Zur Bedeutung von somatischen Mutationen und Keimbahnmutationen des HMGA2 Gens bei Tumorerkrankungen

(1)

somatischen Mutationen und

Keimbahnmutationen des HMGA2 Gens bei

Tumorerkrankungen

DISSERTATION

ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES

DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN

-DR. RER. NAT.-

DEM

PROMOTIONSAUSSCHUß DR. RER. NAT.

IM

FACHBEREICH BIOLOGIE / CHEMIE DER UNIVERSITÄT BREMEN

VORGELEGT VON

INGA VON AHSEN

BREMEN, DEZEMBER 2005

1. GUTACHTER: PROF. DR. J. BULLERDIEK 2. GUTACHTER: PROF. DR. H. WENK

(2)

I

INHALTSVERZEICHNIS

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS………...III

1 EINLEITUNG………. 1

2 MATERIAL UND METHODEN………...6

2.1 ZELLMATERIAL……….…6

2.1.1 GENOMISCHE KLONE………...6

2.1.2 PRIMÄRES ZELLMATERIAL………..………...6

2.1.3 ZELLLINIEN………..………..10

2.2 ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN………..……….10

2.2.1 PAC-, COSMID- UND PLASMID-DNA ISOLIERUNG………..………10

2.2.2 DNA-ISOLIERUNG………....11 2.2.3 RNA-ISOLIERUNG………...………...…11 2.3 cDNA-ERST-STRANG-SYNTHESE………...………...11 2.4 PCR………...………12 2.5 RT-PCR………...………12 2.6 3’RACE-PCR………...………12 2.7 GELELEKTROPHORESE………...………13

2.8 HERSTELLUNG VON DNA-SONDEN...………....………...13

2.9 SOUTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG………...…13

2.10 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA………...………14

2.11 HERSTELLUNG VON KLONIERUNGSVEKTOREN…...………15

2.12 LIGATIONEN………...………....…………15

2.13 TRANSFORMATIONEN………...………15

2.13.1 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN…...15

2.13.2 TRANSFORMATION VON E. coli...………...………16

2.14 ZELLKULTUREN………...………16

2.14.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN………...………16

2.14.2 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN………...………16

2.14.3 AUFTAUEN EINGEFRORENER ZELLEN………...16

2.15 ZYTOGENETISCHE PRÄPARATION………...17

2.15.1 CHROMOSOMENPRÄPARATION………...………17

2.15.2 G-BANDING ALS VORBEREITUNG ZUR FISH………...17

2.16 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (FISH)………...17

(3)

II

2.16.2 FLUORESZENZ IN-SITU-HYBRIDISIERUNG……….……...……...18

2.17 SEQUENZIERUNGEN...18

2.18 IN SILICO-ANLYSEN………...………18

3 ERGEBNISSE...19

3.1 IN CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER CHROMOSOMALEN ABERRATION IN DER REGION 12q13-15 UND 13q12-14 KONNTE KEIN HMGA2-LHFP FUSIONSGEN DETEKTIERT WERDEN...……….19

3.2 IN ALLEN UNTERSUCHTEN CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER t(3;12)(q27-28;q14-15) WIRD EIN IDENTISCHES HMGIC-LPP TRANSKRIPT EXPREMIERT..………...………20

3.3 EXPRESSIONSMUSTER VOM HMGA2-LPP FUSIONSTRANSKRIPT IN CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER t(3;12)(q27-28;q14-15).……...21

3.4 EIN TEIL DES HMGA2-LOKUS IST IN EINEM LIPOM MIT DER t(3;12)(q27-28;q14-15) VON EINER DELETION BETROFFEN………....…...22

3.5 EIN NEUES LPP-FUSIONSGEN WEIST AUF DIE ENTSCHEIDENDE ROLLE VON TRUNKIERTEN LPP PROTEINEN IN LIPOMEN UND CHONDROIDEN LUNGENHAMARTOMEN HIN……...………..………...22

3.6 IN NUR EINEM VON 61 CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINEM NORMALEN KARYOTYP WIRD DAS HMGA2-LPP FUSIONSTRANSKRIPT EXPREMIERT………...…………23

3.7 FÜR DIE MEHRHEIT DER LEIOMYOME DES UTERUS SIND KEINE KEIMBAHNMUTATIONEN DES HMGA2-GENS VERANTWORTLICH………...24

4 DISKUSSION……….……….………….………….……26 5 ZUSAMMENFASSUNG………...34 6 SUMMARY………....36 7 LITERATUR………...38 DANKSAGUNG………...51 PUBLIKATIONSÜBERSICHT….………...52

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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

µg, µl, µm Mikrogramm, -liter, -meter AS Aminosäure bp Basenpaare C Celsius

cDNA komplementäre DNA

C-terminal Carboxyterminal dATP Desoxy-Adenosin-5’-Triphosphate dCTP Desoxy-Cytosin-5’-Triphosphate dGTP Desoxy-Guanosin-5’-Triphosphate DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxy-Nukleosid-5’-Triphosphate DTT Dithiotreithol dTTP Desoxy-Thymidin-5’-Triphosphate dUTP Desoxy-Uracil-5’-Triphosphate EDTA Ethylendiamintetraacetat ERG Eppendorf-Reaktionsgefäß EtOH Ethanol FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung FCS Fötales Kälberserum g Gravitationsbeschleunigung

GAPDH Glyceraldehyde-3-Phosphat Dehydrogenase GTG G Bänderung mit Trypsin und Giemsa

h Stunde HMG High Mobility Group

HMGA1 HMGA1-Gen (ehemals HMGIY)

HMGA1 Protein des HMGA1-Gen (HMGA1a und HMGA1b) HMGA2 HMGA2-Gen (ehemals HMGIC)

HMGA2 Protein des HMGA2-Gen kb Kilo-Basenpaare M Molar

Mb Mega-Basenpaare mg, ml, mM Milligramm, -liter, -molar

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min Minute

mRNA messenger Ribonukleinsäure ng, nm, nM Nanogramm, -meter, -molar

ORF Offenes Leseraster

OT Objektträger

PAC P1 abgeleitetes, artifizielles Chromosom

PCH chondroides Lungenhamartom

PCR Polymerase-Kettenreaktion RACE Rapid Amplification of cDNA Ends RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse-Transkription-PCR sec Sekunde

UTR Untranslatierte Region UV ultraviolett

v Volumen w Gewicht

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1 EINLEITUNG

Viele Erkrankungen beruhen auf Mutationen, die die funktionellen Interaktionen der Transkriptionsregulation und vorangehende oder nachfolgende Signalwege

beeinflussen. Eine Gruppe von Transkriptionsregulatoren sind die High Mobility Group (HMG) Proteine, die in den 70er Jahren von Goodwin und seinen Mitarbeitern (Goodwin et al.,1973) entdeckt wurden und in den letzten Jahren mehr und mehr durch die Entdeckung ihrer kausalen Rolle bei einer Vielzahl von Erkrankungen an Bedeutung gewonnen haben.

Die Mitglieder der Familie der HMG-Proteine kodieren für nukleare Nicht-Histon-Proteine, welche mit geringer Spezifität DNA binden, die als so genannte

architektonische Transkriptionsfaktoren die Chromatin-Struktur verändern und abhängige Prozesse wie Transkription, Replikation, Rekombination und

DNA-Reparatur beeinflussen. (Bustin und Reeves, 1996; Bustin 1999). Funktionell lassen sich die HMG-Proteine durch ihre DNA-bindenden Domänen in drei Subfamilien, die HMG Nukleosom bindenden Proteine (HMGN), die HMG Box bindenden Proteine (HMGB) und die HMG AT-Hook bindenden Proteine (HMGA), unterteilen.

Die HMGN-Familie besteht aus Proteinen, die an die Innenseite nukleosomaler DNA binden und damit die Interaktion zwischen DNA und dem Histon Oktamer

beeinflussen (Shick et al., 1985; Bustin und Reeves, 1996). Durch Interaktionen der C-terminalen Domäne der HMGN-Proteine mit den Histonen H1 und H3 können sie die Chromatinstruktur modifizieren, um dadurch die Transkription zu erleichtern, ohne dabei selbst ein Bestandteil des Transkriptionskomplexes zu sein (Trieschmann et al., 1995; Bustin, 1999).

Zur Familie der HMGB-Proteine gehören die drei Mitglieder HMGB1, HMGB2 und HMGB3. Die HMGB-Proteine bestehen aus zwei homologen DNA-bindenden Domänen (A- und B-Box) und einer sauren C-terminalen Domäne (Reeck et al. 1982). Mit Hilfe dieser HMG-Boxen erfolgt das strukturspezifische Binden der DNA. HMGA Proteine sind architektonische Transkriptionsfaktoren (Thanos und Maniatis, 1992), die auf die Organisation des Chromatins bzw. der Chromosomen einwirken. Die HMGA-Subfamilie setzt sich aus sechs Mitgliedern zusammen: Aus dem auf Chromosom 6p21.3 lokalisiertem HMGA1 Gen mit seinen sich unterscheidenden

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Splicevarianten HMGA1a, HMGA1b und HMGA1c (Friedmann et al., 1993) und dem in der chromosomalen Region 12q14-15 gelegenen HMGA2-Gen (Schoenmakers et al., 1995) mit seinen Splicevarianten HMGA2a und HMGA2b (Chau et al., 1995; Hauke et al., 2002). Die HMGA-Proteine bestehen aus drei stark konservierten DNA-bindenden Domänen, den sogenannten AT-Hooks, mit denen sie mit hoher Affinität an die kleine Furche AT-reicher B-Form DNA binden (Solomon et al., 1986; Elton et al.,1987; Reeves und Nissen, 1990) und einer sauren C-terminalen Domäne. Die HMGA-Proteine erkennen mehr die DNA-Struktur als die Nukleotid-Sequenz (Reeves und Nissen, 1990; Reeves und Wolffe, 1996), wodurch sie bevorzugt an irreguläre Strukturen wie for-way-junction DNA (Hill und Reeves, 1997), supercoiled-DNA (Nissen und Reeves, 1995) und an nukleosomale Kern-Partikel (Reeves und Nissen, 1993) binden und dadurch die DNA biegen, strecken, entwickeln und supercoils in sie einfügen (Bustin und Reeves, 1996).

Die HMGA-Proteine können allein keine Transkription auslösen, sondern

ermöglichen durch eine Konfirmationsänderung der DNA definierte Protein-DNA und Protein-Protein-Wechselwirkungen (Wolffe, 1994). Die Bildung von Enhanceosomen in der Promotorregion von regulierten Zielgenen, werden durch HMGA-Proteine unterstützt, indem sie zwischen den beteiligten Transkriptionsfaktoren kooperative Bindungen vermitteln. Dadurch nehmen sie regulatorisch auf die Expression vieler Gene Einfluss, wodurch es zur Aktivierung oder Inhibierung der Genexpression kommen kann (Thanos und Maniatis, 1995; John et al., 1995). Bisher konnte gezeigt werden, dass mindestens 18 verschiedene Transkriptionsfaktoren reguliert und dadurch mehr als 40 verschiedene virale und eukaryotische Gene in ihrer Expression durch HMGA-Proteine kontrolliert werden (Reeves und Beckerbauer, 2001).

HMGA-Proteine sind hauptsächlich in proliferierenden, undifferenzierten Zellen aktiv. Dementsprechend ist eine starke Expression dieser Gene während der

Embryogenese zu finden. Im adulten, differenzierten Gewebe ist HMGA2 gar nicht und HMGA1 nur noch in sehr geringen Konzentrationen detektierbar. Lediglich in der Retina ist HMGA1 stark exprimiert (Bussemarkers et al., 1991; Chiapetta et al., 1996; Rogalla et al., 1996; Zhou et al., 1996; Chau et al., 2000).

Expressionsuntersuchungen von HMGA-Proteinen in verschiedenen embryonalen Entwicklungsstadien der Maus zeigten, dass HMGA1 und HMGA2 in allen Geweben in früher Phase exprimiert wurden. In der zweiten Hälfte der Embryonalentwicklung

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zeigte sich eine eingeschränkte Expression von HMGA2 im mesenchymalen

Gewebe, das sich zu Knorpel und Muskel differenziert sowie in einigen epithelialen Zellschichten und Teilen des zentralen Nervensystems (Hirning-Folz et al., 1998). HMGA1 hingegen wurde in allen, aber nur in einigen Geweben stark exprimiert (Chiappetta et al., 1996).

Neben dem bedeutenden Einfluss der HMGA-Proteine in der Tumorgenese durch eine Reaktivierung ihrer Expression, spielen die HMGA-Proteine eine weitere Rolle in der Proliferation von Fettgewebe, sowie nach Verletzungen von Blutgefäßen in

glatten Muskelzellen (Chau et al., 1995; Chin et al., 1999; Foster et al., 1998; Anand und Chada, 2000; Melillo et al., 2001) und sind in apoptotische Prozesse involviert (Diana et al., 2001; Sgarra et al., 2003).

In vielen verschiedenen malignen Tumoren wie die der Schilddrüse (Chiapetta et al. 1995), des Colons (Fedele et al. 1996; Abe et al., 1999), der Brust (Ram et al., 1993; Rogalla et al., 1997), der Lunge (Rogalla et al., 1998a), der Bauchspeicheldrüse (Abe et al., 2000; Abe et al., 2003), der Prostata (Bussemakers et al., 1991; Tamimi et al., 1993), der Cervix (Bandiera et al., 1998), sowie bei Lymphomen, Leukämien und Liposarkomen (Wood et al., 2000; Rommel et al. 1997; Berner et al., 1997) wurde eine Überexpression der HMGA-Proteine gefunden, so dass die HMGA1 Expression als Indikator für neoplastische Transformation (Goodwin et al. 1985; Giancotti et al., 1987, 1989; Chiapetta et al., 1998) und für die Progression maligner Tumoren diskutiert wird (Bussemakers et al., 1991; Tamimi et al., 1993; Chiapetta et al., 1995).

Die Expression des HMGA2-Gens soll hingegen in Brust- und Lungenkarzinomen mit dem Tumorgrading korrelieren.

Benigne mesenchymale Tumoren stellen die größte Gruppe gutartiger Neoplasien des Menschen dar. Zu den häufigsten chromosomalen Veränderungen bei diesen Tumoren gehören Aberrationen des Chromosoms 12, insbesondere in dem Bereich 12q14-15. Schoenmakers et al. (1995) konnten mit Hilfe der Bruchpunktklonierung herausfinden, dass in der betroffenen Region das HMGA2-Gen lokalisiert ist und das Zielgen der chromosomalen Aberration darstellt.

Die häufigsten von dieser Aberration betroffenen mesenchymalen Tumoren beim Menschen sind die Lipome (Heim et al., 1986; Turc-Carel et al., 1986; Mandahl et al., 1987; Sreekantaiah et al., 1991; Belge et al., 1992). Sie bestehen aus subkutanen

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und intramuskulären Fettgewebe. Die Leiomyome des Uterus (Heim et al., 1988; Turc-Carel et al., 1988; Vanni und Lecca, 1988), mesenchymale Muskeltumoren, gehören mit einer Inzidenz von etwa 30% bei Frauen über 30 Jahren zu den häufigsten Tumoren der Frau überhaupt (Norris und Zaloudek, 1982).

Weitere Tumoren mit Veränderungen der Region 12q14-15 sind chondroide Hamartome der Lunge (Fletcher et al., 1991; Dal Cin et al., 1993), die neben Knorpel-, Muskel-, Fett- und undifferenzierten mesenchymalen Zellen auch Epithel des respiratorischen Traktes umfassen, chondromatöse Tumoren (Bridge et al., 1992; Mandahl et al., 1989), pleomorphe Adenome der Kopfspeicheldrüsen (Mark et al., 1980; Mark und Dahlenfors, 1986; Bullerdiek et al., 1987), benigne Tumoren der Brust (Birdsal et al., 1992; Rohen et al., 1995; Staats et al.,1996),

Endometriumpolypen (Walter et al., 1989; Vanni et al., 1993; Dal Cin et al., 1995), Hämangiopericytome (Mandahl et al., 1993), diffuse Astrocytome (Jenkins et al., 1989), aggressive Angiomyxome (Kazmierczak et al., 1995), und Osteoclastome (Noguera et al., 1989).

Auf molekulargenetischer Ebene besteht das HMGA2-Gen strukturell aus 5 Exons und 4 Introns und überspannt eine genomische Distanz von ca. 142 kb (Chau et al. 1995; Schoenmakers et al., 1995; Ashar et al., 1996). Die ersten drei Exons, die jeweils einen AT-Hook kodieren, werden durch ein ca. 112 kb langes Intron 3 vom Exon 4 und Exon 5, die die carboxyterminale Protein-bindende Domäne kodieren, getrennt (Chau et al., 1995; Hauke et al., 2002). Der häufigste Bruchpunkt

chromosomaler Aberrationen in menschlichen Tumoren befindet sich im Intron 3 des HMGA2-Gens (Kazmierczak et al., 1996a). Durch dieses Bruchereignis ersetzen ektopische Sequenzen die carboxyterminale Protein-bindende Domäne (Gattas et al. 1999; Rogalla et al., 1997), als auch die AT-Hooks des HMGA2-Gens (Petit et al., 1996; Schoenmakers et al.,1999). Derartige chromosomale Bruchereignisse konnten bisher in Lipomen (Schoenmakers et al., 1995; Ashar et al., 1995; Petit et al.,1996), chondroiden Hamartomen der Lunge (Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et al., 1995, 1996a), Uterus Leiomyomen (Schoenmakers et al.,1995),

Endometriumpolypen (Schoenmakers et al., 1995; Bol et al., 1996), pleomorphen Adenomen der Kopfspeicheldrüse (Schoenmakers et al., 1995), sowie für

Fribroadenome (Schoenmakers et al., 1995) und Angiomyxome (Schoenmakers et al., 1995) gefunden werden. Zum einen kommt es in den verschiedenen

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Splicen mit Sequenzen aus dem Intron 3 oder Intron 4 von HMGA2 sind (Hauke et al., 2001, 2002). Zum anderen findet eine Überexpression von nativem HMGA2 oder chimärem HMGA2 statt.

Bei den chimären Formen von HMGA2 stellt die reziproke Fusion zwischen dem HMGA2- und dem LPP-Gen (lipoma preferred partner) das am häufigsten zu beobachtende Fusionsprodukt dar, welches bisher sowohl in Lipomen als auch in Lungenhamartomen mit einer t(3;12)(q27;q14-15) gefunden wurde (Petit et al., 1996; Rogalla et al., 1998b). Weitere Fusionspartner für das HMGA2 sind beispielsweise LHFP (lipoma HMGIC fusion partner) (Petit et al., 1999), RAD51L1 (Schoenmakers et al., 1999), ALDH2 (mitochondriale Aldehyd-Dehydrogenase 2 ) (Kazmierczak et al., 1995) und FHIT (fragile histidine triad) (Geurts et al., 1997).

Eine spezifische Expression von Fusionstranskripten in einzelnen Tumorentitäten konnte bisher nicht nachgewiesen werden. So wird das

HMGA2/LPP-Fusionstranskript sowohl in Lipomen (Schoenmakers et al., 1995; Petit et al., 1996) als auch in chondroiden Lungenhamartomen exprimiert (Rogalla et al., 1998b). Vergleichende Untersuchungen von einer 3’ trunkierten HMGA2-Variante, einem HMGA2/LPP-Fusionstranskript und dem nativen HMGA2 zeigten, das der Verlust der carboxyterminalen Domäne und nicht die Fusion mit neuen funktionellen Domänen für eine neoplastische Zelltransformation verantwortlich ist (Fedele et al., 1998). Transgene Mäuse mit einer hohen Expression einer 3’ trunkierten HMGA2-Variante, wiesen einen „giant“ Phänotyp mit Fettleibigkeit und einem hohen Vorkommen an Lipomen auf (Battista et al., 1999; Arlotta et al., 2000). Knock-out-Mäuse, mit einer homozygoten Deletion des HMGA2-Gens, weisen hingegen Zwergwuchs und eine starke Reduktion ihres Körperfettgehaltes auf (Zhou et al., 1995; Anand und Chada, 2000).

Ziel dieser Arbeit war es die Relevanz und Rolle des HMGA2-Gens bei somatischen Mutationen der zytogenetischen Subgruppe benigner mesenchymaler Tumoren mit einer Veränderung in der Region 12q14-15, insbesondere bei Lipomen und

chondroiden Hamartomen der Lunge zu analysieren und die Relevanz und Rolle des HMGA2-Gens bei Keimbahnmutationen mit einer sich daraus resultierenden

möglichen individuellen genetischen Variabilität assoziiert mit einer Prädisposition in der Tumorgenese zu detektieren.

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2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 ZELLMATERIAL

2.1.1 GENOMISCHE KLONE

Die PAC-Klone 12/1, 12/2 und 20422 wurden mit Hilfe spezifischer Primerpaare für das HMGA2-Gen mittels PCR in einer humanen genomischen PAC-Libary (Genome Systems, St. Louis, USA) identifiziert (Dr. V. Rippe, Universität Bremen; Hauke et al. 2002).

Zwei PAC-Klone wurden mittels PCR mit Hilfe spezifischer Primerpaare für das Exon 6 des LPP-Gens und das Intron 10/Exon 11 des LPP-Gens in einer humanen

genomischen PAC-Libary (Genome Systems, St. Louis, USA) gescreent (Rogalla et al. 1998b).

Die Cosmide 202A1, 27E12 und 142/H1 sind der Region multipler Aberrationen auf Chromosom 12q13-15 zugeordnet und stammen aus der LL12NC01-Cosmidbank des humanen Chromosoms 12 (Schoenmakers et al. 1995).

2.1.2 PRIMÄRES ZELLMATERIAL

Tabelle 1: Für molekulargenetische Untersuchungen verwendete primäre chondroide Lungenhamartome (F: weiblich, M: männlich).

Chondroide Lungen- hamartome Alter/ Geschlecht Karyotyp Publikation 6 18/F 46,XX[12] Kazmierczak et al. (1996b)

12 58/M 46,XY[10] Kazmierczak et al. (1996b)

14 53/F 46,XX[9] Kazmierczak et al. (1996b)

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Chondroide Lungen- hamartome Alter/ Geschlecht Karyotyp Publikation

40 40/M 46,XY,t(3;12)(q27;q15),der(10)add(10)(p15) t(10;21)(q21;q21),der(21)t(10;21)(q21;q21)[20]

Kazmierczak et al. (1999a)

49 74/M 46,XY[12] Kazmierczak et al. (1999a)

53 48/F 46,XX[14] Kazmierczak et al. (1999a)

69 55/F 46,XX,t(3;12)(q28;q15)[16] / 46,idem,del(1)(q2?), der(3)add(3)(p21)dup(3)(q23q29)[2]

Rogalla et al. (1998b)

79 39/F 46,XX,del(6)(p21.1),der(12)t(12;13)(p12 or p13;q12) t(12;17)(q15;p13),der(13)t(12;13)(q15;q12),

der(17)t(6;17)(p21.1;p13)[18]

Kazmierczak et al. (1999a)

85 52/F 46,XX,t(3;12)(q28;q15)[12] / 47,idem,+mar[2] Rogalla et al. (1998b)

115 25/F 46,XX,t(3;12)(q27;q15)[14] Rogalla et al. (1998b)

129 60/M 46,XY,t(3;12)(q27;q15)[10] Rogalla et al. (1998b)

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Chondroide Lungen- hamartome Alter/ Geschlecht Karyotyp Publikation

147 49/M 46,XY,del(6)(q24),t(12;13)(q15;q13)[22] Kazmierczak et al. (1999a)

153 48/F 46,XX,t(3;12)(q27 or q28;q15)[12] Rogalla et al. (1998b)

181 53/F 45,XX,-12,der(13)t(12;13)(q13;q12),

del(14)(q22q24),der(18)t(12;18)(p11.2;p11.1)[9] Kazmierczak et al. (1999a)

184 56/F 46,XX,t(3;12)(q27;q15)[15] Kazmierczak et al. (1998)

228 69/F 46,XX,der(13),t(13;14)(q14;q24),der(14), t(12;14)(q15;q24)[19]

Kazmierczak et al. (1999b)

269 64/F 46,XX,t(3;12)(q27;q14 or q15)[12]/ 46,XX,idem,der(15;18)(p10;p10)[3]

Kazmierczak et al. (1999b)

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Chondroide Lungen- hamartome Alter/ Geschlecht Karyotyp Publikation 276 67/F 46,XX[19] Kazmierczak et al. (1999b) 283 51/F 46,XX,t(3;12)(q27;q15)[16] Kazmierczak et al. (1999b) 296 64/F 46,XX[18] Kazmierczak et al. (1999b) 300 60/F 46,XX,t(3;12)(q27;q14 or q15)[20] Kazmierczak et al. (1999b) 309 23/F 46,XX[16] Kazmierczak et al. (1999b) 318 83/F 46,XX[15] Kazmierczak et al. (1999b)

321 61/M 46,XY[16] Lemke et al. (2002)

322 65/F 46,XX[18] Lemke et al. (2002) 323 39/M 46,XY[28] Lemke et al. (2002)

324 58/M 46,XY[20] Lemke et al. (2002)

329 70/M 46,XY[26] Lemke et al. (2002)

330 58/F 46,XX[13] Lemke et al. (2002)

333 57/F 46,XX[16] Lemke et al. (2002)

340 64/M 46,XY[21] Lemke et al. (2002)

343 65/F 46,XX[18] Lemke et al. (2002)

345 52/M 46,XY[16] Lemke et al. (2002)

350 66/M 46,XY[14] Lemke et al. (2002)

360 34/F 46,XX[17] Lemke et al. (2002)

361 60/F 46,XX[23] Lemke et al. (2002)

379 61/F 46,XX[29] Lemke et al. (2002)

Darüber hinaus wurde primäres normales Fetalgewebe, Embryonalgewebe, Testis, Gewebe der Haut, Glandula Parotis, Schilddrüse, Pleura, Lunge, Mamma,

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2.1.3 Zelllinien

Die folgenden Zelllinien wurden vom Zentrum für Humangenetik der Universität Bremen bereitgestellt und für Untersuchungen verwendet.

EFM19 immortale Mammakarzinom-Zelllinie HeLa immortale Zervixkarzinom-Zelllinie L1236 immortale Leukämie-Zelllinie

Li-14 SV40 transfizierte immortale Lipom-Zelllinie Li-167 SV40 transfizierte immortale Lipom-Zelllinie MCF7 immortale Mammakarzinom-Zelllinie

MRIH186 immortale Zervixkarzinom-Zelllinie

S40 SV40 transfizierte immortale Schilddrüsen-Adenom-Zelllinie S121 SV40 transfizierte immortale Schilddrüsen-Adenom-Zelllinie S216 SV40 transfizierte immortale Schilddrüsen-Adenom-Zelllinie S270 SV40 transfizierte immortale Schilddrüsen-Adenom-Zelllinie

2.2 ISOLIERUNG

VON

NUKLEINSÄUREN

2.2.1 PAC-, COSMID- UND PLASMID-DNA ISOLIERUNG

Die Isolierung der PAC-, Cosmid- und Plasmid-DNA erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse mit nachfolgender Aufreinigung über Anionen-Austauscher-Säulen. Hierfür wurden die kommerziellen DNA-Isolierungs-Kits „QIAGEN Plasmid Midi Kit“, „QIAGEN Maxi Plasmid/Cosmid Purification-Kit“ und „QIAprep Spin Miniprep Kit“ (Qiagen, Hilden) entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet (QIAGEN Plasmid Purification Handbook, QIAprep Miniprep Handbook).

(16)

2.2.2 DNA-ISOLIERUNG

Die DNA-Isolierung wurde mit Hilfe der Salzextraktion nach Lahiri &Nurnberger (1991) durchgeführt. 5ml Vollblut mit 100µl 15 %iger EDTA wurde mit 5 ml TKM1-Puffer versetzt und vermischt. Zur Lyse der Zellen erfolgte die Zugabe von 150 µl IGEPAL mit anschließendem mehrmaligen vortexen. Es folgte das Abzentrifugieren bei 2.500 rpm für 10 min bei RT, der Überstand wurde vorsichtig dekantiert. Das erhaltene Pellet wurde zweimal mit 5 ml TKM1-Puffer gewaschen und erneut bei 2.500 rpm für 10 min bei RT zentrifugiert.

Das Pellet wurde anschließend vollständig in 800 µl TKM2-Puffer resuspendiert und in ein 2.0 ml Eppendorfcup überführen. Nach der Zugabe von 50 µl 10%iger SDS wurde die Suspension gut vermischt und für 10 min bei 55°C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurden dem Ansatz 300 µl 6 M NaCl (gesättigte Lösung) zugegeben und bei 12.800 x g für 5 min zentrifugiert.

Dem Überstand, welcher die DNA enthält wurde gleiches Volumen Isopropanol zugeführt. Das Cup wurde vorsichtig geschwenkt, bis die DNA präzipitiert war. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation bei 12.800 x g für weitere 10 min bei 4°C. Zum Abschluss wurde das Pellet mit 1 ml eiskaltem Ethanol (70%) gewaschen und für 5 min erneut bei 12.800 x g bei 4°C zentrifugiert.

Das Pellet wurde bei RT getrocknet und in 200 µl TE-Puffer (pH 8.0) bei 65°C für 15 min resuspendiert.

2.2.3 RNA- ISOLIERUNG

RNA aus Geweben oder kultivierten Zelllinien wurde mit Hilfe des TRIzol-Reagenzes (Invitrogen,Karlsruhe) nach Herstellerangaben auf der Basis des Einzelschritt Säure-Phenol-Isolierungsprinzips für RNA isoliert.

2.3 cDNA-ERST-STRANG-SYNTHESE

Die cDNA-Erst-Strang-Sythese erfolgte standardmäßig an 5µg totaler RNA in einem Volumen von 20 µl mit Hilfe von 200U M-MLV Reverser Transkriptase

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(AP1)(5’AAGGATCCGTCGACATCT(17)-3’), 1xReaktionspuffer (50mM

Tris-HCl/75mMKCl/3mM MgCl2;pH 8,3) und 0,01M 1,4-Dithiotreitol für 45 min bei 42°C.

Die Inaktivierung des Synthese-Ansatzes erfolgte durch eine 5-minütige Inkubation bei 65°C.

2.4 PCR

Die Amplifikation von DNA Fragmenten mittels PCR erfolgte nach Standardmethoden. Dazu wurden je nach Ansatz 0,5 U Taq-Polymease

verschiedener Hersteller mit dem jeweils zugehörigen 10x Puffer mit 50mM MgCl2,

100µM eines jeden dNTPs und je 200nM Sense- und Antisense-Primer in einem Volumen von 50-100 µl in 0,5 ml PCR-Reaktiongefäßen eingesetzt. Die Reaktion erfolgte im Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg). Spezifische Angaben zu Primern, eingesetzten Proben und Amplifikationsprofilen sind in den einzelnen Publikationen in der Publikationsübersicht beschrieben. Die direkte Aufreinigung von PCR-Ansätzen erfolgte mit Hilfe des QIAquick PCR purification Kits (Qiagen,Hilden) entsprechend der Herstellerangaben.

2.5 RT-PCR

RT-PCRs wurden standardmäßig mit 2-7 µl cDNA, 0,5 U Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden), dem zugehörigen PCR-Reaktionspuffer mit 1,5 mM MgCl2, 1x Q-Solution

(Qiagen,Hilden), 100 µM eines dNTPs und je 200 nM Sense und Antisense-Primer in einem Volumen von 20 µl angesetzt. Die Reaktion erfolgte im Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit Amplifikationsprofilen, die in den einzelnen Publikationen beschrieben sind.

2.6 3’RACE-PCR

3’-RACE-PCRs wurden semi-nested durchgeführt. Für die erste und zweite PCR-Reaktion wurden als Antisense-Primer der universal-Adapter-Primer (UAP2) 5’-CUA CUA CUA CUA CUA AAG GAT CCG TGG ACA TC-3’ und als Sense-Primer

(18)

genspezifische nested-Primer eingesetzt. Die PCR-Reaktionen erfolgten nach standard PCR-Methoden, bei denen 5µl cDNA als Template für die erste PCR und 1 µl der ersten PCR als Template für die zweite PCR eingesetzt wurden. Spezifische Angaben zu Sense-Primern und Amplifikationsprofilen sind in den jeweiligen

Publikationen beschrieben.

2.7 GELELEKTROPHORESE

Die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA wurde je nach Fragmentgröße in 0,8 - 2%igen (w/v) Agarosegelen in 1x TAE-Puffer (0.04M Tris-Base; 1mM EDTA (pH 8,0); 20 mM Eisessig) durchgeführt. Die Proben sowie die Molekulargewichtsmarker wurden mit 1/6 Volumen Gelbeladungspuffer (15% (w/v) Ficoll 400, 0,25% Xylen Cyanol FF, 0,25% Bromphenolblau) versetzt. Die Elektrophorese wurde bei 80-100 V durchgeführt,bis die Fragmente genügend aufgetrennt waren. Durch die Zugabe von Ethidiumbromid wurden die aufgetrennten Nukleinsäuren im UV-Durchlicht bei 254 nm Wellenlänge nachgewiesen. Die Dokumentation erfolgte durch Fotographie (MP-4 Kamerasystem, Polaroid). Mit Hilfe und nach den Protokollen des QIAExII Gel Isolation Kits (Qiagen, Hilden) wurden die DNA-Fragmente aus Agarosegelen isoliert.

2.8 HERSTELLUNG

VON DNA-SONDEN

Die Herstellung Digoxigenin-markierter DNA-Sonden für nicht radioaktive Southern Blot-Hybridisierungen erfolgte mittels PCR unter Zusatz von 0,3 nM DIG-11-dUTP an Plasmid-DNA oder PCR-Produkten. Das PCR-Produkt wurde im Agarosegel

aufgetrennt und die entsprechende Bande mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die Extraktion der DNA aus dem Gelfragment erfolgte nach Herstellerangaben mit dem „QIAquick PCR Purification KIT“ (Qiagen, Hilden).

2.9 SOUTHERN

BLOT-HYBRIDISIERUNG

Die Methode des Southern Blots erfolgte nach einem modifizierten „HybondTM-N+ “-Protokoll (Amersham Biosciences, Freiburg). Zur Denaturierung der zuvor

(19)

aufgetrennten DNA wurde das Gel zweimal für je 15 min in 0,5 M NaOH inkubiert. Nach Neutralisation für 30 min in 1,5 M NaCl/0,5 M Tris-HCl/1mM EDTA (pH 7,2) erfolgte der Transfer auf eine positiv geladene Nylonmembran für 45 min bei 7 inch Hg Unterdruck. Eine kovalente Bindung der DNA an die Nylonmembran erfolgte anschließend durch UV-Crosslinking (0,4 J/cm2). Die Hybridisierung wurde nach einem modifizierten „ExpressHyb Hybridization Solution“-Protokoll (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, USA) durchgeführt. Die Membran wurde für 30 min bei 60°C mit 5 ml vorgewärmter ExpressHyb-Lösung (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, USA) pro 100 cm2 Membran prähybridisiert und anschließend 1 h bei 60°C mit 5ml/1mm cm2 vorgewärmter Express-Hyb-Lösung mit ca. 5 ng/ml denaturierter Sonde

hybridisiert. Das Waschen der Membran erfolgte für zweimal 15 min mit

2xSSC/0,1%SDS bei RT, anschließend zweimal 15 min mit 0,1xSSC/0,1%SDS bei 60°C, dann 5 min mit 0,1 M Maleinsäure/ 0,15 M NaCl/0,3% Tween 20 (pH 7,5) bei RT. Die Detektion der Digoxigenin-markierten DNA-Sonde erfolgte nach einem modifizierten „DIG Application Manual for Filter Hybridization“ Protokoll (Roche Diagnostics, Mannheim). Die Membran wurde für 30 min mit 0,1 M

Maleinsäure/0,15M NaCl/1% Blocking-Reagenz (pH 7,5) bei RT inkubiert. Im

Anschluss erfolgte eine Inkubation für 30 min mit 0,1 M Maleinsäure/0,15 M NaCl/1% Blocking-Reagenz (pH 7,5) mit 75 mU/ml Anti-Digoxigenin-Antikörper bei RT. Die Membran wurde dann zweimal 15 min mit 0,1 M Maleinsäure/0,15M NaCl/0,3% Tween 20 (pH 7,5) bei RT gewaschen. Nach Inkubation für 5 min mit 0,1 M Tris-HCl/0,1 M NaCl/50mM MgCl2 (pH 9,5) bei RT, erfolgte die Nachweisreaktion mittels

12,5 mM CDP-Star Substrat auf einem Film (Hyperfilm ECL; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) nach Angaben des Herstellers.

2.10 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA

Für den enzymatischen Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen wurden die spezifischen 10x Restriktionspuffer des Herstellers verwendet und auf 1x

Konzentration verdünnt. Die Aufreinigung geschnittener DNA erfolgte wahlweise über die Ethanol-Fällung oder mit Hilfe des „QIAquick PCR Purification Kits“ (Qiagen, Hilden) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.

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2.11 HERSTELLUNG VON KLONIERUNGSVEKTOREN

Zur Herstellung von Klonierungsvektoren wurde Vektor-DNA mit singulär

schneidenden Restriktionsendonukleasen über Nacht enzymatisch verdaut und anschließend mit dem „QIAquick PCR Purification Kit“ (Qiagen, Hilden) entsprechend den Herstellerangaben aufgereinigt. Die Entfernung überstehender Phosphatreste an den Restriktionschnittstellen erfolgte nach der Sambrook et al. (1989) beschriebenen Methode. Dabei wurden je 100 pmol 5’-überstehende Enden mit 1 U CIP-Enzym in einem Ansatz mit 1/10 Vol 10x CIP-Reaktionspuffer für 30min bei 37°C

dephosphoryliert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1/9Vol 10x CIP-Stop-Puffer und Inkubation für 30 min bei 56°C gestoppt und mit dem „QIAquick PCR Purification Kit“ aufgereinigt.

2.12 LIGATIONEN

Die Ligationen wurden in einem Gesamtvolumen von 10-20 µl durchgeführt. Das Verhältnis von Vektor- zu Fragment-DNA betrug 1:1-1:5. Die Ligation von PCR-Produkten erfolgte standardmäßig mit Hilfe des Vektor-Systems pGem-T Easy (Promega, Mannheim) nach den Vorgaben des Herstellers. Die Ligation von geschnittenen DNA-Fragmenten erfolgte mittels T4-DNA-Ligase (Promega, Mannheim) in den Vektor pGem11zf+ (Promega, Mannheim). Die Ligation von 3’-RACE-PCR-Produkten erfolgte standardmäßig in pGem-T Easy-Vektor (Promega, Mannheim). Alternativ wurde das pAMP1-Vektor-System (Gibco BRL, Eggenstein) entsprechend den Herstellerangaben verwendet.

2.13 TRANSFORMATIONEN

2.13.1 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN

Die Herstellung transformationskompetenter Bakterien aus Escherichia coli K12-Sicherheitsstämmen wurde entsprechend dem „Standard Protokoll für die SEM Präparation kompetenter Zellen“ (Inoue et al., 1990) durchgeführt.

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2.13.2 TRANSFORMATION VON E. coli

Die Thermo-Transformation von Ligationsprodukten erfolgte nach dem Protokoll von Inoue et al. (1990) in kompetente DH5α E. coli-Zellen (Stratagene, La Jolla, USA).

2.14 ZELLKULTUREN

2.14.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN

Zellkulturen wurden in Medium TC 199 (20% fetales Kälberserum; 200 lU/ml Penicillin; 200 mg/ml Streptomycin) bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit

kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgte alle 2 bis 3 Tage. Bei einer konfluent gewachsenen Zellschicht wurde die Zellkultur trypsiniert (0,05% Trypsin; 0,02% EDTA) und auf neue Kulturflaschen passagiert.

2.14.2 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN

Zur Konservierung kultivierter Zellen wurden diese in Stickstoff eingefroren. Dazu wurden die Zellen nach Ausbildung eines geschlossenen Monolayers trypsiniert, in 2 ml eiskaltem Medium TC199 mit 10% DMSO aufgenommen und in ein Kryoröhrchen überführt. Das Einfrieren erfolgte stufenweise in folgenden Temperaturschritten: 0,7°C/min auf -13°C; 0,3°C/min auf -15°C und 1°C/min auf -120°C mit einem Einfriergerät (CTE 880, Cryotechnik, Erlangen). Nach Beendigung des Vorganges wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert.

2.14.3 AUFTAUEN EINGEFRORENER ZELLEN

In Stickstoff gelagerte Zellen wurden in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut. Anschließend wurde die Zellsuspension in ein Sarstedt-Röhrchen mit 8 ml

MediumTC199 überführt und 10 min bei 120 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet resuspendiert und mit 5 ml Medium TC199 in eine

(22)

2.15 ZYTOGENETISCHE PRÄPARATION

2.15.1 CHROMOSOMENPRÄPARATION

Die Präparation von Metaphase-Chromosomen wurde nach einer Methode von Bullerdiek et al. (1987) durchgeführt. Waren mit dem Phasenkontrastmikroskop eine ausreichende Anzahl proliferierender Zellen im Mitose-Stadium sichtbar, wurden die Zellen mit Colcemid (0,004 mg/ml Medium) in der Metaphase arretiert. Nach einer Inkubation von 4-6 h (Primärkulturen) bzw. 30 min (Zelllinien) wurden die Zellen durch Trypsinierung (0,05% Trypsin, 0,02% EDTA) geerntet. Nach einer 20 minütigen hypotonen Behandlung in 1:6 verdünnter Medium/aqua bidest Lösung wurden die Zellen in 3:1 Methanol/Eisessig-Gemisch über Nacht bei 4°C fixiert. Zur Erlangung gespreizter Metaphase-Chromsomen wurde die fixierte Zellsuspension auf eiskalte Objektträger getropft.

2.15.2 G-BANDING ALS VORBEREITUNG ZUR FISH

Die präparierten Metaphasen von Lymphozyten- bzw. Tumorzellkulturen wurden einer GTG-Banding modifiziert nach Seabright (1971) zum Zwecke einer

Karyotypanalyse unterzogen. Die Präparate wurden mit einem Durchlichtmikroskop (Axiophot, Zeiss) nach geeigneten, gespreizten Metaphase-Chromosomen

abgesucht. Die Dokumentation der Metaphasen erfolgte mit Hilfe einer

Bildverarbeitung mit dem Karyotypisierungs-Programm Mac-Type von Perceptive Scientific International.

2.16 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (FISH)

2.16.1 MARKIERUNG DER SONDEN-DNA DURCH NICK TRANSLATION

In die Sonden-DNA wurden mittels Nick Translation Biotin-markierte Nukleotide (Biotin-16-dUTPs) oder Digoxigenin-markierte Nukleotide (DIG-11-dUTPs) eingebaut. Das Labelling wurde nach dem Protokoll des Biotin-/DIG-Nick Translationsmix im

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Handbuch „Nonradioactive in situ hybridization application manual“ von Roche diagnostics durchgeführt.

2.16.2 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung wurde nach dem Protokoll von Kievits et al. (1990) modifiziert durchgeführt. Die Auswertung der FISH-Versuche erfolgte an den zuvor ausgesuchten Metaphasen: An einem UV-Durchlichtmikroskop, mit digitaler Aufsatzkamera und mit dem Macintosh Programm MacProbe (Perspective Scientific Instruments, England).

2.17 SEQUENZIERUNGEN

Sequenzierungen wurden von kommerziellen Anbietern (MWG-Biotech, München; GAG, Bremen; Institut für Rechtsmedizin, ZKH St.-Jürgen-Str., Bremen)

durchgeführt. Für die Sequenzierung klonierter Fragmente wurden zumeist die Standardprimer M13 uni TGTAAAACGACGGCC-AGT-3’) und M13 rev

(5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’) verwendet. Die Sequenzierung von PCR-Produkten erfolgte jeweils mit den Primern, mit denen diese Produkte generiert worden waren. Alle Sequenzdaten wurden manuell durch Überprüfung der Chromatogramme verifiziert.

2.18 IN SILICO-ANALYSEN

Die Sequenzanalysen erfolgten mit Hilfe des Lasergene Software Paket (DNAstar, Madison, USA). Für in silico Analysen von Nukleinsäure- und Proteinsequenzen wurden Online-Programme des National Center for Biotechnology Information (Bethesda, USA) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) genutzt.

(24)

3 ERGEBNISSE

3.1 IN CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER

CHROMOSOMALEN ABERRATION IN DER REGION 12q13-15 UND 13q12-14 KONNTE KEIN HMGA2-LHFP FUSIONSGEN DETEKTIERT WERDEN.

I: Rogalla et al., Cancer Genetics and Cytogenetics, 133: 2002

Neben den beiden predominanten chromosomalen Veränderungen t(3;12)(q27-28;q14-15) und t (12;14)(q14-q15;q23-q24) in Hamartomen der Lunge, Lipomen und uterinen Leiomyomen, bei denen jeweils das HMGA2-Gen betroffen ist, wurde eine weitere häufig auftretende Aberration t(12;13)(q14-q15;q12-q14) in Lipomen und Hamartomen der Lunge beschrieben (Mandahl et al.,1994; Kazmierczak et al., 1995; 1999b). Auf molekulargenetischer Ebene wurde das Fusionsgen HMGA2-LHFP (LHFP=lipom HMGA2 fusion partner) in einem Lipom mit einer t(12;13)(q14-q15;q12-q14) identifiziert (Petit et al., 1999). Es stellt sich die Frage, ob das Fusionsgen HMGA2-LHFP auch in anderen Tumorentitäten zu finden ist, wie z.B. das Fusionsgen HMGA2-LPP, das sowohl in Lipomen als auch in Hamartomen der Lunge mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) zu finden ist.

Aus diesem Grund wurden mittels RT-PCR und Southern blot Analysen drei Lungenhamartome mit komplexen Aberrationen in den chromosomalen Regionen 12q14-15 und 13q12-14 sowie ein Lungenhamartom mit einer einfachen t(12;13) auf das Vorkommen des HMGA2-LHFP Transkripts untersucht. Es zeigte sich, dass das Fusionsgen HMGA2-LHFP nicht konstant in mesenchymalen Tumoren mit klonalen Aberrationen in den chromosomalen Regionen 12q13-15 und 13q12-14 zu finden ist.

(25)

3.2 IN CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER t(3;12)(q27-28;q14-15) WIRD EIN IDENTISCHES HMGA2-LPP TRANSKRIPT EXPRIMIERT.

II: Rogalla et al., Genes, Chromosomes & Cancer, 29: 2000

Bei Betrachtung der chimären Formen des HMGA2-Gens stellt das HMGA2-LPP Fusionsgen das am häufigsten zu beobachtende Fusionsprodukt in Tumoren dar, das bisher sowohl in Lipomen als auch in chondroiden Hamartomen der Lunge mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) gefunden wurde. Eine mögliche molekulare Variabilität des HMGA2-LPP Fusionsgens könnte zu einem besseren Verständnis von der sich unterscheidenden Histologie zwischen Lipomen, die homogen aus reifen Adipozyten bestehen und Hamartomen der Lunge, die sich aus Chondrozyten, Adipozyten, Muskelzellen, undifferenzierten Mesenchymalzellen und Epithel des respiratorischen Traktes zusammensetzen, beitragen. Auch in anderen Neoplasien kommt es zur Fusion identischer Gene in verschiedenen Tumorentitäten. Daher wurde

angenommen, dass der Phänotyp des Tumors sich durch variierende Bruchpunkte in beiden Genen und sich damit verschiedene Varianten von Fusionsgenen ergeben (Melo, 1996). Im HMGA2-LPP Fusionsgen konnten in neun Lipomen Variationen identifiziert werden (Petit et al., 1996). So hatten acht Lipome ein identisches Fusionstranskript, bestehend aus Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des LPP-Gens. In einem weiteren Lipom fusionierten jedoch Exon 1-3 vom HMGA2 mit Exon 7-11 vom LPP.

Aus einer Serie von 364 chondroiden Hamartomen der Lunge wurden 13 Hamartome mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) ausgewählt. Mittels RT-PCR, Southern blot und Restriktionsenzymverdau wurde das HMGA2-LPP Fusionstranskript charakterisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass alle PCR-Fragmente die gleiche Struktur aufwiesen, Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des LPP-Gens. Ein entsprechendes Fusionsprotein bestehend aus drei AT-Hooks und zwei LIM-Domänen.

(26)

3.3 EXPRESSIONSMUSTER VOM LPP-HMGA2 FUSIONSTRANSKRIPT IN CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER t(3;12) (q27-28;q14-15).

III: von Ahsen et al., Cancer Genetics and Cytogenetics, 163: 2005a

Da sich die unterschiedliche Histologie zwischen Lipomen und chondroiden Hamartomen der Lunge und dessen histologische Heterogenität nicht durch ein variierendes HMGA2-LPP Fusionstranskript erklären lässt, wurden in einem

nächsten Schritt Expressionsstudien vom LPP-HMGA2-Fusionsgen an chondroiden Hamartomen der Lunge durchgeführt, um dort eine eventuelle molekulare Variabilität des Fusionsgens zu detektieren und somit eine Erklärung für die unterschiedlichen Phänotypen von Lipomen und Hamartomen der Lunge zu finden. Das reziproke Fusionstranskript, bestehend aus Exon 1-8 des LPP-Gens und Exon 4-5 des

HMGA2-Gens wurde nur in einem von neun untersuchten Lipomen exprimiert (Petit et al., 1996). Eine große Deletion des LPP-Lokus, hervorgerufen durch die

Translokation, scheint für das Fehlen des LPP-HMGA2 Transkripts in Lipomen verantwortlich zu sein (Lemke et al., 2001).

Mit Hilfe von RT-PCR und Southern blot Analysen wurde die mögliche Expression des LPP-HMGA2 Transkripts in elf Hamartomen der Lunge mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) untersucht. In einer vorherigen Studie wurde gezeigt, dass alle elf

Hamartome der Lunge das gleiche HMGA2-LPP-Fusionsgen exprimierten (Rogalla et al., 2000).

Das LPP-HMGA2-Fusionstranskript konnte in acht von elf Hamartomen der Lunge mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) nachgewiesen werden. Klonierungs- und

Sequenzierungsanalysen zeigten, dass sich alle Fusionstranskripte aus Exon 1-8 des LPP-Gens und Exon 4-5 des HMGA2-Gens zusammensetzen. Ein Protein

zusammengesetzt aus der prolinreichen Region und der ersten LIM-Domäne des LPP-Gens und dem sauren Teil des HMGA2-Gens. Somit ist anzunehmen, dass in chondroiden Hamartomen der Lunge neben dem HMGA2-LPP-Fusionsgen, dem reziproken Fusionsgen eine pathologische Signifikanz zukommt.

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3.4 EIN TEIL DES HMGA2-LOKUS IST IN EINEM LIPOM MIT DER t(3;12)(q27-28;q14-15) VON EINER DELETION BETROFFEN.

IV: Lemke et al., Cancer Genetics and Cytogenetics, 129: 2001a

Auf Grund der Beobachtung, dass in Lipomen mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) das reziproke Fusionstranskript LPP-HMGA2 häufig nicht zu detektieren ist (Petit et al. 1996) und die Hypothese aufgestellt wurde, dass durch die Translokation im Bruchpunktbereich Chromosomenmaterial deletiert und somit das reziproke

Transkript nicht entstehen kann, wurde mittels FISH-Experimenten mit Proben vom HMGA2- und LPP-Lokus ein Lipom mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) untersucht, bei dem mit Hilfe von RT-PCR und Southern blot Analysen das HMGA2-LPP

Fusionstranskript nachgewiesen werden konnte, jedoch nicht das LPP-HMGA2 Fusionstranskript.

Die Ergebnisse der FISH-Analysen mit den Cosmid-Klonen 27E12, 142H1 und 202A1 sowie den PAC-Klonen 12/1, 12/2 und aus der chromosomalen Region 3q27-28 zeigten Signale auf dem normalen Chromosom 12, auf dem derivativen

Chromosom 12, jedoch keine Signale auf dem derivativen Chromosom 3. Das bedeutet, dass die t(3;12)(q27-28;q14-15) von einer großen Deletion begleitet wird. Der Vergleich mit der genomischen Organisation vom HMGA2-Lokus

(Schoenmakers et al. 1995) ergab, dass ca. 170 kb vom Chromosom 12 deletiert sind. Somit kann das Fehlen des LPP-HMGA2 Fusionsgens in Lipomen mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) durch eine Deletion erklärt werden.

3.5 EIN NEUES LPP-FUSIONSGEN WEIST AUF DIE ENTSCHEIDENDE ROLLE VON TRUNKIERTEN LPP PROTEINEN IN LIPOMEN UND CHONDROIDEN LUNGENHAMARTOMEN HIN.

V:Lemke et al., Cytogenetics and Cell Genetics, 95: 2001b

Vorangegangene Studien zeigten das Vorkommen einer Deletion, ausgelöst durch die t(3;12)(q27-28;q14-15) in einem Lipom (Lemke et al., 2001). Die Expression des

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HMGA2-LPP-Fusionstranskript in allen Tumoren mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) und das Fehlen des LPP-HMGA2-Fusionstranskript führte zu der Schlussfolgerung, dass nur das HMGA2-LPP Fusionsgen von funktioneller Signifikanz in der

molekularen Pathogenese von Lipomen ist (Petit et al., 1996). Die Überlegung, dass das Fehlen des LPP-HMGA2-Fusionsgens die Fusion mit Sequenzen 3’ vom HMGA2 mit dem 5’-Part des LPP-Gens nicht ausschließt, sind bisher als nicht relevant in der Tumorentstehung betrachtet worden. Aus diesem Grund wurde ein Lipom mit einer 170 kb großen Deletion, mittels 3’ RACE analysiert.

In einem mesenchymalen Tumor konnte erstmals ein neues LPP-Fusionstranskript detektiert werden, bestehend aus den Exons 1-6 des LPP-Gens und zwei terminalen Exons eines bisher unbekannten Gens (Gen Bank Accession Number: AF 393503). Das neue Gen, genannt C12orf9 (chromosome 12 open reading frame 9) ist

approximal 200 kb 3’ vom HMGA2-Gen lokalisiert. Das LPP-C12orf9 Fusionsprotein besteht aus der Prolinreichen-Region des LPP-Gens und 28 Aminosäuren vom C12orf9-Gen. Des weiteren wurde die genomische Struktur des C12orf9-Gens (Gen Bank Accession Number: AF 393634) mit Hilfe von in silico Analysen durchgeführt, bei denen keine positiven cDNAs oder ESTs in der NCBI Datenbank gefunden wurden.

Bei zusätzlichen RT-PCR Experimenten mit C12orf9 spezifischen Primern konnte die Expression in zehn verschiedenen Normalgeweben, zehn Hamartomen der Lunge, acht verschiedenen Tumorzelllinien und einem weiteren Lipom nicht nachgewiesen werden. Somit ist das C12orf9-Gen kein „echtes“ Gen, sondern wurde nur durch die Deletion und Zusammenführung mit LPP, exprimiert. Ein trunkiertes LPP-Protein oder LPP in Fusion mit anderen Genen außer HMGA2 weist demnach ein onkogenes Potential auf.

3.6 IN NUR EINEM VON 61 CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINEM NORMALEN KARYOTYP WIRD DAS HMGA2-LPP

FUSIONSTRANSKRIPT EXPRIMIERT.

VI: Lemke et al., Cancer Genetic and Cytogenetics, 138: 2002

(29)

So stellt sich die Frage, ob nicht doch kleine Subpopulationen von Tumorzellen mit HMGA2 Rearrangierungen in einigen Tumoren aufzufinden sind. Die Existenz dieser Populationen würde nahe legen, dass es sich bei der chromosomalen Aberration um ein sekundäres Ereignis handelt.

Auf diesen Hintergrund Bezug nehmend, wurden 61 Hamartome der Lunge mit einem scheinbar normalen Karyotypen mittels RT-PCR auf das Fusionsgen HMGA2-LPP untersucht.

Die Ergebnisse zeigen, dass in einem von 61 Hamartomen der Lunge das HMGA2-LPP Transkript, bestehend aus Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des HMGA2- LPP-Gens, exprimiert wurde. Zusätzlich wurde der positive Tumor auf das reziproke Fusionstranskript untersucht. Mit Hilfe einer Semi-nested RT-PCR konnte keine Expression des LPP-HMGA2 Fusionsgens nachgewiesen werden. Weitere dual-color FISH-Analysen an dem positiven Hamartom wurden mit einem PAC-Klon, der das vollständige Intron 3 des HMGA2-Gens beinhaltet und einem PAC-Klon, aus der chromosomalen Region 3q27-28 durchgeführt.

Es zeigten sich Hybridisierungs-Signale von beiden Sonden auf einem anscheinend normalen Chromosom 4, in 6 von 20 Metaphasen. Neben dieser Anordnung waren LPP-spezifische Signale auf beiden normalen Chromosomen 3, jedoch zeigte nur ein Chromosom 12 Signale der HMGA2-spezifischen Probe. Die Ergebnisse zeigen, dass das HMGA2-LPP Fusionstranskript in kleinen Populationen von karyotypisch normalen Hamartomen der Lunge nicht exprimiert wird und legt nahe, das

chromosomale Aberrationen primäre Ereignisse in gutartigen mesenchymalen Tumoren darstellen.

3.7 FÜR DIE MEHRHEIT DER LEIOMYOME DES UTERUS SIND KEINE KEIMBAHNMUTATIONEN DES HMGA2-GENS VERANTWORTLICH.

VII: von Ahsen et al., Molecular Human Reproduction

(Eingereicht) 2005b

Leiomyome des Uterus gehören zu den häufigsten Tumoren der Frau und treten bei mehr als 30% aller Frauen über 30 Jahren auf (Norris und Zaloudek, 1982). Weil der

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Ursprung dieser häufig auftretenden Neoplasie unbekannt ist, wurde eine genetische Prädisposition, basierend auf Zwillingsstudien (Snieder et al., 1998) und familiären Auffälligkeiten für diesen Tumor in betracht gezogen (Vikhlyaeva et al., 1995). Ein Gen, das mit der Entstehung von Leiomyomen des Uterus assoziiert wird, ist HMGA2 (Schoenmakers et al., 1995; Ashar et al., 1995), welches durch Aberrationen in der chromosomalen Region 12q14-15 in den meisten Fällen rearrangiert vorliegt. Obwohl die Existenz einer genetischen Prädisposition in diesem häufig auftretenden Tumor angenommen wird, wurden noch keine Untersuchungen zu Sequenzvariationen im HMGA2-Gen unternommen. Ebenso sollten die Untersuchungen Aufschluss über mögliche Sequenzvarianten in Bezug auf die Problematik der unterschiedlichen Histologien von Lipomen und chondroiden Hamartomen der Lunge, sowie dessen histologische Heterogenität geben.

Es wurde die kodierende Region des HMGA2-Gens von 87 gesunden Kontrollpersonen sequenziert, um individuelle Unterschiede in der

Nukleotid-Sequenz zu detektieren, die mit einer genetischen Prädisposition assoziiert werden können. Alle fünf Exons des HMGA2-Gens wurden mit spezifischen Primern mittels PCR von 87 Individuen amplifiziert. Eine anschließende Sequenzierung jedes PCR-Fragments ergab eine G -> A Punktmutation an Position 26 im Exon 1, mit einem Aminosäureaustausch im Codon 9 von Glycin zu Glutaminsäure.

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4 Diskussion

Benigne mesenchymale Tumoren stellen die größte Gruppe gutartiger Neoplasien des Menschen dar. Dabei ist das häufigste Ziel chromosomaler Rearrangierungen die chromosomale Region 12q14-15. Mit Hilfe von Bruchpunktklonierungen konnten Schoenmakers et al. (1995) in der betroffenen Region das HMGA2-Gen lokalisieren. Die am häufigsten von einer Rearrangierung der chromosomalen Region 12q14-15 betroffenen mesenchymalen Tumoren sind u. a. Lipome (Heim et al., 1986; Turc-Carel et al., 1986; Mandahl et al., 1987; Sreekantaiah et al., 1991; Belge et al., 1992), die homogen aus reifen Adipozyten bestehen und zu den häufigsten mesenchymalen Tumoren des Menschen gehören, chondroide Hamartome der Lunge (Fletcher et al., 1991; Dal Cin et al., 1993), die zu den häufigsten benignen Tumoren der Lunge zählen und sich aus Chondrozyten, Adipozyten, Muskelzellen, undifferenzierten Mesenchymzellen und Epithel des respiratorischen Traktes zusammen setzen, sowie Leiomyome des Uterus (Heim et al., 1988; Turc-Carel et al., 1988; Vanni und Lecca, 1988), mesenchymale Muskeltumoren, die zu den häufigsten Tumoren der Frau gehören und in mehr als 30% aller Frauen über 30 Jahren auftreten (Norris und Zaloudek, 1992).

Diese chromosomalen Rearrangierungen führen häufig zu Fusionsgenen. Die am häufigsten zu beobachtenden Fusionsprodukte stellen die reziproken Fusionen zwischen dem HMGA2- und LPP-Gen dar. Diese Fusion wurde sowohl in Lipomen als auch in chondroiden Hamartomen der Lunge mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) gefunden (Petit et al., 1996; Rogalla et al., 1998), sowie die Fusion zwischen dem HMGA2- und RAD51L1-Gen in uterinen Leiomyomen mit einer t(12;14)(q14-15;q23-24) (Schoenmakers et al., 1995).

Neben diesen beiden prominenten Translokationen, wurde eine weitere Translokation t(12;13)(q14-15;q12-14) in einem Lipom detektiert, bei dem das

Fusionsgen HMGA2-LHFP entsteht (Petit et al., 1999). Der Frage nachgehend ob ein weiteres gemeinsames Fusionsgen in Lipomen und Hamartomen besteht, wurden in der vorliegenden Arbeit vier Hamartome mit einer t(12;13)(q14-15;q12-14)

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Frühere Studien korrelierten die Genese verschiedener Tumorentitäten mit der Expression spezifischer HMGA2-Fusionsgene, bei denen die DNA-bindenden-Domänen (DBD’s) des HMGA2 mit funktionellen DNA-bindenden-Domänen anderer Gene

fusionierten. So wurde die Entstehung von Lipomen mit der Fusion der DBD’s mit den proteinbindenden LIM-Domänen des LPP korreliert (Ashar et al., 1995; Lovell-Badge 1995). Um die unterschiedliche Histologie zwischen Lipomen und

chondroiden Hamartomen der Lunge sowie deren histologische Heterogenität trotz gleicher zytogenetischer Veränderung, der t(3;12)(q27-28;q14-15) aufzuklären, wurden im ersten Schritt mögliche molekulare Variabilitäten des Fusionsgens

HMGA2-LPP untersucht. Auch in anderen Neoplasien fusionieren identische Gene in verschiedenen Tumorentitäten. Demnach wurde angenommen, dass variierende Bruchpunkte in beiden Genen und somit verschiedene Fusionsproteine den

Phänotyp des Tumors bestimmen. So konnte Melo (1996) postulieren, dass bei der Translokation t(9;22) der Bruchpunkt in den Fusionsgenen BCR und ABL mit den genauen klinischen und morphologischen Formen der chronischen myeloischen Leukämie (Ph+ CML) oder der akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) assoziiert werden kann.

Beim HMGA2-LPP Fusionsgen konnten Petit et al. (1996) bei der Analyse von neun Lipomen zeigen, dass das Fusionsgen nicht konstant identisch ist. So zeigten acht Lipome ein identisches Fusionsgen (Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des LPP-Gens), ein Lipom zeigte jedoch ein Fusionstranskript bestehend aus den Exons 1-3 vom HMGA2- und Exon 7-11 vom LPP-Gen.

In der vorliegenden Arbeit wurden 13 chondroide Hamartome der Lunge mit einer t(3;12)(q27-28;14-15) untersucht. Eine molekulargenetische Variabilität der

Fusionsgene konnte nicht nachgewiesen werden. Es zeigten sich bei allen 13 untersuchten chondroiden Hamartomen der Lunge die gleichen HMGA2-LPP Fusionstranskripte, bestehend aus Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des LPP-Gens, woraus sich folgern lässt, dass andere Faktoren für die histologischen Unterschiede verantwortlich sind.

In vitro und in vivo-Studien belegen, dass das tumorigene Potential der HMGA2-Transkripte eher auf die Reexpression der DNA-bindenden-Domänen als auf die Entstehung funktionell neuartiger Transkripte zurückzuführen ist. Versuche mit murinen NIH3T3-Zellen ergaben sowohl für eine 3’trunkierte HMGA2-Variante, die

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nur die DNA-bindenden-Domänen kodiert, als auch für das HMGA2-LPP

Fusionstranskript das gleiche neoplastische Transformationspotential (Fedele et al., 1998). Darüber hinaus entwickelten transgene Mäuse, die die trunkierte HMGA2-Variante exprimierten, einen ‚giant’ Phänotyp mit stark ausgeprägter abdominaler Lipomatose, einhergehend mit einer außergewöhnlich hohen Prävalenz für Lipome (Battista et al., 1999; Arlotta et al., 2000). Dies weist darauf hin, dass für die

Adipogenese die Reexpression der DNA-bindenden-Domänen des HMGA2-Gens wesentlich ist, nicht aber die Expression von HMGA2-LPP Fusionstranskripten (Fedele et al., 2001). Die in der vorliegenden Arbeit nachgewiesenen

Expressionsmuster von HMGA2-LPP würden zwar die Genese der Lipome erklären, nicht aber die Heterogenität der chondroiden Hamartome, die lediglich aus 10% reifer Adipozyten bestehen.

In einem zweiten Schritt wurden Untersuchungen durchgeführt, die Aufschluss über die Relevanz des reziproken Fusionsgens LPP-HMGA2 in der histologischen

Variabilität von chondroiden Hamartomen der Lunge geben sollten.

Die LPP-HMGA2 Expressionsstudien zeigten in 8 von 11 chondroiden Hamartomen der Lunge mit einer t(3;12), die alle das HMGA2-LPP Fusionstranskript aufweisen, dass Fusionsgen LPP-HMGA2, bestehend aus Exon 1-8 vom LPP- und Exon 4-5 vom HMGA2-Gen. In einer Arbeit von Petit et al., (1996) wurde nur in einem von neun Lipomen mit einer t(3;12) das LPP-HMGA2 Fusionsgen nachgewiesen. Die Expression des HMGA2-LPP Transkripts in allen Lipomen und die Abwesenheit des LPP-HMGA2 Fusionsgens hatte zu der Annahme geführt, dass nur die HMGA2-LPP Fusion bzw. die DNA-bindenden-Domänen der trunkierten Form von HMGA2 von funktioneller Signifikanz sind. So kann dieses für Lipome angenommen werden, jedoch nicht für chondroide Hamartome der Lunge mit einer t(3;12).

Basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann geschlossen werden, dass neben der HMGA2-LPP Fusion das reziproke Fusionsgen LPP-HMGA2 bzw. ein trunkiertes LPP-Gen in der Pathogenese von chondroiden Hamartomen

signifikant ist. Ein ähnlicher Mechanismus wurde bei uterinen Leiomyomen mit einer t(12;14) von Schoenmakers et al. (1999) beschrieben. Neben der Dysregulation von HMGA2 führt auch die Expression trunkierter oder aberranter RAD51L1 Proteine zu einem tumorspezifischen Merkmal.

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Um den molekularen Hintergrund bzw. das Fehlen des LPP-HMGA2 Fusionsgens in Lipomen aufzuklären, wurde ein Lipom mit einer t(3;12)(q28-27;q14-15) näher untersucht. Mittels RT-PCR konnte das HMGA2-LPP Fusionsgen, bestehend aus Exon 1-3 vom HMGA2 und Exon 9-11 vom LPP detektiert werden, welches klar einen Bruch im Intron 3 des HMGA2-Gens belegt, jedoch nicht das reziproke LPP-HMGA2. Basierend auf der Hypothese, dass das Fehlen von LPP-HMGA2 durch eine Deletion ausgelöst durch die Translokation erklärt werden könnte, wurden FISH-Analysen mit einer Vielzahl von Proben 3’ des HMGA2 Bruches durchgeführt.

Fehlende Signale auf dem (der) 3 Chromosom und der Vergleich mit der

genomischen Organisation vom HMGA2-Lokus (Schoenmakers et al., 1995) ergaben eine 170 kb große Deletion des Chromosoms 12.

Mit diesen Ergebnissen lässt sich auch das Fehlen des LPP-HMGA2 Transkripts in 8 von 9 Lipomen erklären (Petit et al., 1996).

Vergleichend wurden einfache Deletionen, die eine reziproke Translokation begleiten z.B. auch in chronischen myeloischen Leukämien mit einer t(9;22)(q34;q11)

(Popenoe et al., 1986) oder in follikulären Lymphomen mit einer t(14;18)(q32;q21) gefunden (Zelnetz et al., 1993).

Die Abwesenheit des Fusionsgens LPP-HMGA2 (Lemke et al., 2001) schließt nicht aus, dass Fusionstranskripte bestehend aus dem 5’ Part von LPP und anderen Sequenzen 3’ vom HMGA2 existieren und eine Rolle in der Tumorentstehung spielen. Die Hypothese, dass LPP in Fusion mit anderen Genen außer mit HMGA2 eine Rolle in der Tumorentstehung spielt wurde von Daheron et al. (2001) postuliert. Hier wurde eine klonale t(3;11)(q28;q23) mit einer Fusion des LPP- und dem MLL-Gen in einer sekundären akuten Leukämie beschrieben. Ebenso konnten

Schoenmakers et al. (1999) nachweisen, dass neben der Dysregulation von HMGA2 ein knock out von Splicevarianten des RAD51L1-Gens in uterinen Leiomyomen mit einer t(12;14) ein tumorspezifisches Merkmal aufweisen. Auf diesen Hintergrund bezogen wurden 3’RACE-Experimente an dem Lipom mit einer 170 kb großen Deletion auf Chromosom 12 3’ des HMGA2-Gens durchgeführt (Lemke et al., 2001). Das LPP-C12orf9 Fusionsgens, das dabei detektiert wurde codiert ein Protein

bestehend aus der aminoterminalen Prolin-reichen Region von LPP und 28 AS vom C12orf9-Gen. Es stellt sich die Frage ob ein LPP-Fusionsgen oder ein trunkiertes LPP-Protein eine Rolle in der Tumorgenese spielt. Da das putative C12orf9-Gen

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nicht in verschiedenen normalen Geweben exprimiert wird und nur aus 28 AS besteht, handelt es sich wahrscheinlich nicht um ein „echtes“ Gen, sondern wird nur als Resultat einer Deletion exprimiert und nur durch die Vereinigung mit LPP zu einem echten Gen. Es wird in der vorliegenden Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass die mögliche Rolle von LPP-Fusionsproteinen aus der aberranten Expression der Prolin-reichen-Region resultiert. Ähnliches zeigte sich bei dem Fusionsgen MLL-AF3p21 (Sano et al., 2000). So konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein

anderes LPP Fusionsgen außer das LPP-HMGA2 in einem mesenchymalen Tumor und das onkogene Potential von einem trunkierten LPP-Gen aufgeführt werden. Da HMGA2-Mutationen eine verstärkte Proliferation mesenchymaler Zellen auslösen und ihren Differenzierungsgrad beeinflussen (Ashar et al., 1995), ist es vorstellbar, das die pathologische Heterogenität von chondroiden Hamartomen der Lunge sich durch eine Translokation t(3;12) in einer Stammzelle erklären lassen könnte.

Gewebespezifische Stammzellen kommen in allen adulten Organen vor. Sie besitzen das Potential zu proliferieren und sich in unterschiedlichste terminal differenzierte Zellen zu entwickeln (Zvaifler et al., 2000; Zuk et al., 2001). Sie sind daher

Ausgangspunkt von Geweberegeneration in den Geweben und Organen. Nach bisheriger Meinung haben sie je nach Lokalisation eine Entwicklung durchgemacht, die sie prädestiniert, einen gewebespezifischen Differenzierungsweg einzuschlagen. So können mesenchymale Stammzellen (MSC) zu Chondrozyten, Adiopozyten, Osteoblasten, Fibroblasten und Myozyten werden. Diese Prägung - das so genannte Committment - determiniert die Zellen möglicherweise nicht unwiderruflich, so dass sie prinzipiell auch in Zellen differenzieren können, die nicht spezifisch dem

jeweiligen Gewebe zugeordnet werden können. In vitro können beispielsweise MSC auch in Zellen differenziert werden, die neuronale Charakteristika aufweisen. Derzeit wird zudem das Potential vieler unterschiedlich ausgereifter Zellen untersucht, trotz eines bereits deutlichen Phänotyps doch noch in eine Zellart anderer Provenienz umzudifferenzieren. Ebenfalls könnte angenommen werden, dass die Translokation eine Dedifferenzierung der bereits differenzierten Zellen bewirkt.

Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war, versteckte HMGA2- Aberrationen in zytogenetisch normalen chondroiden Hamartomen der Lunge zu detektieren. Zytogenetische Analysen von Kurzzeit-Kulturen einer großen Serie benigner mesenchymaler Tumoren zeigten, dass in einer beträchtlichen Anzahl in Tumoren mit klonalen Veränderungen, zytogenetisch normale Zellen vorhanden sind (Mark et

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al., 1990; Skreekantaiah et al., 1991; Kazmierczak et al., 1999). Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass sich chromosomale Rearrangierungen in der Folge von unbekannten primären submikroskopischen Veränderungen ereignen können. Augenscheinlich wurde diese Hypothese von Klonalitäts-Assays unterstrichen, durchgeführt mit DNA von Zellkulturen uteriner Leiomyome (Marshal et al., 1994; Xing et al., 1997). Als Resultat von Fällen mit Mosaiken, charakterisiert in Zellen mit klonalen karyotypischen Veränderungen und karyotypisch normalen Zellen, zeigte sich ein monoklonales Muster von Chromosom X Inaktivität. Diese Ergebnisse gelten für uterine Leiomyome, müssen aber nicht für andere Tumorentitäten wie z.B. für chondroide Hamartome der Lunge und Lipome gelten. Um die Rolle von Aberrationen mit der Involvierung von HMGA2 zu

verstehen, wurden Expressions- und FISH-Studien durchgeführt, um das Fusionsgen HMGA2-LPP in kleinen Populationen karyotypisch normaler Zellen zu detektieren. Nur in 1 von 61 chondroiden Hamartomen der Lunge konnte das Fusionsgen HMGA2-LPP detektiert werden. In diesem Tumor zeigte sich eine versteckte Aberration, die mit zytogenetischen Methoden nicht detektierbar war.

Somit konnte in einer Serie von 61 chondroiden Hamartomen der Lunge mit

normalem Karyotyp kein Beweis für die Existenz kleiner Subpopulationen von Zellen mit einer HMGA2-LPP-Fusion gefunden werden. Vorausgesetzt, dass es sich um ein Ereignis sekundärer Natur handelt, würde das Vorkommen dieses Fusionsgens in einer Subpopulation in einer beträchtlichen Anzahl von Tumoren erwartet werden. Die Ergebnisse erlauben aber den Schluss, dass die t(3;12)(q27-28;q14-15) in

chondroiden Hamartomen der Lunge ein primäres Ereignis ist. So konnte zum ersten Mal gezeigt werden, das das HMGA2-LPP-Fusionsgen nicht in kleinen Populationen von karyotypisch normalen chondroiden Hamartomen der Lunge exprimiert wird und stark auf einen primären Vorgang chromosomaler Aberrationen hinweist. Ebenso schließt das primäre Vorkommen der t(3;12) nicht aus, dass diese Translokation per se nicht ausreichend ist, um ein chondroides Hamartom der Lunge zu induzieren, sobald es in einer einzigen Zelle vorkommt.

Trotz der entscheidenden Rolle von HMG-Proteinen in der Pathogenese von mesenchymalen Tumoren wie Lipomen, Hamartomen der Lunge und uterinen Leiomyomen sowie anderen Erkrankungen wie z.B. Lipomatose oder Adipositas, wurden bisher keine Analysen im Hinblick auf individuelle genetische Variabilitäten durchgeführt, die genetische Dispositionen erkennen lassen.

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Keimbahnmutationen des HMGA2-Gens zeigten im Phänotyp eine Disposition zum Groß- oder Kleinwuchs und zur Lipomatose (Zhou et al., 1995, Battista et al., 1999; Arlotta et al., 2000).

Der Phänotyp eines 8 Jahre alten Jungen mit einer perizentrischen Inversion auf Chromosom 12, inv(12)(p11.22;q14.3), zeigt ein übermäßiges Wachstum und Lipomatose (Ligon et al., 2005).

Ein Dinukleotid-Repeat im HMGA2 Promoter wurde von Ishwad et al. (1997)

identifiziert. Dieser Polymorphismus besteht aus 18-37 Kopien eines (CT)-Repeats mit einer beobachteten Heterogenität in 82-83% bei Afroamerikanern und

Kaukasiern. Das dieses polymorphe Dinukleotid Repeat im HMGA2 Promoter einen entscheidenden Einfluss auf dessen Expressionsaktivität ausübt, wobei die

Promoteraktivität von der Länge des Repeats abhängig ist, konnte von Borrmann et al. (2003) nachgewiesen werden. Durch die in dieser Arbeit durchgeführte

Sequenzierung des ORF vom HMGA2-Gen, konnte in 174 Allelen nur eine

Sequenzveränderung mit einem Aminosäure-Austausch detektiert werden. Dieses Ergebnis lässt zum einen den Schluss zu, das Sequenzvariationen des HMGA2-Gens bei der Tumorgenese insbesondere bei der Genese von uterinen Leiomyomen sich auf Grund eines bisher unbekannten Ereignisses, beispielsweise einer

Virusinfektion (Bullerdiek, 1999) vollzieht.

Zum anderen wird dadurch verdeutlicht, dass es sich um ein hoch konserviertes Gen handelt was durch die Untersuchungen von Manfioletti et al. (1991); Zhou et al. (1996) und Kazmierzcak et al. (1998b) unterstützt wird. Um eine individuelle genetische Disposition z.B. in der familiären Lipomatose oder Adipositas auszuschließen oder ob erkrankte Gewebe durch spezifische

Sequenzveränderungen zu charakterisieren sind, bedarf es weiterer Analysen. Die Relevanz und Rolle des HMGA2-Gens sowie dessen Fusionspartner in der Tumorgenese wurden in den vorliegenden Untersuchungen verdeutlicht. Es konnte gezeigt werden, dass bei somatischen Mutationen dem reziproken LPP-HMGA2 neben dem HMGA2-LPP Fusionsgen in chondroiden Hamartomen der Lunge eine pathologische Signifikanz zukommt. Veränderungen des HMGA2-Gens konnten als primäres Ereignis in der Tumorgenese von chondroiden Hamartomen der Lunge nachgewiesen werden. Erstmals konnte ein neues LPP-Fusionsgen in einem

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aufgeführt werden. Keimbahnmutationen, die das HMGA2-Gen betreffen und eine sich daraus resultierende individuelle genetische Prädisposition in der Tumorgenese benigner Neoplasien konnten in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Weiterführende Studien zur Relevanz und Rolle des HMGA2-Gens als

pathogenetische Ursache für die Genese von Neoplasien beständen in zyto- und molekulargenetischen Untersuchungen, wie z.B. Bruchpunktklonierungen,

Expressionsstudien bei Tumoren mit Veränderungen in der chromosomalen Region 12q14-15 und weitere Sequenzanalysen.