Aus dem Institut für Pathologie
Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. Moll des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
in Zusammenarbeit mit dem Klinikum Kassel
Mikrosatelliteninstabilität und
Mismatch-Repairgenexpression in Adenomen bei
erblichen Dickdarmkarzinom (HNPCC)
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der gesamten Humanmedizin in dem Fachbereich
Medizin der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von Carmen Beckmann
aus Hamburg
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am: 08.04.2008
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.
Dekan: Prof. Dr. Rothmund
Referent: Prof. Dr. Rüschoff
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis... 3
Inhaltsverzeichnis... 3
Abkürzungsverzeichnis...5
Abkürzungsverzeichnis...5
Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung...6
Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung...6
1.1 Epidemiologie Tumorerkrankungen... 6
1.2 Epidemiologie gastrointestinaler Tumore... 6
1.3 Erblichkeit gastrointestinaler Tumore...7
1.3.1 sporadische vs. genetisch determinierte gastrointestinale Tumore... 7
1.3.2 Klassifikation genetisch determinierter gastrointestinaler Tumore... 7
1.3.3 Arten der vererbten gastrointestinalen Tumore... 7
1.4 Hereditäres non-polypöses Kolonkarzinoms (HNPCC)... 8
1.4.1 Definition... 8
1.4.2 Diagnosekriterien des HNPCC... 8
1.4.3 Pathogenese des HNPCC-Syndroms... 10
1.4.4 Pathohistologie des HNPCC... 13
1.4.5 Adenome beim HNPCC...14
1.5 Fragestellung... 16
Kapitel 2 Material und Methoden...18
Kapitel 2 Material und Methoden...18
2.1 Material... 18
2.2 Methoden...18
2.2.1 Mikrosatellitenanalyse... 18
2.2.2 (Laser-) Mikrodissektion ...21
2.2.3 Immunhistochemische Darstellung der Proteine MLH1-, MSH2-, MSH6- und PMS2... 22 2.2.3.1 Methode... 22 2.2.3.2 Reagenzien...22 2.2.3.3 Lösungen...22 2.2.3.4 Vorbehandlung... 23 2.2.3.5 Färbevorgang... 23 2.2.3.6 Auswertungskriterien...24 Kapitel 3 Ergebnisse...26 Kapitel 3 Ergebnisse...26 3.1 Allgemeine Daten...26 3.2 Adenomhäufigkeit...26
3.3 Histologie der Adenome... 29
3.4 Mikrosatellitenstatus der Adenome im Vergleich zu den Karzinomen... 29
3.5 MMR Proteinexpression der Adenome...32
3.6 Immunhistochemie der Adenome im Vergleich zu den Karzinomen...33
3.7 Lokalisation der Adenome... 35
3.8 Zeitliche Zusammenhänge... 37
3.9 Lokalisation Adenome zu ihren Karzinomen... 38
Kapitel 4 Diskussion... 39
4.1 Allgemeine Daten...39
4.2 Mutationsanalysen...39
4.3 Tumorentstehung unter dem Einfluss der MMR - Gene...39
4.4 Adenome und HNPCC...40
4.5 Immunhistochemische Untersuchungen des Mikrosatellitenstatus... 40
4.5.1 Aufbau von Mikrosatelliten... 40
4.5.2 Mikrosatelliten(in)stabilität bei HNPCC-Patienten... 40
4.6 Grundlage jeder HNPCC – Diagnostik: Die Anamnese... 41
4.7 Ziele der Arbeit... 41
4.8 Zeitliche Zusammenhänge zwischen Adenomen und Karzinomen... 42
4.9 Mikrosatellitenstabilität in Adenomen und Karzinomen... 42
4.10 Immunhistochemische Zusammenhänge zwischen Adenomen und Karzinomen ... 42
4.11 Lokalisationen von Adenomen und Karzinomen...43
4.12 Zusammenfassung und Schlußfolgerungen... 44
Kapitel 5 Zusammenfassung ... 45
Kapitel 5 Zusammenfassung ... 45
Chapter 6 Summary ... 47
Chapter 6 Summary ... 47
Kapitel 7 Literatur und Abbildungsnachweis... 49
Kapitel 7 Literatur und Abbildungsnachweis... 49
Kapitel 8 Anhang I (Gensequenzen)... 53
Kapitel 8 Anhang I (Gensequenzen)... 53
8.1 MSH2... 53
8.2 MSH6... 54
8.3 MLH1...55
8.4 PMS2...56
Kapitel 9 Anhang II...58
9.1 Tabellarischer Lebenslauf... 58
9.2 Verzeichnis der akademischen Lehrer... 59
9.3 Danksagung...61
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Bedeutung
APC-Gen Adenomatosis Polyposis Coli -Gen
CA Kalifornien
CE Kolektomie
CRC Kolorektales Karzinom
DNA Desoxyribonukleinsäure
E. coli Escherichia coli (Darmbakterium)
EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid
FAP familiäre adenomatöse Polyposis
GI-Trakt Gastrointestinal-Trakt
HE - Färbung Hämatoxilin – Eosin - Färbung
HNPCC hereditäres non-polypöses Kolonkarzinom
ICG International Cancer Group
IGFRIIR Insulin-like growth factor receptor II
hMLH humanes MutL Homolog
MMR Mismatch Reparaturgene
hMSH humanes MutS Homolog
MSI Mikrosatelliteninstabilität
MSI-H hochgradige (high) Mikrosatelliteninstabilität MSI-L geringgradige (low) Mikrosatelliteninstabilität
MSS Mikrosatellitenstabilität
NIH national institute of health
PBS Phosphate buffered saline
PCR Polymerasekettenreaktion
hPMS humanes postmeiotic segragation increased
PSA Prostataspezifisches Antigen
RT-PCR Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion
TGF Transforming growth factor
Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung
1.1 Epidemiologie Tumorerkrankungen
Seit Jahren gibt das statistische Bundesamt die Altersstruktur der deutschen Bevölkerung heraus, und daraus ist ersichtlich, daß die Bevölkerung eine steigende Lebenserwartung hat (Statistisches Bundesamt, 2005). Konform zu dieser Entwicklung steigen die Neuerkrankungen an Neoplasien stetig an. Die Todesursachenstatistik für das Jahr 2004 zeigt die Mortalität an Malignomen an zweiter Stelle (Statistisches Bundesamt, 2005). Dieser Trend ist zum einen zurückzuführen auf die gestiegene Lebenserwartung, zum anderen aber auch auf den Lebensstandard, wie Ernährungs- und Bewegungsweise und nicht zuletzt spielt auch der medizinische Fortschritt eine bedeutende Rolle in dieser Entwicklung, da das Auftreten vieler Neoplasien mit zunehmendem Alter ansteigt.
1.2 Epidemiologie gastrointestinaler Tumore
Bezogen auf die Häufigkeit stehen Malignome des Gastrointestinaltrakts an zweiter Stelle, gleich hinter den Malignomen des Bronchialsystems (Statistisches Bundesamt 2005).
Im Gastrointestinalsystem ist das Kolon am häufigsten von Tumoren befallen (34%), gefolgt vom Magen mit 22% und dem Rektum mit 18% (Abb. 1). Dies macht in der Summe mit 64% weit mehr als die Hälfte aller gastrointestinalen Tumore aus.
Abb.1.1 Inzidenz gastrointestinaler Tumorerkrankungen (Prozent Neuerkrankungen/Jahr)
Kolon 34% Leber5% Ösophagus 4% Gallenblase 6% Magen 22% Pankreas 11% Rektum 18%
1.3 Erblichkeit gastrointestinaler Tumore
1.3.1 sporadische vs. genetisch determinierte gastrointestinale Tumore
Die Tumore des Gastrointestinaltraktes lassen sich in sporadische und genetisch determinierte einteilen. Unter den sporadischen Tumoren des
Gastrointestinaltraktes versteht man Tumore, die ohne genetische Vorbelastung, entstehen. Mit rund 65% sind diese Tumoren zwar in der Mehrzahl, dies
bedeutet aber auch, dass bei 35% der Patienten, die an einem
gastrointestinalen Tumor erkranken, eine genetische Belastung vorliegt, die unterschiedlich ausgeprägt ist (Rüschoff et al.. 2004).
1.3.2 Klassifikation genetisch determinierter gastrointestinaler Tumore
Betrachtet man nur die Patienten, die durch eine genetische Prädisposition an einem gastrointestinalen Tumor erkrankt sind, so fällt auf, dass der
überwiegende Teil, rund 90%, eine polygene Vererbung aufweist. Polygene Vererbung bedeutet, dass sich diese Tumore nicht auf eine Genveränderung zurückführen lassen und dass in der Regel auch Faktoren wie Lebensweise die Manifestation eines Karzinoms mit beeinflussen.
Etwa 10% werden monogen vererbt, d.h. sie lassen sich auf eine Mutation in einem bestimmten Gen zurückführen. Dabei zeichnen sich Betroffene durch eine hohe z.T. bis 100%ige Penetranz (Manifestation weitgehend unabhängig von Umweltfaktoren) aus (Rüschoff et al.. 2004). Während die genetischen
Grundlagen bei letzteren Formen relativ gut aufgeklärt sind, ist dies bei den polygenetischen Formen noch weitgehend ungeklärt.
Unabhängig davon kommt der Familienanamnese eine zentrale Rolle bei der Aufdeckung von Tumorhäufungen und möglicherweise einer erblichen Belastung zu.
1.3.3 Arten der vererbten gastrointestinalen Tumore
So auch bei dem hereditären nicht – polypösen Kolonkarzinom (HNPCC). Auch wenn in den letzten Jahren die ursprünglich angenommene Inzidenz von 5% auf zwischen 2 und 4% korrigiert wurde, stellt dieses den größten Anteil des
erblichen Dickdarmkrebses dar, gefolgt von der familiären adenomatösen
Polyposis (FAP), die mit bis 2% die zweithäufigste vererbte Karzinomerkrankung des Gastrointestinaltraktes ist ( Rüschoff et al.. 2004) (Abb. 2).
Im Unterschied zum HNPCC ist die FAP gekennzeichnet durch das Auftreten hunderter von Adenomen im Kolon. Der Erkrankungsbeginn liegt schon im Kindesalter, so daß bei Koloskopien bis zu hundert Adenome gleichzeitig gefunden werden können. Diese Blickdiagnose ermöglicht ein frühes Einschließen von Patienten und deren Angehörige in effektive
Vorsorgeprogramme. Die Krankheit ist begründet in einem Defekt des APC-Gens und führt letztendlich zur Entartung der multiplen Adenome (Friedl W 2002).
Abb. 1.2: Häufigkeit der vererbaren Kolonkarzinome in Prozent
1.4 Hereditäres non-polypöses Kolonkarzinoms (HNPCC) 1.4.1 Definition
Erstmalig wurde das HNPCC - Syndrom im Jahr 1913 von Warthin beschrieben. Aldred Warthin war Pathologe an der Universität von Michigan in Ann Arbor (USA). Angeregt durch die Aussage seiner Schneiderin, sie werde an Unterleibs- oder Darmkrebs sterben, untersuchte er schon seit 1895 diese Familie. Seine Schneiderin sollte Recht behalten, sie verstarb in jungen Jahren an einem Endometriumkarzinom. Warthin veröffentlichte erstmals seine
Unter-suchungsergebnisse in seiner Publikation als Familie G (Warthin, 1913). Auffällig an dieser Familie waren das gehäufte Auftreten von Tumoren im Bereich des Magen-Darm- und Urogenitaltraktes, sowie das junge Erkrankungsalter der Familienmitglieder. Warthin versuchte, in seinen Untersuchungen eine Verbin-dung zwischen Krebserkrankung und familiärer Prädisposition zu finden. Seit Warthins Veröffentlichung 1913 haben verschiedene Autoren sich mit dieser Familie G beschäftigt und deren Stammbaum ergänzt. So auch Lynch, der in einem follow – up 1966 nochmals diese Familie untersuchte (Lynch et al.., 1966) und das Lynch – Warthin – Syndrom definierte, heute auch als HNPCC benannt. 1991 wurde von der "International Collaborative Group on Hereditary Non– Polyposis Colorectal Cancer" die Amsterdam-Kriterien I festgelegt (Vasen et al.., 1991). Diese ermöglichen eine Diagnosestellung des HNPCC nach
anamnestischen und klinischen Angaben (Tab. 1). Später zeigte sich, daß die Amsterdam-Kriterien I nicht ausreichend sind, da häufig bei Patienten mit HNPCC extraintestinale Tumore auftreten. In einer erweiterten Definition, den Amsterdam-Kriterien II (Vasen et al.., 1999), werden diese Tumore mit
eingeschlossen.
1.4.2 Diagnosekriterien des HNPCC
Die Diagnose eines HNPCC Syndroms basiert auf den sog. Amsterdam I und II Kriterien (Tab. 1). Polygen 93% Hamartomatöse Polypöse Tumorsyndr. 1% FAP 2% HNPCC 4%
Amsterdam I Kriterien
Mindestens drei Personen in einer Familie mit kolorektalem Karzinom und Erfüllung aller folgenden Kriterien:
• Einer der drei Patienten ist ein Verwandter 1. Grades der beiden anderen Erkrankten.
• Mindestens zwei aufeinanderfolgende Generationen sind betroffen.
• Mindestens ein Betroffener ist jünger als 50 Jahre bei Karzinommanifestation.
• Ausschluß einer familiären adenomatösen Polyposis und
• Tumoren sind histopathologisch verifiziert.
Amsterdam II Kriterien
Mindestens drei Personen in einer Familie mit einem HNPCC-assoziierten Tumor und Erfüllung aller folgenden Kriterien, wobei neben kolorektalen
Karzinomen auch extrakolische Malignome wie Karzinome des Endometriums, des Dünndarms und der ableitenden Harnwege oder des Nierenbeckens gleichwertig berücksichtigt werden:
• Einer der 3 Patienten ist ein Verwandter 1. Grades der beiden anderen Erkrankten.
• Mindestens 2 aufeinander folgende Generationen sind betroffen.
• Mindestens ein Betroffener ist jünger als 50 Jahre bei Karzinommanifestation.
• Ausschluß einer familiären adenomatösen Polyposis und
• Tumoren sind histopathologisch verifiziert.
Tab. 1 Amsterdam-Kriterien zur Diagnose des HNPCC Syndroms
Mit Aufklärung der molekulargenetischen Grundlagen des HNPCC Syndroms kann die Diagnose nicht nur klinisch - anamnestisch sondern auch mittels Nachweis einer Mutation in den heute bekannten Genen (Keimbahnanalyse) nachgewiesen werden (Die genauen Gene und Mutationsloci werden in Kapitel 1.3 beschrieben). Da sich die Mutatationsanalyse allein kostenbedingt nicht zum Screening eignet, ist es notwendig die Risikopatienten, bei denen eine
Keimbahnanalyse sinnvoll ist, vorab zu selektieren. Dazu wurden 1994 die so genannten Bethesda – Kriterien eingeführt (Rodriguez – Bigas et al., 1997). Diese wurden inzwischen anläßlich eines weiteren Expertentreffens in Bethesda überarbeitet (Tab.2). Hiermit wird festgelegt, von welchen Patienten
Tumorproben auf Mikrosatelliteninstabilität geprüft werden sollten, womit dann die Indikation zur Keimbahnanalyse auf einen HNPCC typischen Gendefekt gestellt werden kann.
Bethesda Kriterien
• Patienten, die die Amsterdam – Kriterien I/II erfüllen
• Patienten mit synchronen / metachronen Tumoren aus dem HNPCC – Spektrum
• Patienten mit kolorektalem Karzinom und Verwandte 1. Grades mit Karzinom aus dem HNPCC – Spektrum vor dem 45. Lebensjahr oder mit kolorektalem Adenom vor dem 45. Lebensjahr
• Patienten mit kolorektalem Karzinom oder Endometriumkarzinom vor dem 45. Lebensjahr
• Patienten mit rechtsseitigem, wenig differenziertem kolorektalem Karzinom vor dem 45. Lebensjahr
• Patienten mit kolorektalem Karzinom vom Siegelringzelltyp vor dem 45. Lebensjahr
• Patienten mit kolorektalem Adenom vor dem 45. Lebensjahr
a Karzinome des Endometriums, der Ovarien, des Magens, hepatobiliären Systems, Dünndarms Tab. 2 Aktualisierte Bethesda Kriterien:
1.4.3 Pathogenese des HNPCC-Syndroms
Bei dem HNPCC - Syndrom handelt es sich um eine autosomal - dominant ver-erbte Erkrankung. Aufgrund einer Keimbahnmutation kommt es zu einem Funk-tionsverlust in einem der Mismatch Repairgene (MMR). Bis heute sind 6 MMR-Gene (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, PMS1, MLH3) bekannt, von denen die vier Erstgenannten ursächlich dem HNPCC Syndrom zugrunde liegen. Dabei sind in nahezu 90% der Fälle die Gene MLH1 oder MSH2 betroffen. Fehler, die in der Replikation der DNA in Form von Basenfehlpaarungen und Leserasterwechsel auftreten, werden vom MMR-System erkannt, ausgeschnitten und repariert. In E. coli sind im MMR-System drei Gene beteiligt: MutS, MutL und MutH (Lahue et al.., 1989). Das MutS Protein erkennt als Homodimer Basenfehlpaarungen und bindet an diesen, so daß sie als "loop" aus dem neu synthetisierten Strang herausragen.
In Verbindung mit MutL aktiviert MutS MutH, welche zusammen den Strang mar-kieren, so daß Exonukleasen das fehlerhafte DNA-Segment herausschneiden und die DNA Polymerase zusammen mit der DNA Ligase die so entstandene Lücke ergänzen (Mara und Schär, 1999).
In Eukaryonten gibt es im Wesentlichen zwei Unterschiede zum E. coli Modell: Zum einen wird das MMR-System lediglich durch Strang-Diskontinuitäten an die zu reparierende Stelle gelenkt und nicht wie bei E. coli über hemimethylierte Basenpaare. Daraus folgend wurden auch keine MutH-Analoga in Eukaryonten gefunden. Zum anderen sind die MutS und MutL Homologe nicht Homodimere wie in E. coli, sondern als Heterodimere tätig. Es finden sich mindestens sechs
MutS Homologe und fünf MutL Homologe, die als MSH und MLH bezeichnet
werden. MSH2-MSH6 Heterodimere erkennen und reparieren Basenpaar-fehlbildungen und "loops" bis zu zwei Basenpaaren, wo hingegen MSH2-MSH3 Heterodimere Basenfehlbildungen verschiedener Größe reparieren (Luiz et al.., 2003). In Abb. 3 ist ein Schema dieses Reparationsvorganges dargestellt.
Abb. 3 Mismatchrepair
Das MMR - System ist speziell für Reparaturen in so genannten Basenrepeats zuständig. Zu einem endgültigen Ausfall des MMR - Systems und damit zu einer Tumor-Entstehung, muss zum ererbten Ausfall des einen Allels eine zufällige somatische Mutation zum Ausfall des anderen Allels führen, entsprechend der "two hit"- Hypothese von Knudson (Knudson, 1971).
Die durch Mutation des MMR - Systems entstandene Mikrosatelliten - Instabilität (MSI) ist ein wichtiges Diagnosekriterium für ein HNPCC. Mikrosatelliten sind repetetive DNA-Sequenzen mit einer Sequenzlänge bis zu 6 Basen.
Mikrosatelliten - DNA ist am häufigsten in Introns lokalisiert, allerdings gibt es auch codierende Abschnitte der menschlichen DNA, die Mikrosatelliten enthalten. Die vom National Cancer Institute Workshop und den International Cancer Group (ICG) – HNPCC (Boland et al.., 1998; Umar et al.., 2004) international veröffentlichten Mikrosatelliten - Loci, BAT25, BAT26, D5S346, D2S123, D17S250, sind bei Instabilität ein molekularbiologischer Anhalt für ein HNPCC - Syndrom. Für den molekularbiologischen Verdacht eines HNPCC sollten nach den Empfehlungen des National Institute of Health (NIH) zwei dieser fünf Mikrosatelliten instabil sein, also eine hochgradige MSI bestehen (MSI – H). Im Gegensatz dazu treten Mikrosatelliten-Instabilitäten (MSI) bei den
sporadischen Formen erst in späteren Tumorstadien auf. Eine MSI kann auch bei Tumoren ohne Störung des MMR - Systems auftreten, die Ausprägung ist dann allerdings deutlich geringer, so daß man zur Unterscheidung dort von einem Tumor mit leichter MSI (MSI – L) spricht. Zusätzlich gibt es noch die Möglichkeit Tumoren mit einem stabilen Mikrosatellitensystem zu haben, diese Tumore werden als MSS bezeichnet.
Wie sporadische CRC entstehen HNPCC - assoziierte Tumore in der so genannten Dysplasie - Adenom - Karzinom - Sequenz. Dabei spielt ein
schrittweiser Verlust von wachstumsbegrenzenden Faktoren eine wichtige Rolle (Vogelstein, 1988).
neu synthetisierter Strang
MutS mismatc h MutH M utH Neusynthes e
Bei HNPCC assoziierten CRC sind vor allem BAX, TGFβRII (transforming groth factor – β receptor II), IGFRIIR (insulin – like growth factor receptor II) , sowie
MSH3 betroffen. In geringerer Häufigkeit treten Mutationen in den Genen c – K – ras und p53 auf. Bei sporadischen CRC sind im wesentlichen APC, K – ras und p53 mutiert. Bei sporadischen CRC kommt es mit zunehmender Akkumulation
von genetischen Schäden zum Verlust eines Allels und Mutation des anderen Allels, also zur Akkumulation grober genetischer Schäden, die nicht selten mit Verlusten und/oder Zugewinnen ganzer Chromosomen und
Chromosomenteilstücke mit Ausbildung einer Aneuploidie führen können. Im Gegensatz dazu betreffen die Mutationen bei MSI-H Tumoren nur kleine DNA Sequenzabschnitte, so dass diese Tumoren häufiger einen diploiden
Chromosomensatz aufweisen (Perucho M, 1996).
Sind beide Genallele eines Reparaturgens ausgeschaltet, lässt sich dies in den meisten Fällen immunhistochemisch als fehlende Expression im Tumorgewebe erfassen. In etwa 70-80% der HNPCC - Fälle ist ein solcher
Genexpressionsausfall vor allem in den Genen MSH2 oder MLH1 nachweisbar. Dabei konnte gezeigt werden, dass ein Ausfall von MSH2 in der Regel von einer verminderten Expression von MSH6 begleitet ist. Analog ist eine verminderte Expression von PMS2 bei einem Ausfall von MLH1 zu erwarten (Rüschoff et al. 2006).
Als Beispiel für HNPCC-assoziierte Gene sei hier MSH2 beschrieben. Bisher entdeckte Mutationen liegen größtenteils im codierenden Bereich des Gens. Das Gen ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 2 lokalisiert und besteht aus
insgesamt 16 Exons mit 2804 Basenpaaren. Das Genprodukt besteht aus 935 Aminosäuren, das ungefähr in der Mitte des Proteins eine DNA Bindungsdomäne und am C-Peptid lokalisierte ATP-ase Aktivität besitzt. Die genauen
Basensequenzen der Gene MSH2 und MSH6, sowie MLH1 und PMS2 sind in Abb. I bis IV (s. Anhang) beschrieben.
Da die im Anschluß beschriebenen pathohistologischen und makroskopischen Aspekte der Tumore nicht ausreichen, um mit Sicherheit die Diagnose eines HNPCC zu stellen, wird bei einem entsprechendem Verdacht (Amsterdam- und Bethesda- Kriterien) eine molekulargenetische Untersuchung angestrebt. Zunächst wird eine Untersuchung zur Analyse des Expressionsverlustes von
MSH2, MLH1, MSH6 und PMS2 empfohlen (Rüschoff et al. 2004). Diese wird
routinemäßig mit entsprechenden Antikörpern und den entsprechenden
Färbungen durchgeführt. Der definitive Nachweis einer Keimbahnmutation erfolgt somit nach immunhistochemischer Charakterisierung der entsprechenden Gene. Hierbei empfiehlt es sich, das Gen auf eine Mutation hin zu untersuchen, das in der immunhistochemischen Färbung einen Verlust der Expression des Proteins gezeigt hat. Da bis zum heutigen Tage keine bevorzugten Mutationsorte ("hot-spots") der betroffenen Gene bekannt sind, muß jeweils das gesamte Gen analysiert und sequenziert werden (Peltomäki et al., 1997). Daraus resultiert ein aufwendiges "Screening"-Verfahren für die alltägliche Praxis. Ein weiteres Problem des Nachweises einer Keimbahnmutation besteht in der geringen eindeutigen Mutationsnachweisrate von 50-60% bei den durch die Amsterdam-Kriterien anamnestisch definierten HNPCC-Erkrankten (Park et al.., 2002).
1.4.4 Pathohistologie des HNPCC
HNPCC-Tumore zeigen histologisch ein zu den sporadisch auftretenden
Tumorformen differentes Bild. Sporadische Tumoren sind in der Regel eher nicht muzinös und aneuploid, wohingegen HNPCC assoziierte Tumoren muzinös / solid erscheinen und euploid sind. (Rüschoff et al.., 1998).
Als häufiges Merkmal ist eine sogenannte Siegelringzellform zu verzeichnen, die durch eine verstärkte Schleimproduktion der Zelle und konsekutiver Verdrängung des Zellkernes entsteht. Weiterhin konnten Jass et al.. (Jass et al., 1998) zeigen, daß ein signifikant höherer Anteil an HNPCC-Tumoren eine sogenannte
"CROHN´s like lesion", also eine lymphozytäre Infiltration in den Randzonen des Tumors beinhaltet (Abb. 9). Als letztes histologisch auffälliges Merkmal ist eine zunehmende Dedifferenzierung des Tumors zu vermerken (Abb. 10).
Abb.10 Beispiel für eine zunehmende Dedifferenzierung (solid medulläres Karzinom, PAS)
1.4.5 Adenome beim HNPCC
War man zu Beginn der Erforschung des HNPCC-Syndroms noch der Meinung, daß das Auftreten von Adenomen ein sehr seltenes Ereignis ist, so ist man heute eher der Ansicht, daß die Häufigkeit von Adenomen bei dieser Erkrankung
zumindest denen der Allgemeinbevölkerung gleichzusetzen ist (Iino et al.., 2000). Im Gegensatz zum sporadischen CRC ist die Adenom-Karzinom-Sequenz
deutlich beschleunigt. Beträgt die Zeitspanne vom Auftreten des Adenoms bis zur Entstehung des Karzinoms bei sporadischen CRC in der Regel 8-10 Jahre, so haben im Vergleich hierzu Untersuchungen gezeigt, daß sich die Entartung der Adenome bei HNPCC-Patienten innerhalb von drei Jahren vollzieht (Lynch und Chapelle, 2003). Festzustellen ist, daß die Adenome bei HNPCC-Erkrankten deutlich im früheren Lebensalter auftreten, im Median bei 43,3 Jahren (De Jong et al.., 2004), als dies der Fall bei sporadischen CRC ist (Altersgipfel bei 65 Jahren). Auffällig ist dabei die fehlende Expression der MMR-Proteine in den meisten Adenomen (De Jong et al.., 2004). Dies ist ein guter Ansatzpunkt, um ein frühzeitiges Erkennen von HNPCC-Tumoren in der Vorsorge zu ermöglichen. Histopathologisch kann man bei Adenomen von HNPCC-Erkrankten zumeist eine höhergradige Dysplasie der Adenome finden, als es der Fall bei Adenomen von Patienten mit sporadischen Karzinomen ist (Lynch et al.., 1989; Mecklin und Jarvinen, 1986; Mecklin et al..,1986a; Muto et al..,1985). Zusätzlich sind diese Adenome größer und haben häufig eine tubulo-villöse Architektur (De Jong et
al.., 2004, Iino et al.., 2000). In Abbildung 11 ist ein Adenom eines Patienten mit sporadischen CRC, in Abbildung 12 ein Adenom eines HNPCC-Patienten
dargestellt.
Abb. 12 hochgradig dysplastisches Adenom
1.5 Fragestellung
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich Adenome als Untersuchungsmaterial für ein HNPCC - Screening eignen.
Adenome stellen die erste Stufe der Karzinomentstehung dar. Dabei ist die Adenom-Karzinom-Sequenz bei HNPCC - erkrankten Patienten zeitlich deutlich verkürzt. Aus diesem Grund war die Fragestellung dieser Arbeit, ob durch molekulargenetische Analyse in Form von Mikrosatelliteninstabilität und die immunhistochemische Färbung an Adenomen ein Hinweis auf HNPCC geben kann.
Im Umkehrschluss muss geklärt werden, ob ein MSS - Status automatisch ein Ausschluss eines HNPCC - Syndroms bedeuten kann, oder ob hier zusätzlich auch ein sporadisches Adenom aufgetreten sein kann.
Durch Untersuchung von syn- oder metachronen Adenomen bei gesicherten HNPCC - Patienten wurde, unter Zuhilfenahme von Lasermikrodissektion und immunhistochemischer Färbung, dieser Fragestellung Rechnung getragen. Die Beurteilung der Ergebnisse der Mikrosatellitenanalyse und immunhisto-chemischen Färbung soll zeigen, inwieweit es sich hierbei um verläßliche Unter-suchungsmethoden in der Praxis handelt, die zum Beispiel in Form eines
Screening-Verfahrens für Risiko-Patienten routinemäßig angewendet werden sollten.
Kapitel 2 Material und Methoden
2.1 Material
Das in dieser Arbeit verwendete Untersuchungsgut stellt Normalgewebe, Tumor-gewebe und AdenomTumor-gewebe aus dem Gastrointestinaltrakt dar. Die
Gewebeblöcke stammen aus der Pathologie des Klinikums Kassel, die im Rahmen der Verbundstudie zum erblichen Dickdarmkarzinom der Deutschen Krebshilfe gesammelt worden sind (Patienten- und Follow-up Details, s. Ergebnisteil).
An diesen Geweben wurden Mikrosatellitenanalysen, Lasermikrodissektion und immunhistochemische Analysen durchgeführt.
2.2 Methoden
2.2.1 Mikrosatellitenanalyse
Für die Mikrosatellitenanalyse wurde DNA aus Normal- und Tumor- bzw.
Adenomgewebe mit den vom National Cancer Institute Workshop und den ICG-HNPCC (Boland et al., 1998; Umar et al., 2004) empfohlenen und zuvor von Dietmaier et al. (1997) validierten 5 Primerpaaren untersucht. Hierbei handelte es sich um die folgenden Mikrosatellitenloci: zwei Mononukleotidrepeats (BAT 25, BAT 26) und drei Dinukleotidrepeats (D2S123, D5S346, D17S250).
Zusätzlich wurde bei der Lasermikrodissektion der Locus BAT40 untersucht. Die Normal - DNA stammte entweder aus unauffälliger Darmmucosa, die an den Tumor grenzte, oder aus isolierter DNA aus dem Blut des jeweiligen Patienten. Aus den Paraffingewebeblöcken wurden mehrere 5 µm dicke Gewebeschnitte angefertigt. Hiervon wurde ein Schnitt mittels Hämatoxylin - Eosin (HE) gefärbt und vier Schnitte für die immunhistochemische Analyse verwandt.
Weitere 5 µm dicke Schnitte von in Paraffin eingebetteten Karzinom-, Adenom und angrenzendes Normalgewebe wurden auf Objektträger gezogen.
Zur Entparaffinisierung werden die Objektträger ca. 20 Minuten bei 80° C im Wärmeschrank inkubiert. Durch eine absteigende Xylol/Ethanolreihe wird das verflüssigte Paraffin aus dem Gewebe entfernt. Dies geschieht, indem die Schnitte nach 10- und 5-minütiger Inkubation in 100% Xylol für jeweils eine Minute in 100%, 96%, 80%, 70% und 70% Ethanollösung überführt werden. Im Anschluß werden sie kurz mit destilliertem Wasser gespült.
Mit Hilfe des korrespondierenden HE-Präparates wurden die Tumorareale mit einer sterilen Skalpellklinge vom Objektträger gekratzt und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß gegeben, das zuvor mit 100 µl Lysepuffer beschickt wurde. Danach wurde zur Gewinnung der Gesamt-DNA das High Pure PCR Template Preparation Kit der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim) verwendet. Die einzelnen Komponenten des Kits mit ihrer Zusammensetzung und Funktion ist in Tabelle 1 aufgeführt. Nach Zugabe von 200 µl tissue lysis buffer und 40 µl
Proteinase K und kurzem Durchmischen wurden die Ansätze bei 50° C und kontinuierlichem Schütteln auf einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) über Nacht inkubiert.
Am nächsten Tag wurden pro Ansatz 200 µl Binding buffer pipettiert und diese für 10 Minuten bei 72° C inkubiert. Es folgte durch die Zugabe von 100 µl
Isopropanol die Aufreinigung der DNA. Die Lysate wurden nachfolgend in ein mit einem Filtervlies versehenes filter tube gegeben und bei 6800 g eine Minute zentrifugiert (Eppendorf Tischzentrifuge 5810 R, Hamburg). Anschließend wurden die Gefäße mit 500 µl Waschpuffer versetzt und nochmals bei 6800 g zentrifugiert. Dieser Schritt wurde zweimal durchgeführt.
Nach Leerung des Auffanggefäßes erfolgte ein erneutes Zentrifugieren für 10 Sekunden bei 18000 g. Nun wurde das filter tube in ein frisches Reagiergefäß eingesetzt und mit 100 µl elution buffer versetzt. Der elution buffer wurde zuvor auf 72° C erwärmt. Es schloß sich eine erneute Zentrifugation bei 6800 g für eine Minute an. Das gewonne Eluat entspricht der gereinigten DNA. Die gereinigte DNA konnte nun weiterverarbeitet werden oder bei 4° C bzw. –20° C gelagert werden.
Für die weitere Verarbeitung der gereinigten DNA wurde das HNPCC Micro-satellite Instability Test-Kit der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim) verwendet. Hierfür wurde zu einem auf Eis stehenden 0,5 ml Reaktiongefäß 10 µl steriles H2O (PCR grade) hinzugegeben. Anschließend wurden 4 µl Multi-Primer Mix (5fach konzentriert), dann 4 µl Enzyme Master Mix (5fach
konzentriert) und zum Abschluß 2 µl Tumor-, Adenom- bzw. Normal-DNA
hinzupipettiert. Es folgte das Vermischen (Vortex) und das anschließende kurze Zentrifugieren der Reaktionsansätze. Nun wurden die Gefäße im Thermocycler plaziert und die Polymerasenkettenreaktion (PCR) gestartet.
Bei der PCR handelt es sich um ein automatisiertes, enzymatisches Verfahren zur exponentiellen Vermehrung spezifischer DNA-Sequenzen. Diese wurde nach einem modifizierten Originalprotokoll (Saiki et al., 1988) durchgeführt.
Charakeristisch ist das zyklische Durchlaufen dreier Reaktionsschritte, die i. d. R. bei definierten Temperaturen stattfinden (PCR-Programm). Initial werden die DNA-Stränge von einander getrennt (Denaturierung bei 94° C). Im folgenden Schritt lagern sich distal und proximal der zu amplifizierenden Sequenz Oligonukleotide (Primer) an (Annealing, bei 52° C), an die beim jeweiligen Temperaturoptimum (72° C) der verwendeten DNA-Polymerase Nukleotide entsprechend der zu kopierenden Sequenz synthetisiert werden (Elongation). Bei den durchlaufenden PCR-Zyklen stehen jeweils zunehmend jene Stränge für die Kopie zu Verfügung, die die betreffende DNA-Sequenz umfassen. Das
Ergebnis ist eine exponentielle Anreicherung der Ziel-DNA im Reaktiongemisch. In Tabelle 2 ist das verwendete PCR-Programm aufgeführt. Anschließend
erfolgte die Analyse mit dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer, hierfür wurden zu jeweils 2 µl PCR-Produkt, 15 µl entionisiertes Formamid und 0,5 µl Längen-standard (GS500TAMRA) gegeben und gemischt. Das Gefäß wurde mit einem Septum verschlossen und der Reaktionsansatz bei 94° C für zwei Minuten denaturiert. Bis zum Auftragen wurden die PCR-Produkte bei 4° C auf Eis gelagert.
Bezeichnung Funktion Zusammensetzung
Tissue Lysis Buffer Gewebelyse 4 M Harnstoff, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 mM EDTA, pH
7,4 Binding Buffer
optimales
Bindeverhalten der DNA an das Glasvlies
6 M
Gunanidiniumhydrochlorid, 10 mM Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X-100 (v/v), pH 4,4
Proteinase K Proteinabbau Lyophilisat
Wash Buffer Entfernung von überschüssigen Zellbestandteilen
80% Ethanol, 20 mM NaCl, 2 mM Tris, HCl, pH 7,5
Elution Buffer Elution der DNA vom
Glasvlies 10 mM Tris, pH 8,5 High Pure Filter
Tubes Polypropylen Gefäße mit Glasfieber-Fleece Collection tubes Auffanggefäße Polypropylen
Tab.1: Komponenten des High Pure PCR Template Preparation Kit
Schritt Dauer/Temperatur Wiederholung
Denaturierung 2 min 94° C 1x
Amplifikation
10 s 94° C Denaturierung 30 s 52° C Annealing
30 s 72° C Elongation 35x
Final Elongation 7 min 72° C 1x
Abkühlung 4°C
Tab. 2: PCR-Programm
Abb. 2 Mikrosatellitenstabiles Adenom
2.2.2 (Laser-) Mikrodissektion
Für die Lasermikrodissektion kommen in Paraffin eingebettete Gewebestücke zum Einsatz, die Karzinom-, Adenomgewebe und korrespondierendes Normal-gewebe enthalten. Mit einem Mikrotom werden von diesen
Paraffin-gewebeblöcken 5 µm dicke Schnitte angefertigt. Jeweils ein Schnitt wird auf einen membranmontierten Objektträger (Polyethylenmembran fixiert mit Rubber-cement (Fixogum, Marabuwerke, Tamm, Deutschland)) gezogen und einer Hämatoxilin – Eosin - Färbung (HE - Färbung) mit dem Färbeautomat (Tissue Stainer cot, Fa. Medite, Burgdorf) unterzogen. Zu jedem Tumor wurde zusätzlich ein Querschnitt angefertigt und mit PAS (periodic acid Schiff) gefärbt.
Zunächst wurde mit Hilfe des HE - Schnittes das betreffende Tumor- bzw. Adenomareal markiert, welches mikrodisseziert werden soll. Das Areal besteht aus mindestens 1 cm2 Größe. Für die manuelle Dissektion wird der zu
unter-suchende Zellverband vom Objektträger gekratzt, für die Laserdissektion mit dem Laser gelöst und mit Proteinase K in einer Konzentration von 2 µg/ml (Fa. Qiagen, Valencia, CA), der Verdauung unterzogen. Die DNA wird mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Fa. Qiagen, Valencia, CA) gemäß der Herstellerangaben extrahiert und mit dem PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche, Mannheim) gereinigt.
Die Schnitte werden mit Xylene entparaffinisiert und durch eine absteigende Alkoholreihe rehydriert, analog zu der Mikrosatellitenanalyse.
Für die Lasermikrodissektion kam das Leica AS LMD System (Leica
Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) zum Einsatz. Hierbei wurden ca. 100 bis 200 Epithelzellen entnommen. Bei der Entnahme der Zellen wurde darauf geachtet, daß jeweils Adenomanteile mit verschiedenen Dysplasiegraden (D1-D3) des Adenoms zur Analyse kamen. Für jeden Dysplasiegrad wurden jeweils zwei unabhängige Zellgruppen entnommen. Diese Epithelzellen wurden in ein Reagenzglas getan und mit 20 µl Lysis buffer versetzt. Der Lysis buffer setzt sich aus 10% Proteinase K 2 mg/ml (Fa.Roche, Mannheim, Deutschland), 0,5% Tween 20 (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) und einmal Taq PCR Buffer (Fa. Roche, Mannheim, Deutschland) zusammen. Anschließend fand der
Verdau für 18 Stunden bei 50°C statt. Nach dieser Zeit wurde die Proteinase K durch die Inkubation für 10 Minuten bei 94°C gestoppt.
Zur DNA Isolierung siehe oben.
2.2.3 Immunhistochemische Darstellung der Proteine MLH1-, MSH2-, MSH6- und PMS2
2.2.3.1 Methode
Nach dem heutigen Wissensstand führt eine Mutation in der Keimbahn eines der Mismatch-Repair(MMR)-Gene zu einem Stopcodon. Daraus resultiert eine fehler-hafte Transkription bzw. es kommt zu einem Basenabbruch und somit zur
Unfähigkeit, das entsprechende Protein zu synthetisieren und als Antigen zu präsentieren. Dieses Phänomen macht sich die immunhistochemische Analyse zu eigen, da bei einer Mutation der entsprechende Antikörper nicht mehr an das Antigen binden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden Schnitte von Tumor-, Adenom- und korrespondierendem Normalgewebe des Darms verwendet und Primärantikörper gegen das hMLH1-, hMSH2- und hMSH6- und hPMS2-Protein für die immunhistochemische Darstellung eingesetzt (Tab. 3).
2.2.3.2 Reagenzien
• Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland
• Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland
• Citronensäure-Monohydrat (C6H8O7), Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland
• Trinatriumcitratdihydrat (C6H5O7Na3), Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland
• Tween 20, Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland
• EDTA, Fa. Sigma 2.2.3.3 Lösungen
• Phosphate Buffered Saline (PBS)-Puffer pH 7,4
• 12,4g KH2PO4 + 43,1g Na2HPO4 x 2H2O + 42,5g NaCl in 5l Aqua dest. lösen, mit 1M NaOH auf pH 7,4 einstellen.
• Phosphate Buffered Saline (PBS)-Puffer pH 7,4 mit Tween (PBS/Tween)
• 12,4g KH2PO4 + 43,1g Na2HPO4 x 2H2O + 42,5g NaCl in 5l Aqua dest. lösen, mit 1M NaOH auf pH 7,4 einstellen. 2,5ml Tween 20 zufügen.
• 10mM Citratpuffer pH 6,0
• 21,01g C6H8O7 x 2H2O in 1000ml Aqua dest. lösen = 0,1M Zitronensäure = Stammlösung A
• 29,41g C6H5O7Na3 x 2H2O in 1000ml Aqua dest. lösen = 0,1M Natriumcitrat = Stammlösung B
• 9ml Stammlösung A + 41ml Stammlösung B mit 450ml Aqua dest. auf 500ml auffüllen.
• 1mM EDTA pH 8,0
• 0,37g EDTA in 1000ml Aqua dest. lösen und mit NaOH auf pH 8,0 einstellen.
2.2.3.4 Vorbehandlung
Für die Untersuchung werden 4 µm dicke Schnitte von Tumor-, Adenom- und korrespondierendes Normalgewebe des Darms auf silanisierte Objektträger gezogen. Konnte kein Normalgewebe in der Nähe des Tumors bzw. Adenoms verwendet werden, wurde ein zusätzlicher Gewebeschnitt von einem anderen Block angefertigt. Das Normalgewebe diente zur Positivkontolle und wurde für 30 Minuten bei 60° C sowie über Nacht bei 38° C getrocknet.
Es folgt die Entparaffinierung der Schnitte, indem die Objektträger zweimal 5 Minuten in Xylol überführt, anschließend zweimal 5 Minuten in Aceton und abschließend zweimal 5 Minuten in Aqua dest. getaucht werden. Zur Antigen-demaskierung werden die Gewebeschnitte für die hMLH1- und hMSH2-Analyse in eine mit EDTA Lösung gefüllte Küvette überführt und in der Mikrowelle bei 250 W für 30 Minuten gekocht. Schnitte, die einer hMSH6- und hPMS2-Analyse unterzogen werden, werden in eine Küvette mit Citratpuffer überführt und im Autoklaven bei 120° C für 20 Minuten hitzebehandelt. Danach werden die Küvetten der Mikrowelle bzw. dem Autoklaven entnommen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt.
Es folgte das Abspülen der Objektträger mit Aqua dest. Für die Blockierung endogener Peroxidasen werden die Objektträger für 20 Minuten bei Raum-temperatur einem 0,3%igen H2O2-Methanol-Bad unterzogen, danach mit Aqua
dest. gespült und anschließend für 5 Minuten in PBS/Tween überführt. 2.2.3.5 Färbevorgang
Die Färbetechnik erfolgte mit Hilfe des Tecan-Immunostainers Genesis RSP 200 unter Verwendung der EnVision+-Methode (Fa. DAKO) nach Herstellerangaben. Die Schnitte wurden zweimal mit PBS/Tween für 7 Minuten gespült und mit dem Primärantikörper (hMLH1-, hMSH2-, hMSH6- oder hPMS2-Antikörper;
Verdünnung siehe Tab.3) für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation wurde mit 100 µl/Objektträger PBS/Tween gestoppt. Danach wurden die Schnitte mit 1400 µl PBS/Tween für 7 Minuten gewaschen und anschließend für 30 Minuten mit 120 µl anti-mouse EnVision HRP (Fa. DAKO) inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Vorgang mit 100 µl PBS/Tween gestoppt. Es folgte ein 7 minütiges Spülen der Objektträger mit 1400 µl PBS/Tween. Hiernach wurden die Schnitte für 10 Minuten mit 120 µl DAB-Chromogen (1:50 Verdünnung in Substratpuffer (Fa. DAKO)) inkubiert.
Die DAB-Inkubation wurde mit 100 µl PBS/Tween gestoppt und die Objektträger wurden mit 1400 µl PBS/Tween für 7 Minuten gespült. Anschließend wurden die Objektträger dreimal in einem Abstand von zwei Stunden mit PBS/Tween
gespült. Am Ende schloss sich das Spülen der Objektträger mit Aqua dest. an. Die Objektträger wurden zur Gegenfärbung für 10 Sekunden in Harris
Hämatoxylin (Fa. Merck) überführt, 5 Minuten in warmem Wasser gebläut und abschließend mit Pertex (Fa. Medite) eingedeckt.
Antikörper Verdünnung Klon Firma Katalog-Nummer hMLH1 1 : 100 Clon G 168-15 BD PharMingen 551091 hMSH2 1 : 50 AB-2 Calbiochem NA 27 hMSH6/GTBP 1 : 50 44 Becton-Dickinson 610919 hPMS2 1 : 25 A16-4 BD PharMingen 556415
Tab. 3: Für die immunhistochemische Darstellung verwendete Antikörper, deren Verdünnung und Herstellernachweis.
2.2.3.6 Auswertungskriterien
Die mikroskopische Kontrolle soll bei positiver Färbung eine Kernfärbung zeigen, da sich die DNA-Mismatch-Repair-Proteine im Kern nachweisen lassen. Dies ist gleichbedeutend mit einer regelrechten Antiköperbindung an das entsprechende Protein und einer ungestörten Proteinexpression im Zellkern. Bewertet wurden die Kerne der Basalzellen in den Krypten der Normalmucosa bzw. des Stromas und der Entzündungszellen. Zeigte sich im Bereich des Tumors bzw. Adenoms eine Kernfärbung von weniger als 10%, dann wurde dies als eine fehlende Proteinexpression gewertet. Eine inkomplette Kernfärbung von 10-50% oder nur eine partielle Färbung wurde als positiv gewertet. Zur Positivkontolle wurde das angrenzende Normalgewebe oder der zusätzlich angefertigte Gewebeschnitt des Normalgewebes herangezogen.
Abb. 2 Beispiel für eine positive Anfärbung (MLH1 positives Adenom desselben Patienten)
Darstellung einer immunhistochemischen Färbung von Tumorgewebe und Normalgewebe eines HNPCC Patienten. Im Tumorgewebe ist keine Anfärbung der Kernregion durch den verwendeten Antikörper gegen MLH1 darzustellen, im Normalgewebe färben sich die Kernregionen braun an.
Kapitel 3 Ergebnisse
3.1 Allgemeine Daten
Die vorliegenden Daten entstammen dem Patientenkollektiv der Verbundstudie der Deutschen Krebshilfe der Pathologie Kassel in den Jahren 01/1998 bis 08/2003. Insgesamt wurden für die hier vorliegende Arbeit bei 122 Patienten Karzinome auf MSI und Expression der MMR Gene untersucht, die auf Grund der Lokalisation und Voranamnese für ein HNPCC-Syndrom verdächtig waren. Bei 40 dieser Patienten waren neben dem Karzinomgewebe ein oder mehrere Adenome verfügbar. Diese Patienten und die entsprechenden Adenome wurden in die weiteren Untersuchungen aufgenommen (40/122 = 32,78%).
Bei genauer Anamnese-Erhebung erfüllten von diesen 40 Patienten 36 (36/40 = 90%) die Bethesda Kriterien, so daß diese 15 Frauen und 21 Männer in die Studie aufgenommen wurden (w:m = 1:1,4). Das mittlere Alter dieser Patienten bei der Erstuntersuchung betrug 46 (24-78) Jahre.
Abb. 1 Untersuchungsgut. a.) Pat., die die Kriterien erfüllten b.) Geschlechterverteilung
3.2 Adenomhäufigkeit
Von 22 Patienten lag im Untersuchungszeitraum von 5,5 Jahren ein Adenom vor, bei 14 Patienten waren in diesem Zeitabschnitt mehrere Adenome aufgetreten (1:1,57).
Insgesamt gab es 38 multiple Adenome, von denen 22 synchron und 16 metachron auftraten (1,375 : 1).
Bei 28 Patienten wurden die Adenome zeitgleich mit dem Karzinom entfernt, bei fünf (17,8%) wurde erst das Karzinom diagnostiziert und dann im weiteren Krankheitsverlauf neu auftretende Adenome entfernt. Lediglich drei Patienten (10,7%) fielen zuerst durch ein Adenom auf und hatten im späteren Verlauf ein Karzinom. -20 30 80 130 Pat insg. Pat.Amst Pat. Amst/Beth. 58% 42% Männer Frauen
Abb. 3 zeitlicher Zusammenhang Adenom/Karzinom
3.3 Histologie der Adenome
Von den 71 untersuchten Adenomen waren die überwiegende Mehrzahl tubulär (45/71 = 63,38%). Gefolgt wurde diese Gruppe von den tubulo-villösen
Adenomen (15/71 = 21,12%) und einer Gruppe von Adenomen (10/71 =
14,08%), deren Wachstumsform nicht sicher näher bestimmt werden konnte, da nicht genügend Material zur Verfügung stand.
Zusätzlich fanden wir ein Adenoma serratum. (1/71 = 1,4%)
1,40% 14,08% 21,12% 63,36% t AD t-v AD AD AD serratum
Abb. 4 Histologischer Adenomtyp
3.4 Mikrosatellitenstatus der Adenome im Vergleich zu den Karzinomen Von den 44 untersuchten tubulären Adenomen wurde bei 18 Proben der Mikrosatellitenstatus bestimmt. Es fand sich kein MSI - L Adenom.
78% 8% 14% synchron erst Adenom erst Carzinom
Die Mehrzahl der tubulären Adenome waren MSI – H (12/18 = 66,6%), gefolgt von MSS (6/18 = 33,3%), wobei alle tubulären Adenome am Rande eines Karzinoms jeweils wie das Karzinom MSI – H waren.
Dagegen traten MSS Adenome jeweils getrennt vom Karzinom auf, dies 1x synchron und 5x metachron zum jeweils instabilen Karzinom.
Abb. 5 Mikrosatellitenstatus der Adenome
Bei den tubulo-villösen Adenomen fanden sich in der überwiegenden Mehrzahl MSI - H Adenome, somit dem MSI Status der Karzinome entsprechend (13/15 = 86,6%), ein Adenom war MSI - L und ein Adenom MSS. Interessant ist hier, daß der Mikrosatellitenstatus der übereinstimmenden Adenome immer mit dem der Karzinome übereinstimmte, obwohl sogar ein Karzinom nicht im Darm sondern im Uterus (Endometriumarzinom) gefunden wurde.
Bei der drittgrößten Gruppe, den nicht näher klassifizierten Adenomen, waren 6 MSI – H (75%) und 2 MSI – L.
Das Adenoma serratum war MSI – L bei MSI – H Karzinom.
Somit waren nur in 73,8% (31/42) der bei gesichertem HNPCC aufgetretenen Adenome MSI-H, während die ebenfalls aufgetretenen Karzinome jeweils den MSI-H Phänotyp aufwiesen.
Abb. 6 Verteilung der Mikrosatellitenstabilität bei den Adenomen
13% 13% 74% MSI - H MSI - L MSS 0 2 4 6 8 10 12 MSI - H MSS
Abb. 7 Zeitlicher Zusammenhang Adenome und Karzinom 0 5 10 15 20 25 30 35 40 synchron m e tachron M SI- H M SI- L M SS
Abb. 8 Zusammenhang zwischen MS – Status und zeitlichem Auftreten
3.5 MMR Proteinexpression der Adenome
Insgesamt wurden 51 Adenome immunhistochemisch auf Expression der MMR Gene MSH2, MSH6, MLH1 und PMS2 hin untersucht. Darunter waren 40
hochinstabile Adenome, 1 leicht instabiles Adenom und 10 mikrosatellitenstabile Adenome.
Bei den MSI-H Adenomen hatten 20 einen Ausfall im MSH2/6 System (50%), 11 einen Ausfall im MLH1/PMS2 System (27,5%) und 9 (22,5%) waren in keiner Expression negativ.
Das MSI-L Adenom war im MLH1/PMS2 System negativ.
Den Bezug der immunhistiochemischen Befunde zum MSI Status verdeutlicht Abb. 9.
75% 25%
synchron m e tachron
Abb. 9 MMR Proteinexpression und MSI Status
3.6 Immunhistochemie der Adenome im Vergleich zu den Karzinomen
Bei der größten Gruppe den tubulären Adenomen zeigten 12/23 Adenome einen Expressionsausfall mindestens eines Repairgens (12/23= 52,2%). Die Hälfte der Fälle zeigten einen Ausfall von MSH2 und MSH6 (6/12 = 50%). In 4 Fällen waren auch die Karzinome derselben Patienten MSH2 und MSH6 negativ (Kongruenz 67%), bei den zwei übrigen Karzinomen war nur MSH2 komplett negativ (33%). Insgesamt ergibt sich für die Gruppe der MSH2 und MSH6 negativen Adenome, ein entsprechender Befund bei den Karzinomen, die entweder nur einen MSH2 oder auch einen MSH6 Ausfall aufwiesen.
9 3 12 0 2 4 6 8 10 12 14 MSH 2/6 negativ MLH 1neg positiv
Abb. 10 IHC Status der Adenome
In der Gruppe der MLH1 negativen tubulären Adenome (4/13 = 30%) waren auch alle Karzinome MLH1 negativ (100% Kongruenz).
Elf tubuläre Adenome (47,8%) waren in allen untersuchten Expressionen positiv. Bei den tubulo-villösen Adenomen war die Mehrzahl der Adenome MSH2 negativ (3/5 = 60%), die Karzinome waren hier MSH6 (2/3 = 67%) und MSH2 negativ (33%), also eine direkte Kongruenz von 33%.
Ein tubulo-villöses Adenom war MSH6 negativ das entsprechende Karzinom war ebenfalls MSH6 negativ. 2 20 1 1 11 7 9 0 5 10 15 20 25 MSI-H MSI-L MSS MSH2/6 neg. MLH1/PMS2 neg. kein Ausfall
Insgesamt bestätigte sich auch hier wieder die Beobachtung, daß bei MSH2 und MSH6 negativen Adenomen die Karzinome auch entweder MSH2 oder MSH6 negativ sind, bei einer direkten Kongruenz von 50%.
Zwei tubulo-villöse Adenom waren MLH1 negativ, hier war auch das entsprechende Karzinom jeweils MLH1 negativ.
Bei den Adenomen, die aufgrund von ungenügendem Material nicht näher bestimmt werden konnten, waren 4 MLH1 negativ, 2 MSH2 negativ und 2 MSH2 und MSH6 negativ. Alle Karzinome entsprachen direkt den Adenomen (100% Kongruenz).
Das Adenoma serratum war durchweg positiv, bei einem MLH1 negativen Karzinom.
In der Gruppe der Adenome ergibt sich also eine direkte immunhistochemische Kongruenz von insgesamt 14/19 (73,7%), zählt man die Gruppe MSH2 und MSH6 zusammen sowie MLH1 ergibt sich ein Kongruenz von 100% (19/19). Bei einem MSH 2+6 /MLH1 Verhältnis von 13/6 = 2,16/1).
Abb. 11 Immunhistochemische Kongruenz Adenom/Karzinom
Abb. 12 Anzahl der MSH2/6 neg. bzw. MLH1 neg. Adenome
MSH 2/6 negativ Entspr. Karzinom negativ Kongruen z in % MLH1 negativ Entspr. Karzinom negativ Kongruen z in % Pos. Adenome bei neg. Karzinomen Tubuläre Adenome 6 6 100 4 4 100 11 Tubulo villöse Adenome 4 4 100 2 2 100 Adenoma serratum 1
Tabelle 1 Zusammenhang MSH /MLH Status der Adenome und der entsprechenden Karzinome (MSH 2 und MSH6 wurden zu einer Gruppe zusammengefasst).
Wie man aus Tabelle 1 deutlich erkennen kann, ist der Zusammenhang zwischen Adenomen und Karzinomen deutlich zu sehen. Jedoch sind immer wieder einzelne Adenome vorhanden, die immunhistochemisch keinen Bezug zum Karzinom zu haben scheinen.
26% 74%
nicht kongruent kongruent
0 2 4 6 8 10 12 14 Anzahl MSH MLH
3.7 Lokalisation der Adenome
Von den tubulären Adenomen waren 11 vor der rechten Kolonflexur (11/31 = 35,5%), 8 im Kolon transversum (8/31 = 25,8%) und 12 nach der linken Kolonflexur (12/31 = 38,7%) lokalisiert. Bei 13 tubulären Adenomen war die genaue Lokalisation nachträglich nicht mehr eruierbar.
Bei den tubulo-villösen Adenomen waren 3 Adenome vor der rechten Kolonflexur (3/10 = 30%) und 7 Adenome nach der linken Kolonflexur. Zwei tubulo-villöse Adenome konnten keiner genauen Lokalisation zugeordnet werden.
In der Gruppe der durch Materialmangel nicht als tubulär oder villös näher bestimmbaren Adenome war die Mehrzahl nach der linken Kolonflexur (4/6 = 66,7%)lokalisiert. Vor und nach der rechten Kolonflexur befand sich jeweils ein Adenom und bei einem weiteren Adenom konnte die Lokalisation nicht mehr nachvollzogen werden.
Abb. 13 Lokalisation der Adenome bezogen auf die Histologie
Bei den synchronen Adenomen (unabhängig von der Histologie) waren 15 Adenome (15/44 = 34,1%) vor der rechten Kolonflexur, 7 (7/44 = 15,9%) im Kolon transversum und 22 (22/44 = 50%) hinter der linken Kolonflexur lokalisiert. Sieben Adenome konnten nachträglich nicht mehr einer genauen Lokalisation zugeordnet werden.
Bei den metachronen Adenomen war kein Adenom vor der rechten Kolonflexur, zwei nach der rechten Kolonflexur (2/7 = 28,6%) und fünf nach der linken
Kolonflexur (5/7 = 71,4%). Acht der metachronen Adenome konnten auch hier wieder nicht zugeordnet werden.
0 2 4 6 8 10 12 t AD AD tv AD
Abb. 14 Lokalisation der Adenome bezogen auf den zeitlichen Zusammenhang
Bei den MSI-H Adenomen waren 11(11/26 = 42,3%) vor der rechten Kolonflexur, 3 (3/26 = 8,7%) nach der rechten Kolonflexur und 12 (12/26 = 46,2%) nach der linken Kolonflexur. 12 MSI – H Adenome konnten nicht mehr zugeordnet werden.
Abb. 15 Lokalisation der Adenome bezogen auf die Immunhistochemie
Bei den MSS Adenomen waren 2 vor der rechten Kolonflexur (2/8 = 25%), 1 vor der linken Kolonflexur ( 1/8 = 12,5%) und 5 nach der linken Kolonflexur (5/8 = 62,5%). Zwei der MSS Adenome konnten nicht mehr zugeordnet werden.
12% 46% 42% vor re Kolonflexur vor li Kolonflexur nach li Kolonflexur 0 5 10 15 20 25 s ynchron m etachron
Abb. 16 Lokalisation der Mikrosatellitenstabilen Adenome
Von den im Mikrosatellitenstatus nicht bekannten Adenome waren vor der rechten Kolonflexur 4 (4/19 = 21%), vor der linken Kolonflexur 4 (4/19 = 21%)
Abb. 17 Lokalisation der histologisch nicht bestimmten Adenome
Adenome und nach der linken Kolonflexur waren 11 (11/19 = 28,9%) Adenome. 3 Adenome konnten auch hier nicht weiter zugeordnet werden.
3.8 Zeitliche Zusammenhänge
In der Gruppe der tubulären Adenome waren die meisten synchron zum Karzinom (33 /43 = 76,7%), 23,2% (10/43) waren metachron.
Bei den tubulo - villösen Adenomen waren 12 synchron (12/15 = 80%) und 3 metachron (3/15 = 20%).
Bei den aufgrund von Materialmangel nicht näher bestimmten Adenomen (10/10 = 100%) entwickelten sich alle synchron mit dem Karzinom.
Das Adenoma serratum war metachron.
Die hoch mikrosatelliteninstabilen Adenome erwiesen sich als überwiegend synchron (30/36 = 83,3%), 6 dieser Adenome entstanden metachron (6/36 = 16,6%). Das leicht mikrosatelliteninstabile Adenom stellte sich als synchron dar.
62% 13% 25% vor re Kolonflexur vor li Kolonflexur nach li Kolonflexur 58% 21% 21% vor re Kolonflexur vor li Kolonflexur nach li Kolonflexur
Von den mikrosatellitenstabilen Adenomen entwickelten sich 8 synchron (8/10 = 80%), zwei metachron (2/10 = 20%).
Von den MSH 2 negativen Adenomen traten 7 synchron (7/12 = 58,3%) und 5 metachron (5/12 = 41,7%) auf. Von den MSH6 negativen Adenomen kamen alle 3 synchron vor.
Von den MSH2 und 6 negativen Adenomen stellten sich 5 synchron (5/6 = 83,3%) und 1 metachron (1/6 = 16,7%) dar. Insgesamt enthielt diese Gruppe 15 (15/21 = 71,4%) synchron und 6 (6/21 = 28,6%) metachron entstandene
Adenome.
Von den MLH1 negativen Adenomen traten alle 13 synchron auf.
Von den in allen untersuchten Expressionen positiven Adenomen entwickelten sich 13 synchron (13/17 = 76,5%) und 4 metachron (4/17 = 23,5%).
3.9 Lokalisation Adenome zu ihren Karzinomen
12 Adenome wurden im Karzinom lokalisiert. In einem Abstand bis zu 5 cm vom Karzinom entfernt waren 28 Adenome. Mehr als 5 cm vom Karzinom entfernt, fanden wir 31 Adenome.
Metachron aufgetretene Adenome fanden sich nur in der Gruppe der mehr als 5 cm entfernt vom Karzinom aufgetretenen Adenome (12/31 = 38,7%).
Alle Adenom in Karzinom aufgetretenen Adenome waren zu 100% kongruent in ihrem Mikrosatellitenstatus zum Karzinom.
In der Gruppe der bis zu 5 cm entfernten Adenome boten die meisten denselben Mikrosatellitenstatus wie die Karzinome (25/28 = 89,3%), jedoch gab es hier auch drei mikrosatellitenstabile Adenome (3/28 = 10,7%).
In der Gruppe der mehr als 5 cm entfernten Adenome waren 24/31 = 77,4% kongruent zum Karzinom, allerdings gab es auch hier insgesamt sieben mikrosatellitenstabile Adenome (7/31 = 22,5%).
In der MMR-Expression waren sowohl in der Adenom in Karzinom Gruppe, als auch in der Gruppe der Adenome weniger als 5 cm entfernt vom Karzinom alle Adenome dem Karzinom analog. In der Gruppe der mehr als 5 cm entfernten Adenome war die Mehrzahl der Adenome ebenfalls kongruent zu ihrem jeweiligen Karzinom (18/31 = 58,1%), jedoch gab es hier auch deutliche Unterschiede zum Karzinom (13/31 = 41,9%). Diese Adenome entsprachen in ihrer Expression dem „gesunden“ Normalgewebe.
Kapitel 4 Diskussion
4.1 Allgemeine Daten
Die im Kolon und Rektum lokalisierten Karzinome bilden die größte Gruppe der gastrointestinalen Tumore. Davon sind etwa 10% genetisch fixiert, wobei die vom Typ des hereditären nicht mit Polyposis assoziierten Kolonkarzinoms (HNPCC) die derzeit größte Gruppe genetisch verankerter vererbbarer Kolonkarzinome darstellen.
4.2 Mutationsanalysen
Das HNPCC Syndrom wird durch Mutationen im Mismatchrepair (MMR-) System verursacht, so daß die betroffenen Patienten früher und häufiger an Karzinomen erkranken als Patienten ohne diese Mutation. Dies zeigte auch die
Altersverteilung in unserer Studie: das mittlere Alter bei Erstmanifestation der Erkrankung betrug 46 Jahre, der jüngste Patient war 24 Jahre, der älteste 78 Jahre. In den meisten Fällen ist eine Mutation in den Genen MLH1 oder MSH2 beschrieben. Diese Mutation ist bereits durch das Genom der Patienten fixiert, durch ein molekulargenetisches Screening müsste man also bis zu 90% der Patienten identifizieren können. 10% der Patienten haben eine Mutation in anderen Genen, z.B. PMS2 oder MSH6. Wie Zilinski et al (2002) jedoch zeigen konnten, ist ein Mutationsscreening zur Detektion insbsondere von noch nicht erkrankten Mutationsträgern aufgrund unterschiedlicher Schwierigkeiten (noch) nicht zu empfehlen:
Derzeitig liegt die Nachweisrate von Keimbahnmutationen bei klinisch oder auch durch Nachweis von MSI und MMR Proteinausfall definierten HNPCC Patienten nur bei etwa 60%. Eine Ursache dafür scheint zu sein, daß verschiedene Genloci von der Mutation betroffen sein können. Bisher wurden allein 120 verschiedene Keimbahnmutationen beschrieben, den größten Teil stellen dabei die Mutation in den MSH2- und MLH1-Genen (Hahn und Schmiegel 1995). In den bislang
durchgeführten Untersuchungen zu diesen beiden Genen, konnten keine bevorzugten Loci, sog. hot spots, für eine Mutation ausgemacht werden. Daher müssen jeweils die gesamten Gene mit einer Länge von entweder 2,5Kb für das MSH2 Gen oder 2,7Kb für das MLH1 Gen sequenziert werden.
Durch ein molekulargentisches Mutationsscreening ist es somit bisher weder möglich HNPCC Patienten eindeutig zu identifizieren noch sie definitiv
auszuschließen.
4.3 Tumorentstehung unter dem Einfluss der MMR - Gene
Die Tumorentstehung wird durch verschiedene Gene begünstigt. Am besten untersucht sind die zuerst entdeckten Onkogene. Sie liegen als Protoonkogene in der Zelle vor und sind bei Aktivierung für das unkontrollierte Wachstum der Zelle verantwortlich.
Die als nächste für die Tumorentstehung verantwortlich entdeckte Gruppe von Genen sind die Tumorsupressorgene, die bei normaler Funktion die
Zellproliferattion unterdrücken. Bei einem Ausfall dieser Gene teilt sich die Zelle unkontrolliert.
Anhand von Untersuchungen von HNPCC-Patienten fand sich eine dritte Gruppe von Genen, die für eine Tumorentstehung verantwortlich sein können, die MMR-Gene. Parson et al (1993) konnten zeigen, daß Patienten einen Ausfall in diesen Genen auf einem Allel haben. Auch hier reicht jedoch der vererbte Ausfall eines Genes nicht aus, um ein Karzinom entstehen zu lassen. Es muß zu einer
erworbenen Veränderung des anderen Allels kommen, analog zu der Hypothese von Knudson ("two hit Hypothese") (Knudson AG (1971)).
Die MMR Gene haben einen Einfluß auf verschiedene Enzyme, z.B. den TGF-beta-II-Rezeptor.
Wie bei Lynch et al. (1999) und Vasen et al.(1999) beschrieben, ist HNPCC die häufigste autosomal dominant vererbte Störung. Auch die in unserer Studie gefundene nahezu gleiche Verteilung Männer zu Frauen (1:1,4) spricht für eine autosomal vererbte Störung.
4.4 Adenome und HNPCC
Bisherige Untersuchungen zu HNPCC richten sich vor allem auf die
Karzinogenese und somit auf die Untersuchung der Karzinome. Erst in letzter Zeit finden zunehmend auch die Adenome Beachtung. Wie beim sporadischen Karzinom sind auch beim HNPCC auftretende Adenome Vorläufer der sich daraus entwickelnden Karzinome. Daher wird HNPCC Patienten auch ein enger Vorsorgeplan mit regelmäßig stattfindenden Koloskopien zur frühzeitigen
Entdeckung und Entfernung der Adenome angeraten. Hiermit erhofft man sich ein Ausbrechen der Tumorart frühzeitig verhindern zu können.
Ein weiterer Vorteil der frühzeitigen Diagnose einer HNPCC – Erkrankung vor Auftreten des Tumors ist die Möglichkeit einer primären Prävention. Wie Arbeiten von Jarvinen et al gezeigt haben kann so die Entstehung von Karzinomen beim HNPCC – Syndrom bis zu 62% gesenkt werden (Jarvinen et al, 2000). Zusätzlich konnten Bliss et al. zeigen, daß diese Untersuchungsmethode im frühzeitigen Krankheitsverlauf nicht nur positiv für den Krankheitsverlauf, sondern auch kosteneffektiv ist (Bliss et al., 2004)
4.5 Immunhistochemische Untersuchungen des Mikrosatellitenstatus 4.5.1 Aufbau von Mikrosatelliten
Mikrosatelliten sind kurze sich wiederholende Sequenzen, vorwiegend der Basen Adenosin und Tyrosin. Diese Basen sind in kurzen Gruppen von drei bis fünf Basen angeordnet. Ihre Funktion ist bisher noch nicht geklärt, beim HNPCC Syndrom scheinen sie eine wichtige Rolle bei der Genomstabilisierung zu spielen.
Akiyama et al konnten in 57% der untersuchten Adenome bei HNPCC-Patienten eine Veränderung des Poly-A-Repeats zeigen (Akiyama et al 1996).
4.5.2 Mikrosatelliten(in)stabilität bei HNPCC-Patienten
HNPCC Karzinome können sowohl immunhistochemisch auf Expression der MMR Proteine MSH2, MSH6, MLH1 und PMS2 als auch auf
Immunhistochemie schließt die Tumore aus der Erfassung aus, die einen Aktivitätsverlust, jedoch kein Expressionsverlust haben. Dies führte zu den allgemeinen Empfehlungen, bei hochgradig HNPCC verdächtigen Patienten bei Erkrankungsverdacht und/oder immunhistochemisch festgestelltem Ausfall einer Komponente des MMR Systems den Mikrosatellitenstatus zu bestimmen.
Folgerichtig wurde bei den uns zugänglichen Patienten zusätzlich im Rahmen des molekulargenetischen Screenings der Mikrosatelliten-Status bestimmt. Eine hohe Mikrosatelliteninstabilität wurde dabei durch einen Ausfall von mindestens zwei der untersuchten Sequenzabschnitte definiert. Untersucht wurden
insgesamt fünf Sequenzabschnitte, welche als Referenzpanel vom National Cancer Institute empfohlen wurden (Dietmaier Cancer Res; Umar JNCI 2004). HNPCC-Erkrankte haben in bis zu 90% einen Störung im Mikrosatelliten-System, im Umkehrschluß heißt das jedoch auch, das 10% der HNPCC-Erkrankten einen unauffälligen Mikrosatelliten-Status an den untersuchten Loci haben (Aaltonen et al 1994). Im Gegensatz dazu haben Patienten mit sporadischen Karzinomen nur in 15% eine Mikrosatelliteninstabilität (Peltomäki et al 1993).
In der anfänglichen Bestimmung von Mikrosatelliteninstabilitäten gab es große Unterschiede in der Inzidenz, was sich durch einen Uneingikeit in der Anzahl der analysierten Mikrosatellitenmarker, der unterschiedlichen Repeattypen und der Uneinigkeit, ab welcher Anzahl von positiven Markern ein Tumor als instabil zuwerten war, erklärte. Diese Uneinigkeiten führten 1998 zu den allgemein gültigen Kriterien, die auch in unserer Studie berücksichtigt wurden (Boland et al 1998).
4.6 Grundlage jeder HNPCC – Diagnostik: Die Anamnese
Der Beginn jeder Diagnosestellung eines HNPCC-Syndroms ist jedoch neben dem molekulargenetischen Screening die genaue Anamneseerhebung, die spätestens bei der Verdachtsdiagnose nachgeholt werden muß, da die typische klinische Symptomatik, wie z.B. die Polyposis oder
Augenhintergrundveränderung bei der FAP, fehlt, noch das es typische Laborbefunde wie z.B. das erhöhte PSA (prostataspezifisches Antigen) beim Prostatakarzinom gibt. Der entscheidende Nachteil der bisherigen
Diagnosestellung ist, daß zur Diagnose bereits ein Tumor vorliegen muß. Daher wurde, auch in der Klinik, in letzter Zeit immer mehr Augenmerk auf die
präkanzerösen Adenome gelegt. Das, soweit es in das allgemeine Screening Einzug halten sollte, hat eine wichtige Folge: Die Diagnose HNPCC kann bei durch die Familienanamnese vorbelasteten Patienten früher gestellt werden und mögliche Karzinomentstehung gegebenenfalls verhindert werden. Die
Voraussetzung für alle Screening – Überlegungen ist aber, dass immer alle Adenome bei HNPCC – Patienten den genetischen Defekt aufweisen. 4.7 Ziele der Arbeit
Die hier vorliegende Arbeit widmet sich insbesondere der genauen Beschreibung der Adenome im zeitlichen, histologischen und genetischen Zusammenhang unter verstärktem Augenmerk auf die klinische Relevanz und die möglichen praktischen Konsequenzen.
Um eine wirkungsvolle Prävention zu erreichen muß der Patient einen
Arztkontakt vor Auftreten der Krankheit (in diesem Fall vor Karzinomentstehung) haben.
4.8 Zeitliche Zusammenhänge zwischen Adenomen und Karzinomen In unseren Daten sind zumeist die Adenome zeitgleich mit dem Karzinom entfernt worden (78%). In 14% der Fälle wurde zuerst das Karzinom entfernt und erst im weiteren Krankheitsverlauf die Adenome diagnostiziert. Insgesamt ergibt dies eine Patientengruppe von immerhin 92%. Diese Patienten hatten keine Möglichkeit einer früheren Diagnosestellung über die Untersuchung ihrer bereits bestehenden Adenome.
Lediglich bei 8% der Patienten wurde zuerst eine Adenomentfernung vor Diagnose der Karzinomerkrankung durchgeführt. Diese Patienten haben eine effektive Vorsorge erfahren. Für die zukünftige Versorgung der HNPCC- Patienten wäre es wünschenswert, wenn noch mehr HNPCC vorbelastete Patienten in die engmaschige Vorsorge einbezogen werden könnten. 4.9 Mikrosatellitenstabilität in Adenomen und Karzinomen
Bei der Bestimmung der Mikrosatellitenstabilität ergaben sich teilweise große Ähnlichkeiten zwischen Adenomen und Karzinomen der jeweiligen Patienten. Die Mehrzahl der Adenome entsprach in der Mikrosatellitenstabilität den
Karzinomen. Jedoch waren auch hier komplett mikrosatellitenstabile Adenome zu finden.
Dies ist umso mehr von Bedeutung, als dass bisher eine
Mikrosatelliteninstabilität als Kriterium für eine HNPCC-Diagnose unumgänglich war, wie auch Untersuchungen von Rüschoff et al. (1995), Boland et al. (1998), Lamberti et al und Loukola et al zeigen konnten (Rüschoff et al, 1995, Boland et al,1998, Lamberti et al, 1994, Loukola et al, 2001). Dem schließt sich auch die Untersuchung Iino et al und Peroni et al an, die die Hypothese vertreten, daß MSI eine frühe Stufe der Karzinogenese in HNPCC ist (IIno et al, 2000, Pedroni et al, 2001).
Wie bisher dargestellt wurde, sind die Adenome bei HNPCC zuerst
mikro-satelliteninstabil und dann genetisch verändert. Daher ist es wahrscheinlich, daß wir "echte" sporadische Adenome erfaßt haben und nicht, wie es ebenfalls möglich wäre, Adenome vor dem second hit.
Nicht unerwähnt soll in diesem Zusammenhang bleiben, daß in beiden Gruppen die Adenome sowohl zeitgleich mit dem Karzinom (synchron), als auch
unabhängig von der Karzinomentfernung (metachron) aufgetreten waren. 4.10 Immunhistochemische Zusammenhänge zwischen Adenomen und Karzinomen
Die meisten der entfernten Adenome, gleich welcher genauen histologischen Kategorisierung, entsprachen in ihrer immunhistochemischen Färbung den Karzinomen entweder genau oder wiesen Ausfälle im entsprechenden Gegenpartner der Reparaturgene (MSH2/MSH6, PMS2/MLH1) auf. Die
Peltomäki et al. (Peltomäki, 2001) entspricht, in deren Untersuchung 90% der HNPCC-Karzinome MSI-H waren, wohingegen dies nur bei 15 % der
sporadischen Karzinome der Fall war.
In den immunhistochemischen Färbungen ergaben sich zwei Konstellationen von Enzymausfällen. In dem einen Fall war der Komplex MSH2 / MSH6 ganz oder teilweise betroffen, der andere Teil wurde von dem Paar MLH1 und PMS2 gestellt. So war in der immunhistochemischen Färbung immer festzustellen, daß bei Adenomen mit einem Ausfall in der MSH2 und/oder MSH6 Expression auch die Karzinome entsprechende Defizite vorwiesen. Analog dazu hatten die MLH1 defizitären Adenome auch MLH1 negative Karzinome. Interessanterweise hatten wir in der uns zugänglichen Patientengruppe kein Adenom, welches alleinig einen Ausfall in der Expression von PMS2 gezeigt hat.
Besondere Aufmerksamkeit soll hier auf den Punkt gelenkt werden, daß es in allen Subklassen der Adenome Adenome mit positiver MMR Genexpression gab. Dies hat große Konsequenzen für den möglichen Ausschluß für Patienten aus Vorsorgeprogrammen, bei nachgewiesenen positiven Adenomen und somit falsch negativer HNPCC - Ausschlußdiagnose.
4.11 Lokalisationen von Adenomen und Karzinomen
Die klassische Lokalisation für das HNPCC – Karzinom ist das Kolon und das Rektum. In der Mehrzahl der Fälle waren sie nach der linken Flexur lokalisiert, also im Kolon descendes, Sigma oder Rektum. An dieser anatomischen Lokalisation ist auch eine sporadische Adenomentstehung am
wahrscheinlichsten.
Nicht unerwähnt bleiben darf die zweithäufigste Lokalisation, das Endometrium. Im Gegensatz zum Kolon ist die Möglichkeit der Früherkennung durch Adenome hier jedoch deutlich schlechter. Eine Nichtbeachtung dieser Lokalisation hätte aber eine deutliche Unterdiagnostik der Erkrankung zur Folge.
Ebenso diskutiert werden müssen die anderen möglichen Lokalisationen, wie z.B. Karzinome des Urogenitaltraktes, des Dünndarms oder des Ovars, die in deutlich kleinerer Fallzahl vorliegen, jedoch unzweifelhaft mit zum HNPCC Syndrom gezählt werden müssen (Jarvinen et al 1995, Menko et al 1993,
Toribara und Schleisinger 1995). So fanden sich bei Untersuchungen von Vasen et al 1990 an HNPCC Familien 104 Kolonkarzinome und 65 extrakolische
Karzinome (62,5%).
Eine früher häufig aufgetretene Lokalisation des HNPCC, das Magenkarzinom, spielt heute nur noch eine untergeordnete Rolle. Dies scheint die Hypothese von Knudson et al. zu bestätigen, daß zur Karzinogenese ein Mutation im zweiten DNA – Strang eintreffen muß. Dieser "zweite Schlag" (two hit Hypothese) ist durch Umweltfaktoren beeinflußbar und tritt demzufolge auch an den
Lokalisationen auf, die auch von sporadischen Karzinomen, oft ebenfalls mit Umweg über ein entsprechend sporadisches Adenom, am häufigsten betroffen sind.
Besonderes Augenmerk sollte in diesem Zusammenhang auf die Adenome, die mehr als 5 cm entfernt vom Karzinom lokalisiert sind, gerichtet werden. Sie sind meist jenseits der linken Flexur, alle jedoch jenseits der rechten Flexur gelegen.
Dies spricht, abgesehen von den häufigeren Unterschieden in der
Genexpression und dem MSI-Status, für eine sporadische Entstehung dieser Adenome. Interessanterweise sind alle Patienten mit diesen Adenomen eindeutig HNPCC-Patienten, die auch „HNPCC-typische“ Adenome haben.
Abb. 1 Vergleich zweier räumlich entfernter, synchroner Adenome desselben Patienten
4.12 Zusammenfassung und Schlußfolgerungen
All diese Fakten sprechen für eine zusätzliche eigenständige Adenomentstehung bei HNPCC- Patienten, also eine sporadische Adenomentstehung zusätzlich zur HNPCC- assoziierten Adenomentstehung.
Da bei Patienten mit einer entsprechenden Vorgeschichte ein engeres Screening dringend empfohlen wird, liegt in der Entfernung von sporadischen Adenomen eine mögliche Fehlerquelle für eine falsch negative Diagnose, sollte diese als beweisend für einen Ausschluss einer HNPCC-Erkrankung gelten.
