Medizinischen Hochschule Hannover Leiter: Prof. Dr. med. J. Klempnauer
Experimentelle Studie zur Untersuchung des therapeutischen Nutzens einer Knochenmark-Zelltherapie im subakuten
Leberversagen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Felix C. Popp aus München
Hannover, 2004
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am:
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer: Prof. Dr. med. Pompiliu I. Piso
Referent/Referentin: Prof. Dr. med. Wolfgang Hiller
Koreferent/Koreferentin: Priv.-Doz. Dr. Christian Strassberg Tag der mündlichen Prüfung: 28. Februar 2005
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Reinhold E. Schmidt Prof. Dr. med. Helmut Drexler Prof.’in Dr. med. Anke Schwarz
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... 1
1 Einleitung und Fragestellung ... 4
1.1 Stammzelltherapie als Ergänzung zur Lebertransplantation ... 4
1.1.1 Embryonale Stammzellen ... 5
1.1.2 Adulte Stammzellen... 5
1.1.3 Stufenmodell der Leberregeneration ... 7
1.2 Entwicklung eines Rattenmodells zur Untersuchung der Leberregeneration... 9
1.3 Fragestellung... 11
2 Material und Methoden... 12
2.1 Material... 12
2.1.1 Verbrauchsmaterial... 12
2.1.2 Chemikalien ... 13
2.1.3 Antikörper... 14
2.1.4 Geräte... 15
2.1.5 Programme... 15
2.1.6 Chirurgisches und sonstiges Material ... 15
2.2 Tierversuche... 16
2.2.1 Versuchstiere ... 16
2.2.2 Anästhesie und Narkotika... 17
2.2.3 Proliferationshemmung der Leber durch Retrorsine ... 17
2.2.4 Schädigung der Leber ... 18
2.2.5 Knochenmarktransplantation ... 20
2.2.6 Tiermodelle... 21
2.2.7 Blutentnahmen ... 28
2.3 Labormethoden ... 29
2.3.1 HE-Färbung auf Kryoschnitten... 29
2.3.2 Immunhistologie ... 30
2.3.3 FACS-Färbung... 33
2.3.4 Zellkultur ... 36
3 Ergebnisse... 39
3.1 Leberregeneration bei verschiedenen Schädigungsmodellen ... 39
3.1.1 Alleinige Gabe von Retrorsine ... 39
3.1.2 Leberschädigung durch CCl4... 42
3.1.3 Leberschädigung durch partielle Hepatektomie ... 43
3.1.4 Zusammenfassung ... 45
3.2 Knochenmarktransplantation als Zelltherapie bei subakutem Leberversagen ... 46
3.2.1 Ohne Vorbehandlung mit Retrorsine... 47
3.2.2 Mit Vorbehandlung mit Retrorsine... 49
3.2.3 Zusammenfassung ... 50
3.3 Verhalten der knochenmarkstämmigen Zellen bei subakuten Leberversagen ... 50
3.4 Qualitativer Beitrag der Zelltherapie zur Leberregeneration... 54
3.4.1 Subakutes Leberversagen durch CCl4... 54
3.4.2 Subakutes Leberversagen durch partielle Hepatektomie... 57
3.4.3 Zusammenfassung ... 60
4 Diskussion... 61
4.1 Die Leber regeneriert sich nach subakutem Leberversagen ... 61
4.1.1 Auswirkungen einer Retrorsine-Behandlung auf die Leber ... 62
4.1.2 Die Leber regeneriert sich nach subakutem Leberversagen durch CCl4... 63
4.1.3 Die Leber regeneriert sich nach subakutem Leberversagen durch partielle Hepatektomie ... 64
4.2 Eine Knochenmarkzelltherapie erzielt keine Überlebensvorteile bei subakutem Leberversagen durch CCl4... 65
4.3 Die Spenderzellen beteiligen sich an der subakuten Entzündungsreaktion... 68
4.4 Einige Spenderzellen verbleiben langfristig in der Leber ... 70
5 Zusammenfassung ... 75
6 Anhänge ... 78
6.1 Tiermodelle in der Übersicht ... 78
6.2 Transplantation embryonaler Stammzellen ... 80
6.3 Protokoll Immunhistologie Einfachfärbung ... 80
6.4 Arbeitsschritte Immunhistologie Doppelfärbung ... 82
6.5 Protokoll FACS-Doppelfärbung ... 83
6.6 Abkürzungen... 84
7 Literatur ... 88
8 Lebenslauf... 98 9 Eidesstattliche Erklärung ... 99 10 Danksagung ... 100
1 Einleitung und Fragestellung
1.1 Stammzelltherapie als Ergänzung zur Lebertransplantation
Fünf Jahrzehnte nach der ersten Organtransplantation stellt diese einerseits immer noch die Therapie der Wahl für bestimmte, ansonsten tödlich verlaufende Krankheiten dar, andererseits handelt es sich nach wie vor um einen risikoreichen operativen Eingriff, der mit einer lebenslangen, belastenden Immunsuppression verbunden ist. Trotz neu entwickelter Techniken wie Split-Lebertransplantation, unterstützender Transplantation im akuten Leberversagen und der Leber-Lebendspende stehen insgesamt zu wenig Spenderorgane zur Verfügung, was wachsende Wartelisten mit teilweise mehrjährigen Wartezeiten für die schwerkranken Patienten zur Folge hat. Während eines akuten Leberversagens steht oft entweder kein Organ zur schnellen Transplantation zur Verfügung, oder der Patient kann wegen des sich rapide verschlechternden Allgemeinzustands nicht mehr operiert werden. Einige Patienten versterben, während sie auf ein Organ warten. Aus diesen Gründen wird nach Alternativen und Ergänzungen zur Organtransplantation gesucht, wobei in letzter Zeit Stammzellen eine wichtige Rolle spielen.
Stammzellen können als Zelltherapie eingesetzt werden und haben das Potenzial, die Organfunktion zu übernehmen und beschädigte, gealterte oder von Geburt an funktionslose Gewebe zu reparieren. Die Stammzellapplikation ist idealerweise eine komplikationsarme Therapie, da sie intravenös verabreicht werden kann. Dem Patienten würde der belastende Eingriff einer mehrstündigen Organtransplantation erspart bleiben. Bestimmte Arten von Stammzellen sind schnell und einfach zu gewinnen und könnten deswegen eine Alternative zur Lebertransplantation darstellen. Denkbar ist auch eine unterstützende Therapie im subakuten Organversagen, wobei die Organfunktion durch eine Stammzelltherapie solange aufrechterhalten werden kann, bis ein geeignetes Organ zur Transplantation zur Verfügung steht. Dies wäre besonders
beim Leberversagen ein Fortschritt, da die verminderte Organfunktion mit den derzeit verfügbaren therapeutischen Maßnahmen nur unzureichend überbrückt werden kann.
Das große Potenzial von Stammzellen erfordert eine nähere Untersuchung ihrer Eigenschaften und ihrer Eignung für einen therapeutischen Einsatz. Dabei unterscheidet man grundsätzlich embryonale von adulten Stammzellen.
1.1.1 Embryonale Stammzellen
Embryonale Stammzellen sind pluripotent und haben per Definition die Fähigkeit in eine Vielzahl von Geweben zu differenzieren und diese möglicherweise zu regenerieren. Sie können in vitro kultiviert und expandiert werden, wodurch sie in fast unbegrenzter Zahl in Form stabiler Zelllinien zur Verfügung stehen. Die Nutzung embryonaler Stammzellen birgt allerdings ethische Probleme, denn zur Gewinnung der Stammzellen müssen unter Umständen Embryonen getötet oder „hergestellt“ werden.
Der Schutz ungeborenen Lebens steht dabei den Bedürfnissen und Hoffnungen schwer kranker Patienten gegenüber. Nach syngener Transplantation embryonaler Stammzellen wurden im Tierversuch Tumore beobachtet86, was nahe legt, dass das große Proliferationspotenzial und die geringe Differenzierung dieser Zellen mit einem hohen Entartungsrisiko verbunden ist. Die Gefahr der adjuvanten Tumorerzeugung spricht derzeit gegen die Durchführung einer embryonalen Stammzelltherapie.
1.1.2 Adulte Stammzellen
In der letzten Zeit wurde das Phänomen der Transdifferenzierung adulter Stammzellen beschrieben. Dabei ist herausgefunden worden, dass adulte Stammzellen nicht nur in das für sie typische Gewebe differenzieren, sondern sich unter bestimmten Umständen auch zu völlig anderen Zellarten entwickeln können. Diese Beobachtung legt nahe, dass auch adulte Stammzellen zur Regeneration einer Vielzahl geschädigter Gewebe fähig sind. Wahrscheinlich ist für den Vorgang der Transdifferenzierung ein gewisser Selektionsvorteil der Stammzellen notwendig. Hämatopoetische Stammzellen beispielsweise transdifferenzieren nicht ohne weiteres in großem Umfang in andere Zellarten. Es wird angenommen, dass organfremde Stammzellen erst dann in einem Gewebe anwachsen, wenn dessen organeigene Regenerationsmöglichkeiten erschöpft sind, weil es beispielsweise zu stark geschädigt ist. In diesem Fall haben organfremde
Stammzellen einen Selektionsvorteil und können Zellen des geschädigten Gewebes ersetzen. Teilweise wurde dabei sogar ein so genannter Keimblattsprung beobachtet, wobei Stammzellen von Geweben eines embryonalen Keimblattes in funktionsfähige Zellen eines anderen Keimblattes differenzieren. Dies steht im Widerspruch zum Paradigma der Zelldifferenzierung, nach dem eine Stammzelle immer nur in Zellen eines Organsystems differenzieren kann6,47,90. Die Eigenschaft der Stammzellen, auch in Zellen anderer Gewebe zu transdifferenzieren, wird Plastizität genannt.
Es werden verschiedene Arten adulter Stammzellen unterschieden, die jeweils auf unterschiedliche Weise gewonnen werden und spezifische Eigenschaften besitzen.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) beispielsweise werden durch Kultur von plastikadhärenten Knochenmarkzellen gewonnen und ähneln Fibroblasten. Es sind keine hämatopoetischen Zellen, sie können in einer Zellkultur expandiert werden und besitzen ein enormes Proliferations- und Differenzierungspotenzial. Es ist gezeigt worden, dass mesenchymale Stammzellen unter anderem zu Knochen-, Knorpel- und Fettzellen differenzieren76,78. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass sie sowohl in vitro als auch in vivo funktionstüchtige Hepatozyten bilden können80. Besonders interessant sind hämatopoetischen Stammzellen (HSC), da sie ein ausgesprochen hohes Differenzierungspotenzial besitzen und einfach gewonnen werden können. Für hämatopoetischen Stammzellen ist die Differenzierung in Muskel-33 und Herzmuskelzellen40, sowie in Neuronen8,62,101 und Hepatozyten4,7,51,89 beschrieben worden. Sie können entweder direkt aus dem Blut aufgereinigt oder einfach aus dem Knochenmark gewonnen werden. Eine weitere attraktive Möglichkeit ist die medikamentöse Mobilisation aus dem Knochenmark ohne invasive Eingriffe, beispielsweise durch SCF („Stem Cell Factor“) und G-CSF52 (Granulozyten-Kolonie- stimulierender Faktor). Ein Nachteil ist allerdings, dass hämatopoetische Stammzellen in vitro nicht expandiert werden können. Eine weitere Stammzellart aus dem Knochenmark ist die so genannte „side population“, die dadurch gewonnnen wird, dass die Zellen der side population einen fluoreszierenden Farbstoff aus dem Zytoplasma transportieren können und so identifizierbar sind. Auch diese Zellen können zur Leberregeneration beitragen103. Zu den hepatischen Stammzellen zählen die so genannten „oval cells“, die in Hepatozyten und Gallengangszellen differenzieren können24,74. Die Hepatozyten selbst zählen nicht zu den Stammzellen, sie können sich zwar fast beliebig oft teilen und besitzen somit die Stammzelleigenschaft der
Selbsterneuerung. Es fehlt allerdings die Fähigkeit zur Differenzierung zu verschiedenen Zelltypen, so dass nicht alle Kriterien einer Stammzelle erfüllt sind.
Diese Beispiele zeigen, dass auch adulte Stammzellen das Potenzial zur Differenzierung in verschiedene Gewebe haben und möglicherweise Organschäden reparieren können.
Adulte Stammzellen können unkompliziert gewonnen werden und bergen kaum ethische Probleme beim Einsatz als Zelltherapie. Die Stammzelltherapie der Zukunft könnte sich aus mehreren Schritten zusammensetzen, die idealerweise alle medikamentös induziert werden. Nach einer Mobilisierungsphase der Stammzellen aus ihrem ursprünglichen Kompartiment (z.B. Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen aus dem Knochenmark durch G-CSF) müssen sie dazu gebracht werden, in das Zielgewebe einzuwandern (so genanntes „homing“). Nun sollen sie sich in den Zellverband des geschädigten Gewebes einfügen („re-entry“), gefolgt von einer Differenzierungsphase in das neue Gewebe. Schließlich ist noch eine Proliferationsphase nötig, aus der möglichst viele Zellen des zu regenerierenden Gewebes hervorgehen. Eine Therapie unter Nutzung der körpereigenen Stammzellen ohne Explantation und Replantation ist folglich besonders risikoarm, da sie nicht invasiv ist. Bei der Nutzung körpereigener Stammzellen als Therapiealternative zur Organtransplantation würde zusätzlich die lebenslange Immunsuppression wegfallen.
Bei der ergänzenden Therapie zur Überbrückung eines subakuten Leberversagens könnte die Mortalität auf den Wartelisten zur Organtransplantation gesenkt werden, eine Stammzelltherapie nach einer Lebertransplantation könnte postoperativ die Leberregeneration unterstützen.
1.1.3 Stufenmodell der Leberregeneration
Viele Autoren gehen von einer Leberregeneration in Stufen aus3,14,18,66,81. Wenn die Leber erkrankt, kann die Restleber einen Parenchymverlust von mehr als ⅔ der Gesamtmasse durch Proliferation der restlichen Hepatozyten, also durch Hyperplasie ausgleichen. Ist die Regenerationsfähigkeit der Hepatozyten erschöpft, reparieren andere Zellpopulationen den Schaden22,58,74. Das Stufenmodell der Leberregeneration besagt also, dass wenn ein Regenerationsmechanismus nicht funktioniert oder ausgelastet ist, ein komplexerer Mechanismus genutzt wird.
Gordon et al. beschrieben kürzlich kleine Zellen, die nach pharmakologischer Unterbindung der Hepatozytenmitose und partieller Hepatektomie die Leber
regenerierten36-38. Wegen ihrer Morphologie und ihres Verhaltens, ähnlich wie hepatische Vorläuferzellen, nannten die Autoren diese Zellpopulation „small hepatocyte like progenitor cells“ (SHPC). Bei dieser Zellpopulation handelt es sich wahrscheinlich um endogene Leberstammzellen.
Eine andere regenerierende Zellpopulation sind die „oval cells“, bipolare endogene Stammzellen der Leber, die zu Hepatozyten und Gallengangszellen differenzieren können. Sie sind nach ihrer ovalen Zellmorphologie benannt worden und finden sich primär in den terminalen Gallengängen, den so genannten Hering’schen Kanälen. In letzter Zeit ist beobachtet worden, dass die „oval cells“ auch aus dem Knochenmark stammen können und von dort in die Leber einwandern66,72, außerdem scheinen sie auch beim Menschen zu existieren92.
Lagasse et al. lieferten den wohl eindrucksvollsten Beweis, dass hämatopoetische Stammzellen Lebergewebe regenerieren können51. Bei Mäusen mit angeborner Tyrosinämie Typ I wurde die Leberfunktion nach Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) vollständig wieder hergestellt, die Tiere überlebten die ansonsten letale Krankheit. In den Lebern der Tiere fanden sich bis zu 50% funktionierende Spender-Hepatozyten, die aus den transplantierten hämatopoetischen Stammzellen hervorgegangen sind. Die gespendeten Stammzellen besaßen den genetischen Defekt nicht, hatten also einen Selektionsvorteil gegenüber den defekten Hepatozyten.
Für dieses Beispiel der Leberregeneration ist kürzlich gezeigt worden, dass die transplantierten hämatopoetischen Stammzellen nicht transdifferenzieren, sondern mit den defekten Leberzellen fusionieren95,98. Das Fusionsprodukt entwickelt sich im Phänotyp zu einem Hepatozyten und regeneriert die Leber, wobei die Eigenschaften der hämatopoetischen Stammzelle weitgehend verloren gehen. Im Prinzip kann dieser Vorgang als eine neue Form der Gentherapie angesehen werden, bei dem die hämatopoetischen Stammzelle das fehlende Gen beisteuert und der Hepatozyt den Phänotyp und die Funktion des Fusionsprodukts bestimmt.
Viele Fragen bezüglich adulter Stammzellen sind noch ungeklärt und müssen erforscht werden. Fraglich ist beispielsweise, ob die Stammzellen immer fusionieren oder tatsächlich auch transdifferenzieren können und falls letzteres zutrifft, ob sie direkt zu Gewebszellen differenzieren, oder erst einen Dedifferenzierungsschritt zu einer noch undifferenzierteren und potenteren Zelle durchlaufen. Ungelöst ist auch die Frage, ob Stammzellen ausschließlich durch ihr exprimiertes Genmuster definiert sind, oder ob sie
Nischenzellen benötigen, die sie durch Zytokine oder andere Botenstoffe am Leben erhalten. Da Nischen und die komplexen Interaktionen von Stammzellen noch ungenügend bekannt sind, bieten sich in vivo Versuche zur Erforschung des Potenzials von Stammzellen an. Soll eine Stammzelltherapie bei Organschädigung untersucht werden, sind Tierversuche unverzichtbar.
1.2 Entwicklung eines Rattenmodells zur Untersuchung der Leberregeneration
In der vorliegenden Arbeit ist ein Rattenmodell entwickelt worden, mit dem der Beitrag von adulten Knochenmarkzellen zur Regeneration im subakuten Leberversagen untersucht werden kann. Hämatopoetische (Stamm-)zellen sind gewählt worden, weil sie einfach zu gewinnen sind, Erfahrungen mit ihnen vorlagen16 und der funktionelle Nutzen hämatopoetischer Stammzellen bei der Regeneration eines chronischen Leberschadens bereits beschrieben worden ist51. Kürzlich wurde auch von knochenmarkständigen hepatischen Vorläuferzellen berichtet, die unter bestimmten Umständen in vitro und in vivo in funktionsfähige Hepatozyten differenzieren5. Um im vorliegenden Modell die knochenmarkstämmigen Zellen zu untersuchen, wurde eine Knochenmarktransplantation durchgeführt, wobei sich die Spender in einem genetischen Merkmal vom Empfänger unterschieden, wodurch die Spenderzellen später immunhistologisch identifiziert werden konnten. Für dieses Markersystem wurden CD45 (RT7) diallele102 und MHC Klasse I (RT1A) diallele Rattenstämme benutzt.
Als Zielorgan wurde in der vorliegenden Arbeit die Leber gewählt, da hier eine Zelltherapie besonders dringend benötigt wird und am ehesten positive Effekte zu erwarten sind. Theise et al. wiesen das Y-Chromosom in Hepatozyten von weiblichen Spenderlebern nach, die in männliche Empfänger transplantiert wurden91. Die Leberzellen waren vermutlich aus dem Knochenmark (trans-)differenzierte männliche hämatopoetischen Stammzellen. Da das Phänomen der Transdifferenzierung auch beim Menschen auftritt, und dort vor allem in der Leber beschrieben worden ist, scheint es sinnvoll, besonders die Leber als Ziel für eine Stammzelltherapie zu wählen.
Als Krankheitsmodell wurde in der vorliegenden Arbeit ein subakutes Leberversagen untersucht, zum einen, weil eine Knochenmarkzelltherapie in einer solchen Versuchsanordnung noch nicht erforscht worden ist und zum anderen eine klinische
Anwendungen besonders interessant erscheint. Eine relativ einfach verfügbare Stammzelltherapie könnte in Zukunft helfen, die Leberfunktion während der Wartezeit auf eine Spenderleber zu unterstützen, wodurch die Sterblichkeit auf den Wartelisten zur Lebertransplantation gesenkt werden könnte. Das subakute Leberversagen wurde pharmakologisch, durch CCl4, oder durch partielle Hepatektomie herbeigeführt. CCl4 ist ein Lebergift, das zu Nekrose von Hepatozyten und Parenchymverlust führt, also ähnliche Effekte wie die klassische partielle Hepatektomie hervorruft.
Durch eine pharmakologische Vorbehandlung mit dem Mitoseinhibitor Retrorsine wurde die naive Leberregeneration via Zellteilung unterbunden, damit nach dem Stufenmodell andere Regenerationsmechanismen greifen können und deutlich beobachtbar werden. Retrorsine ist ein pflanzliches Pyrrolizidinalkaloid, das in der Leber zu DNS-alkyliereden Metaboliten abgebaut wird, die die Leberzellen daran hindern eine einmal begonnene Mitose zu beenden20,48,49,61,75. Retrorsine wirkt selektiv und langfristig mitoinhibitorisch auf Hepatozyten, stört aber kaum die normale Leberfunktion. Es wirkt erst bei Auftreten des subakuten Organversagens, weil durch den Parenchymverlust ein Mitosestimulus ausgelöst wird. Als Zelltherapie im subakuten Leberversagen ist im benutzten Modell das gesamte Knochenmark eingesetzt worden, um Effekte der Stammzellen, der hepatischen Vorläuferzellen und etwaiger Nischenzellen zu erfassen.
Zusammenfassend wurde ein Rattenmodell etabliert, bei dem durch Retrorsine- Vorbehandlung und Induktion eines subakuten Leberversagens andere, die Leber regenerierende Zellpopulationen einen Selektionsvorteil erhalten sollten, weil die Hepatozyten sich nicht mehr teilen konnten. Untersucht wurde das Regenerationspotenzial knochenmarkstämmiger Zellen, die beobachtet werden konnten, weil zuvor eine Knochenmarktransplantation durchgeführt wurde. Die Spenderzellen unterschieden sich in einem genetischen Merkmal und konnten mittels einer immunhistologischen Färbung identifiziert werden. Die Effekte einer anschließend durchgeführten Knochenmarkzelltherapie bei der Leberregeneration im subakuten Organversagen sind untersucht worden.
1.3 Fragestellung
Folgende Fragen sollen durch das Tiermodell in der vorliegenden Arbeit geklärt werden:
1. Leberregeneration nach subakutem Organversagen mit und ohne Unterbindung der naiven Leberregeration via Zellteilung:
a. In welchem Umfang wird die Leber regeneriert?
b. Durch welchen Mechanismus wird die Leber regeneriert?
2. Funktioneller Beitrag zur Leberregeneration: Kann eine intravenös applizierte Knochenmarkzelltherapie die Überlebenswahrscheinlichkeit verbessern?
3. Kurzfristige Besiedelung der Leber durch Spenderzellen: Beteiligen sich Spenderzellen an der Entzündungsreaktion im subakuten Organversagen und wenn ja, welcher Art und wie viele?
4. Langfristige Besiedelung der Leber durch Spenderzellen:
a. Verbleiben knochenmarkstämmige Zellen langfristig in der Leber?
b. (Trans-)differenzieren Spenderzellen und bilden Leberparenchym?
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Verbrauchsmaterial
Cryo-Tubes: ...Nunc, Wiesbaden
Deckgläser: ...Bezug über Jürgens, Hannover EDTA-Röhrchen: ...Sarstedt, Nümbrecht
Einmal-Injektions-Kanülen (20 G x 1 ½”, 20 G x 4/5”):.Braun, Melsungen Einmalküvetten: ... Sarstedt, Nümbrecht
FACS-Röhrchen: ...Falcon/Becton Dickinson, USA Flourescein protein labeling kit: ...Roche
Glasgewindeschraubröhrchen : ...Serolab, Aidenbach Glaskapillaren: ...Sarstedt, Nümbrecht
Mikrotiterplatten, 96 Vertiefungen, Rundboden: ...Nunc, Roskilde, Dänemark Objektträger: ...Bezug über Jürgens, Hannover Spritzen, 3 ml, 5 ml und 10 ml: ...Braun, Melsungen
Sterilfilter (Minisart NML 0,2 µm): ...Sartorius, Göttingen Zentrifugenröhrchen, 15 und 50 ml: ...Falcon, Heidelberg Zellkulturflaschen, 50 ml: ...Falcon, Heidelberg Zellkulturflaschen, 250 ml: ...Nunc, Wiesbaden
2.1.2 Chemikalien
Aceton (Reinst): ... Merck, Darmstadt Ammoniumchlorid (NH4Cl): ... Merck, Darmstadt Diethylether: ... Merck, Darmstadt Ethanol (96%ig): ... Merck. Darmstadt 3-Amino-9-Ethylcarbazol: ... Sigma, Deisenhofen FCS: ... Cytogen, Berlin N,N-Dimethylformamid: ... Sigma, Deisenhofen Ketamin 10%: ... WDT, Garbsen Glyceringelantine: ... Merck, Darmstadt Hämalaun: ... Merck, Darmstadt Kollagenase Typ IV: ... Sigma, Deisenhofen Methanol: ... Baker, Derventer Natriumchlorid: ... Merck. Darmstadt Normales Mausserum: ... Dianova, Hamburg Normales Rattenserum: ... Dianova, Hamburg PBS Dulbecco: ... Biochrom, Berlin Penicillin/Streptomycin: ... Seromed, Deisenhofen Ringer-Lactat DAB 7: ... Braun, Melsungen Salzsäure: ... Merck, Darmstadt TC 199: ... Flow, Meckenheim Tris: ... Merck, Darmstadt Türks-Lösung: ... Merck, Darmstadt Trypanblau: ... Merck, Darmstadt Wasserstoffperoxid: ... Merck, Darmstadt
2.1.3 Antikörper
Antikörper-Spezifität Spezies Klon Ig- Subklasse
Bezugsquelle
CD45 RC Maus OX-22 IgG1, κ Pharmingen, San Diego, USA Thy1 (CD90) Maus OX-7 IgG1, κ Pharmingen, San Diego, USA anti-RT1Aa,b Ratte C3 IgG2b, κ Pharmingen, San Diego, USA
anti-RT1Au Maus 5C10A n.n. Kooperation mit Prof. Wonigeit, Hannover, Deutschland
RT7.1 Ratte 12F11C IgG2b Kooperation mit Prof. Wonigeit / A. Dinkel, Hannover, Deutschland
RT7.2 Maus HIS41 IgG1, κ Pharmingen, San Diego, USA
αβ TCR Maus R73 IgG1, κ Kooperation mit Prof. Wonigeit, Hannover, Deutschland
Originalquelle: Prof. Hünig, Würzburg, Deutschland
Granulozyten Maus HIS 48 IgM, κ Pharmingen, San Diego, USA GAM-POX
Ziege-anti-Maus IgG POX konjugiert
Ziege polyklonal IgG und IgM F(ab)2
Dakopatts, Hamburg, Deutschland
GAM-AP Ziege-anti-Maus-IgG AP konjugiert
Ziege polyklonal IgG und IgM F(ab)2
Dianova, Hamburg, Deutschland
anti-FITC-POX Ziege-anti-FITC-IgG POX konjugiert
Ziege polyklonal IgG und IgM F(ab)2
Dianova, Hamburg, Deutschland
GAM-PE Ziege-anti-Maus IgG PE konjugiert
Ziege polyklonal IgG und IgM F(ab)2
Dakopatts, Hamburg, Deutschland
Tabelle 2-1 Verwendete Antikörper
2.1.4 Geräte
Brutschrank (Cytoperm): ...Heraeus, Hanau Digitalkamera für Mikroskop: ...Zeiss, Jena
Durchflusszytometer (FACScan): ...Becton Dickinson, CA, USA ELISA-Plattenlesegeraät (MR 7000): ...Dynatech, Plochingen Farbscanner: ...Olympus
Magnetrührer (TypKF): ...Heidolph (Jürgens, Hannover) Lichtmikroskop: ...Zeiss, Jena
Pipetten (5, 10, 100, 200, 1000 µl): ...Eppendorf, Hamburg
Rüttler (REAX 2000): ...Heidolph (Jürgens, Hannover) Sterilbank (Lamin-Air): ...Heraeus, Hanau
Varifuge 3.2S: ...Heraeus, Hanau Wasserbad: ...GFL, Burgwedel
2.1.5 Programme
Adobe Photoshop 7.0: …... Adobe Acrobat Reader 5.0: ……... Adobe
Microsoft Word 2002: ... Microsoft Corp.
Microsoft Excel 2002: ... Microsoft Corp.
Reference Manager 9.0: ... ISI ResearchSoft.
SigmaPlot 2000: ... SPSS Inc.
WinMDI2.8: ... Joseph Trotter, Freeware
2.1.6 Chirurgisches und sonstiges Material
Nadelhalter: ... Aeskulap, Tuttlingen Neubauer-Zählkammer: ... Sarstedt, Nümbrecht Pinzette, anatomisch: ... Aeskulap, Tuttlingen Pinzette, chirurgisch: ... Aeskulap, Tuttlingen
Präparierschere: ... Aeskulap, Tuttlingen Zellsieb 125µl: ... Neolap, Heidelberg Zellspatel: ... Neolap, Heidelberg
2.2 Tierversuche
2.2.1 Versuchstiere
Die Tiere wurden unter Standardbedingungen im Tierhaus der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten und wogen bei Beginn der Versuche zwischen 180 und 220g.
Ratten der Stämme LEW, LEW.1WR2 und LEW.1A wurden im Tierhaus der MHH (Leiter: Prof. Dr. Hedrich) gezüchtet, LEW.7B Tiere wurden aus der Zucht des Transplantationslabors der MHH (Leiter: Prof. Wonigeit) bezogen.
Alle verwendeten Stämme (siehe Tabelle 2-2) waren definitionsgemäß Inzuchtstämme (mindestens 20 Generationen von Bruder/Schwester Verpaarung) mit nahezu 100%
Wahrscheinlichkeit der Homozygotie auf einem bestimmten Genlokus.
RT1 RT7
A B/D E
LEW.1WR2 u a a A
LEW.1A a a a A
LEW.7B l l l B
LEW l l l A
Tabelle 2-2 Genetische Definition der verwendeten Rattenstämme
Der RT1-Genkomplex der Ratte entspricht den MHC Genen des Menschen, RT1A und RT1E entsprechen dem menschlichen MHC-I Komplex, RT1B/D dem MHC-II Komplex. Das RT7-Gen entspricht dem humanen CD45, das Genprodukt, eine transmembrane Tyrosin-phosphatase, wird auf nahezu allen Zellen hämatopoetischen
Ursprungs exprimiert. Hiervon ausgenommen sind nur Thrombozyten und Erythrozyten, sowie einige ihrer direkten Vorläuferzellen.
2.2.2 Anästhesie und Narkotika
Während Knochenmarktransplantationen sowie Blutentnahmen wurden die Versuchtiere mit Diethyläther narkotisiert, um Schmerzfreiheit und Relaxation zu erreichen. Die Inhalationsnarkose wurde in einem Glastopf durchgeführt, wobei die Tiere so lange darin belassen wurden, bis eine ausreichende Narkosetiefe erreicht war.
Bewusstlosigkeit wurde durch Feststellung der fehlenden Bewegung der Tiere, des Ausbleiben des Lidschlags und der Abflachung der Atmung festgestellt. Für eine flache Narkose wurde nach Eintreten der Bewusstlosigkeit 5 Sekunden gewartet, für eine tiefe 10 Sekunden.
2.2.3 Proliferationshemmung der Leber durch Retrorsine
Die Regenerationsfähigkeit der Leber nach einer Schädigung der Hepatozyten wurde durch Retrorsine unterbunden. Retrorsine ist ein Pyrrolizidinalkaloid aus der Pflanze Senecio vulgaris (gewöhnliches Greiskraut), das selektiv die Leberzelle daran hindert sich zu teilen20,48,49,61. In der Leberzelle wird Retrorsine aufgenommen, metabolisiert und zu bioaktiven Substanzen gegiftet, die Proteine und DNS alkylieren60. Dadurch wird die Zelle wahrscheinlich in der späten S-Phase und/oder der G2-Phase des Zellzyklus arretiert94 und kann die Mitose nicht beenden. Nicht ganz geklärt ist die Frage, ob in der Zelle DNS repliziert wird oder nicht, dazu liegen unterschiedliche Ergebnisse vor49,94. Gesichert ist eine rasche Metabolisierung und eine Wochen bis Monate andauernde Wirkung des antimitotischen Effekts48,61.
Die Leber ist ein Organ mit beträchtlicher Regenerationskraft, ein Verlust von bis zu ⅔ der Lebermasse wird innerhalb weniger Wochen wieder vollständig ausgeglichen. Dies geschieht durch Zellteilung der Hepatozyten, wobei die regenerierenden Zellen nur wenige Mitosen durchlaufen. Retrorsine verhindert diese Zellteilungen. Eine Schädigung der Leber induziert eine Proliferationsstimulation der Hepatozyten. Diese können die Mitose nicht beenden, eine normale Regeneration der Leber wird somit unterbunden.
Retrorsine liegt als Festsubstanz vor und muss vor der intraperitonealen Applikation erst gelöst werden. Pro Applikation erhielten die Ratten zwischen 6 und 7 mg Retrorsine i.p., was bei einem durchschnittlichen Körpergewicht von 200 g ca. 30 mg/kg KG entspricht. Zunächst wurde die benötigte Menge Retrorsine abgewogen und in ein Becherglas gegeben, in dem VE-Wasser vorgelegt wurde, so dass 10 mg Retrorsine/ml VE-Wasser vorlagen. Das noch ungelöste Gemisch wurde mit einer 1:10 verdünnten 37%en HCl-Lösung tropfenweise auf pH 2,5 titriert. Bei diesem sauren Milieu ließ sich das Retrorsine mit einem Magnetrührer auflösen. Um einen physiologischen pH-Wert zu erreichen, wurde die Lösung mit 1N NaOH auf pH 7,0 neutralisiert, wobei das Retrorsine in Lösung blieb. Danach wurde noch so viel NaCl zugegeben, bis eine 0,15 molare NaCl Lösung entstand. Die Retrorsinelösung wurde innerhalb von drei Stunden appliziert. Um einen optimalen Effekt zu erhalten wurden zwei Applikationen im Abstand von 14 Tagen vorgenommen, wobei nach der letzten Applikation 14 Tage gewartet wurde, bis weitere Behandlungen an den Tieren vorgenommen wurden.
2.2.4 Schädigung der Leber
Die Schädigung der Leber stellt einen Regenrationsreiz dar und löst eine Proliferation der Hepatozyten aus.
In der vorliegenden Arbeit sollte ein subakutes Leberversagen induziert werden, wozu sich verschiedene Methoden eignen, die folgende Anforderungen erfüllen:
1. Einfache und reproduzierbare Anwendung 2. Selektive Schädigung der Leber
3. Schneller und starker Wirkungseintritt
4. Langanhaltende Proliferationsstimulation der Hepatozyten
Im Folgenden werden die in dieser Arbeit angewandten Methoden vorgestellt.
2.2.4.1 Tetrachlorkohlenwasserstoff
Tetrachlorkohlenwasserstoff (CCl4) gehört zu den halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoffen und ist somit gut fettlöslich. In der Leberzelle wir es durch Monooxygenasen dehalogeniert, es bilden sich freie Radikale oder in anderen Biotransformationsreaktionen Epoxide. Die Toxizität beruht auf der Reaktion der freien Radikale mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wobei Chloroform (HCCl3) und Fettsäureradikale mit konjugierten Doppelbindungen entstehen. Die Anlagerung von O2
führt zur Bildung von Peroxiden bzw. Hydroperoxiden, die leicht zerfallen. Dieser Prozess mündet in eine Membranschädigung und Permeabilitätssteigerung, was zum Wassereintritt und Enzymaustritt und schließlich zum Zelltod führt.
Bei der akuten Vergiftung ist beim Menschen ein biphasischer Verlauf typisch. Nach einer Phase der narkotischen Erscheinungen treten Nierenschäden und vor allem eine toxische Hepatitis auf. In schweren Fällen entwickelt sich eine letale gelbe Leberatrophie oder ein urämisches Koma. Alle halogenierten Kohlenwasserstoffe sensibilisieren das Myokard gegen Katecholamine und lösen Herzrhythmusstörungen aus, die unter Umständen auch zum Tod führen können.
Bei der chronischen Vergiftung kann sich eine Leberzirrhose entwickeln. Schädlich ist nicht der Ausgangsstoff, sondern die reaktiven, kurzlebigen Metabolite, die vor allem in der Leber durch Giftung entstehen. CCl4 wirkt hinreichend selektiv, um es zur Induktion einer subakuten Leberinsuffizienz einzusetzen. Die Wirkung trat bei den durchgeführten Versuchen schnell ein und erreichte innerhalb von drei Tagen ihren Höhepunkt.
Tetrachlorkohlenwasserstoff wurde intraperitoneal appliziert, war gut steuerbar und die erzielten Vergiftungserscheinungen erwiesen sich als reproduzierbar. Innerhalb von 10 bis 14 Tagen erholten sich die Tiere von einer subletalen Dosis vollständig, in diesem Zeitraum bestand der Proliferationsstimulus für die Hepatozyten.
Tetrachlorkohlenwasserstoff zersetzt sich unter Einwirkung von Licht und der Anwesenheit von Feuchtigkeit unter Bildung von Phosgen. Das Gift wurde deswegen immer lichtgeschützt verwahrt und nach Lösung in Speiseöl in einem Verhältnis von 1:1 intraperitoneal appliziert.
2.2.4.2 Partielle Hepatektomie
Bei der partiellen Hepatektomie wurden je nach Versuch chirurgisch ⅓ bzw. ⅔ der Lebermasse entfernt. Nach Durchführung einer rechtsseitigen queren Oberbauchlaparatomie wurde der obere Teil des Dünndarms nach links geklappt und in eine nasse, aufgefaltete Kompresse geschlagen. Die Leber war nun gut zugänglich und der oberflächliche Leberlappen wurde mit einem Faden angeschlungen und herausluxiert. Der exponierte Lappen wurde ligiert, um die Blutzufuhr nach peripher zu unterbrechen. Mit einer Mikroschere wurde Stückweise die Leber durchtrennt, wobei die Schnittfläche mit einem Elektrokauter koaguliert wurde. Während dieses Vorgangs wurde mit einer Spritze 0,9% NaCl-Lösung auf die Schnittfläche getröpfelt, was den Koagulationsvorgang unterstützte. Falls die Blutung anhielt, wurde die Wunde mit
einem feuchten Tupfer für ca. eine Minute komprimiert und anschließend ein Stück Kollagenflies (Tabotamp®) aufgelegt. Bei der erweiterten Hepatektomie, wurde zusätzlich der rechte Leberlappen auf die gleiche Weise entfernt, so dass insgesamt ⅔ der Leber entfernt werden.
Nach Überprüfung der Blutstillung wurde das Abdomen in zwei Schichten zugenäht.
Zunächst wurden mit einer fortlaufenden Naht die Bauchwandfaszien miteinander verbunden, danach folgte eine fortlaufende Hautnaht. Die Tiere wurden während des Aufwachens unter eine Wärmelampe gelegt.
Die Ergebnisse waren zwar reproduzierbar, aber die Operation war technisch aufwendiger durchzuführen als die intraperitoneale Applikation von CCl4. Die Operationsmethode war mit einer höheren Letalität verbunden als die Gabe von CCl4, die Tiere benötigten länger, um sich davon zu erholen. Die Schädigung beschränkte sich singulär auf die Leber und der Proliferationsstimulus trat sofort nach der Operation ein.
Nach 10 bis 14 Tagen war die Lebermasse vollständig wieder hergestellt, der Proliferationsstimulus bestand somit über einen vergleichbaren Zeitraum wie bei der Verwendung von CCl4.
2.2.5 Knochenmarktransplantation
Die Knochenmarktransplantation wurde durchgeführt, damit Zellen des Knochenmarks bzw. der Knochenmark-Zelltherapie in der Leber des Empfängers immunhistochemisch detektiert werden konnten. Durch dieses Markersystem konnte der Beitrag der Spenderzellen zur Leberregeneration untersuchen werden.
Die Transplantation wurde an zwei aufeinander folgenden Tagen durchgeführt und bestand aus einem Konditionierungsteil und der eigentlichen Transplantation von Knochenmarkzellen.
2.2.5.1 Bestrahlung von Versuchstieren
Die Versuchstiere wurden in einen speziellen Plastikkasten verbracht und in der Abteilung für Nuklearmedizin der MHH mit einem Linearbeschleuniger bestrahlt. Alle Tiere erhielten eine Ganzkörperbestrahlung mit einer subletalen Dosis von 7 Gy. Diese diente der so genannten Konditionierung, bei der das Immunsystem zumindest teilweise depletiert wurde. Das wegen des hohen Zellumsatzes sensible Knochenmark war bei der Ganzkörperbestrahlung besonders betroffen. Die hämatopoetischen Vorläuferzellen
sowie periphere Zellen gingen zugrunde, was eine temporäre Immunsuppression zur Folge hatte sowie physisch Raum für das Anwachsen der Spenderzellen schuf (so genanntes „spacing“). Die nachfolgend transplantierten Knochenmarkzellen wurden deswegen nicht als fremd erkannt, konnten anwachsen und es bildete sich ein stabiler Chimärismus aus.
2.2.5.2 Zelltransplantation
Die Spendertiere wurden in eine tiefe CO2-Narkose versetzt und anschließend mittels zervikaler Dislokation getötet. Die langen Röhrenknochen Femur, Tibia und Humerus wurden entfernt und in eine Petrischale, gefüllt mit TC199-Medium, auf Eis verbracht.
Die Epiphysen wurden aufgebrochen und mit einer Kanüle angebohrt. Das Knochenmark wurde durch Spülung des Markraums mit einer 5 ml-Spritze gewonnen.
In einer weiteren Petrischale mit TC199-Medium wurde das Mark mit einer Spritze resuspendiert, bis eine homogene Einzelzellsuspension entstand. Das Knochenmark wurde nun bei 1000 upm, 4°C für 10 min zwei mal gewaschen, anschließend in TC199- Medium aufgenommen und auf 1 ml pro Tier expandiert. Die Zellzahl wurde mittels Trypanblaufärbung lichtmikroskopisch in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.
Anschließend wurden die Zellen in eine Schwanzvene des mit Äther betäubten Empfängertiers gespritzt. Jedes Tier erhielt mindestens 100⋅106 Knochenmarkzellen.
Nach 20 Tagen wurde mittels FACS-Messung (siehe unten) der periphere Chimärismus überprüft. Nur Tiere mit mehr als 30% Spenderleukozyten wurden in die weiteren Versuche übernommen (so genanntes „engraftment“) 41,55,100. Bei ca. einem von acht Tieren bildete sich kein stabiler Chimärismus aus, wobei unklar blieb, ob die Ganzkörperbestrahlung nicht ausreichend war oder das Spenderknochenmark nicht anwuchs (so genanntes „non-engraftment).
2.2.6 Tiermodelle
In Vorversuchen wurde zunächst die Auswirkung von Retrorsine auf die Leberregeneration untersucht. Die verschiedenen Schädigungsmodelle wurden miteinander verglichen. Dann wurde der Nutzen einer Knochenmarkzelltherapie bei subakutem Leberversagen untersucht.
Die im Weiteren verwendeten Tiermodelle ähneln sich im Prinzip stark und besitzen ein gemeinsames Grundgerüst. Für die speziellen Fragestellungen wurden bestimmte Rattenstämme kombiniert, wie in den darauf folgenden Abschnitten dargelegt wird.
2.2.6.1 Leberregenration bei verschiedenen Schädigungsmodellen
In einem ersten Ansatz wurde bei LEW.1A Versuchstieren die Leber mit 0,6 ml CCl4/kg KG geschädigt (Abkürzung: Hit(CCl4 0,6), siehe Abbildung 2-1 A), wobei in einer Gruppe die Versuchstiere zweimal im Abstand von je zwei Wochen mit 7 mg Retrorsine vorbehandelt wurden (Abkürzung: R, siehe Abbildung 2-1 B). Jede Gruppe bestand aus vier Tieren, schematisch lassen sich diese Vorversuche folgendermaßen darstellen:
A B
Stamm Versuch Anzahl der Tiere
LEW.1A Hit(CCl4 0,6) n = 4
LEW.1A R + R + Hit(CCl4 0,6) n = 4
Abbildung 2-1 Versuchsgruppen bei Schädigung durch CCl4 ohne (A) und mit (B) Vorbehandlung mit Retrorsine
In einem zweiten Versuch wurde das Schädigungsmodell durch eine ⅔ partielle Hepatektomie (Abkürzung: Hit(PH), siehe Abbildung 2-2 A) ersetzt und Lewis-Ratten als Versuchstiere benutzt. Eine weitere Gruppe wurde wieder mit Retrorsine vorbehandelt (siehe Abbildung 2-2 B).
A B
Stamm Versuch Anzahl der Tiere
LEW Hit(PH) n = 7
LEW R + R + Hit(PH) n = 4
Abbildung 2-2 Versuchsgruppen bei Schädigung durch partielle Hepatektomie ohne (A) und mit (B) Vorbehandlung mit Retrorsine
Als Kontrollgruppen dienten Tiere, die keiner Behandlung unterzogen wurden, sowie Tiere, die zweimal mit Retrorsine behandelt wurden:
Stamm Versuch Anzahl der Tiere
LEW.1A R + R n = 3
An Tag 12 nach der Leberschädigung wurden die Tiere getötet und aufgearbeitet. Dabei wurden erst das Tier, dann die Leber gewogen und Teile aus drei verschiedenen Lappen der Leber in flüssigem Stickstoff bei -80°C eingefroren. Ein Schnitt aus jedem Lappen wurde HE-gefärbt und je vier zufällig gewählte Stellen sind bei 40-facher Vergrößerung (so genannte „high power fields“, kurz: HPF) unter dem Mikroskop mit einer Digitalkamera fotografiert worden. Pro Tier wurden die Hepatozytenkerne von 12 HPFs ausgezählt und miteinander verglichen. Bei einigen Tieren wurden zusätzliche Schnitte angefärbt und ausgezählt, was in den jeweiligen Abbildungen im Einzelnen angegeben ist.
2.2.6.2 Funktioneller Nutzen einer Knochenmarkzelltherapie
Weibliche LEW.1A oder LEW Ratten erhielten steigende Dosen CCl4 (0,6 ml/kg, 0,8 ml/kg, 1,0 ml/kg, 1,2 ml/kg und 1,5 ml/kg) und entweder keine weitere Behandlung oder sechs Stunden später mindestens 100⋅106 LEW.1WR2 oder LEW Knochenmarkzellen als intravenös applizierte Stammzelltherapie (Abkürzung:
BMC(1WR2) oder BMC(LEW)). Der gleiche Versuch wurde nach zweimaliger Vorbehandlung mit 7 mg Retrorsine i.p. durchgeführt. Zwischen den Applikationen von Retrorsine und der Leberschädigung lagen je zwei Wochen Abstand. Um Unterschiede zwischen einer allogenen oder syngenen Knochenmarkzelltherapie zu ermitteln, wurde
ein Teil des Versuchs mit LEW Spendern und Empfängern durchgeführt. Insgesamt wurden folgende Gruppen eingesetzt:
Stamm Versuch Anzahl der Tiere
LEW.1A Hit(CCl4 0,6) n = 2
LEW.1A Hit(CCl4 0,6) + BMC(1WR2) n = 2
LEW.1A R + R + Hit(CCl4 0,6) n = 2
LEW.1A R + R + Hit(CCl4 0,6) + BMC(1WR2) n = 2
LEW.1A Hit(CCl4 0,8) n = 3
LEW.1A Hit(CCl4 0,8) + BMC(1WR2) n = 3
LEW.1A R + R + Hit(CCl4 0,8) n = 2
LEW.1A R + R + Hit(CCl4 0,8) + BMC(1WR2) n = 3
LEW.1A Hit(CCl4 1,0) n = 3
LEW Hit(CCl4 1,0) + BMC(LEW) n = 4
LEW.1A R + R + Hit(CCl4 1,0) n = 3
LEW R + R + Hit(CCl4 1,0) + BMC(LEW) n = 4
LEW.1A Hit(CCl4 1,2) n = 3
LEW.1A Hit(CCl4 1,2) + BMC(1WR2) n = 2
LEW.1A Hit(CCl4 1,5) n = 3
LEW.1A Hit(CCl4 1,5) + BMC(1WR2) n = 4
Tabelle 2-3 Zusammenfassung der Versuchsgruppen zur Erfassung des funktionellen Beitrags einer Knochenmarkzelltherapie zur Leberregeneration. Die Tiere wurden zum Teil mit Retrorsine vorbehandelt (R), erhielten steigende Dosen von CCl4 (Hit) wobei bei einigen Tieren anschließend eine Knochenmarkzelltherapie appliziert wurde (BMC).
Für die Auswertung wurden die Überlebenszeiten erfasst und eine immunhistologische Färbung des RT1Au-Moleküls zum Auffinden von Spenderzellen durchgeführt.
2.2.6.3 Allgemeines Zelltherapiemodell
Das Grundprinzip der folgenden Versuche beruhte auf der Kombination von:
1. Hepatozytenregenerationsblockade 2. Knochenmarktransplantation 3. Leberschädigung
4. Knochenmarkzelltherapie
Zunächst wurde die Regenerationsfähigkeit der Hepatozyten mit Retrorsine unterbunden. Ziel dieser Maßnahme war es, die normale Antwort der Leber auf
Schädigung zu unterdrücken, damit andere Regenerationsmechanismen einen Selektionsvorteil erhalten und deutlich beobachtbar zu Tage treten. Um Zellen aus dem Knochenmark sichtbar zu machen, wurde eine allogene Knochenmarktransplantation durchgeführt, welche als Nachweissystem diente, da die Spenderzellen mit bestimmten Antikörpern markiert werden konnten. Darauf folgte die Leberschädigung, die eine Proliferationsstimulierung der überlebenden Hepatozyten bewirkte und die Leberregenration auslöste. Dazu wurde entweder CCl4 benutzt, oder eine partielle Hepatektomie durchgeführt. Um die Auswirkungen einer Knochenmarkzelltherapie zu untersuchen, wurden dann Zellen aus Stämmen der Knochenmarkspender verabreicht.
Wegen des stabilen Knochenmarkchimärismus wurde die Zelltherapie einerseits vom Empfänger angenommen und andererseits unterschieden sich die Spenderzellen im Phänotyp und konnten mittels Immunhistochemie vom Empfänger unterschieden werden. In einigen Gruppen wurde keine Knochenmarkzelltherapie durchgeführt, um den alleinigen Beitrag des endogenen Knochenmarks zur Leberregeneration zu untersuchen.
2.2.6.4 CD45 dialleles Modell
In diesem Modell wurde die Rolle der aus dem Knochenmark stammenden Zellen während der Leberregeneration untersucht.
Spender waren LEW.7B (RT1lll, RT7b) Tiere, Empfänger LEW (RT1lll, RT7a) Ratten, die sich im RT7-Allel unterschieden (siehe Tabelle 2-2). Zellen des Knochenmarks der Spender waren in den Chimären mittels monoklonaler Antikörper gegen das RT7b- Molekül eindeutig nachweisbar (das RT7b-Molekül wird synonym als RT7.2-Molekül bezeichnet, es wurde der Klon HIS41 eingesetzt).
Die weiblichen LEW Versuchstiere erhielten 7 mg Retrorsine i.p. (Abkürzung: R) und nach vier Wochen eine Knochenmarktransplantation mit männlichen LEW.7B Zellen (Abkürzung: KMT(7B)). Nach einer Erholungszeit von vier Wochen wurde wieder 7 mg Retrorsine i.p. verabreicht mit einer folgenden Pause von weiteren vier Wochen. Die erste Versuchsgruppe wurde getötet und aufgearbeitet, bei den verbleibenden Gruppen wurde die Leber mit 1,0 ml CCl4/kg KG geschädigt (Abkürzung: Hit(CCl4 1,0)). Ein, drei, sieben und 14 Tage später wurde je eine Gruppe von mindestens drei Tieren aufgearbeitet. Der Versuch lässt sich folgendermaßen Abkürzen:
R + KMT(7B) + R + Hit(CCl4 1,0)
Um den Einfluss von Retrorsine zu ermitteln wurde der gleiche Versuch mit Versuchstiergruppen durchgeführt, die kein Retrorsine erhielten:
KMT(7B) + Hit(CCl4 1,0) 2.2.6.5 MHC-I dialleles Modell
In diesem Modell wurden verschiedene Schädigungsmodelle und die Auswirkung einer Gabe von Knochenmarkzellen über einen Zeitraum von 25 bzw. 50 Tagen bei der Leberregeneration untersucht.
A B
Abbildung 2-3 Kontrollfärbung des RT1Au-Moleküls. A: Einfachfärbung einer unbehandelten LEW.1WR2 Ratte, rötlich: anti-RT1Au mAk (Positivkontrolle), B: Einfachfärbung einer unbehandelten LEW.1A Ratte (Negativkontrolle).
Spender waren LEW.1WR2 (RT1uaa) Tiere, Empfänger LEW.1A (RT1aaa) Ratten, die sich im RT1A Genkomplex unterscheiden (siehe Tabelle 2-2). Zellen der Spendertiere waren in den Empfängern mittels monoklonaler Antikörper (anti-RT1Au mAk) gegen das RT1Au-Molekül eindeutig nachweisbar, weil auch Hepatozyten den RT1A- Genkomplex ausreichend exprimieren (siehe Abbildung 2-3). Da sich die Tiere nur im MHC-I Lokus unterschieden, war die immunologische Barriere bei der Knochenmarktransplantation erfahrungsgemäß gering.
A B C D
Abbildung 2-4 Tiermodell R+R+R+KMT(1WR2)+Hit(CCl4 0,6)+BMC(d3, i.v.).
A: Leberregenerationsblock einer LEW.1A (RT1aaa) Ratte durch 3 × 30 mg/kg KG Retrorsine i.p.
B: Bestrahlung mit 7 Gy und Knochenmarktransplantation von 100⋅106 LEW.1WR2 (RT1uaa) Zellen.
C: Leberschädigung durch 0,6 ml/kg KG CCl4 i.p.
D: LEW.1A/LEW.1WR2 Chimäre mit subakutem Leberversagen erhält eine LEW.1WR2 Knochenmarkzelltherapie.
Die weiblichen LEW.1A Versuchstiere erhielten dreimal im Abstand von je zwei Wochen 30 mg/kg KG Retrorsine. Weitere zwei Wochen darauf wurde eine Knochenmarktransplantation mit Zellen von LEW.1WR2 Tieren durchgeführt. Falls ein stabiler peripherer Chimärismus mittels FACS-Analyse festgestellt werden konnte, wurde die Leber mit 0,6 ml CCl4/kg KG geschädigt (siehe Abbildung 2-4). Tiere ohne stabilen Chimärismus wurden von den weiteren Versuchen ausgeschlossen. Am dritten Tag nach der Schädigung wurden als Zelltherapie mindestens 100⋅106 Knochenmarkzellen von LEW.1WR2 Ratten in eine Schwanzvene gespritzt (Abkürzung: BMC(d3, i.v.)). Die Tiere wurden nach 25 bzw. 50 Tagen aufgearbeitet, um den Langzeitverbleib der Knochenmarkzellen zu beobachten. Der Versuch lässt sich folgendermaßen abkürzen (siehe Abbildung 2-4):
R + R + R + KMT(1WR2) + Hit(CCl4 0,6) + BMC(d3, i.v.)
A B C D
Abbildung 2-5 Tiermodell R+R+R+KMT(1WR2)+Hit(PH)+BMC(d3. ipo).
A: Leberregenerationsblock einer LEW.1A (RT1aaa) Ratte durch 3 × 30 mg/kg KG Retrorsine i.p.
B: Bestrahlung mit 7 Gy und Knochenmarktransplantation von 100⋅106 LEW.1WR2 (RT1uaa) Zellen.
C: Leberschädigung durch partielle Hepatektomie
D: LEW.1A/LEW.1WR2 Chimäre mit subakutem Leberversagen erhält eine WR2 Knochenmarkzelltherapie.
In einem weiteren Versuch wurde die partielle Hepatektomie als Schädigungsmodell untersucht (Abkürzung: Hit(PH)), die Knochenmarkzellen wurden zwei Tage später nach medianer Laparotomie intraportal appliziert, um sie direkt an den Ort der Schädigung zu bringen (Abkürzung: BMC(d2, ipo)). Diese Tiere wurden nach 25 Tagen getötet und untersucht (siehe Abbildung 2-5):
R + R + R + KMT(1WR2) + Hit(PH) + BMC(d2, ipo) 2.2.6.6 NPC-Gewinnung
Bei einigen Versuchstieren im MHC Klasse I diallelen Modell wurde die Leber für eine FACS-Analyse in Einzelzellsuspension gebracht. Dazu ist eine modifizierte Methode nach Munthe-Kaas68 verwendet worden: Die Tiere wurden in eine sehr tiefe, tödliche Narkose gebracht. Nach Eröffnen des Abdomens durch Medianschnitt wurde eine 18 G Kanüle in die Vena porta eingeführt und die Leber für 10 min mit einem Enzymgemisch aus Pronase und Kollagenase H perfundiert. Durch die Pronase wurden die Hepatozyten angedaut, Kollagenase H löste die Zell-Zell-Verbindungen. Nach vorsichtiger Resektion wurde die Leber in einer Petrischale erneut mit Kollagenase H perfundiert und mit der Schere zerkleinert. Nach Sieben der Zellsuspension wurde diese zur Auflösung der Hepatozyten kurz mit Pronase inkubiert, so dass eine Einzelzellsuspension aller Leberzellen, außer den durch Pronase zerstörten Hepatozyten vorlag. Diese Zellfraktion ohne Leberzellen wird NPC-Fraktion (non parenchymal cells) genannt. Die Zellen wurden sofort gefärbt und mittels FACS-Analyse gemessen.
2.2.7 Blutentnahmen
Nach Durchführung einer flachen Äthernarkose wurde Blut mit Hilfe einer Glaskapillare aus dem retrobulbären Augenvenenplexus entnommen. Für die FACS- Analyse wurden 5 – 10 µl, in EDTA-Röhrchen, für die Quickwertbestimmung 1 ml in Citrat abgenommen. Nach Blutstillung durch Kompression mit einem feuchten Papiertuch wurden die FACS-Proben bei 4°C aufbewahrt, der Quickwert wurde in Kooperation mit dem Gerinnungslabor der MHH (Leitung Prof. Ganser) sofort bestimmt.
2.3 Labormethoden
2.3.1 HE-Färbung auf Kryoschnitten
Falls frische Kryoschnitte vorlagen, wurden diese einige Minuten getrocknet. Dann wurden die Schnitte 5 min in Aceton fixiert. Falls die Schnitte bei -20°C lagerten, wurde die Fixierung auch bei -20°C durchgeführt. Die Schnitte wurden in Träger gegeben und in Färbekammern 7 min in Hämalaun gefärbt. Nach Verbringen der Träger in eine Spülwanne folgte ein 15 min Waschvorgang unter fließenden Leitungswasser (sog. Bläuen). Die Spülwanne wurde dabei mehrmals gewechselt. Es folgte ein Färbeschritt in Eosin für 30 s. Nach einem kurzen Waschschritt in Leitungswasser wurden die Schnitte für 1 min in 70% Alkohol, für 2 min in 96% und 100% Alkohol entwässert. Die Fixierung erfolgte zweimal 1 min in Xylol. Nach dem Eindecken mit Kunstharz (Eukitt®) und Aufbringen eines Deckglases wurden die Schnitte zum Abdampfen unter einen Abzug gelegt und dann bei Zimmertemperatur gelagert.
Hämalaun wurde folgendermaßen hergestellt: Zunächst Lösen von 1 g Hämatoxilin in 1000 ml Aqua dest., anschließend Erwärmen und dann Zugabe von 0,2 g Natriumjodat (NaJO3) und 50 g chemisch reinem Kaliaun (Aluminiumkaliumsulfat). Nach Beimischen von 50 g Chloralhydrat und 1 g Zitronensäure schlägt der Farbton ins Violette um.
Eosin wurde durch Mischung von 0,5-1 % Eosinlösung mit einem Tropfen Essigsäure hergestellt.
2.3.1.1 Auswertung der Ergebnisse
Um auf die Zellgröße schließen zu können wurden bei HE-Färbungen die Hepatozytenkerne ausgezählt. Dabei wurden Gesichtsfelder bei 40-facher Vergrößerung (eng. high power field, kurz: HPF) unter dem Mikroskop mit einer Digitalkamera abfotografiert. Die Bilder wurden in Adobe Photoshop 7.0® geladen und beim Zählen jeder Kern mit einem grünen Punkt markiert, wodurch die Wahrscheinlichkeit des sich Verzählens verringert wurde. Alle Bilder wurden von einer Person ausgewertet.
Teilweise wurden HPFs doppelt ausgewertet, um den Zählfehler abzuschätzen (intra observer error), wobei die Abweichung bei höchstens 6 Zellen lag. Die Anzahl der
jeweils ausgewerteten HPFs findet sich bei der Beschreibung der einzelnen Versuche.
Die gewonnen Daten wurden mit Microsoft Excel 2002® analysiert und Grafiken mit SigmaPlot 2000® erstellt.
Zur Dokumentation wurden von Präparaten aller Versuch mit einer Digitalkamera Bilder aufgenommen, deren Kontrast und Helligkeit mit Hilfe von Adobe Photoshop 7.0® verbessert wurde.
2.3.2 Immunhistologie
Die Immunhistologie dient dem Nachweis von Antigenen auf Zellen, die im Gewebsverband als Schnitte vorliegen. Je nach benutztem Antikörper können damit spezifische Proteine und somit Merkmale von Zellen sichtbar gemacht werden. Im MHC Klasse I diallelem Modell können mit der Immunhistologie beispielsweise Spenderzellen identifiziert werden, indem ein anti-RT1Au mAk benutzt wird. Der Nachweis eines Antigens wird Einfachfärbung, der von gleichzeitig zwei Merkmalen Doppelfärbung genannt.
Die spezifische Anfärbung beruht auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion, wobei der zuerst aufgebrachte so genannte Primärantikörper an das Antigen bindet. Der Sekundärantikörper, der mit einem Enzym konjugiert ist, welches eine Färbereaktion katalysiert, bindet dann an den Primärantikörper. Der zum Schluss aufgebrachte Farbstoff wird von dem Enzym des Sekundärantikörpers so verändert, dass er sichtbar wird und so den Antigen-Antikörper-Komplex markiert.
Zur Herstellung von Kryoschnitten wurde das in flüssigem Stickstoff schockgefrorene histologische Material zunächst in einer Matrix (Tissuetek®) bei –20°C fixiert. Im Anschluss daran wurden in einem Kryostaten (Frigocut 2800 E) Schnitte in einer Schichtdicke von 5 µm hergestellt und mit Objektträgern aufgenommen. Die so angefertigten Präparate wurden für 2 bis 24h bei Raumtemperatur luftgetrocknet und dann langfristig in einem Gefrierraum bei -20°C aufbewahrt.
Der Nachweis von Spenderzellen (anti-RT1Au mAk), hämatopoetischen Zellen mit dem RT7b-Antigen (HIS41 mAk), Granulozyten (HIS48 mAk), T-Zellen (R73 mAk) und B- Zellen (OX-33 mAk) wurde auf 5 µm dicken Kryoschnitten ohne weitere Vorbehandlung der Gewebe durchgeführt (benutzte Konzentrationen siehe Tabelle 2-4).
Der anti-RT1Au mAk wurde vor Gebrauch mit FITC konjugiert (Flourescein protein labeling kit, Roche).
2.3.2.1 Einzelfärbung
Nach der Acetonfixierung wurden die Schnitte mit heterologem Serum der Spezies des Sekundärantikörpers absorbiert. Auf diese Weise wurden unspezifische Bindungsstellen abgesättigt und dadurch die Hintergrundfärbung verringert. Danach wurden die Schnitte mit dem Primärantikörper (z.B. anti-RT1Au-FITC mAk) inkubiert. Es handelte sich ausschließlich um monoklonale Antikörper (mAk), was eine spezifische Bindung an das zu untersuchende Antigen sicherstellte. Nach drei Waschschritten folgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper (z.B. anti-FITC-POX), der an den Primärantikörper band.
Der Sekundärantikörper war bei der Einzelfärbung immer mit Peroxidase (POX) konjugiert. Danach schlossen sich wieder drei Waschschritte an, welch notwendig waren, um eine möglichst spezifische Färbung zu erhalten. Die Substratentwicklung erfolgte mit 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC), das durch die Peroxidase des Sekundärantikörperes den Antigen-Antikörper-Komplex rötlich anfärbte. Vor dem Eindecken erfolgte noch eine Hämalaun-Gegenfärbung, um die Zellkerne besser kenntlich zu machen. Für das genaue Protokoll inklusive aller Inkubationszeiten siehe Abschnitt 6.3. Für die verwendeten Konzentrationen siehe Tabelle 2-4.
Absättigen Primärer Antikörper Sekundärer Antikörper POX-Substrat
je 100 µl
Thy1 (1:2)
GAM-POX (1:50) + NRS (1:50) NGS
(1:10)
OX-1 (1:1000)
GAM-POX (1:50) + NRS (1:50)
je 200 µl 20 min 15 min RT1Au-FITC
(1:1)
anti-FITC-POX (1:100) + NRS (1:50)
Tabelle 2-4 Konzentrationen (in Klammern) der verwendeten Antikörper bei der Einfachfärbung.
NGS = normales Ziegenserum, NRS = normales Rattenserum.
2.3.2.2 Doppelfärbung
Die Doppelfärbung, mit der zwei Eigenschaften einer Zelle gleichzeitig identifiziert werden können, wurde bis zur Inkubation mit dem Sekundärantikörper wie die Einfachfärbung durchgeführt, mit dem Unterschied, dass der Sekundärantikörper mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugiert war. Da der erste Primärantikörper meist aus der Maus stammte, handelte es sich beim ersten Sekundärantikörper fast ausschließlich
um alkalische Phosphatase konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG (GAM-AP). Um freie Valenzen des Primärantikörpers zu binden, folgte ein Absorptionsschritt mit Serum aus der Spezies des Primärantikörpers. Daraufhin wurde das Präparat mit dem zweiten Primärantikörper inkubiert. Um die beiden Primärantikörper voneinander unterscheidbar zu machen, wurde als erster Primärantikörper immer ein unkonjugierter benutzt und als zweiter immer ein mit FITC konjugierter. In den durchgeführten Doppelfärbungen wurde als zweites stets das spenderspezifische RT1Au-Antigen gefärbt, so dass als zweiter Primärantikörper immer anti-RT1Au-FITC eingesetzt wurde.
Nach dem obligatorischen Waschen folgte die Inkubation mit dem zweiten Sekundärantikörper, bei den durchgeführten Doppelfärbungen wurde folglich immer Peroxidase konjugiertes Ziege-anti-FITC-IgG (anti-FITC-POX) eingesetzt. Um nach dem folgenden Waschen die phosphathaltigen Bestandteile des Waschmediums zu entfernen, wurden diese mit 100 mM Tris/Hcl-Puffer, pH 8,5 ausgewaschen. So wurde eine unspezifische Färbung bei der sich anschließenden Substratentwicklung der alkalischen Phosphatase durch Fast Blue verhindert. Nach einem weiteren Waschschritt, der Substratentwicklung von Peroxidase durch AEC und einer optionalen Hämalaun Gegenfärbung endete die Doppelfärbung mit dem Eindecken der Präparate. Für die genaue Reihenfolge der Arbeitsschritte siehe Abschnitt 6.4. Für die verwendeten Konzentrationen siehe Tabelle 2-5.
Erster Primärantikörper
Erster
Sekundärantikörper Absättigen
Zweiter Primärantikörper
Zweiter Sekundärantikörper
Thy1 (unverdünnt)
GAM-AP (1:50) +
NRS (1:50)
NMS (1:10) + NRS (1:10)
RT1Au-FITC (unverdünnt)
anti-FITC-POX (1:100) + NRS (1:50) OX-1
(1:500)
GAM-AP (1:50) +
NRS (1:50)
NMS (1:10) + NRS (1:10)
RT1Au-FITC (unverdünnt)
anti-FITC-POX (1:100) + NRS (1:50)
Tabelle 2-5 Konzentrationen (in Klammern) der verwendeten Antikörper bei der Doppelfärbung.
NRS = normales Rattenserum. NMS = normales Mausserum.
2.3.2.3 Lichtmikroskopische Auswertung
Zur Bewertung der Migration von hämatopoetischen Zellen in die Leber (siehe Abschnitt 3.2.3) wurden die immunhistologischen Färbungen von zwei geschulten,
unabhängigen Beobachtern simultan an einem Doppelmikroskop ausgezählt. Pro Schnitt wurden zwischen drei und sechs HPFs (high power fields) ausgezählt. Pro Tier wurden drei Schnitte ausgewertet. Die gewonnen Daten wurden mit Microsoft Excel 2002 analysiert und Grafiken mit SigmaPlot 2000 erstellt.
Zur Dokumentation wurden von Präparaten aller Versuch mit einer Digitalkamera Bilder aufgenommen, deren Kontrast und Helligkeit mit Hilfe von Adobe Photoshop 7.0 verbessert wurde.
2.3.3 FACS-Färbung
Die Durchflusszytometrie (FACS) ist eine Immunfärbemethode zur Detektion von Zelloberflächenmolekülen mittels monoklonaler Antikörper. Die Antikörper sind mit Fluoreszenzfarbstoffen wie beispielsweise Phycoerythrin (PE) oder Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) konjugiert, welche bei Anregung durch einen Laser Licht definierter Wellenlänge emittieren. Bei der FACS-Messung wird jede Zelle einer Einzelzellsuspension von einem Laserstrahl beschossen. Das Licht wird durch die Zellen teils absorbiert und teils gestreut, die Fluoreszenzfarbstoffe der Antikörper werden durch den Laser zum Leuchten angeregt. Fotodetektoren messen einerseits das gestreute Licht, wodurch die Größe und Granularität der Zellen ermittelt werden kann.
Andererseits wird auch das von den Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht gemessen, wodurch qualitative sowie semiquantitative Aussagen über die durch die Antikörper markierten Oberflächenmoleküle der Zelle gemacht werden können.
Die Zellgröße korreliert mit der Streuung parallel zum Laserstrahl, welche durch den so genannten „forward scatter“ (FSC) gemessen wird, die Granularität korreliert mit der Streuung rechtwinklig zum Laserstrahl, die mit dem so genannten „side scatter“ (SSC) erfasst wird. Das durch FITC und PE emittierte Licht wird mit der ersten (FL1) bzw.
zweiten Fluoreszenz (FL2) des Durchflusszytometers gemessen. Die Messung wird üblicherweise durch eine Punktewolke (sog. Dotplot) dargestellt. Dabei werden je zwei Eigenschaften gegeneinander aufgetragen (z.B. Granularität - SSC gegen Größe - FSC) und verglichen. Bei der Fluoreszenzmessung kann die Zahl der bindenden Antikörper pro Zelle anhand der gemessenen Leuchtstärke semiquantitativ abgeschätzt werden. Für ein Beispiel der Darstellung einer FACS-Messung siehe Abbildung 2-6.
2.3.3.1 FACS-Doppelfärbung
In der vorliegenden Arbeit wurde sie vorwiegend zur Bestimmung des Chimärismusgrads im peripheren Blut (PBL) genutzt und wie von Dahlke und Lauth15 beschrieben durchgeführt. Spenderzellen wurden im CD45 diallelen Modell durch FITC konjugierten HIS41 mAk (gegen RT7b), im MHC Klasse I diallelen durch FITC konjugierten anti-RT1Au mAk gefärbt. Empfängerzellen wurden im ersten Modell mit Biotin konjugiertem 12F11C mAk (gegen RT7a), und im Zweiten mit Biotin konjugiertem anti-RT1Aa mAk bestimmt. Granulozyten, T-Zellen und B-Zellen wurden durch HIS48 mAk, R73 mAk, bzw. OX-22, angefärbt. Diese Antikörper stammten alle aus der Maus, so dass Phycoerythrin konjugierter Ziege-anti-Maus mAk (GAM-PE) als Sekundärantikörper benutzt wurde (für die genauen Konzentrationen siehe Tabelle 2-1).
Klon gebundenes Epitop/Zelle Konzentration
5C10A RT1Au unverdünnt
C3 RT1Aa unverdünnt
12F11C RT7.1 unverdünnt
HIS41 RT7.2 1:800
OX-22 CD45 RC (B-Zellen) 1:400
R73 αβ T-Zellrezeptor 1:5
HIS48 Granulozyten 1:20
GAM-PE Fc-Rezeptor der Maus 1:50
Tabelle 2-6 Konzentrationen der verwendeten Antikörper für die FACS-Messung.
Durch die Benutzung der verschiedenen Antikörper konnte der Chimärismusgrad getrennt für die einzelnen Subpopulationen bestimmt werden.
Die FACS-Färbung begann mit der Lyse der Erythrozyten durch NH4, gefolgt von zwei Waschschritten. Der nun aufgebrachte erste Primärantikörper war entweder unkonjugiert oder mit Biotin konjugiert und stammte aus der Maus. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen mit dem Sekundärantikörper inkubiert, bei dem es sich stets um GAM-PE beziehungsweise SA-PE handelte. Nach weiterem Waschen wurden freie Valenzen des Sekundärantikörpers mit normalen Mausserum (NMS) abgesättigt, woraufhin nach obligatorischem Waschen der zweite, direkt mit FITC markierte Primärantikörper aufgebracht wurde. Nach zwei weiteren Waschschritten folgte die
Messung am Durchflusszytometer (FACScan, Becton Dickinson). Für das genaue Protokoll siehe Abschnitt 6.5.
2.3.3.2 Auswertung der Ergebnisse
Die auf einem Computer gespeicherten FACS-Daten wurden mit WinMDI 2.8 ausgewertet, wobei zunächst die Zellgröße und Granularität in einem Streudiagramm dargestellt wurde. Tote Zellen wurden dabei nicht berücksichtigt und durch ein so genanntes „open wide gate“ ausgeschlossen. Anschließend wurden die beiden Fluoreszenzen gegeneinander dargestellt. Für einzelne Subpopulationen wurden separate Gates definiert. Das Programm ermöglichte auch die Berechnung des prozentualen Anteils der Subpopulationen an der Gesamtzellzahl.
Zur Bestimmung des Chimärismusgrads bei LEW.1A/LEW.1WR2-Tieren beispielsweise wurde eine Doppelfärbung mit RT1Aa-bio als ersten Primärantikörper und SA-PE (leuchtet auf Fluoreszenz 2) als Sekundärantikörper, sowie RT1Au-FITC (leuchtet auf Fluoreszenz 1) als zweiten Primärantikörper durchgeführt (siehe Abbildung 2-6). Nach dem Ausschließen der toten Zellen durch Setzen eines Gates (R1, siehe Abbildung 2-6 A) in der Darstellung SSC (Zellgranularität, X-Achse) gegen FSC (Zellgröße, Y-Achse) folgte die Darstellung RT1Au (leuchtet durch FITC auf Fluoreszenz 1, X-Achse) gegen RT1Aa (leuchtet durch PE auf Fluoreszenz 2, Y-Achse).
Es wurden die Zellzahlen der RT1Au-positiven, sowie der RT1Aa-positiven Zellen bestimmt (R2, R3, siehe Abbildung 2-6 B), die RT1Au-positiven Zellen reagieren mit dem anti-RT1Aa mAk kreuz und färben deswegen teilweise auch in Fluoreszenz 2 positiv. Aus diesem Grund reicht R2 in Abbildung 2-6 B so weit in Richtung Y-Achse (Fluoreszenz 2) hinein. Wegen des Ausschlusses der toten Zellen wurde R1 gleich 100% gesetzt und diente als Grundlage für die Chimärismusberechnung. Der Prozentsatz der RT1Au-positiven Zellen (hier 7366 von 9247 entspricht 80%) wurde berechnet und als Chimärismusgrad definiert. Der Prozentsatz der RT1Aa-positiven Zellen (hier 1759 von 9247 entspricht 19%) diente der Fehlerabschätzung.
