Kurzzeiteffekte einer intrauterinen Seminalplasmaapplikation auf die Genexpression immun- und follikelreifungsassoziierter Transkripte
im weiblichen Genitaltrakt des Schweins
INAUGURAL – DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Alexandra Bölling
Telgte
Hannover 2012
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Prof. Dr. Ron Hunter
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Univ.- Prof. Dr. Christiane Pfarrer
Anatomisches Institut
Apl. Prof. Dr. Hans - Joachim Schuberth Arbeitsgruppe Immunologie
Univ.- Prof. Dr. Christine Wrenzycki
Klinik für Rinder, Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
1. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. Dagmar Waberski
2. Gutachterin: Univ.- Prof. Dr. Sabine Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2012
Eine Arbeit aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft: INST 193/49-1 AOJB:567417
Meinen Eltern in
Liebe und Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht... 2
2.1 Charakterisierung des Einflusses von Seminalplasma auf den Genitaltrakt der Sau... 2
2.1.1 Immunmodulatorische Effekte auf zellulärer Ebene ... 3
2.1.2 Immunmodulatorische Effekte auf molekularer Ebene... 7
2.2 Immun- und follikelreifungsassoziierte Transkripte im weiblichen Genitaltrakt ... 8
2.3 Interaktionen zwischen einzelnen Kompartimenten des Genitaltraktes ... 13
2.4 Der Effekt des Seminalplasmas auf den Genitaltrakt verschiedener Spezies ... 16
3 Material und Methoden ... 21
3.1 Versuchsziel ... 21
3.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 21
3.3 Medikamente, Chemikalien und Gebrauchslösungen ... 21
3.4 Versuchstiere... 22
3.5 Sonographische Untersuchung der Ovarialfollikel ... 22
3.6 Brunstkontrolle... 23
3.7 Seminalplasmapool-Herstellung... 23
3.8 Chirurgische Maßnahmen ... 24
3.9 Probengewinnung... 29
3.9.1 Ovarien... 29
3.9.2 Uterusproben... 30
3.10 Probenbearbeitung... 31
3.10.1 Gewinnung der Oozyten, Cumulus- und Granulosazellen ... 31
3.10.2 Laser-Mikrodissektion der Epithelzellen aus den kryokonservierten Gewebeproben... 33
3.10.2.1 Fixierung der Proben ... 34
3.10.2.2 Anfertigen der Schnitte ... 34
3.10.2.3 Histologische Färbung ... 35
3.10.2.4 Gewinnung des Epithels ... 35
3.11 Molekularbiologische Verfahren zur Analyse des Uterusepithels sowie der Granulosa- und Cumuluszellen... 38
3.11.1 RNA-Extraktion... 39
3.11.2 Qualitative und quantitative Analyse der RNA mit dem Experion™ Automated Elektrophoresis System®... 40
3.11.3 cDNA Herstellung mittels Reverser Transkriptase ... 42
3.11.4 Herstellung externer Standardreihen für die RT-qPCR ... 43
3.11.5 RT-qPCR... 49
3.11.5.1 Primer-Optimierung... 50
3.11.5.2 Messung der Proben ... 50
3.11.5.3 Auswertung ... 52
3.12 Molekularbiologische Verfahren zur Analyse der Oozyten ... 55
3.12.1 RNA-Extraktion... 55
3.12.2 cDNA Herstellung mittels Reverser Transkriptase ... 56
3.12.3 RT-qPCR... 57
3.13 Hormonanalysen im Blut ... 59
3.14 Statistische Auswertung ... 61
4 Ergebnisse ... 65
4.1 Ergebnisse der quantitativen und qualitativen Analyse der Uterus- Epithelzellproben sowie der Oozyten und Cumulus- und Granulosazellen... 65
4.2 mRNA-Expressionsstudien ... 68
4.2.1 Nachweisbarkeit der einzelnen Transkripte... 68
4.2.2 Variabilität der Genexpression ... 69
4.2.3 Einfluss des Zeitintervalls auf die mRNA-Expression... 70
4.2.4 Modulatorische Wirkung des Seminalplasmas auf die Genexpression des Uterusepithels ... 71
4.2.4.1 PTGS2 mRNA-Expression im Uterusepithel ... 71
4.2.4.2 Interleukin 6 mRNA-Expression im Uterusepithel ... 73
4.2.4.3 TNFA mRNA-Expression im Uterusepithel ... 74
4.2.4.4 TNFAIP6 mRNA-Expression im Uterusepithel ... 76
4.2.4.5 UBB mRNA-Expression im Uterusepithel... 78
4.2.5 Modulatorische Wirkung des Seminalplasmas auf die Genexpression des Epithels des uterinen Teils der uterotubalen Verbindung (UTV) ... 79
4.2.5.1 PTGS2 mRNA-Expression im Epithel des uterinen Teils der uterotubalen Verbindung (UTV)... 79
4.2.5.2 IL6 mRNA-Expression im Epithel des uterinen Teils der uterotubalen Verbindung (UTV)... 80
4.2.5.3 TNFA mRNA-Expression im Epithel des uterinen Teils der uterotubalen Verbindung (UTV)... 80
4.2.5.4 TNFAIP6 mRNA-Expression im Epithel des uterinen Teils der uterotubalen Verbindung (UTV) ... 81
4.2.5.5 UBB mRNA-Expression im Epithel des uterinen Teils der uterotubalen Verbindung (UTV)... 82
4.2.6 Modulatorische Wirkung des Seminalplasmas auf die Genexpression in den Granulosazellen... 84
4.2.6.1 PTGS2 mRNA-Expression in den Granulosazellen ... 84
4.2.6.2 PPARG1 mRNA-Expression in den Granulosazellen ... 86
4.2.6.3 PTX3 mRNA-Expression in den Granulosazellen ... 87
4.2.6.4 TNFAIP6 mRNA-Expression in den Granulosazellen ... 88
4.2.6.5 UBB mRNA-Expression in den Granulosazellen... 89
4.2.7 Modulatorische Wirkung des Seminalplasmas auf die Genexpression in den Cumuluszellen ... 90
4.2.7.1 PTGS2 mRNA-Expression in den Cumuluszellen ... 90
4.2.7.2 PTX3 mRNA-Expression in den Cumuluszellen ... 91
4.2.7.3 TNFAIP6 mRNA-Expression in den Cumuluszellen ... 92
4.2.7.4 UBB mRNA-Expression in den Cumuluszellen ... 93
4.2.8 Gruppierung der Tiere nach der Expressionsstärke in den Granulosa- und Cumuluszellen... 94
4.2.9 mRNA-Expression im Lokalisationsvergleich ... 96
4.2.9.1 Unterschiede in der Reaktivität des Uterus- und UTV- Epithels ... 96
4.2.10 Zusammenhänge zwischen Transkripten in den einzelnen Lokalisationen ... 104
4.2.10.1 PTGS2 – TNFA... 105
4.2.10.2 PTGS2 – PTX3 ... 106
4.2.10.3 PTGS2 – TNFAIP6 ... 108
4.2.10.4 PTX3 – TNFAIP6 ... 112
4.2.11 Zusammenhänge zwischen unterschiedlichen Transkripten in verschiedenen Lokalisationen... 113
4.2.12 Hormonanalysen im Blut... 119
4.2.13 Modulatorische Wirkung des Seminalplasmas auf die Genexpression in den Oozyten... 120
4.2.14 Zusammenhänge zwischen Transkripten in den Oozyten und den Cumuluszellen... 121
5 Diskussion... 131
6 Zusammenfassung... 141
7 Summary ... 144
8 Literaturverzeichnis ... 146
9 Anhang ... 159
9.1 Tabellen ... 159
9.2 Brunstkontrollblatt... 171
9.3 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 172
9.4 Medikamente und Reagenzien... 175
9.4.1 Lösungen für die Operation und Probengewinnung ... 177
9.4.1.1 PBS-Lösung... 177
9.4.1.2 PBS-Stocklösung... 177
9.4.1.3 PBS-Gebrauchslösung ... 177
9.4.1.4 PBS-Gebrauchslösung + BSA Zusatz (1 %) ... 178
9.4.1.5 TCM Air... 178
9.4.1.6 PBS mit PVA... 178
9.4.1.7 Lysispuffer... 178
9.4.1.8 1 mol NaOH ... 178
9.4.2 Lösungen für die Histologie... 179
9.4.2.1 DEPC-Wasser (0,1 %)... 179
9.4.2.2 Färbelösungen für die Kryoschnitte... 179
9.4.3 Plasmid pCR®2.1-TOPO®... 180
9.4.4 Medien und Primersequenzen für die molekularbiologischen Analysen des Uterusepithels sowie der Granulosa- und Cumuluszellen... 181
9.4.4.1 EDTA Stock, pH 8,0... 181
9.4.4.2 10x TBE-Puffer ... 181
9.4.4.3 1x TBE-Puffer ... 181
9.4.4.4 Zusätze, Medien und Nährböden für Bakterienkulturen... 181
9.4.4.5 LB (Lysogeny Broth)-Medium... 182
9.4.4.6 LB (Lysogeny Broth)-Agar ... 182
9.4.4.7 Primersequenzen zur Analyse der Uterus-, UTV-, Granulosazell- und Cumuluszellproben... 183
9.4.5 Medien und Primersequenzen für die molekularbiologischen Analysen der Oozyten... 184
9.4.5.1 Zusammensetzung der Dynabeadslösung... 184
9.4.5.2 Zusammensetzung des Lysis/Binding Buffers ... 184
9.4.5.3 Zusammensetzung des Washing Buffer A ... 184
9.4.5.4 Zusammensetzung des Washing Buffer B ... 185
9.4.5.5 Primersequenzen zur Analyse der Oozyten... 186
10 Abbildungsverzeichnis ... 187
11 Tabellenverzeichnis ... 194
Abkürzungsverzeichnis
15d-PGJ2 15-deoxy-Prostaglandin J2
A. Arteria
Aq. dest. Aqua destillata Aq. bidest. Aqua bidestillata Aq. tridest Aqua tridestillata Areg Amphiregulin
BMP15 Bone Morphogenetic Protein 15 BSA Bovines Serumalbumin
BTS Beltsville Thawing Solution
bzw. Beziehungsweise
CD45 Cluster Differentation 45 CDK1 Cyclin-dependent Kinase 1
cDNA Complementary DNA, komplementäre Desoxyribonukleinsäure COC Cumulus-oocyte complex
Ct threshold cycle
DEPC Diethylpyrocarbonat
Dif Differenz
DNA desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure Dnase Desoxyribonuklease
dnTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DTT Dithiothreitol
E.coli Escherichia coli
eCG Equines Choriongonadotropin
Eges Gesamtöstrogen
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGF Epidermal-Growth-Factor Ereg Epiregulin
FAF Fatty Acid Free
FSH Follikel stimulierendes Hormon
g Gramm
G Gauge
gDNA Genomic Desoxyribonucleic acid, genomische Desoxyribonukleinsäure GDF9 Growth/Differentiation Factor 9
GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony-stimulating Factor
h Stunde (hour)
HAS2 Hyaluronan Synthase 2
hCG Humanes Choriongonadotropin H.E. Hämatoxylin Eosin
HGF Hepatozyt-Growth-Factor
Hind III Restriktionsenzym aus Haemophilus influenzae
Hz Hertz
i.m. Intramuskulär
i.v. Intravenös inkl. Inklusive IL6 Interleukin 6
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid IαI Inter-alpha Trypsin Inhibitor
K Kontrollseite
Kb Kilobase
l Liter
lacZ Gen, das für das Enzym β-Galactosidase codiert
LB Lysogeny Broth
LH Luteinisierendes Hormon LMD Laser Mikrodissektion LPS Lipopolysaccharid
MAPK1 Mitogen-Activated Protein Kinase 1 (synonym: ERK2: Extracellular Signal-regulated Kinase 2)
MAX Maximum
MED Median
Mio. Million
µg Mikrogramm
mg Milligramm
mg/kg KGW Milligramm pro Kilo Körpergewicht
MHC Major Histocompatibility Complex, Haupthistokompatibilitätskomplex
min Minute
MIN Minimum
miRNA Mikro-RNA
ml Milliliter
mmHg Millimeter Quecksilbersäule
µm Mikrometer
µm² Quadrat Mikrometer
MPC Magnetic Particle Concentrator mRNA Messenger RNA, Boten RNA
MuLV Murine Leukaemia Virus, Leukämievirus der Maus MVB Multivesicular Bodies
MW Mittelwert
n Probandenzahl
ng Nanogramm
nmol Nanomol
nm Nanometer
OD260 Optische Dichte bei 260 nm OIF Ovulation Inducing Factor OSF Oocyte Secreted Factor
P PCR-Produktlänge in Basenpaaren p Irrtumswahrscheinlichkeit (probability)
p.os. Per os
PBS Phosphate Buffered Saline, phosphatgepufferte Salzlösung PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
PCR Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Kettenreaktion
PEN Polyethylennaphthalat PGE2 Prostaglandin E2
PGES Prostaglandin E-Synthase PGF2α Prostaglandin F2α
PGFS Prostaglandin F-Synthase PGH2 Prostaglandin H2
PMN Polymorphonuclear leukocytes
PPAR Peroxisome Proliferator-Activated Receptor
PPARA Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha PPARD Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Delta/Beta PPARG Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma PR Progesteron Rezeptor
PRR Pathogen-Recognition Receptor
PTGS2 Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2 (synonym COX2:
Cyclooxygenase 2)
PTX3 Pentraxin 3
PVA Polyvinylalkohol r Korrelationskoeffizient
R. Ramus
R² Bestimmtheitsmaß
RNA Ribonucleicacid, Ribonukleinsäure Rnase Ribonuklease
RQI RNA-Qualitäts-Index RT Reverse Transkriptase
RT-qPCR Quantitative Reverse Transkriptase-PCR in Echtzeit
S Standardkonzentration
s Sekunde
Sca I Restriktionsenzym aus Streptomyces caespitosus SD Standard deviation, Standardabweichung
sog. Sogenannt
SP Seminalplasma
TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer TCM 199 Tissue Culture Medium 199 TGFβ Transforming Growth Factor β TLR Toll Like Receptor
TNFA Tumor Necrosis Factor Alpha
TNFAIP6 Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Protein 6 (synonym: TSG6:
Tumor Necrosis Factor-stimulated Gene 6)
UBB Ubiquitin B
UTV Uterotubale Verbindung
UV-A Ultraviolettstrahlung (Wellenlängenbereich 380–315 nm)
V Versuchsseite
V. Vena
vol% Volumenprozent
x g Gravitational acceleration, Erdbeschleunigung X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-beta-D-Galactopyranosid ZAR1 Zygote Arrest 1
1 Einleitung
Seminalplasma stellt den Hauptanteil des großvolumigen Eberejakulates (bis 600 ml) dar. Faktoren des Seminalplasmas modulieren nicht nur die Funktion der Spermatozoen bei der Befruchtungskaskade, sondern üben zusätzlich einen Einfluss auf den weiblichen Reproduktionstrakt aus (TÖPFER-PETERSEN et al. 1998).
WABERSKI et al. (1995) stellten fest, dass die transzervikale Verabreichung von Seminalplasma zu Brunstbeginn bei spontan östrischen Jungsauen zu einer Ovulationsvorverlegung von bis zu 14 Stunden führte. Die zugrunde liegenden Mechanismen, mit denen der uterine Seminalplasmastimulus an das Ovar vermittelt wird, sind weitestgehend unbekannt. Frühere Untersuchungen weisen dabei auf eine spezifische Rolle der uterotubalen Verbindung hin (WABERSKI et al. 1999). Es wird vermutet, dass Seminalplasma zu einer lokalen Immunmodulation führt, in deren Folge präovulatorische Ereignisse im Ovar östrischer Sauen reguliert werden, die in einer induzierten Ovulation münden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Kurzzeiteffekte einer uterinen Seminalplasma- Infusion auf die Genexpression immun- und follikelreifungsassoziierter Transkripte des Uterus und des Ovars bei östrischen Jungsauen zu untersuchen. Dabei kam ein In- vivo-Tiermodell zur Anwendung, mit dem durch unicornuale Applikation von Seminalplasma und kontralaterale Kontrolle Behandlungseffekte unter Minimierung tierindividueller Einflüsse erfasst werden konnten. Gleichzeitig erlaubte das Tiermodell, tierspezifische Reaktionen auf die Behandlung zu differenzieren. Besondere Aufmerksamkeit wurde auf eine potentielle spezifische Regulation der Genexpression an der uterotubalen Verbindung (UTV) gelegt.
2 Literaturübersicht
2.1 Charakterisierung des Einflusses von Seminalplasma auf den Genitaltrakt der Sau
Seminalplasma stellt den spermienfreien Anteil des Spermas dar und dient nicht nur dem Transport der Spermien und deren Nährstoffversorgung, sondern interagiert auch unmittelbar mit dem Uterus (MANN 1964). Es führt zu einer Reihe von immunologischen Reaktionen (SCHUBERTH et al. 2008) und zu Veränderungen in der Genexpression im endometrialen Gewebe (TAYLOR et al. 2009b). ROZEBOOM et al. (2000) applizierten spontan östrische Sauen zwölf Stunden nach Brunstfeststellung (zweimal tägliche Brunstkontrolle) mit einem Besamungskatheter Verdünner, Verdünner mit 20 µg Lipopolysaccharid (LPS) oder Verdünner mit 3 x 109 abgetöteten Spermien. Zwölf bis 18 Stunden später erfolgte eine künstliche Besamung mit 3 x 109 Spermatozoen in 100 ml Seminalplasma oder mit 3 x 109 Spermatozoen in 100 ml Verdünner plus 11,5 µg Östrogen (5 µg Östradiol-17, 4,5 µg Östronsulfat und 2 µg Östron). Die Konzeptions- und Ferkelrate war bei den Sauen, die im Anschluss an den durch LPS oder abgetötete Spermien gesetzten entzündlichen Stimulus eine künstliche Besamung von Spermatozoen in 100 ml Seminalplasma erhielten, signifikant höher als bei den Sauen, die ohne Seminalplasma inseminiert wurden.
Die transzervikale Verabreichung von 100 ml Seminalplasma zu Brunstbeginn führte bei spontan östrischen Jungsauen zu einer Ovulationsvorverlegung um durchschnittlich 10,7 Stunden (8 bis 14 Stunden; WABERSKI et al. 1995). Es wurden zweimal täglich Brunstkontrollen durchgeführt und es konnte gezeigt werden, dass der deutlichste Effekt hinsichtlich der Ovulationsvorverlegung (8,5 ± 0,9 Stunden) erreicht wird, wenn das Seminalplasma gleich zu Beginn des Östrus appliziert wird. Wurde die Behandlung 16 Stunden nach Östrusbeginn durchgeführt, verkürzte sich dieser Effekt auf 4,6 ± 3,8 Stunden. Erfolgte die Seminalplasma-Behandlung 24 Stunden nach Brunstbeginn, d.h. zum praxisüblichen Zeitpunkt der ersten Besamung, konnte keine
Ovulationsvorverlegung mit Seminalplasma induziert werden (WABERSKI et al. 1997).
Die Seminalplasmainfusion in den Uterus von präpubertären Jungsauen hatte ebenfalls einen Effekt auf die Plasmaprogesteronkonzentration in der frühen Trächtigkeit. Nach Östrusinduktion durch hCG wurde den Tieren einen Zyklus später sechs bis zwölf Stunden nach Brunstfeststellung Seminalplasma transzervikal verabreicht. Zwei künstliche Besamungen (3 x 109 Spermatozoen) erfolgten zwei Stunden später und am darauf folgenden Morgen. Die Sauen wiesen eine Erhöhung der Plasmaprogesteronkonzentration an den Tagen fünf bis neun nach Seminalplasmabehandlung auf (p < 0,05; O'LEARY et al. 2006).
Die Dauer des Östrus ist variabel; er liegt im Durchschnitt bei 40 bis 60 Stunden, kann aber zwischen 24 Stunden und 96 Stunden variieren (SOEDE u. KEMP 1997). Durch die Vorverlegung der Ovulation könnte das Intervall zwischen Brunstbeginn und Ovulation reduziert bzw. standardisiert werden. So könnte die Paarung an dem optimalen Zeitpunkt stattfinden und die Befruchtungsraten maximiert werden (O'LEARY et al. 2002).
2.1.1 Immunmodulatorische Effekte auf zellulärer Ebene
Nach Insemination kommt es innerhalb von Stunden zu einer schnellen und hochgradigen EInwanderung neutrophiler Granulozyten in das Uteruslumen (CLAUS 1990) und zusätzlich zur Einwanderung von Makrophagen, dendritischen Zellen, Granulozyten und Lymphozyten vom Blut in das endometriale Stroma (BISCHOF et al.
1994). Dieses Phänomen wird als post mating inflammatory response bezeichnet. Bei Mäusen konnte nach der Interaktion von Seminalplasma mit zervikalen und uterinen Epithelzellen die Synthese verschiedener proinflammatorischer Zytokine beobachtet werden. Diese Faktoren führten zur Extravasation und zur Einwanderung von Makrophagen, dendritischen Zellen und Granulozyten in das subepitheliale Stroma des Uterus (ROBERTSON et al. 1996).
In einem Tiermodell am Schwein wurden 25 cm distal von der uterotubalen Verbindung (UTV) Ligaturen an beiden Uterushörnern gelegt. Zwanzig Milliliter
Ebersperma wurde in das eine Uterushorn, 20 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) in das andere Horn injiziert. Eineinhalb Stunden später wurden Gewebeproben des Uterus und der UTV genommen. Immunhistochemisch konnten mehr MHC Klasse II positive Zellen in dem Gewebe festgestellt werden, das aus dem mit Sperma behandelten Horn stammte. Daher könnten antigenpräsentierende Zellen eine Rolle in der Immunantwort auf männliche Antigene spielen. Zudem zeigte die UTV der mit Sperma behandelten Seite mehr MHC Klasse II positive Zellen als die Uterusprobe dieser Seite. Dies kann auf eine sensiblere Rolle der UTV hindeuten (WABERSKI et al. 2006).
O'LEARY et al. (2004) untersuchten den Effekt auf uterine Leukozyten 34 Stunden nach einer Applikation von 100 ml Seminalplasma in den Uterus. Die transzervikale Verabreichung erfolgte bei Jungsauen mit induziertem Östrus ein bis zwei Stunden nach hCG-Gabe. O'LEARY et al. (2004) konnten immunhistochemisch eine höhere Infiltration von Leukozyten (p < 0,001) sowohl im superfizialen Endometrium als auch im Stroma und Myometrium verglichen zur PBS-Kontrollgruppe feststellen. Bei den eingewanderten Leukozyten handelte es sich größtenteils um Makrophagen; die Anwesenheit dieser Zellen stieg um 62-85 % in den einzelnen Gewebeabschnitten. Es wurden außerdem analog zu WABERSKI et al. (2006) mehr MHC Klasse II positive Zellen im Endometrium sowie im Stroma nach Seminalplasma festgestellt (O'LEARY et al. 2004). JIWAKANON et al. (2011) verabreichten spontan östrische Jungsauen 15 bis 20 Stunden nach Brunstfeststellung (Brunstkontrolle alle vier Stunden) transzervikal verschiedene Lösungen. Sie konnten weder fünf bis sechs, noch 35 bis 40 Stunden nach Applikation von 100 ml Seminalplasma einen signifikanten Unterschied zur Beltsville Thawing Solution (BTS)-Gruppe in Hinsicht auf die Verteilung von neutrophilen Granulozyten im oberflächlichen Epithel des porcinen Uterus feststellen. Es zeigte sich aber im Vergleich zu BTS die Tendenz eines suppressiven Effekts von Seminalplasma auf die Anwesenheit neutrophiler Granulozyten (auch polymorphonuclear leukocytes genannt, PMN) im subepithelialen Bindegewebe. TAYLOR et al. (2009a) konnten nach Spülungen porciner Uteri feststellen, dass die transzervikale Verabreichung von Seminalplasma mit Besamungskatheter nur zu einer moderaten (p > 0,05) Leukozyten-Erhöhung im
Vergleich zur nicht katheterisierten Gruppe führte. Die Applikation des konventionellen Samenverdünners Androhep™ erhöhte hingegen die Einwanderung von Leukozyten in das porcine uterine Lumen drei Stunden nach transzervikaler Verabreichung im Vergleich zu Seminalplasma signifikant. Desweiteren konnte durch In-vitro- Transmigrations-Assays mit aus Blut gewonnenen Leukozyten gezeigt werden, dass die durch rekombinantes humanes Interleukin 8 induzierte Leukozyten-Transmigration durch Androhep™ signifikant gehemmt wurde. Vor allem das in dem hier verwendeten Verdünner beinhaltete Citrat zeigte die auffälligste Hemmung der Chemotaxis; wurde Androhep™ ohne Citrat im In-vitro-Transmigrationsassay getestet, konnte keine Hemmung der Transmigration mehr festgestellt werden. Dies zeigt, dass die durch Androhep™ induzierte Leukozytenmigration in den Uterus kein Resultat direkter Chemotaxis zu sein scheint, denn die Chemotaxis wird in vitro durch den in Androhep™ beinhalteten Chelatbildner Citrat verhindert. Stattdessen könnte die Zunahme der Leukozyten durch einige unspezifische Irritationen der Epithelzellen oder der residenten Leukozytenpopulation zustande gekommen sein (TAYLOR et al.
2009a).
Die seminalplasmainduzierte Infiltration von Leukozyten in das Uteruslumen und Uterusgewebe scheint eine größere Rolle als nur die Beseitigung überzähliger Spermatozoen und Mikroorganismen zu haben. Makrophagen z.B. sezernieren unter anderem eine Reihe von Enzymen und können das Zellwachstum sowie die Zelldifferenzierung und -funktion beeinflussen (HUNT u. ROBERTSON 1996). So applizierten O'LEARY et al. (2004) 100 ml Seminalplasma bzw. 100 ml PBS mittels Besamungskatheter bei Jungsauen zwei Stunden nach hCG-Gabe. Weitere zwei Stunden später sowie am nächsten Morgen erhielten die Sauen zwei Inseminationen mit je 3 x 109 Spermatozoen. An Tag 5 und Tag 9 konnten dann verglichen zur Kontrollgruppe (PBS) signifikant mehr Embryonen mittels Spülung aus dem Uterus gewonnen werden.
Die nach Insemination im Uterus vorhandenen Zellen dienen außerdem als wichtige Zytokinquelle. Neutrophile Granulozyten produzieren pro Zelle zwar weniger Moleküle eines Zytokins als Makrophagen oder Lymphozyten, da sie aber oft die
mononukleären Leukozyten an Entzündungsherden zahlenmäßig übertreffen, könnten sie dennoch eine wichtige Zytokinquelle darstellen (SCHUBERTH et al. 2008).
Leukozyten und deren Zytokine könnten also eine Verbindung zwischen dem Einfluss der Seminalplasmakomponenten und der Beschleunigung der Geschehnisse, die in der Ovulation enden, darstellen. Mögliche Lokalisationen der Leukozyten sind das Uteruslumen, die uterine Mukosa und die lymphatischen Gefäße, die den Uterus versorgen. Induzierte Zytokine könnten mittels Lymphe via Countercurrent Transfer die Graaf’schen Follikel erreichen und beeinflussen (WABERSKI et al. 2006). Die Zytokin- Sekretion könnte die Leukozytenpopulationen auch dahingehend beeinflussen, in die Wände der Graaf’schen Follikel einzuwandern und dort lokal Zytokine zu produzieren (WABERSKI et al. 2006).
Auch ESPEY (1994) verknüpfte den Ovulationsprozess mit einer entzündlichen Reaktion, deren Eigenschaft vor allem die Infiltration verschiedener Leukozytenpopulationen in und durch das Gewebe der Graaf’schen Follikel darstellt.
Zytokine, die von den angelockten Leukozyten freigesetzt werden, sollen entscheidend an der Veränderung der Follikelwand beteiligt sein (BUKULMEZ u. ARICI 2000).
O'LEARY et al. (2006) zeigten 34 Stunden nach intrauteriner Infusion von 100 ml Seminalplasma mittels transzervikalem Besamungskatheter immunhistochemisch viermal mehr (p = 0,001) CD45-positive Leukozyten im Follikel- und Stromagewebe des porcinen Ovars verglichen zur PBS-Kontrollgruppe. Bei diesen Zellen handelte es sich größtenteils um aktivierte Makrophagen und/oder dendritische Zellen. Begleitend wurden 34 Stunden nach der intrauterinen Infusion von 100 ml Seminalplasma bzw.
100 ml PBS Granulosazellen und Thekagewebe gewonnen und mit 5 IU/ml hCG kultiviert. Dabei konnte eine signifikant erhöhte Progesteronproduktion durch beide Zelltypen im Vergleich zur kultivierten PBS-Kontrollgruppe im Zellkulturmedium festgestellt werden. Diese erhöhte Progesteronproduktion konnte ebenfalls bei Mäusen (KIRSCH et al. 1981), Menschen (HALME et al. 1985) und Schweinen (STANDAERT et al. 1990) durch Granulosazellen in Co-Kultivierungsexperimenten mit Makrophagen ohne eine gleichzeitige Granulosazellproliferation hervorgerufen werden (O'LEARY et al. 2006). O'LEARY et al. (2006) konnten außerdem ein Auseinanderweichen der Plasmaprogesteronprofile zwischen den
Behandlungsgruppen feststellen. Der Plasmaprogesteronspiegel war während des Zeitfensters von Tag fünf bis zum Ende der Studie am Tag neun bei der Seminalplasma-Gruppe um 20 % (p < 0,001) höher als bei der PBS-Kontrollgruppe.
Die Autoren vermuten, dass die in das Ovar rekrutierten Leukozyten an der Etablierung und der Vermittlung der Follikelantwort auf Seminalplasma beteiligt sein könnten. Die Makrophagen sowie ihre Produkte könnten die Architektur und Funktionalität des vaskulären Stromas und des Thekagewebes des Ovars mit direkten oder indirekten Effekten auf die Granulosazellen beeinflussen (O'LEARY et al. 2006).
2.1.2 Immunmodulatorische Effekte auf molekularer Ebene
Jungsauen wurde 24 Stunden nach Induktion des Östrus durch eine hCG-Injektion 100 ml Seminalplasma transzervikal verabreicht. Drei Stunden nach intrauteriner Applikation konnte bei den Seminalplasma-Tieren verglichen zu einer nicht transzervikal infundierten Kontrollgruppe im Endometrium weder bei den Transkripten Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2 (PTGS2) noch bei Interleukin 6 (IL6) oder Tumor Necrosis Factor Alpha (TNFA) ein signifikanter Unterschied mittels quantitativer Reverse Transkriptase PCR in Echtzeit (RT-qPCR) festgestellt werden. Die Expressionsstärke erwies sich verglichen mit der der Kontrollgruppe als erstaunlich niedrig. Dafür konnte bei PTGS2 ein signifikanter Unterschied zwischen Seminalplasma und dem kommerziellen Eberspermaverdünner Androhep™ (höher) in der Expression festgestellt werden. Dies ließ die Autoren vermuten, dass eventuelle immunstimulierende Inhaltsstoffe im Samenverdünner für diese Reaktion verantwortlich sind und im Seminalplasma nicht vorkommen. Es wäre aber auch möglich, dass die Reaktion durch einen reinen Volumeneffekt von Androhep™
zustande kommt, dann allerdings müssten immunsuppressive Inhaltsstoffe im Seminalplasma vorhanden sein, die zu einer geringeren Genexpression führen (TAYLOR et al. 2009b). Diese Gene sind relevant, da PTGS2 den initialen Schritt der Synthese von Prostaglandinen aus Arachidonsäure katalysiert und TNFA ebenso wie IL6 als proinflammatorisches Zytokin die akute Immunantwort moduliert.
Auch O'LEARY et al. (2004) untersuchten den Effekt von Seminalplasma auf die Genexpression im porcinen Uterus. Bei Jungsauen wurde der Östrus induziert und den Tieren ein bis zwei Stunden nach hCG-Gabe mittels transzervikalem Katheter 100 ml Seminalplasma intrauterin appliziert. 34 Stunden später wurden die Tiere geschlachtet und der Uterus entnommen. Mittels quantitativer RT-PCR wurden verschiedene Transkripte im endometrialen Gewebe untersucht. So konnte 34 Stunden nach Seminalplasmaapplikation eine zur PBS-Kontrollgruppe signifikant erhöhte (4,5-fache) Expression von PTGS2 festgestellt werden. Am Tag fünf war diese Expression jedoch in der PBS-Kontrollgruppe sechsfach höher als in der Versuchsgruppe. Die TNFA- Expression war unempfänglich für die Seminalplasma-Behandlung, bei IL6 konnte ebenso wie bei PTGS2 eine signifikant höhere Expression 34 Stunden nach Seminalplasmaapplikation im Vergleich zur PBS-Kontrolle festgestellt werden (O'LEARY et al. 2004). Nur drei Stunden nach Zusatz von Seminalplasma konnte auch in einer In-vitro-Kultivierung von porcinen Uterusepithelzellen eine signifikant höhere Expression von IL6 gemessen werden (MADEJ et al. 2012).
Eine weitere Studie zeigt den Effekt fünf bis sechs Stunden sowie 35-40 Stunden nach der intrauterinen Verabreichung von Seminalplasma. Die transzervikale Applikation wurde 15-20 Stunden nach Brunstfeststellung bei spontan östrischen Jungsauen durchgeführt. Es konnte im Gegensatz zu den Untersuchungen von MADEJ et al.
(2012) kein signifikanter Unterschied bei der IL6-Expression zwischen Seminalplasma und dem Samenverdünner BTS festgestellt werden (JIWAKANON et al. 2011). Den Unterschied zu den Studien von O'LEARY et al. (2004) erklären die Autoren mit Unterschieden zwischen den Tieren und Material und Methoden.
2.2 Immun- und follikelreifungsassoziierte Transkripte im weiblichen Genitaltrakt
Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) sind Mitglieder der Nuclear Hormone Receptor Superfamilie der Ligand-abhängigen Transkriptionsfaktoren, werden also durch Ligandenbindung aktiviert. Drei Subtypen, nämlich PPAR Alpha
(PPARA), PPAR Delta/Beta (PPARD) und PPAR Gamma (PPARG) sind bei Säugetieren bekannt (LORD et al. 2006). LORD et al. (2006) führten einen Nachweis vom Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma (PPARG) sowohl im trächtigen (Tag 15 und Tag 25) als auch im nicht trächtigen porcinen Uterus mittels Immunhistochemie durch, da PPARG eine essentielle Rolle für die Trächtigkeit bei Mäusen spielt, es scheint für die Differenzierung der Plazenta benötigt zu werden (BARAK et al. 1999). Der bei LORD et al. (2006) verwendete Antikörper kann nicht zwischen den zwei Isotypen PPARG1 und PPARG2 unterscheiden, es könnte sich daher in dem positiv gefärbten Epithel des Uterus zyklischer Sauen sowie trächtiger Sauen (Tag 15 und Tag 25) um PPARG1 und/oder PPARG2 handeln. Mittels real time PCR konnte allerdings die mRNA-Expression sowohl von PPARG1 als auch von PPARG2 nachgewiesen werden (LORD et al. 2006).
PPARG wurde bereits ebenfalls in ovariellem Gewebe untersucht. Mittels RT-PCR konnte es in den Granulosazellen von Frauen, die sich einer In-vitro-Fertilisation unterzogen (MU et al. 2000) sowie in porcinen Theka- und Granulosazellen (SCHOPPEE et al. 2002) nachgewiesen werden. PPARs können auf zwei Weisen die Synthese von Östrogen beeinflussen. Zum einen können sie die Synthese durch Bindung an sogenannte Estrogen Response Elements (EREs) beeinflussen und so als kompetitive Inhibitoren agieren (KELLER et al. 1995). Zum anderen kann PPARG durch Hemmung der Aromatase-Expression in humanen Granulosazellkulturen die Synthese von Östrogen beeinflussen, da Androgene nicht mehr zu Östradiol umgewandelt werden können (FAN et al. 2005). PPARs beeinflussen darüber hinaus die Synthese von Prostaglandinen und stellen daher wichtige Mediatoren der Entzündung dar. Die Promotor-Region von PTGS2 beinhaltet ein sogenanntes Response-Element für PPARs, so können PPARs auf diese Weise die Transkription von PTGS2 direkt beeinflussen (MEADE et al. 1999). Dennoch gibt es widersprüchliche Berichte über den Einfluss von PPARs auf PTGS2. MEADE et al.
(1999) berichteten von stimulierenden Einflüssen. Sie behandelten humane Zellen mit dem PPAR-Agonisten WY-14,643 und konnten feststellen, dass es zu einer vermehrten PTGS2-Proteinexpression in Mamma- und Colonepithelzellen führte.
INOUE et al. (2000) und SUBBARAMAIAH et al. (2001) berichteten, dass Liganden
von PPARG die Phorbolester (PMA)-vermittelte Induktion der PTGS2-Synthese im humanen Epithelzellen hemmten. Aber nicht nur PPARs regulieren die PTGS2- Produktion, sondern Prostaglandine selber stellen endogene Liganden dar, die ihrerseits PPARs aktivieren können. Es scheint also eine zyklische Beziehung zwischen der Anwesenheit von Prostaglandinen, Aktivierung und/oder Inhibierung von PPARs und dem Feedback zu dem Prostaglandin-synthetisierenden Enzym PTGS2 zu geben (KOMAR 2005). Desweiteren übt PPARG einen Einfluss auf die Progesteron- und Androgensynthese in porcinen Thekazell-Kulturen aus. Nach Zugabe des PPARG-Liganden 15d-PGJ2 (15-deoxy-Prostaglandin J2) konnte konzentrationsabhängig eine Stimulation der Progesteronproduktion und eine Hemmung der Androgen-Biosynthese gemessen werden (SCHOPPEE et al. 2002).
Die Ovulation ist ein Prozess, der durch den Anstieg von LH induziert wird und bei dem eine reife Eizelle mit ihren umgebenden Cumuluszellen den Follikel verlässt (ESPEY L.L. 1999; RUSSELL u. ROBKER 2007). Cumuluszellen bieten die Möglichkeit, durch Analyse potentieller Marker-Transkripte, die in den Cumuluszellen exprimiert werden, auf die Qualität der Eizelle zu schließen (CILLO et al. 2007). Die Entfernung von Cumuluszellen ist einfach und ohne direkte Manipulation der Eizelle möglich, so dass kein experimenteller Stresseinfluss auf die Eizelle zu erwarten ist.
Hyaluronan Synthase 2 (HAS2) würde sich sich als ein cumulusassoziierter Qualitätsmarker anbieten. HAS2 kontrolliert die Produktion von Hyaluronsäure, die eine Hauptkomponente in der Cumulusmatrix darstellt und während der Cumulusexpansion von Cumuluszellen sezerniert wird (WEIGEL et al. 1997). Eine weitere wichtige Komponente der Cumulusmatrix ist das lange Pentraxin 3 (PTX3), das für die Stabilität der Matrix eine Rolle spielt (VARANI et al. 2002). Eizellen von PTX3 defizienten Mäuse können in vitro, aber nicht in vivo befruchtet werden. Cumuli der PTX3 defizienten Mäusen synthetisieren zwar Hyaluronsäure, sind aber unfähig, diese in einer stabilen Matrix zu organisieren. Wird exogenes PTX3 hinzugefügt, entsteht wieder ein normaler stabiler Cumulus-Phänotyp (SALUSTRI et al. 2003).
PTX3 kann nicht direkt mit der Hyaluronsäure binden, aber die Anwesenheit von PTX3 ist essentiell, um Hyaluronsäure-Moleküle für den expandierenden Cumulus in der extrazellulären Matrix zu halten. Das Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Protein 6
(TNFAIP6) wird in Cumuluszellen des präovulatorischen Follikels während des Expansionsprozesses gebildet und ist die Komponente, die die Interaktion zwischen Hyaluronsäure und PTX3 vermittelt (FULOP et al. 1997). Es wird üblicherweise mit Entzündungen in Verbindung gebracht und besitzt die Fähigkeit, Hyaluronsäure spezifisch zu binden (LEE et al. 1992). Der Inter-alpha Trypsin Inhibitor (IαI) ist ein Serum-Protein Komplex, der durch zwei schwere und eine leichte Kette kovalent zu Chondroitinsulfat verbunden ist. Im expandierenden Cumulus werden die schweren Ketten des IαI vom Chondroitinsulfat zur Hyaluronsäure verlagert; TNFAIP6 ist essentiell, damit dieser Vorgang beendet wird (CHEN et al. 1996). Daher stellt TNFAIP6 in dieser Reaktion einen Schlüsselkatalysator dar (RICHARDS et al. 2008).
Mäuse mit fehlerhaftem TNFAIP6 können ebenfalls keine stabile Cumulusmatrix bilden und sind steril (FULOP et al. 2003). In porcinen Follikeln kann TNFAIP6 in Cumulus- Oozyten-Komplexen (COCs) und Granulosazellen nachgewiesen werden (NAGYOVA et al. 2009). Auch im Endometrium trächtiger Schweine ist die mRNA-Expression von TNFAIP6 nachgewiesen worden (ASHWORTH et al. 2010). Das bereits erwähnte PTX3 ist in der Literatur in Cumuluszellen beschrieben und würde sich ebenfalls als Qualitätsmarker anbieten. Jedoch ist diese Beziehung nicht eindeutig geklärt. Um eine mögliche Korrelation zwischen der PTX3-Expression in Cumuluszellen und dem Entwicklungspotential von Eizellen in vitro festzustellen, untersuchten ZHANG et al.
(2005) Cumuluszellen von Eizellen, die zur In-vitro-Fertilisation verwendet wurden. Sie verglichen die PTX3-Expression in Cumuluszellen von Eizellen, die nicht befruchtet werden konnten, mit der PTX3-Expression von Cumuluszellen, deren Eizellen sich in Achtzell-Embryos am Tag drei entwickeln konnten. Die PTX3 mRNA- Expressionsstärke in Cumuluszellen von Eizellen, sie sich nach drei Tagen im Achtzellstadium befanden, war zwölfmal höher (p < 0,01) als die PTX3- Expressionsstärke in Cumuluszellen von Eizellen, die nicht befruchtet werden konnten.
Eine Veränderung der PTX3-Expression in Cumuluszellen könnte daher laut Autoren Rückschlüsse auf die Qualität der von ihnen eingeschlossenen Eizelle zulassen.
MCKENZIE et al. (2004) und CILLO et al. (2007) konnten allerdings keine Beziehung zwischen PTX3 Expressionsstärken und der Oozytenqualität bis 72 Stunden nach der Befruchtung ausmachen.
Während des Ovulationsprozesses wird der Follikel hyperämisch, produziert große Mengen von Prostaglandinen und eine hyaluronreiche Matrix. Die LH-induzierte Signalkaskade führt in den Granulosazellen zur Induktion von Epidermal-Growth- Factor- (EGF-) ähnlichen Faktoren, wie z.b. Amphiregulin (Areg), Epiregulin (Ereg) und Betacellulin (CONTI et al. 2006; HSIEH et al. 2007). Die EGF-ähnlichen Faktoren wiederum führen zur Aktivierung der EGF-Rezeptoren und regulieren die Induktion von Genen in Cumuluszellen, die an der Cumulusexpansion beteiligt sind, wie HAS2, PTGS2, TNFAIP6 und PTX3 (RICHARDS et al. 2008). Daraufhin erfolgt die Formation der vorher genannten hyaluronsäurereichen Matrix. Schlüsselfaktor dieser Veränderungen ist die Aktivierung der Mitogen-Activated Protein Kinase 1 (MAPK1, ehemals: ERK2: Extracellular signal-regulated kinase 2; CONTI et al. 2006; FAN et al.
2009). Ebenfalls bedeutend für die Ovulation ist die Induktion des Progesteron- Rezeptors (PR) in den Granulosazellen und die Induktion von PR-regulierten Genen wie IL6 und PPARG (KIM et al. 2008). Eine weitere Studie gibt den Hinweis, dass die Signal-Kaskade, die in der Ovulation endet, facettenreicher ist und das angeborene Immunsystem mit einschließt (SHIMADA et al. 2006).
So sind Mitglieder des Pathogen-Recognition Receptor (PRR) Systems maßgeblich an der Einleitung einer Immunantwort beteiligt. Ein Mitglied ist die Familie der Toll-like- Rezeptoren (TLR). Sie werden z.B. in Granulosa- und Cumuluszellen exprimiert und beeinflussen dort die Expression spezifischer Gene, die zur Ovulation beitragen (LIU et al. 2008). Toll-like-Rezeptoren sind eine Gruppe von Membran-gebundenen Proteinen, die eine Vielzahl von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (sog.
PAMPs, Pathogen-Associated Molecular Patterns) erkennen und im Anschluss eine Immunzellantwort herbeiführen können (AKIRA u. TAKEDA 2004; KAWAI u. AKIRA 2007). Verschiedene Arbeitsgruppen haben TLRs bereits in ovariellem Gewebe beschrieben: ALVAREZ et al. (2006) detektierten TLR4 im porcinen Ovargewebe, TLR 4, 8 und 9 wurden in Granulosa- und Cumuluszellen von Mäusen nachgewiesen (SHIMADA et al. 2006). SHIMADA et al. (2006) konnten auch zeigen, dass der TLR 4 funktionierte, da sein exogener Ligand Lipopolysaccharid (LPS) zur Expression der TLR4-Zielgene führte, zu denen unter anderem PTGS2, IL6 und TNFA gehören. Auch in uterinen Epithelzellen von Menschen und Mäusen induzieren bakterielle
Lipopolysaccharide die Zytokinsynthese durch Bindung an die Toll-Like-Rezeptoren 2 und 4 im Uterus. Das Vorhandensein verschiedener Bakterien im Samen könnte so auch das Zytokinprofil des uterinen Epithels durch die Bindung an verschiedene TLRs erklären (SCHAEFER et al. 2004). TLRs können auch von nicht pathogenen, endogenen Liganden wie Hyaluronsäure aktiviert werden und in der Befruchtung involviert sein (SHIMADA et al. 2008). Ovulierte COCs von Mäusen wurden mit aufgereinigten Hyaluronsäurefragmenten kultiviert. Anschließend wurden sie mit Hyaluronidase behandelt oder Spermien als eine physiologische Quelle für Hyaluronidase ausgesetzt. Die Hyaluronsäure und Hyaluronidase führten innerhalb von zwei Stunden zur Expression verschiedener Transkripte, wie z.B. IL6. Anti-TLR2 und anti-TLR4 neutralisierende Antikörper konnten die Hyaluronsäure- und Hyaluronidase-induzierte Genexpression signifikant hemmen. Wurden die ovulierten COCs mit Spermien kultiviert, wurde die Zytokin- und Chemokin-Expression ebenfalls induziert, konnte aber auch durch TLR2/TLR4-Antikörper oder durch Hyaluronsäure- blockierende Peptide (Pep-1) gehemmt werden. TLR2 and TLR4 auf den Cumuluszellen werden also durch die Co-Kultur mit Spermien in einer Hyaluronsäure- Fragment-abhängigen Weise aktiviert (SHIMADA et al. 2008).
2.3 Interaktionen zwischen einzelnen Kompartimenten des Genitaltraktes
In einem Tiermodell wurde Jungsauen operativ ein Uterushorn abgetrennt (Marienseemodell; WABERSKI et al. 1995). Nach der Genesung wurde bei den Tieren eine 100 ml-Infusion direkt nach Ebertoleranz (Brunstkontrolle zweimal täglich) transzervikal in das verbleibende Uterushorn durchgeführt und alle vier Stunden wurde ultrasonografisch untersucht, ob eine Ovulation stattgefunden hatte. Die Applikation von nativem Seminalplasma führte zu einer Ovulationsvorverlegung von 10,7 ± 2,4 Stunden. Desweiteren wurde Seminalplasma mit Aktivkohle behandelt (ein Liter Seminalplasma + fünf Gramm Aktivkohle), für 20 min bei 3.000 x g zentrifugiert und der Überstand weitere 24 Stunden mit Aktivkohle behandelt. Im Anschluss erfolgte eine Zentrifugation und Filtration der Lösung. Die transzervikale Verabreichung dieses
steroidinaktivierten Seminalplasmas führte zu einer Vorverlegung der Ovulation um 7,3 ± 1 Stunden. Durch Zusatz von 10 µg Östradiol zu 100 ml dieses Aktivkohle- behandelten Seminalplasmas konnte der vorverlegende Effekt wieder hergestellt werden (10 ± 1,8 Stunden). Die Applikation von 100 ml Östradiol (10 µg) oder Östronsulfat (7,8 µg) in PBS konnte den Ovulationszeitpunkt um bis zu 3,3 ± 1,6 Stunden vorverlegen, Behandlungen mit Fraktionen < 1 und > 10 kDa waren ineffektiv. Die Verabreichung einer 1-10 kDa Fraktion führte zur Vorverlegung um 5,3 ± 1,6 Stunden, die < 10 kDa Fraktion erzeugte eine Vorverlegung von 6,8 ± 1,8 Stunden. Die Inaktivierung der 1-10 kDa Fraktion mit Pronase führte zu einem totalen Verlust der ovulationsvorverlegenden Wirkung. Daher scheint die
< 10 kDa Fraktion eine Schlüsselrolle einzunehmen. Der Unterschied von 3,4 Stunden zwischen steroidinaktiviertem Seminalplasma und nativem Seminalplasma entspricht dem Effekt, den die PBS-Lösung mit Östrogenen hervorrief. Dies weist zusätzlich auf einen additiven Effekt von Östrogenen und einer nicht-steroidalen Komponente im Seminalplasma hin (WABERSKI et al. 1995).
Östrogene beeinflussen zusätzlich die Kontraktilität des Uterus. Die Infusion von mit Östrogen angereicherter Kochsalzlösung bei der Sau führte zu einer 2,5-fachen Steigerung der Frequenz der Myometriumskontraktionen. Dieser Effekt wird durch die Freisetzung von PGF2α direkt nach der Östrogen-Infusion hervorgerufen (CLAUS 1990). Außerdem ist bekannt, dass 34 Stunden nach Seminalplasmakontakt im endometrialen Gewebe von Jungsauen auch die Transkription der PTGS2-mRNA im Endometrium erhöht ist (O'LEARY et al. 2004). Dies könnte zur uterinen Synthese der Prostaglandine PGE2 and PGF2α führen. In nicht gedeckten Tieren ist PGF2α das Haupteikosanoid, aber in belegten Sauen tritt die Prostaglandin-Sekretion früher auf.
PGE2 dominiert dabei und antagonisiert den luteolytischen Effekt von PGF2α (CHRISTENSON et al. 1994). Prostaglandine erreichen das Ovar durch Countercurrent Transfer der uterinen venösen Gefäße und der Ovararterie (KRZYMOWSKI et al. 1990). Die Erhöhung der PTGS2-mRNA nach Seminalplasmaexposition bietet somit die Möglichkeit einer neuen Rolle für das Seminalplasma. Es könnte die vom Uterus kommenden Prostaglandinsignale, die zu einer Ovulation führen, verstärken, die Entwicklung der Corpora lutea fördern und so
die Progesteronsynthese erhöhen (ROBERTSON 2007). Eine transzervikale Infusion von PGF2α (250 µg) oder PGE2 (250 µg) in PBS verlegte den Ovulationszeitpunkt allerdings nicht (WABERSKI et al. 1995).
Auch innerhalb des Follikels stellt die effektive Zellkommunikation einen entscheidenen Faktor für die Entwicklung der Oozyte dar. Daher wird die Möglichkeit einer Kommunikation via Sekretion und Aufnahme kleiner Vesikel aktuell bei Pferden untersucht (DA SILVEIRA et al. 2011). Mikrovesikel sind unterschiedlich groß (~ 100- 1.000 nm) und entstehen durch äußere Knospung und Abspaltung von der Plasmamembran (COCUCCI et al. 2009). Exosome sind kleiner (50-100 nm) und homogener als Mikrovesikel und stammen von multivesicular bodies (MVBs) in Zellen.
Die Invagination dieser MVBs, die einige Exosome enthalten, führt dazu, dass die Exosome nach Verschmelzung der MVBs mit der Plasmamembran in den extrazellulären Raum abgegeben werden. Sie enthalten ebenfalls wie die Mikrovesikel bioaktives Material wie Proteine, RNA und Mikro-RNA (miRNA) und können über weite Distanzen per Blut transportiert werden (KELLER et al. 2006; LAKKARAJU u.
RODRIGUEZ-BOULAN 2008; YUAN et al. 2009). Mikro-RNA besitzt eine Größe von etwa 22 Nukleotiden und ist eine hoch konservierte RNA, die eine wichtige Rolle in der Genregulation spielt (DA SILVEIRA et al. 2011). Nach Punktion equiner Follikel konnten Mikrovesikel und Exosome in der ovariellen Flüssigkeit von Stuten nachgewiesen werden. Auch in den Granulosa- und Cumuluszellen des punktierten Follikels konnten Mikrovesikel und Exosome festgestellt werden. Der Vergleich der 381 untersuchten miRNAs aus den Granulosa- und Cumuluszellen zeigte, dass einige miRNAs nur in einem Zelltyp vorkamen; 22 miRNAs nur in Granulosazellen, 35 miRNAs nur in Cumuluszellen. Einige (17 miRNAs) wurden in beiden Zelltypen festgestellt. Der Vergleich zwischen der miRNA der Zellen und der miRNA der Vesikel aus der Follikelflüssigkeit zeigte, das 21 miRNAs in Granulosazellen und 12 miRNAs in Cumuluszellen auch in den Vesikeln der Follikelflüssigkeit gegenwärtig waren. In einem zweiten Versuch wurden fluoreszenzmarkierte Mikrovesikel Granulosazellkulturen zugesetzt. Nach 24 Stunden waren die Vesikel in den Granulosazellen sichtbar. Granulosazellen, die mit fluoreszenzmarkierten PBS inkubiert wurden, zeigten keine Fluoreszenz. Desweiteren wurden aus
Follikelflüssigkeit isolierte Mikrovesikel fluoreszenzmarkiert und in den gleichen Follikel zurückinjiziert. 24 Stunden nach Punktion des gleichen Follikels konnten grün fluoreszierende Mikrovesikel in den gewonnenen Granulosazellen festgestellt werden.
Die Granulosazellen nehmen also Mikrovesikel in vivo sowie in vitro auf. Durch die gemeinsamen Sets der miRNA-Profile in Follikelflüssigkeit, Granulosa- und Cumuluszellen schließen die Autoren außerdem, dass die Vesikel aus dem Follikel stammen müssen. Diese Vesikel bieten die Möglichkeit einer Kommunikation zwischen einzelnen Kompartimenten des Genitaltraktes (DA SILVEIRA et al. 2011).
2.4 Der Effekt des Seminalplasmas auf den Genitaltrakt verschiedener Spezies
Seminalplasma-Effekte auf den Genitaltrakt sind sowohl beim Menschen als auch bei verschiedenen Tierarten bekannt.
Lamas und Alpakas zählen zu den Tieren, deren Ovulation durch kopulatorische Stimulation induziert wird (FERNANDEZ-BACA et al. 1970). Neben dem mechanischen Stimulus der Vagina und Zervix durch den Penis ist ein chemischer Stoff im Samen für die Ovulationsinduktion verantwortlich, der Ovulation Inducing Factor (OIF; ADAMS et al. 2005). OIF ist ein Bestandteil des Seminalplasmas der Kameliden und stimuliert die LH-Sekretion der Hypophyse. Die intramuskuläre Injektion von 1,5 ml Lama-Seminalplasma führte bei Lamas mit Follikeln > 8 mm zwei Stunden später zu einem verlängertem Anstieg der LH-Plasmakonzentration verglichen zu einer Gruppe, die mit GnRH behandelt wurde (ADAMS et al. 2005). In einer anderen Studie wurden Alpakastuten mit Follikeln > 8 mm entweder intramuskulär oder intrauterin 2 ml Alpaka-Seminalplasma verabreicht. Es ovulierten signifikant mehr Alpakastuten nach intramuskulärer als nach intrauteriner Gabe von 2 ml Seminalplasma. Der ovulationsinduzierende Effekt scheint daher eher auf einem systemischen und nicht auf einem lokalen Effekt zu beruhen (RATTO et al. 2005). Dies zeigen auch Untersuchungen von BOGLE et al. (2011): Mäuse ovulieren nach intraperitonealer Gabe von Lama-Seminalplasma. Eine signifikante Anzahl von Lamas
zeigt im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe ebenfalls nach intramuskulärer Gabe von equinem bzw. porcinem Seminalplasma eine Ovulation. Zusätzlich unterstützt dies die Theorie, dass OIF ein Bestandteil des Seminalplasmas der Säugetiere ist und einen Effekt auf die Ovarfunktion nicht verwandter Spezies zu haben scheint (BOGLE et al.
2011). Auch der Wirkmechanismus des OIF, z.B. über OIF-Rezeptoren, scheint speziesübergreifend vorhanden zu sein. Der genaue Aktionsmechanismus ist noch nicht klar; es konnte aber durch die Gabe verschiedener Seminalplasma-Dosen gezeigt werden, dass OIF in einer dosisabhängigen Weise wirkt. Der Unterschied in der Anzahl der Lamas, die nach Gabe von heterologem Seminalplasma (Pferd, Schwein) verglichen zur Gabe von homologem Seminalplasma ovulierten, deutet außerdem an, dass OIF nicht in gleichen Konzentrationen im Seminalplasma verschiedener Tierarten vorkommt. Es scheint, dass OIF einen größeren Anteil am Gesamtprotein im Lama-Seminalplama hat als im Seminalplasma von Pferden und Schweinen. Es ist aber nicht bekannt, ob OIF immer einen größeren Anteil am Seminalplasma von Tieren mit induzierter Ovulation aufweist als das Seminalplasma spontan ovulierender Tiere (BOGLE et al. 2011).
Laut ROBERTSON et al. (2002) ist der Transforming Growth Factor-β (TGFβ) im Seminalplasma von Mäusen ein wichtiger Trigger für die Induktion einer entzündlichen Antwort des Uterus. Samen von Mäusen beinhaltet vergleichsweise viel TGFβ, etwa die fünffache Menge wie es im Serum vorkommt (ROBERTSON et al. 2002). TGFβ ist auch in hohen Konzentrationen im Seminalplasma von Ebern vorhanden. Es wurden Konzentrationen von 150 ng/ml (Median) TGFβ1 und 123 ng/ml (Median) TGFβ2 gemessen (ROBERTSON et al. 2002). TGFβ wirkt indirekt über die Induktion der Genexpression verschiedener Zytokine im weiblichen Genitaltrakt. Bei Mäusen werden innerhalb von Stunden nach Insemination verschiedene proinflammatorische Zytokine in den Epithelzellen des Uterus hochreguliert, z.B. der Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF), der nach seminalem TGFβ-Stimulus zwanzigfach sowohl als mRNA als auch auf Proteinebene vorliegt (ROBERTSON u.
SEAMARK 1992). Auch TREMELLEN et al. (1998) konnten 16 Stunden nach Applikation von humanem rekombinanten TGFβ1 in den Uterus von Mäusen eine signifikante, dosisabhängige Erhöhung der GM-CSF Konzentration in der luminalen
Uterusflüssigkeit feststellen. Die TGFβ1-Behandlung des Uterus führte außerdem zu einem vermehrten Leukozyteneinstrom in das Endometrium. Ein kritischer Faktor für den Trächtigkeitserfolg ist die Notwendigkeit, dass das maternale Immunsystem angemessen gegenüber den Antigenen, die von Spermien und Embryo exprimiert werden, reagiert. Es würde erwartet, dass die Rekrutierung von antigenpräsentierenden Zellen nach der Paarung das Priming gegen spermaassoziierte Antigene unterstützt. Daher vermuten die Autoren, dass TGFß eine Schlüsselfunktion in der Einleitung der immunologischen Veränderungen und Umbauvorgänge einnimmt, die während der Präimplantationsphase im Uterus geschehen (TREMELLEN et al. 1998). Es ist bekannt das GM-CSF durch Epithelzellen im porcinen Uterus nach Seminalplasma-Stimulus gebildet wird:
34 Stunden nach Insemination von 100 ml Seminalplasma bei Jungsauen mit induziertem Östrus wurde mittels quantitativer RT-PCR eine fünffache Erhöhung der Genexpression von GM-CSF im Vergleich zur PBS-Gruppe gemessen (O'LEARY et al.
2004). Ob dies aber tatsächlich bei der Sau zu einer Regulation der Entzündungsantwort beiträgt, ist unklar.
Auch beim Hund liegen Studien über die Wirkung von Seminalplasma vor. In einer aktuellen In-vitro-Studie mit Uterusexplanten von Hündinnen zeigte sich, dass signifikant weniger Spermatozoen an das Uterusepithel in Anwesenheit von PMN
banden als ohne PMN-Zusatz. Dieser Effekt konnte sowohl durch einen 25-prozentigen Zusatz von Seminalplasma als auch durch einen 25-prozentigen
Zusatz von Prostata-Flüssigkeit fast komplett aufgehoben werden. So lagen ähnlich viele gebundene Spermien vor wie ohne PMN-Zusatz. Wurden PMN mit 25 % Seminalplasma oder Prostatasekret versetzt und dann Spermien hinzugegeben, führte dies ebenfalls zu einer signifikanten Reduzierung der Bindung von PMNs an Spermatozoen. PMNs können also in Anwesenheit von Seminalplasma oder Prostatasekret weniger an Spermatozoen binden, dadurch haben die Spermien die Chance an das Uterusepithel zu binden. Die Flüssigkeit der akkzessorischen Geschlechtsdrüsen der Rüden scheint also einen spermienschützenden Effekt vor der uterinen Entzündungsantwort zu haben (ENGLAND et al. 2012).
Eine Stunde nach Infusion von je 20 ml homologem Seminalplasma, Samen oder Milchverdünner in den Uterus von Stuten konnte ein signifikanter Anstieg der Flüssigkeitsmenge im Uterus bei allen drei Medien festgestellt werden. Außerdem wurde eine Stunde nach Infusion von Seminalplasma bzw. Samen eine signifikante Zunahme der Uterusdurchblutung beobachtet. Der uterine Blutfluss wurde mittels Dopplersonografie untersucht und die Time Averaged Maximum Velocity (TAMV) bestimmt. Die zytologischen (Anzahl der Neutrophilen in 200 Zellen) und bakteriologischen (Anzahl Bakterienkolonien) Ergebnisse 48 Stunden nach Besamung zeigten signifikante Veränderungen nach Seminalplasma- bzw. Sameninfusion. Die zum Samen vergleichsweise milden Entzündungserscheinungen nach Seminalplasma und die durch Seminalplasma ähnlich stark wie durch den Samen veränderte Uterusperfusion lässt darauf schließen, dass nicht nur die uterine Entzündungsreaktion, sondern auch vasodilatatorische Faktoren im Seminalplasma für den erhöhten uterinen Blutfluss verantwortlich sind (BOLLWEIN et al. 2003).
Menschliches Seminalplasma scheint ebenfalls Effekte auf den weiblichen Genitaltrakt auszuüben. DITTRICH et al. (2011) untersuchten, welchen Effekt Seminalplasma auf den Spermientransport im weiblichen Genitale hat. Dazu wurde wiederholt 1 ml humanes Seminalplasma in einen perfundierten Schweineuterus infundiert.
Währenddessen wurde der intrauterine Druck (Millimeter-Quecksilbersäule, mmHg) mittels eines intrauterinen Ballonkatheters gemessen, der mit einem Druckmesser verbunden war. Der Druckmesser wandelte die Veränderungen des intrauterinen Drucks in elektrische Signale um, die zu einem Analog-Digital-Wandler übermittelt wurden. Die Seminalplasmainfusion führte zu signifikant höherem Druck und einer signifikant höheren Frequenz der Uteruskontraktionen im Vergleich zur Krebs-Ringer- Bicarbonat Lösung (DITTRICH et al. 2011).
KHAN et al. (2010) untersuchten den Effekt von humanem Seminalplasma auf das Wachstum von endometrialen Zellen von Frauen mit und ohne Endometriose. Epithel und Stromazellen wurden aus Biopsien von eutopischen und ektopischen Endometrien isoliert und kultiviert. Sie konnten in vitro feststellen, dass die 24 stündige Inkubation mit humanem Seminalplasma zu einem deutlich stärkerem Wachstum der Epithel- und
Stromazellen führte (2-3 fach), als bei unbehandelten Zellen. Das Zellwachstum von eutopischen Endometriumszellen von Frauen mit Endometriose war signifikant stärker als von Frauen, die keine Endometriose aufwiesen. Auch die ektopischen Endometriumszellen wuchsen stärker durch Seminalplasma verglichen zu den unbehandelten Zellen. Es wurde die Menge von PGE2, Hepatozyt-Growth-Factor (HGF) und Östradiol (E2) im Seminalplasma der Männer sowie in der Peritonealflüssigkeit und dem Serum der Frauen ermittelt. Seminalplasma wies signifikant höhere Mengen von PGE2 und HGF auf als das Serum oder die Peritonealflüssigkeit der Frauen mit oder ohne Endometriose. Die individuelle Vorbehandlung der Endometriumszellen mit anti-PGE2 Antikörpern, anti-HGF Antikörpern oder zwei selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren führte zu keiner Verringerung des Seminalplasma-vermittelten Wachstums der Zellen. Wurden die Zellen kombiniert mit beiden Antikörpern (anti-PGE2 Antikörper und anti-HGF Antikörper) oder den beiden Antikörpern inkl. Östrogen-Rezeptor-Modulatoren behandelt, konnte das durch Seminalplasma geförderte Wachstum unterdrückt werden. Daher führen die Autoren das durch Seminalplasma geförderte Zellwachstum auf die Kombination verschiedener Makromoleküle wie PGE2, HGF und E2 zurück.
Somit könnte Seminalplasma einen zusätzlichen Trigger zu der sonst östrogenabhängigen Endometriose bei der Frau darstellen und bei ungeschütztem Geschlechtsverkehr zu einem nachteiligen Effekt bei Frauen mit Endometriose führen (KHAN et al. 2010).
3 Material und Methoden
3.1 Versuchsziel
Ziel dieser Arbeit war es, Kurzzeiteffekte einer uterinen Seminalplasmaapplikation auf die Genexpression immun- und follikelreifungsassoziierter Transkripte des Uterus und des Ovars bei östrischen Jungsauen zu untersuchen. Es wurde unter Anwendung eines Tiermodells die Hypothese geprüft, dass Seminalplasma spezifisch die Genexpression an der uterotubalen Verbindung (UTV) reguliert und Änderungen der Genexpression in Cumulus- und Granulosazellen sowie Eizellen induziert.
In dem angewendeten Tiermodell wurden innerhalb eines Tieres eine Versuchs- und eine Kontrollseite geschaffen. In das Lumen des Uterushorns der Kontrollseite wurden 100 ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS-Lösung, siehe 9.4.1.1) injiziert, deren pH- Wert auf den pH-Wert des Seminalplasmas eingestellt wurde. In das Lumen des Uterushorns der Versuchsseite erfolgte die Applikation von 100 ml eines Seminalplasmapools, der nach der in Kapitel 3.7 beschriebenen Methode hergestellt wurde.
3.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Die verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialen sind im Anhang dieser Arbeit aufgelistet (Kapitel 9.3).
3.3 Medikamente, Chemikalien und Gebrauchslösungen
Eine Auflistung der verwendeten Medikamente, Chemikalien mit Bezugsquellen und der Rezepte zur Herstellung verwendeter Lösungen befindet sich im Anhang dieser Arbeit (Kapitel 9.4).
3.4 Versuchstiere
Für die Untersuchungen standen 11 klinisch gesunde Hybridsauen im Alter von 7 bis 13 Monaten mit einem Gewicht von 140 bis 180 kg zur Verfügung (siehe Tab. 1). Die Jungsauen kamen aus einem Mastbetrieb und wurden in den Monaten April bis Juli 2011 im Versuchstierstall der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingestallt und in Zweier- bis Dreiergruppen auf Stroh gehalten. Die Tiere wurden erst nach dem ersten Zyklus nach dem Transport (sog. Transportrausche) in den Versuch eingegliedert. Vor jeder Operation wurde eine eingehende Allgemeinuntersuchung der Tiere vorgenommen.
Tab. 1: Alter (in Monaten) und geschätztes Gewicht (in kg) der einzelnen Tiere Sau Nr. Alter (Monate) Geschätztes Gewicht (kg)
1 13 180
2 13 180
3 7 140
4 8 140
5 8 140
6 7 140
7 7 160
8 7 160
9 7 160
10 7 140
11 7 140
3.5 Sonographische Untersuchung der Ovarialfollikel
Die Tiere wurden regelmäßig mittels Ultraschall untersucht, um das Vorhandensein von Ovarialfollikeln präoperationem festzustellen. Die Ultraschalluntersuchung erfolgte ab dem 16. Zyklustag einmal täglich (11 Uhr), ab dem 18. Zyklustag viermal täglich (05 Uhr, 11 Uhr, 17 Uhr und 23 Uhr). Hierfür wurden die Sauen in einen Untersuchungsstand verbracht. Die Untersuchung erfolgte am stehenden Tier transkutan an der rechten Flankengegend in der Kniefalte mit einem 5-MHz- Sektorschallkopf und dem Ultraschallgerät Sonoline SI-400 (Siemens). Die sonographisch festgestellte Größe der Follikel wurden dokumentiert (siehe
Anhang 9.2, Brunstkontrollblatt). Alle Sauen wiesen präoperationem sonografisch darstellbare Follikel auf.
3.6 Brunstkontrolle
Nach Feststellung der Transportrausche erfolgte die Brunstkontrolle zur möglichst genauen Feststellung des Brunstbeginns ab dem 16. Zyklustag einmal täglich (11 Uhr) und ab dem 18. Zyklustag viermal täglich im Abstand von 6 Stunden (05 Uhr, 11 Uhr, 17 Uhr und 23 Uhr). Hierzu wurden die Sauen nach der Ultraschalluntersuchung in die benachbarten Abteile getrieben, in denen sich die Eber befanden und für 10 bis 15 Minuten vor den Boxen der Eber belassen. Nach einigen Minuten wurden die folgenden Tests durchgeführt, um die Duldung der Sau zu untersuchen: Flankengriff, Stütztest und Reitprobe (WABERSKI, D., u. K.F. Weitze 2007). Die von der Sau tolerierte Reitprobe wurde als Duldung gewertet. Der errechnete Brunstbeginn stellt den Zeitpunkt in der Mitte des Zeitintervalls zwischen letzter Zurückweisung und erster Duldung dar. Neben der Duldung wurden auch die Rötung und die Schwellung der Vulva, sowie das Interesse am Eber dokumentiert (siehe Anhang 9.2, Brunstkontrollblatt).
3.7 Seminalplasmapool-Herstellung
In den Monaten Juni und Juli 2008 wurde Sperma von zehn verschiedenen allgemein- und geschlechtsgesunden Ebern mit geprüfter Fertilität der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover mittels Handmethode gewonnen und jedes Ejakulat einzeln dreimal für jeweils 10 min bei 3.370 x g (Megafuge 2.0R, Heraeus Instruments, Osterode) zentrifugiert. Der Überstand wurde nach jeder Zentrifugation mit 1 cm Abstand zum Zellpellet abgenommen. Das Seminalplasma wurde von jedem Eber separat bei –27 °C in 100 ml Portionen tiefgefroren (Plastikflasche für Ebersperma, 100 ml, Minitüb, Tiefenbach).
Im April 2010 wurde das Seminalplasma innerhalb von 24 Stunden bei 21 °C aufgetaut, in einem sterilen 10 Liter-Glasgefäß (Simax, Czech Republic) gepoolt (Menge gesamt: 8,8 l) und für 15 min auf einem Magnetrührer (Heidolph MX 3001 R) mit Rührfisch gemischt. Eine mikroskopische Kontrolle auf Spermienfreiheit wurde bei zehn Seminalplasma-Proben vor dem Poolen und bei fünf Proben nach dem Poolen vorgenommen (Phasenkontrast, 20 x Vergrößerung; Zeiss Axiostar plus, Göttingen).
Anschließend wurde der Seminalplasmapool in 100 ml Portionen aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei –27 °C eingefroren (Plastikflasche für Ebersperma, 100 ml, Minitüb, Tiefenbach). Die Gesamtlagerungsdauer des Seminalplasmas bei –27 °C betrug 34 bis 37 Monate. Kurz vor der Operation wurde das Seminalplasma aufgetaut und der pH-Wert gemessen (pH-Meter: Microprocessor pH/ION Meter pMX 3000, WTW (Wissenschaftlich-technische Werkstätten) Weiheim; Elektrode: pH Electrode SenTix 60, WTW, Weiheim). Das Seminalplasma wies stets einen pH-Wert von 8,2 auf. Dementsprechend wurde der pH-Wert der Phosphat-gepufferten Lösung (PBS) dem des Seminalplasmas angepasst (1 mol NaOH, siehe 9.4.1.8).
3.8 Chirurgische Maßnahmen
Die chirurgischen Maßnahmen wurden unter Inhalationsnarkose durchgeführt. Um einen präoperativen Futterentzug von 6 Stunden zu gewährleisten, wurden die Tiere immer erst nach der negativen Brunstkontrolle um 05 Uhr oder 17 Uhr gefüttert. War die Brunstkontrolle positiv, wurde den Tieren nach einer Allgemeinuntersuchung 0,02 mg/kg KGW Atropinsulfat (Atropin sulfuricum® sol. 1 vol%, Eifelfango, Bad Neuenahr Ahrweiler) als Prämedikation intramuskulär am Ohrgrund im Bereich des Übergangs von unbehaarter zu behaarter Haut verabreicht. Zwanzig mg/kg KGW Ketamin (Ursotamin®, Serumwerk Bernburg AG) und 2,0 mg/kg KGW Azaperon (Stresnil®, Janssen-Cilag GmbH) wurden 10 Minuten später ebenfalls intramuskulär injiziert, um das Tier abzulegen. Nach dem Niederlegen des Tieres wurde an einer Ohrvene ein venöser Zugang gelegt. Nach Spülen der Braunüle mit Natriumcitratlösung (3,13 %, MediPac, Rheinbreitbach) wurde mit Ketamin (10 mg/kg KGW i.v.) bis zum Eintreten des Toleranzstadiums nachdosiert. Anschließend wurde
das Tier auf den gepolsterten Operationstisch des OPs der Reproduktionsmedizinischen Einheit gelegt und in Brust-Bauchlage endotracheal intubiert. Das Schwein wurde daraufhin waagerecht in Rückenlage fixiert und an das Narkosegerät (Sulla 909 V, Dräger AG, Lübeck) angeschlossen. Das Narkosegasgemisch bestand aus Sauerstoff (während der Anflutungsphase 2 l/min, zur Erhaltung 1,5 l/min), Lachgas (Linde Gas Therapeutics GmbH & CO, Unterschleißheim, bei Anflutung 3 l/min, zur Erhaltung 1,5 l/min) und Isofluran (CP Pharma, Burgdorf, je nach Narkosestadium des Tieres 0,5-3,5 vol%). Die Überwachung der Vitalfunktionen erfolgte zusätzlich mit dem Narkoseüberwachungsgerät Eagle 1000 (marquette Hellige). Nach antiseptischer Vorbereitung des Operationsfeldes (70 % Alkohol, CG Chemikalien, Laatzen;
Braunol®, Braun Melsungen AG, Melsungen) wurde die Bauchhöhle mittels Schnitt in der Medianlinie auf Höhe des letzten Zitzenpaares auf einer Länge von 20 cm geöffnet. Nach stumpfer Präparation in die Tiefe und Öffnung der Bauchhöhle in der Linea alba wurden die Ovarien vorgelagert und überprüft, ob Follikel vorhanden waren.
Es wurde die Follikelanzahl protokolliert. Nach Rückverlagerung der Eierstöcke wurden die Uterushörner extraabdominal vorgelagert und das Mesometrium der Hörner 10 cm cranial der Bifurkation 0,5 bis max. 1 cm von der Uterwand entfernt durchstochen, um die Hörner einzeln abzubinden (Surgicryl® PGA EP 6, SMI AG, Hünnigen, Belgien) und so einen Reflux des Seminalplasmas bzw. der phosphatgepufferten Salzlösung zu verhindern. Es wurden drei Ligaturen pro Seite gesetzt (siehe Abb. 1) und es wurde darauf geachtet, die nahe an der Uteruswand verlaufenden Blutgefäße nicht in die Ligatur miteinzubeziehen.
Abb. 1: Abbinden der Uterushörner corpusnah mit dreifacher Ligatur (siehe Pfeile) Ein Uterushorn (Kontrollseite) wurde 5 cm cranial der Ligaturen mit 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, siehe Anhang 9.4.1.1) infundiert, das andere Horn (Seminalplasmaseite) mit 100 ml des Seminalplasmapools (siehe Kapitel 3.7).
Hierzu wurden die auf 38 °C erwärmten Lösungen (PBS und Seminalplasma) durch eine Hilfsperson in vier sterile 25 ml Einmalspritzen (Norm-Ject®, Henke Sass Wolf, Tuttlingen) gefüllt. Der Operateur hielt einen sterilen Polyethylen- Verlängerungskatheter (Ø 1,5-2,5 mm, Länge 100 cm, Vygon, Frankreich) mit einer angeschlossenen 18 G-Kanüle (1,2 x 40 mm, Neolus Terumo, Leuven, Belgium), so dass er mit den Händen Uterus und Kanüle sicher fixieren konnte. Anschließend wurden auf Anweisung des Operateurs die Flüssigkeiten langsam infundiert (siehe Abb. 2).
