Benigne mesenchymale Tumoren stellen die größte Gruppe gutartiger Neoplasien des Menschen dar. Dabei ist das häufigste Ziel chromosomaler Rearrangierungen die chromosomale Region 12q14-15. Mit Hilfe von Bruchpunktklonierungen konnten Schoenmakers et al. (1995) in der betroffenen Region das HMGA2-Gen lokalisieren.
Die am häufigsten von einer Rearrangierung der chromosomalen Region 12q14-15 betroffenen mesenchymalen Tumoren sind u. a. Lipome (Heim et al., 1986; Turc-Carel et al., 1986; Mandahl et al., 1987; Sreekantaiah et al., 1991; Belge et al., 1992), die homogen aus reifen Adipozyten bestehen und zu den häufigsten mesenchymalen Tumoren des Menschen gehören, chondroide Hamartome der Lunge (Fletcher et al., 1991; Dal Cin et al., 1993), die zu den häufigsten benignen Tumoren der Lunge zählen und sich aus Chondrozyten, Adipozyten, Muskelzellen, undifferenzierten Mesenchymzellen und Epithel des respiratorischen Traktes zusammen setzen, sowie Leiomyome des Uterus (Heim et al., 1988; Turc-Carel et al., 1988; Vanni und Lecca, 1988), mesenchymale Muskeltumoren, die zu den häufigsten Tumoren der Frau gehören und in mehr als 30% aller Frauen über 30 Jahren auftreten (Norris und Zaloudek, 1992).
Diese chromosomalen Rearrangierungen führen häufig zu Fusionsgenen. Die am häufigsten zu beobachtenden Fusionsprodukte stellen die reziproken Fusionen zwischen dem HMGA2- und LPP-Gen dar. Diese Fusion wurde sowohl in Lipomen als auch in chondroiden Hamartomen der Lunge mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) gefunden (Petit et al., 1996; Rogalla et al., 1998), sowie die Fusion zwischen dem HMGA2- und RAD51L1-Gen in uterinen Leiomyomen mit einer t(12;14)(q14-15;q23-24) (Schoenmakers et al., 1995).
Neben diesen beiden prominenten Translokationen, wurde eine weitere Translokation t(12;13)(q14-15;q12-14) in einem Lipom detektiert, bei dem das
Fusionsgen HMGA2-LHFP entsteht (Petit et al., 1999). Der Frage nachgehend ob ein weiteres gemeinsames Fusionsgen in Lipomen und Hamartomen besteht, wurden in der vorliegenden Arbeit vier Hamartome mit einer t(12;13)(q14-15;q12-14)
untersucht, bei denen HMGA2-LHFP nicht nachgewiesen werden konnte.
Frühere Studien korrelierten die Genese verschiedener Tumorentitäten mit der Expression spezifischer HMGA2-Fusionsgene, bei denen die DNA-bindenden-Domänen (DBD’s) des HMGA2 mit funktionellen DNA-bindenden-Domänen anderer Gene
fusionierten. So wurde die Entstehung von Lipomen mit der Fusion der DBD’s mit den proteinbindenden LIM-Domänen des LPP korreliert (Ashar et al., 1995; Lovell-Badge 1995). Um die unterschiedliche Histologie zwischen Lipomen und
chondroiden Hamartomen der Lunge sowie deren histologische Heterogenität trotz gleicher zytogenetischer Veränderung, der t(3;12)(q27-28;q14-15) aufzuklären, wurden im ersten Schritt mögliche molekulare Variabilitäten des Fusionsgens
HMGA2-LPP untersucht. Auch in anderen Neoplasien fusionieren identische Gene in verschiedenen Tumorentitäten. Demnach wurde angenommen, dass variierende Bruchpunkte in beiden Genen und somit verschiedene Fusionsproteine den
Phänotyp des Tumors bestimmen. So konnte Melo (1996) postulieren, dass bei der Translokation t(9;22) der Bruchpunkt in den Fusionsgenen BCR und ABL mit den genauen klinischen und morphologischen Formen der chronischen myeloischen Leukämie (Ph+ CML) oder der akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) assoziiert werden kann.
Beim HMGA2-LPP Fusionsgen konnten Petit et al. (1996) bei der Analyse von neun Lipomen zeigen, dass das Fusionsgen nicht konstant identisch ist. So zeigten acht Lipome ein identisches Fusionsgen (Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des LPP-Gens), ein Lipom zeigte jedoch ein Fusionstranskript bestehend aus den Exons 1-3 vom HMGA2- und Exon 7-11 vom LPP-Gen.
In der vorliegenden Arbeit wurden 13 chondroide Hamartome der Lunge mit einer t(3;12)(q27-28;14-15) untersucht. Eine molekulargenetische Variabilität der
Fusionsgene konnte nicht nachgewiesen werden. Es zeigten sich bei allen 13 untersuchten chondroiden Hamartomen der Lunge die gleichen HMGA2-LPP Fusionstranskripte, bestehend aus Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des LPP-Gens, woraus sich folgern lässt, dass andere Faktoren für die histologischen Unterschiede verantwortlich sind.
In vitro und in vivo-Studien belegen, dass das tumorigene Potential der HMGA2-Transkripte eher auf die Reexpression der DNA-bindenden-Domänen als auf die Entstehung funktionell neuartiger Transkripte zurückzuführen ist. Versuche mit murinen NIH3T3-Zellen ergaben sowohl für eine 3’trunkierte HMGA2-Variante, die
nur die DNA-bindenden-Domänen kodiert, als auch für das HMGA2-LPP
Fusionstranskript das gleiche neoplastische Transformationspotential (Fedele et al., 1998). Darüber hinaus entwickelten transgene Mäuse, die die trunkierte HMGA2-Variante exprimierten, einen ‚giant’ Phänotyp mit stark ausgeprägter abdominaler Lipomatose, einhergehend mit einer außergewöhnlich hohen Prävalenz für Lipome (Battista et al., 1999; Arlotta et al., 2000). Dies weist darauf hin, dass für die
Adipogenese die Reexpression der DNA-bindenden-Domänen des HMGA2-Gens wesentlich ist, nicht aber die Expression von HMGA2-LPP Fusionstranskripten (Fedele et al., 2001). Die in der vorliegenden Arbeit nachgewiesenen
Expressionsmuster von HMGA2-LPP würden zwar die Genese der Lipome erklären, nicht aber die Heterogenität der chondroiden Hamartome, die lediglich aus 10% reifer Adipozyten bestehen.
In einem zweiten Schritt wurden Untersuchungen durchgeführt, die Aufschluss über die Relevanz des reziproken Fusionsgens LPP-HMGA2 in der histologischen
Variabilität von chondroiden Hamartomen der Lunge geben sollten.
Die LPP-HMGA2 Expressionsstudien zeigten in 8 von 11 chondroiden Hamartomen der Lunge mit einer t(3;12), die alle das HMGA2-LPP Fusionstranskript aufweisen, dass Fusionsgen LPP-HMGA2, bestehend aus Exon 1-8 vom LPP- und Exon 4-5 vom HMGA2-Gen. In einer Arbeit von Petit et al., (1996) wurde nur in einem von neun Lipomen mit einer t(3;12) das LPP-HMGA2 Fusionsgen nachgewiesen. Die Expression des HMGA2-LPP Transkripts in allen Lipomen und die Abwesenheit des LPP-HMGA2 Fusionsgens hatte zu der Annahme geführt, dass nur die HMGA2-LPP Fusion bzw. die DNA-bindenden-Domänen der trunkierten Form von HMGA2 von funktioneller Signifikanz sind. So kann dieses für Lipome angenommen werden, jedoch nicht für chondroide Hamartome der Lunge mit einer t(3;12).
Basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann geschlossen werden, dass neben der HMGA2-LPP Fusion das reziproke Fusionsgen LPP-HMGA2 bzw.
ein trunkiertes LPP-Gen in der Pathogenese von chondroiden Hamartomen
signifikant ist. Ein ähnlicher Mechanismus wurde bei uterinen Leiomyomen mit einer t(12;14) von Schoenmakers et al. (1999) beschrieben. Neben der Dysregulation von HMGA2 führt auch die Expression trunkierter oder aberranter RAD51L1 Proteine zu einem tumorspezifischen Merkmal.
Um den molekularen Hintergrund bzw. das Fehlen des LPP-HMGA2 Fusionsgens in Lipomen aufzuklären, wurde ein Lipom mit einer t(3;12)(q28-27;q14-15) näher
untersucht. Mittels RT-PCR konnte das HMGA2-LPP Fusionsgen, bestehend aus Exon 1-3 vom HMGA2 und Exon 9-11 vom LPP detektiert werden, welches klar einen Bruch im Intron 3 des HMGA2-Gens belegt, jedoch nicht das reziproke LPP-HMGA2. Basierend auf der Hypothese, dass das Fehlen von LPP-HMGA2 durch eine Deletion ausgelöst durch die Translokation erklärt werden könnte, wurden FISH-Analysen mit einer Vielzahl von Proben 3’ des HMGA2 Bruches durchgeführt.
Fehlende Signale auf dem (der) 3 Chromosom und der Vergleich mit der
genomischen Organisation vom HMGA2-Lokus (Schoenmakers et al., 1995) ergaben eine 170 kb große Deletion des Chromosoms 12.
Mit diesen Ergebnissen lässt sich auch das Fehlen des LPP-HMGA2 Transkripts in 8 von 9 Lipomen erklären (Petit et al., 1996).
Vergleichend wurden einfache Deletionen, die eine reziproke Translokation begleiten z.B. auch in chronischen myeloischen Leukämien mit einer t(9;22)(q34;q11)
(Popenoe et al., 1986) oder in follikulären Lymphomen mit einer t(14;18)(q32;q21) gefunden (Zelnetz et al., 1993).
Die Abwesenheit des Fusionsgens LPP-HMGA2 (Lemke et al., 2001) schließt nicht aus, dass Fusionstranskripte bestehend aus dem 5’ Part von LPP und anderen Sequenzen 3’ vom HMGA2 existieren und eine Rolle in der Tumorentstehung spielen. Die Hypothese, dass LPP in Fusion mit anderen Genen außer mit HMGA2 eine Rolle in der Tumorentstehung spielt wurde von Daheron et al. (2001) postuliert.
Hier wurde eine klonale t(3;11)(q28;q23) mit einer Fusion des LPP- und dem MLL-Gen in einer sekundären akuten Leukämie beschrieben. Ebenso konnten
Schoenmakers et al. (1999) nachweisen, dass neben der Dysregulation von HMGA2 ein knock out von Splicevarianten des RAD51L1-Gens in uterinen Leiomyomen mit einer t(12;14) ein tumorspezifisches Merkmal aufweisen. Auf diesen Hintergrund bezogen wurden 3’RACE-Experimente an dem Lipom mit einer 170 kb großen Deletion auf Chromosom 12 3’ des HMGA2-Gens durchgeführt (Lemke et al., 2001).
Das LPP-C12orf9 Fusionsgens, das dabei detektiert wurde codiert ein Protein bestehend aus der aminoterminalen Prolin-reichen Region von LPP und 28 AS vom C12orf9-Gen. Es stellt sich die Frage ob ein LPP-Fusionsgen oder ein trunkiertes LPP-Protein eine Rolle in der Tumorgenese spielt. Da das putative C12orf9-Gen
nicht in verschiedenen normalen Geweben exprimiert wird und nur aus 28 AS besteht, handelt es sich wahrscheinlich nicht um ein „echtes“ Gen, sondern wird nur als Resultat einer Deletion exprimiert und nur durch die Vereinigung mit LPP zu einem echten Gen. Es wird in der vorliegenden Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass die mögliche Rolle von LPP-Fusionsproteinen aus der aberranten Expression der Prolin-reichen-Region resultiert. Ähnliches zeigte sich bei dem Fusionsgen MLL-AF3p21 (Sano et al., 2000). So konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein
anderes LPP Fusionsgen außer das LPP-HMGA2 in einem mesenchymalen Tumor und das onkogene Potential von einem trunkierten LPP-Gen aufgeführt werden.
Da HMGA2-Mutationen eine verstärkte Proliferation mesenchymaler Zellen auslösen und ihren Differenzierungsgrad beeinflussen (Ashar et al., 1995), ist es vorstellbar, das die pathologische Heterogenität von chondroiden Hamartomen der Lunge sich durch eine Translokation t(3;12) in einer Stammzelle erklären lassen könnte.
Gewebespezifische Stammzellen kommen in allen adulten Organen vor. Sie besitzen das Potential zu proliferieren und sich in unterschiedlichste terminal differenzierte Zellen zu entwickeln (Zvaifler et al., 2000; Zuk et al., 2001). Sie sind daher
Ausgangspunkt von Geweberegeneration in den Geweben und Organen. Nach bisheriger Meinung haben sie je nach Lokalisation eine Entwicklung durchgemacht, die sie prädestiniert, einen gewebespezifischen Differenzierungsweg einzuschlagen.
So können mesenchymale Stammzellen (MSC) zu Chondrozyten, Adiopozyten, Osteoblasten, Fibroblasten und Myozyten werden. Diese Prägung - das so genannte Committment - determiniert die Zellen möglicherweise nicht unwiderruflich, so dass sie prinzipiell auch in Zellen differenzieren können, die nicht spezifisch dem
jeweiligen Gewebe zugeordnet werden können. In vitro können beispielsweise MSC auch in Zellen differenziert werden, die neuronale Charakteristika aufweisen. Derzeit wird zudem das Potential vieler unterschiedlich ausgereifter Zellen untersucht, trotz eines bereits deutlichen Phänotyps doch noch in eine Zellart anderer Provenienz umzudifferenzieren. Ebenfalls könnte angenommen werden, dass die Translokation eine Dedifferenzierung der bereits differenzierten Zellen bewirkt.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war, versteckte HMGA2- Aberrationen in zytogenetisch normalen chondroiden Hamartomen der Lunge zu detektieren.
Zytogenetische Analysen von Kurzzeit-Kulturen einer großen Serie benigner mesenchymaler Tumoren zeigten, dass in einer beträchtlichen Anzahl in Tumoren mit klonalen Veränderungen, zytogenetisch normale Zellen vorhanden sind (Mark et
al., 1990; Skreekantaiah et al., 1991; Kazmierczak et al., 1999). Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass sich chromosomale Rearrangierungen in der Folge von unbekannten primären submikroskopischen Veränderungen ereignen können. Augenscheinlich wurde diese Hypothese von Klonalitäts-Assays unterstrichen, durchgeführt mit DNA von Zellkulturen uteriner Leiomyome (Marshal et al., 1994; Xing et al., 1997). Als Resultat von Fällen mit Mosaiken, charakterisiert in Zellen mit klonalen karyotypischen Veränderungen und karyotypisch normalen Zellen, zeigte sich ein monoklonales Muster von Chromosom X Inaktivität. Diese Ergebnisse gelten für uterine Leiomyome, müssen aber nicht für andere Tumorentitäten wie z.B. für chondroide Hamartome der Lunge und Lipome gelten. Um die Rolle von Aberrationen mit der Involvierung von HMGA2 zu
verstehen, wurden Expressions- und FISH-Studien durchgeführt, um das Fusionsgen HMGA2-LPP in kleinen Populationen karyotypisch normaler Zellen zu detektieren.
Nur in 1 von 61 chondroiden Hamartomen der Lunge konnte das Fusionsgen HMGA2-LPP detektiert werden. In diesem Tumor zeigte sich eine versteckte Aberration, die mit zytogenetischen Methoden nicht detektierbar war.
Somit konnte in einer Serie von 61 chondroiden Hamartomen der Lunge mit
normalem Karyotyp kein Beweis für die Existenz kleiner Subpopulationen von Zellen mit einer HMGA2-LPP-Fusion gefunden werden. Vorausgesetzt, dass es sich um ein Ereignis sekundärer Natur handelt, würde das Vorkommen dieses Fusionsgens in einer Subpopulation in einer beträchtlichen Anzahl von Tumoren erwartet werden.
Die Ergebnisse erlauben aber den Schluss, dass die t(3;12)(q27-28;q14-15) in
chondroiden Hamartomen der Lunge ein primäres Ereignis ist. So konnte zum ersten Mal gezeigt werden, das das HMGA2-LPP-Fusionsgen nicht in kleinen Populationen von karyotypisch normalen chondroiden Hamartomen der Lunge exprimiert wird und stark auf einen primären Vorgang chromosomaler Aberrationen hinweist. Ebenso schließt das primäre Vorkommen der t(3;12) nicht aus, dass diese Translokation per se nicht ausreichend ist, um ein chondroides Hamartom der Lunge zu induzieren, sobald es in einer einzigen Zelle vorkommt.
Trotz der entscheidenden Rolle von HMG-Proteinen in der Pathogenese von mesenchymalen Tumoren wie Lipomen, Hamartomen der Lunge und uterinen Leiomyomen sowie anderen Erkrankungen wie z.B. Lipomatose oder Adipositas, wurden bisher keine Analysen im Hinblick auf individuelle genetische Variabilitäten durchgeführt, die genetische Dispositionen erkennen lassen.
Keimbahnmutationen des HMGA2-Gens zeigten im Phänotyp eine Disposition zum Groß- oder Kleinwuchs und zur Lipomatose (Zhou et al., 1995, Battista et al., 1999;
Arlotta et al., 2000).
Der Phänotyp eines 8 Jahre alten Jungen mit einer perizentrischen Inversion auf Chromosom 12, inv(12)(p11.22;q14.3), zeigt ein übermäßiges Wachstum und Lipomatose (Ligon et al., 2005).
Ein Dinukleotid-Repeat im HMGA2 Promoter wurde von Ishwad et al. (1997)
identifiziert. Dieser Polymorphismus besteht aus 18-37 Kopien eines (CT)-Repeats mit einer beobachteten Heterogenität in 82-83% bei Afroamerikanern und
Kaukasiern. Das dieses polymorphe Dinukleotid Repeat im HMGA2 Promoter einen entscheidenden Einfluss auf dessen Expressionsaktivität ausübt, wobei die
Promoteraktivität von der Länge des Repeats abhängig ist, konnte von Borrmann et al. (2003) nachgewiesen werden. Durch die in dieser Arbeit durchgeführte
Sequenzierung des ORF vom HMGA2-Gen, konnte in 174 Allelen nur eine
Sequenzveränderung mit einem Aminosäure-Austausch detektiert werden. Dieses Ergebnis lässt zum einen den Schluss zu, das Sequenzvariationen des HMGA2-Gens bei der Tumorgenese insbesondere bei der Genese von uterinen Leiomyomen sich auf Grund eines bisher unbekannten Ereignisses, beispielsweise einer
Virusinfektion (Bullerdiek, 1999) vollzieht.
Zum anderen wird dadurch verdeutlicht, dass es sich um ein hoch konserviertes Gen handelt was durch die Untersuchungen von Manfioletti et al. (1991); Zhou et al.
(1996) und Kazmierzcak et al. (1998b) unterstützt wird. Um eine individuelle genetische Disposition z.B. in der familiären Lipomatose oder Adipositas auszuschließen oder ob erkrankte Gewebe durch spezifische
Sequenzveränderungen zu charakterisieren sind, bedarf es weiterer Analysen.
Die Relevanz und Rolle des HMGA2-Gens sowie dessen Fusionspartner in der Tumorgenese wurden in den vorliegenden Untersuchungen verdeutlicht. Es konnte gezeigt werden, dass bei somatischen Mutationen dem reziproken LPP-HMGA2 neben dem HMGA2-LPP Fusionsgen in chondroiden Hamartomen der Lunge eine pathologische Signifikanz zukommt. Veränderungen des HMGA2-Gens konnten als primäres Ereignis in der Tumorgenese von chondroiden Hamartomen der Lunge nachgewiesen werden. Erstmals konnte ein neues LPP-Fusionsgen in einem
mesenchymalen Tumor und das onkogene Potential von einem trunkierten LPP-Gen
aufgeführt werden. Keimbahnmutationen, die das HMGA2-Gen betreffen und eine sich daraus resultierende individuelle genetische Prädisposition in der Tumorgenese benigner Neoplasien konnten in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden.
Weiterführende Studien zur Relevanz und Rolle des HMGA2-Gens als
pathogenetische Ursache für die Genese von Neoplasien beständen in zyto- und molekulargenetischen Untersuchungen, wie z.B. Bruchpunktklonierungen,
Expressionsstudien bei Tumoren mit Veränderungen in der chromosomalen Region 12q14-15 und weitere Sequenzanalysen.