs besitzen jedoch keine solche Eigenschaft (Ng S Y, 2013). Folglich kann auch das Vorhandensein eines ORF (open reading frame) im ursprünglichen DNA-Abschnitt nicht als Ausschlusskriterium für die Defnition einer lncRNA gewertet werden (Carninci P, 2005).
LncRNAs können anhand ihrer Funktionen weiter unterteilt werden. Erst kürzlich beschrieben Emmrich und Klusmann zwei verschiedene Untergruppen der lncRNAs, welche in der Hämatopoese sowie Leukämogenese eine wichtige Rolle spielen. Es sind zum einen die lincRNAs (long intervening non coding RNA), diese Gene weisen eine identische Konfiguration im Vergleich zu klassischen proteinkodierenden RNAs auf. Gemeinsames Merkmal aller lincRNAs ist eine im Allgemeinen niedrige, dafür jedoch deutlich gewebsspezifische Expression (Emmrich S et Klusmann H J, 2013).
Zum anderen werden T-UCRs (transcribed ultra-conserved regions) beschrieben.
Diese Gene zeigen eine hohe Konservierung beim Menschen, der Maus und der Ratte auf. Sie finden sich häufig an instabilen Regionen des Genoms wieder, welche mit Leukämien und soliden Tumoren assoziert sind (Calin G, 2007; Emmrich S et Klusmann H J, 2013).
Datenbanken über ncRNAs
Kapranov et al. stellten 2007 fest, dass nur ca. 20 % der DNA Peptide bzw. Proteine codiert. Das bedeutet, dass ca. viermal mehr Platz für lncRNA im Vergleich zu mRNAs auf der DNA existiert (Kapranov P, 2007). Mit Hilfe des FANTOM 3 Projekts (Functional Annotation of Mammalian cDNA) konnten bereits 2005 über 38.000 mögliche ncRNAs identifiziert werden, die aktuell Gegenstand der Forschung sind
25 Carninci P, 2005). Auch andere Datenbanken, wie z.B. RNAdb aus dem Jahre 2005 und deren Fortsetzung als RNAdb 2.0 (2007), tragen zum fortschreitenden Verständnis der ncRNAs bei (Pang K C, 2005; Pang K C, 2007). Speziell hinsichtlich der lncRNAs haben Amaral et al. 2011 eine Datenbank entwickelt, welche auch ihre Funktionen erfasst (Amaral P P, 2011). Weitere Datenquellen, welche in dem in dieser Arbeit verwendeten Microarray vertreten sind, werden in Tabelle 10 zusammengefasst.
Tabelle 10: Datenbanken des NCodeTM Human Non-coding RNA Microarray designed by Agilent® and distributed by Invitrogen®
H-Invitational H-InvB Yamasaki C et al. 2008 Antisense ncRNAs Engström P G et al. 2006 Human snoRNA and scaRNA Washietl S et al. 2005
Noncoding RNA Search Torarinsson E et al. 2006
EvoFold Pedersen J S et al. 2006
Funktionen der ncRNAs
Die Funktionen der mannigfaltigen ncRNAs sind bisher nicht ausreichend bekannt.
Oben genannte Datenbanken stellen sowohl Lokalisationsorte als auch mögliche Funktionen der ncRNAs zusammen. Aus diesen lassen sich hinsichtlich der Aufgaben der ncRNAs bereits Aussagen treffen. lncRNAs spielen in der Transkription eine regulatorische Funktion. Dabei beeinflussen die lncRNAs nicht nur die Transkriptionsmaschinerie, sondern auch RNA-Polymerasen und selbst die Konfiguration der DNA-Doppelhelix (Goodrich J A, 2006). Selbst eine Autoregulation der lncRNAs wird beschrieben. Hierbei wird über die Expressionsquantität die eigentliche Aktivität der lncRNAs gesteuert (Feng J, 2006; Pennacchio L A, 2006).
Klinische Relevanz der ncRNAs konnten Calin et al 2007 nachweisen.
Überexpression von bestimmten ultrakonservierten Regionen UCRs, die ncRNAs kodieren, scheinen in der Tumorgenese eine Rolle zu spielen. Experimentelle Repression überexprimierter UCRs konnte in Coloncarcinomzellen die Apoptose einleiten (Calin G A, 2007).
Lnc-RNAs üben ihre Funktion jedoch auch in der posttranskriptionellen Phase aus.
Als RNA Strang mit einer bestimmten Nukleotidsequenz können sie nicht-kovalent an komplementäre mRNA binden und damit die Translation regulieren. Hierbei scheint das Enzym Dicer-2 lange nicht-kodierende RNA in kleinere Fragmente zu
26 prozessieren, die wiederum im Sinne einer small interfering RNA, siRNA, komplementär an bestimmte mRNAs binden und damit das ribosomale Ablesen inhibieren (Czech B, 2008).
Unabhängig von Effekten am Transkriptions- und Translationsprozess beeinflussen lncRNAs auch die Epigenetik der DNA-Stränge. HOTAIR ist eine bereits näher untersuchte ncRNA. Kodiert wird sie durch den HOXC-Locus. Sie beeinflusst über Polykomb-Komplexe die Methylierung des HOXD-Locus und damit dessen Tertiärstruktur. Das Chromatin liegt in einer inaktiven Form vor, die Expression von HOXD wird dadurch reprimiert (Katayama S, 2005; Rinn J L, 2007).
Veränderungen der physiologisch vorkommenden lncRNAs können bei verschiedenen Erkrankungen nachgewiesen werden. Single Nukleotid Polymorphismen SNPs definieren Variationen einzelner Basenpaare innerhalb eines Nukleotidstranges. Ishii et al. konnten 2006 SNPs in lncRNA namens MIAT (myocardial infarction associated transcript) nachweisen. Diese Veränderung geht mit einer erhöhten Anfälligkeit für Myokardinfarkte einher. Unklar bleibt jedoch noch, ob diese genetische Aberration in kausalem Zusammenhang mit der klinischen Manifestation steht oder lediglich einen inzidentiellen Befund darstellt (Ishii N, 2006).
Speziell hinsichtlich der akuten Leukämie konnte vor kurzem nachgewiesen werden, dass die lncRNAs MONC (MIR99AHG) und MIR100HG eine essentielle Rolle in der Entwicklung der akuten megakaryoblastischen Leukämie spielen. Funktionelle Analysen wiesen ein verringertes Wachstum von Leukämiezellen der akuten megakaryoblastischen Leukämie durch knockdown der lncRNAs MONC oder MIR100HG auf (Emmrich S, 2014).
Eine einheitliche Einteilung der lncRNAs nach Funktionen existiert bisher nicht. Wang et al. schlugen jedoch 2011 eine Subklassifizierung von lncRNAs in vier nach Funktion der lncRNAs unterteilten Kategorien vor.
Die erste Kategorie „Signal― beschreibt lncRNAs, welche über die Transkription oder intrazelluläre Lokalisation räumliche und zeitliche Informationen. LncRNAs der Gruppe „Decoy― sequestrieren Biomoleküle von ihren nativen Bindungspartnern. Die Katerogie der „Guides― beschreibt lncRNAs, welche Enzyme an deren Wirkorte rekrutieren. „Scaffold― lncRNAs dienen als Affinitätsgerüst für Molekülkomplexe Wang K C, 2011; Emmrich S et Klusmann J H, 2013).
27 Die Anzahl sowie die Funktionen nicht-kodierender RNA scheinen gegenüber der kodierenden RNA deutlich umfangreicher und komplexer zu sein. Nicht-kodierende RNA eröffnet der wissenschaftlichen und klinischen Medizin ein weitreichendes Gebiet der Forschung.
1.6. Konzept, Ablauf und Zielsetzung der Arbeit
Hinsichtlich der akuten myeloischen Leukämie existieren bereits zahlreiche genetische Veränderungen (sog. Marker), welche die Prognose der Erkrankung beeinflussen können. Der heutige Kenntnisstand hat sicherlich keinen Anspruch auf Vollständigkeit. Im Laufe der Leukämieforschung werden immer mehr (neue) Marker bekannt, welche nicht nur eine Aussage über das Risiko einer Leukämie treffen, sondern auch die Therapiestrategien beeinflussen können. Im Rahmen der APL ist hier die Therapie mit ATRA zu nennen, dessen Wirkmechanismus bis auf Genebene zurückverfolgt werden kann. Das Verständnis der genetischen Veränderung und deren Bedeutung für die Leukämogenese machten die gezielte Therapie mit ATRA möglich. Die APL ist ein Modell, um den Differenzierungsprozess zu verstehen.
Dieses Wissen kann ggf. auf non-APL AML Formen übertragen werden, um die Therapie auch bei diesen Patienten zu verbessern.
Konzept der Arbeit
Die APL und deren Behandlung mit ATRA dienen in dieser Arbeit als Modell für die Differenzierung von leukämischen Zellen zu Granulozyten. Mit Hilfe von Microarrayuntersuchungen können Genexpressionsprofile von lncRNAs beider Reifegrade der Zellen bestimmt und somit die für die Differenzierung von Leukämiezellen verantwortlichen Gene identifiziert werden. Die Korrelation zwischen den identifizierten Genen zu benachbarten proteinkodierenden Genen lässt Rückschlüsse auf die etwaige Regulationskreisläufe zwischen kodierender und nicht- kodierender RNA zu.
Ablauf
HL60 und NB4 Zellen werden jeweils mit DMSO und ATRA inkubiert. ATRA führt zur Differenzierung der Leukämiezellen zu Granulozyten, DMSO führt zu keiner relevanten Veränderung der Zellen und dient als Kontrollreagenz. Der Nachweis der Reifung der Zellen erfolgt lichtmikroskopisch sowie mithilfe der FACS-Analyse zu
