2 Literaturübersicht
2.2 Immun- und follikelreifungsassoziierte Transkripte im weiblichen
Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) sind Mitglieder der Nuclear Hormone Receptor Superfamilie der Ligand-abhängigen Transkriptionsfaktoren, werden also durch Ligandenbindung aktiviert. Drei Subtypen, nämlich PPAR Alpha
(PPARA), PPAR Delta/Beta (PPARD) und PPAR Gamma (PPARG) sind bei Säugetieren bekannt (LORD et al. 2006). LORD et al. (2006) führten einen Nachweis vom Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma (PPARG) sowohl im trächtigen (Tag 15 und Tag 25) als auch im nicht trächtigen porcinen Uterus mittels Immunhistochemie durch, da PPARG eine essentielle Rolle für die Trächtigkeit bei Mäusen spielt, es scheint für die Differenzierung der Plazenta benötigt zu werden (BARAK et al. 1999). Der bei LORD et al. (2006) verwendete Antikörper kann nicht zwischen den zwei Isotypen PPARG1 und PPARG2 unterscheiden, es könnte sich daher in dem positiv gefärbten Epithel des Uterus zyklischer Sauen sowie trächtiger Sauen (Tag 15 und Tag 25) um PPARG1 und/oder PPARG2 handeln. Mittels real time PCR konnte allerdings die mRNA-Expression sowohl von PPARG1 als auch von PPARG2 nachgewiesen werden (LORD et al. 2006).
PPARG wurde bereits ebenfalls in ovariellem Gewebe untersucht. Mittels RT-PCR konnte es in den Granulosazellen von Frauen, die sich einer In-vitro-Fertilisation unterzogen (MU et al. 2000) sowie in porcinen Theka- und Granulosazellen (SCHOPPEE et al. 2002) nachgewiesen werden. PPARs können auf zwei Weisen die Synthese von Östrogen beeinflussen. Zum einen können sie die Synthese durch Bindung an sogenannte Estrogen Response Elements (EREs) beeinflussen und so als kompetitive Inhibitoren agieren (KELLER et al. 1995). Zum anderen kann PPARG durch Hemmung der Aromatase-Expression in humanen Granulosazellkulturen die Synthese von Östrogen beeinflussen, da Androgene nicht mehr zu Östradiol umgewandelt werden können (FAN et al. 2005). PPARs beeinflussen darüber hinaus die Synthese von Prostaglandinen und stellen daher wichtige Mediatoren der Entzündung dar. Die Promotor-Region von PTGS2 beinhaltet ein sogenanntes Response-Element für PPARs, so können PPARs auf diese Weise die Transkription von PTGS2 direkt beeinflussen (MEADE et al. 1999). Dennoch gibt es widersprüchliche Berichte über den Einfluss von PPARs auf PTGS2. MEADE et al.
(1999) berichteten von stimulierenden Einflüssen. Sie behandelten humane Zellen mit dem PPAR-Agonisten WY-14,643 und konnten feststellen, dass es zu einer vermehrten PTGS2-Proteinexpression in Mamma- und Colonepithelzellen führte.
INOUE et al. (2000) und SUBBARAMAIAH et al. (2001) berichteten, dass Liganden
von PPARG die Phorbolester (PMA)-vermittelte Induktion der PTGS2-Synthese im humanen Epithelzellen hemmten. Aber nicht nur PPARs regulieren die PTGS2-Produktion, sondern Prostaglandine selber stellen endogene Liganden dar, die ihrerseits PPARs aktivieren können. Es scheint also eine zyklische Beziehung zwischen der Anwesenheit von Prostaglandinen, Aktivierung und/oder Inhibierung von PPARs und dem Feedback zu dem Prostaglandin-synthetisierenden Enzym PTGS2 zu geben (KOMAR 2005). Desweiteren übt PPARG einen Einfluss auf die Progesteron- und Androgensynthese in porcinen Thekazell-Kulturen aus. Nach Zugabe des PPARG-Liganden 15d-PGJ2 (15-deoxy-Prostaglandin J2) konnte konzentrationsabhängig eine Stimulation der Progesteronproduktion und eine Hemmung der Androgen-Biosynthese gemessen werden (SCHOPPEE et al. 2002).
Die Ovulation ist ein Prozess, der durch den Anstieg von LH induziert wird und bei dem eine reife Eizelle mit ihren umgebenden Cumuluszellen den Follikel verlässt (ESPEY L.L. 1999; RUSSELL u. ROBKER 2007). Cumuluszellen bieten die Möglichkeit, durch Analyse potentieller Marker-Transkripte, die in den Cumuluszellen exprimiert werden, auf die Qualität der Eizelle zu schließen (CILLO et al. 2007). Die Entfernung von Cumuluszellen ist einfach und ohne direkte Manipulation der Eizelle möglich, so dass kein experimenteller Stresseinfluss auf die Eizelle zu erwarten ist.
Hyaluronan Synthase 2 (HAS2) würde sich sich als ein cumulusassoziierter Qualitätsmarker anbieten. HAS2 kontrolliert die Produktion von Hyaluronsäure, die eine Hauptkomponente in der Cumulusmatrix darstellt und während der Cumulusexpansion von Cumuluszellen sezerniert wird (WEIGEL et al. 1997). Eine weitere wichtige Komponente der Cumulusmatrix ist das lange Pentraxin 3 (PTX3), das für die Stabilität der Matrix eine Rolle spielt (VARANI et al. 2002). Eizellen von PTX3 defizienten Mäuse können in vitro, aber nicht in vivo befruchtet werden. Cumuli der PTX3 defizienten Mäusen synthetisieren zwar Hyaluronsäure, sind aber unfähig, diese in einer stabilen Matrix zu organisieren. Wird exogenes PTX3 hinzugefügt, entsteht wieder ein normaler stabiler Cumulus-Phänotyp (SALUSTRI et al. 2003).
PTX3 kann nicht direkt mit der Hyaluronsäure binden, aber die Anwesenheit von PTX3 ist essentiell, um Hyaluronsäure-Moleküle für den expandierenden Cumulus in der extrazellulären Matrix zu halten. Das Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Protein 6
(TNFAIP6) wird in Cumuluszellen des präovulatorischen Follikels während des Expansionsprozesses gebildet und ist die Komponente, die die Interaktion zwischen Hyaluronsäure und PTX3 vermittelt (FULOP et al. 1997). Es wird üblicherweise mit Entzündungen in Verbindung gebracht und besitzt die Fähigkeit, Hyaluronsäure spezifisch zu binden (LEE et al. 1992). Der Inter-alpha Trypsin Inhibitor (IαI) ist ein Serum-Protein Komplex, der durch zwei schwere und eine leichte Kette kovalent zu Chondroitinsulfat verbunden ist. Im expandierenden Cumulus werden die schweren Ketten des IαI vom Chondroitinsulfat zur Hyaluronsäure verlagert; TNFAIP6 ist essentiell, damit dieser Vorgang beendet wird (CHEN et al. 1996). Daher stellt TNFAIP6 in dieser Reaktion einen Schlüsselkatalysator dar (RICHARDS et al. 2008).
Mäuse mit fehlerhaftem TNFAIP6 können ebenfalls keine stabile Cumulusmatrix bilden und sind steril (FULOP et al. 2003). In porcinen Follikeln kann TNFAIP6 in Cumulus-Oozyten-Komplexen (COCs) und Granulosazellen nachgewiesen werden (NAGYOVA et al. 2009). Auch im Endometrium trächtiger Schweine ist die mRNA-Expression von TNFAIP6 nachgewiesen worden (ASHWORTH et al. 2010). Das bereits erwähnte PTX3 ist in der Literatur in Cumuluszellen beschrieben und würde sich ebenfalls als Qualitätsmarker anbieten. Jedoch ist diese Beziehung nicht eindeutig geklärt. Um eine mögliche Korrelation zwischen der PTX3-Expression in Cumuluszellen und dem Entwicklungspotential von Eizellen in vitro festzustellen, untersuchten ZHANG et al.
(2005) Cumuluszellen von Eizellen, die zur In-vitro-Fertilisation verwendet wurden. Sie verglichen die PTX3-Expression in Cumuluszellen von Eizellen, die nicht befruchtet werden konnten, mit der PTX3-Expression von Cumuluszellen, deren Eizellen sich in Achtzell-Embryos am Tag drei entwickeln konnten. Die PTX3 mRNA-Expressionsstärke in Cumuluszellen von Eizellen, sie sich nach drei Tagen im Achtzellstadium befanden, war zwölfmal höher (p < 0,01) als die PTX3-Expressionsstärke in Cumuluszellen von Eizellen, die nicht befruchtet werden konnten.
Eine Veränderung der PTX3-Expression in Cumuluszellen könnte daher laut Autoren Rückschlüsse auf die Qualität der von ihnen eingeschlossenen Eizelle zulassen.
MCKENZIE et al. (2004) und CILLO et al. (2007) konnten allerdings keine Beziehung zwischen PTX3 Expressionsstärken und der Oozytenqualität bis 72 Stunden nach der Befruchtung ausmachen.
Während des Ovulationsprozesses wird der Follikel hyperämisch, produziert große Mengen von Prostaglandinen und eine hyaluronreiche Matrix. Die LH-induzierte Signalkaskade führt in den Granulosazellen zur Induktion von Epidermal-Growth-Factor- (EGF-) ähnlichen Faktoren, wie z.b. Amphiregulin (Areg), Epiregulin (Ereg) und Betacellulin (CONTI et al. 2006; HSIEH et al. 2007). Die EGF-ähnlichen Faktoren wiederum führen zur Aktivierung der EGF-Rezeptoren und regulieren die Induktion von Genen in Cumuluszellen, die an der Cumulusexpansion beteiligt sind, wie HAS2, PTGS2, TNFAIP6 und PTX3 (RICHARDS et al. 2008). Daraufhin erfolgt die Formation der vorher genannten hyaluronsäurereichen Matrix. Schlüsselfaktor dieser Veränderungen ist die Aktivierung der Mitogen-Activated Protein Kinase 1 (MAPK1, ehemals: ERK2: Extracellular signal-regulated kinase 2; CONTI et al. 2006; FAN et al.
2009). Ebenfalls bedeutend für die Ovulation ist die Induktion des Progesteron-Rezeptors (PR) in den Granulosazellen und die Induktion von PR-regulierten Genen wie IL6 und PPARG (KIM et al. 2008). Eine weitere Studie gibt den Hinweis, dass die Signal-Kaskade, die in der Ovulation endet, facettenreicher ist und das angeborene Immunsystem mit einschließt (SHIMADA et al. 2006).
So sind Mitglieder des Pathogen-Recognition Receptor (PRR) Systems maßgeblich an der Einleitung einer Immunantwort beteiligt. Ein Mitglied ist die Familie der Toll-like-Rezeptoren (TLR). Sie werden z.B. in Granulosa- und Cumuluszellen exprimiert und beeinflussen dort die Expression spezifischer Gene, die zur Ovulation beitragen (LIU et al. 2008). Toll-like-Rezeptoren sind eine Gruppe von Membran-gebundenen Proteinen, die eine Vielzahl von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (sog.
PAMPs, Pathogen-Associated Molecular Patterns) erkennen und im Anschluss eine Immunzellantwort herbeiführen können (AKIRA u. TAKEDA 2004; KAWAI u. AKIRA 2007). Verschiedene Arbeitsgruppen haben TLRs bereits in ovariellem Gewebe beschrieben: ALVAREZ et al. (2006) detektierten TLR4 im porcinen Ovargewebe, TLR 4, 8 und 9 wurden in Granulosa- und Cumuluszellen von Mäusen nachgewiesen (SHIMADA et al. 2006). SHIMADA et al. (2006) konnten auch zeigen, dass der TLR 4 funktionierte, da sein exogener Ligand Lipopolysaccharid (LPS) zur Expression der TLR4-Zielgene führte, zu denen unter anderem PTGS2, IL6 und TNFA gehören. Auch in uterinen Epithelzellen von Menschen und Mäusen induzieren bakterielle
Lipopolysaccharide die Zytokinsynthese durch Bindung an die Toll-Like-Rezeptoren 2 und 4 im Uterus. Das Vorhandensein verschiedener Bakterien im Samen könnte so auch das Zytokinprofil des uterinen Epithels durch die Bindung an verschiedene TLRs erklären (SCHAEFER et al. 2004). TLRs können auch von nicht pathogenen, endogenen Liganden wie Hyaluronsäure aktiviert werden und in der Befruchtung involviert sein (SHIMADA et al. 2008). Ovulierte COCs von Mäusen wurden mit aufgereinigten Hyaluronsäurefragmenten kultiviert. Anschließend wurden sie mit Hyaluronidase behandelt oder Spermien als eine physiologische Quelle für Hyaluronidase ausgesetzt. Die Hyaluronsäure und Hyaluronidase führten innerhalb von zwei Stunden zur Expression verschiedener Transkripte, wie z.B. IL6. Anti-TLR2 und anti-TLR4 neutralisierende Antikörper konnten die Hyaluronsäure- und Hyaluronidase-induzierte Genexpression signifikant hemmen. Wurden die ovulierten COCs mit Spermien kultiviert, wurde die Zytokin- und Chemokin-Expression ebenfalls induziert, konnte aber auch durch TLR2/TLR4-Antikörper oder durch Hyaluronsäure-blockierende Peptide (Pep-1) gehemmt werden. TLR2 and TLR4 auf den Cumuluszellen werden also durch die Co-Kultur mit Spermien in einer Hyaluronsäure-Fragment-abhängigen Weise aktiviert (SHIMADA et al. 2008).