T A R T U R I I K L I K U Ü L I К О 0 LI TO I M E T I S E D

B I O L O O G I L I S E D T E A D U S E D 5 Б И О Л О Г И Ч Е С К И Е Н А У К И

T A R T U R I I K L I K U Ü L I K O O L I T O I M E T I S E D

УЧЁНЫЕ ЗАПИСКИ ТАРТУСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА A C T A E T C O M M E N T A T I O N E S U N I V E R S I T A T I S T A R T U E N S 1 S

г. я. к я л л а с

ВЫВЕДЕНИЕ НОВОГО УСТОЙЧИВОГО ШТПМР ПЦЕТОНО - БУТИЛОВЫЕ БЯКТЕРИЙ

ГИЗ „ Н П У Ч И П Я Л И Т Е Р А Т У Р R"

B I O L O O G I L I S E D T E A D U S E D 5 Б И О Л О Г И Ч Е С К И Е Н А У К И

T A R T U R I I K L I K U Ü L I К О 0 LI TO I M E T I S E D

УЧЁНЫЕ ЗАПИСКИ ТАРТУСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА A C T A E T C O M M E N T A T I O N E S U N I У E R S I T A T I S T A R T Ü E N S I S

Г.

я. к я л л я с

ВЫВЕДЕНИЕ НОВОГО УСТОЙЧИВОГО ШТПМР ДЦЕТОНО - БУТИЛОВЫЕ БАКТЕРИЙ

ГИЗ „ Н Н У Ч Н Я Я Л И Т Е Р Н Т У Р Я '

Т А Р Т У , 1949

T R Ü T a i m e f ü s i o l o o g i a K a te e d e r .

J u h a ta ja : H. Kallas.

TRÜ T o i m e t i s t e k o l l e e g i u m : V. H iie, H. K e r e s , R. K le is , A . M u u g a , K. O rv ik u, V- Rit slaid, E, T alv ik , J. T e h v e r , A. U i b o , A. V a g a , A . V a l d e s , Д . V a s s a r , J. V. Veskj.

P e a to im e t a ja : d o ts . K- Tae v,

Н едостатки в области освоения, развед ен и я и хран ен и я спор бактерий ацетоно-бутилового брож ения на крупном помоле к у к у ­ рузной муки ставили порой производство под серьёзную у грозу потери основного ш там а культуры.

С целью обеспечить производство устойчивы м запасны м шта- мом культуры и была начата н астоящ ая работа. Испы тывая эл ек ­ тивную культуру, мы вы вели новы й штам, который отличается своей высокой устойчивостью и имеет р яд других преим ущ еств перед сущ ествую щ ими ш там ам и.

В основу работы был положен принцип проведен и я ж ёсткого отбора на том субстрате, на котором кул ьту ра будет и сп ользован а в производстве. Мы подобрали таки е услови я, которые обеспечи­

вают зарождение, быстрый рост и разм нож ение ж елаем ого о рга­

низма. При этом мы исходили из опыта Виноградского, который ещ ё в 1892 г. ввёл приём элективной культуры , предш ествую щ ий выделению чистой линии. Как известно, тот же приём был с успехом использован В. Омельянским (1900— 1905 г.) при вы ведении м икро­

организм ов, сбраж иваю щ их клетчатку.

I. Методика работы.

Выведение элективной культуры.

5 ° /0-й затор из кукурузн ой муки крупного помола наливаю т в пробирки, закрываю т их ватными пробками, стерилизую т 1 1/а часа при IV2 атм - п охлаждают до 36° С. Затем содерж имое пробирок зараж аю т свеж ей, нестерильной болтуш кой из кукур узн ой м уки крупного помола в количестве 0,5 мл на Ю мл затора.

Д л я создания анаэробных условий, способствующ их развитию ацетоно-бутиловых бактерий, в пробирки, на затор стерильно н а ­ слаиваю т пипеткой ‘2,5 мл генераторного масла. После этого про­

бирки пастеризую т 45 ск при 100° С в аппарате *Коха, быстро охлаждаю т до 37° С и ставят бродить в термостат при 37° С.

После разбраж и ван и я затора в пробирки добавляют (стерильно) 0,5 мл бутилового спирта. Содержимое пробирок слегка взбалты ­ вают и вновь ставят в термостат на 24 часа. Из этих пробирок производят затем зараж ен и е склянок со стерильным (> % -м затором (200—400 мл) кукурузн ой м уки крупного помола. В зараж ён ны е таким способом склянки стерильно добавляют 0 ,5 % до 0 ,7 % , по объёму, нормального бутилового спирта, закрывают ватными проб­

кам и и ставят в термостат.

Через 24 ч а с а производят пересев в подобные ж е склянки по уж е описанной методике, только без добавления бутилового спирта.

Таким образом производят пересев до 7-ой ген ерац и и вклю чительно.

Во всех случаях процент и н окулята по объёму = 2,5 % . Все склянки вы держ иваю т при 37° С GO час., после чего их содержимое анализирую т на ацетон и кислотность.

Ацетон определяется по методу М езигера в грамм ах на литр браж ки; кислотность — титрованием в мл N/lO NaOH на 10 мл бражки.

4

Испытание вы веденной культуры производят на 6 % , 8 % и 0 % -х заторах. Э лективная культура, с паи лучш и м и результатам и, берётся для п олучен и я спор на 5 % , 6 % и 8 % -й конц. того ж е затора. С терилизация затора при испы тании, заготовке и разм н о ­ ж ении спор продолж ается 2 часа при 2 атм. П олученные споры хранятся в склянках с ватными пробками, хотя л учш е их хранить в запаянны х пробирках до 1—2 м-цев, после ч его вновь испы ты ­ вают на заторе 6 %> ' 8 % и 9 % -й конц.

Предварительное двукратное испы тание спор производится на 7 —12-ый день. Из спор, оказавш и хся лучш им и, заготовляю тся новые споры.

Пробирки с новыми спорами, после 72 час. брож ения, п астер и ­ зуются 45 ск при 100° С в аппарате Коха, а затем запаиваю тся.

Д ля вы ведения ацетоно-бутиловых бактерий сущ ествует много методов, папр., Hasse W . (1885), Hall (1929), М антейфель (1940) и др., но они являю тся слиш ком затяяш ы м и и не гарантирую щ им и чистоту и ценность культуры , поэтому мы прим енили свою ори ги ­ нальную методику, гарантирую щ ую быстроту вы ведения необходи­

мого типа культуры и его высокую ценность, соответствующую ноставленым задачам. Но н аш ей методике уж е через 15 дней можно получить устойчивую элективную культуру.

II, Выведение чистой линии.

1. Выделение культуры.

Из зап аян н ой пробирки культуры, условно обозначенной как

„А5“, стерильно берётся капля ж идкого затора с культурой и р а з ­ водится в 10 мл дестилированной воды в пробирке. После лёгкого взбалты вания из той же пробирки, методом р азл и ва на поверхность, п роизводится посев спор на сусловы й агар-агар в ч аш ки Петри.

Ч аш ки П етри вы держ иваю тся 24 ч аса в термостате при 37° С, после чего платиновой петелькой отдельные колонии бактерий пересеваю тся на косой сусловый агар-агар в пробирки и, п ар ал ­ лельно, в пробирки с 5 % -м стерильным затором из кукурузн ой муки крупного помола. После зар аж ен и я все пробирки ставятся в терм о­

стат при 37° О на 24 часа.

2. Пересев.

После разб р аж и ван п я производится пересев в склянки, сод ер­

ж ащ ие 200 мл стерильного 6 % -го затора. Когда склян ки разброди- лись, из них производится новый пересев в подобные я*е склян ки с 6 % -м стерильным затором из той ж е муки, и одновременно для проверки чистоты л и н и и на сусловый агар-агар в ч аш ки Петри.

Из тех склянок с 6 % -м затором, которые дали хорош ие р е зу л ь ­ таты сбраж ивания, производился новый пересев в скл ян ки с 6 % и 9 % - й концент. затора д л я испы тания свойств отдельных чистых линий, с 2,5 % -м инокулятом. Одной чистой л и н и ей за р а ж аю тс я : две скл ян ки с 200 мл 9 % -го затора каж д ая (для ан али за на газо- вы деление); две склян ки с 400 мл 9 % -го затора каж д ая (для определения кислотности и выхода ацетона) и одна скл ян ка 6 % -го затора (200 мл или 400 мл) для инокуляции последую щ их г е н е ­ раций.

6

Из этих склянок через 18— 2-i час. производится и н о ку л яц и я новой серии склянок последую щ ей ген ер ац и и и л и препаратов чистой культуры (для краткости в дальн ей ш ем будем и х назы вать сокра­

щ ённо АЧК). Объём затора А Ч К 8 ли тр.

Чисты е л и н и и с л у чш и м и резу л ьтатам и при предварительном и спы тании испытывают вновь до 7-ой и л и до 9*ой и 10*ой г е н е ­ р а ц и и .

3. Производство химических анализов.

Из склянок, оставленных на определение кислотности, н ач и н ая с 12-го часа брож ения и до устан о вл ен и я спада кислотности, берутся пробы через каж ды е 1—2 часа, а затем, после спада кислотности, через каж дые 4 часа. В зятие проб производится стерильно, при помощ и пипетки Мора н а 20 мл.

Д л я определения газо вы дел ен и я берутся скл ян ки ёмкостью 200—250 мл затора. После и н о ку л яц и и скл ян ки стерильно закры ­ ваю тся резиновы ми пробками, с затвором с серной кислотой. С клянки вместе с затвором взвеш иваю тся с точностью до 0,01 гр. и затем ставятся в термостат при 37° С, и но разн ости в весе п ри повтор­

ных взв еш и ван и ях (через определённые отрезки времени) опреде­

л я е тс я газовы деление. По окон чан и и брож ения из тех ж е склянок производится анализ на ацетон и остаточный сахар (по Б е р т ­ р а н у ) .

Выходы га за и ацетона учиты ваю тся в грамм ах на 1 литр затора или браж ки, сахар — в % к бражке.

П рисутствие крахм ала определяется добавлением иода в пробу затора.

Из А Ч К после окончан и я брож ения берётся проба н а конечную кислотность, ацетон и 2 литра браж ки д л я разгон ки на лаборатор­

ной колонке. Общее количество сольвентов оп ределяется методом вы сали вания поташ ом.

Во всех сл учаях затор и зготовляется и з кукурузн ой м уки к р у п ­ ного помола с содерж анием кр ахм ал а в 6 8 % .

4. Микроскопический анализ.

М икроскопический ан али з культуры п роизводится по методике, разработанной И нститутом м икробиологии АН СССР. Д анны е ан а­

л и з а указаны в граф е „м азок“. Д аётся краткая характеристика

7

культуры или её „тип а“ по стадиям р азви ти я и подвиж ности к у л ь ­ туры. При этом различаю т следую щ ие стадии р а зв и т и я :

1) единичны е неравномерны е по вел и ч и н е п ал о ч ки ;

2) единичны е равномерные, норм альной вели чи н ы п ал о ч ки ; 3) парные палочки, сл и п ш и еся под углом, близким к 90°;

4) неравномерны е по вел и ч и н е и неоднородные п алочки со с п о р а м и ;

5) свободные споры.

Встречаю тся такж е палочки, в разли чн ой степени атроф иро­

ванные и автолизирую щ иеся. К аж ды й тип обозначается сокращ ён н а соответствую щ ими рим ским и циф рам и.

П одвиж ность различаю т как „очень хорошую", „очень быструю44 и т. д. Оценка подвиж ности — сокращ ённо обозначается „ср .“ и ли

„3“, „оч. хор.“ или „5“ и т. д. Наблю дается и неподвиж ность к у л ь ­ туры, что свойственно анорм альном у состоянию культуры в п р о­

цессе брож ения или в период спорообразования — обозначается сокращ ённо „н п “ или ,Д“. В случае, если встречается н еодно­

родность по подвиж ности или стадии разви ти я, то соответству­

ющие стадии и группы подвиж ностей обозначают как II—III, III— IV,.

„хор.-ср.“ и т. д. Е сли от преобладаю щ их стадий р азви ти я или гру п п д ви ж ен и я отличаю тся л и ш ь единичны е организмы , тогда обозначаю т: III — ед. IV, или по подвиж ности „хор.“, „ед. с р .“,_

„5“ — „ед. 3 “ и т. д.

5. Характеристика по внешнему виду.

Различаю т следую щ ие ф азы брож ения:

1) Ф аза разбраж и ван и я, т. е. появление единичны х п у зы р ько в газа.

2) Ф аза активного брож ения, т. е. активного вы делен и я газа, — обозначается сокращ ённо „ га з“.

3) Ф аза, когда затор тя гу ч и й в виде взвеси, — обозначается сокращ ённо „взв“.

4) Ф аза, когда затор поднимается к поверхности в виде н оздре­

ватой тягу ч ей массы, — обозначается сокращ ённо „под“.

5) Ф аза осаж дени я и р азл о ж ен и я слизистой массы. Р ан ее под н явш аяся н а поверхность сли зи стая м асса теряет свою вязкость, р азл агается и осаж дается на дно сосуда, — обозна­

чается сокращ ённо „ос“.

К огда наблю дается пром еж уточное полож ение м еж ду четвёртой и пятой ф азам и, то это состояние обозначается сокращ ённо „ос-взв*.

Это соответствует моменту н ач ал а разл о ж ен и я поднятой слизи.

6. Заготовка спор.

После всех испы таний по ген ерац и ям п роизводится заготовка спор л у ч ш и х чисты х л ини й , условно обозначенны х „А“ и „К “ .

Заготовка производится массовым высевом в пробирки со сте­

рильны м 5 % -м затором кукурузн ой м уки крупного помола, которые после 72 часбв брож ения и п астер и зац и и 45 ск при 100° С запаиваю тся. Затор д л я заготовок стери ли зуется 1 % ч ас а при 1 атм. После нескольких дн ей л ёж ки (на вы держ ку) п роверяли сь 2-е пробирки спор до 10-ой ген ерац и и вклю чительно (чистой л и н и и ш там а „К “). При этом учи ты вали сь активность культуры и бы­

строта сбраж и вания затора. Пересевы по генерациям прои зводи ли сь ч ерез каж ды е 6 час. (пересев на вторую генерацию п роизводился на 14-м ч асу брож ения).

7. Оценка и сравнение результатов.

Результаты брож ения оцениваю тся по сравнению с нормой, которую даёт сущ ествую щ ий ш там „C lostridium acetobuty licum ", согласно работам Н. Д. И ерусалимского (1934—1940) и др. Согласно этим данным, норм альное ацетоно-бутиловое брожение н а средах, содерж ащ их глю козу и крахм ал, им еет две характерные фазы.

П ервая характеризуется быстрым подъёмом кислотности и быстрым подъёмом газовы деления до м аксимума. М аксимум н аступ ает к 12— 20 часам брож ения. После этого н аступает вторая ф аза бро­

ж ен и я с характерны м спадом кислотности и газовы дел ен и я до минимума. При этом газовы деление затухает к моменту конца бро­

ж ения, а кислотность после д ости ж ен и я м иним ум а имеет н езн а­

чительны й вторичны й подъём и остан авливается на некоторой точке, которая имеет м еньш ий показатель, чем показатель кислотности при м аксимуме (обычно 3— 4 мл N/10 NaOH на 10 мл браж ки ; показатель м аксим ум а обычно колеблется м еж ду 4— 5,5 мл N/10 NaOH на 10 мл бражки). Г аза вы деляется всего 32— 38 гр/литр, и ацетона получается не м еньш е 6— 6,5 гр /ли тр и л и 10— 1 1 % от крахмала. Сольвентов по объёму, примерно, 2 ,2 % .

Соотношение получаем ы х сольвентов следую щ ее: ацетона 3 0 % , бутилового спирта 60 % и этилового спирта 10 °/0. К рахм ал и зч езает в браж ке к 24—30 часам. Перед падением кислотности до м и н и ­ м ума происходит поднятие затора, обычно к 20—26 ч асам бро­

ж ения.

Ненормальным считается брожений, когда п олучается очень низкий выход ацетона, и когда кислотность непрерывно растёт, п р е­

вы ш ая показатели обычного м аксим ума, что сопровож дается и сл а­

бым газовы делением. Процесс брож ения продолж ается нормально 60 часов, но при слабом разбраж и ван и и может затян у ться и до 72 ч ас.

10

Ш . Результаты работы.

1. И спы тания элективной культуры .

По указанной методике работы была вы ведена устой чи вая элективная культура, н азван н ая нам и условно культурой „Аб“.

Х арактеристика её даётся в таблицах № 1 и № 2.

Т а б л и ц а № 1.

Р езу л ь т а т ы и сп ы т ан и я элективной культуры „Аьи при 37° С н а 8%-м зат ор е к ук ур узн ой муки крупн ого помола.

№№ генераций % концентра­ ции затора П о к а з а т е л и а н а л и з о в Выход

ацетона

Выход г а за

Кислотность в мл N/10 NaOH на 10 мл А1

2

S 5

ас Макси­ мальная Мини­ мальная

Конеч­

ная

Максим.

к-ти н а ч ас брожения

Миним.

к-ти на час брожения

1 6 5,95 гр.л. 0,4 2,1—2,4

2 8 6,25 „ „ — 0,3 — ^— 2,9 ^— —

3 6 6,89 „ „ — 0,4 — — 2,6—2,9 — ^—

4 6 6,79 „ „ — 0,5 — — 2 ,0 - 2 ,4 — ^—

5 8 6,73 „ „ 32,75 гр.л. 0,4 4,5 1,9 2,5 14 24

6 6 — — 0,8 ^— — 2,6 — —

7 8 6,97 „ 32,34 „ я 0,3 4,0 2,0 2,9 12

18

П р и м е ч а н и е . Поднятие затора наблю далось меж ду 18—20 часами бро­

жения.

Из таблицы № 1 видно, что у элективной культуры „Аб“ ки с­

лотность и выхода ацетона являю тся нормальны ми н а всех ген е­

рациях.

Т а б л и ц а № 2.

Результаты испытания элективной культуры на 5-ой и 7-ой генерациях на 8%-м заторе.

о П о к а з а т е л и а н а Л и 3 0 в

'О S

Я § Выход г а за Кислотность Наличие

крахмала

Характеристика затора

ä * на на на на на на на на

5 генер. 7 генер. 5 генер. 7 генер. 5 генер. 7 генер. 5 генер. 7 генер.

0 0 0

1

12 1,75 3,00

I

14 — — 3,1 3,6 + + »

16 — — 3,3 2,4 + + „ „

18 — — 4,5 2,0 + + „ подн.

19 — % 4Д 2,1 + + подн.

24 11,75 14,10 1,9 2,5 *■— — „

36 19,00 10,85 2,4 2,6 — — п

48 0,50 4,60 2,5 2,9 — — Yi „

60 0,25 0,12 2,5 2,9 — — взв. ОС.

Всего 33,25 32,67 | - — — — — —

2. Описаняе культуры.

Me Coy, F red, P eterson, H astings (1926) в своей совместной работе дают описание культуры Cl. acetobutylicum, как вполне сходной с наш им ш тамом.

В итоге испы таний, из 12 вы веденных чистых л и н и й вы де­

л и л и сь две чистые л и н и и с л у ч ш и м и п оказателям и и р азл и чн ой морфологией. Одна из них н азван а ш тамом „А “ , д р у гая — штамом „К“ .

К ультура ш там а „А “ во многом сходна с сущ ествую щ им ш тамом ацетоно-бутиловых бактерий, в том чи сле по развитию и величине.

На сусловом агар-агаре она даёт ш ирокие круглы е колонии,

* слегка вы пуклые или плоские. К рая колонии немного лоп астевидно­

зазубренны е. В молодом возрасте (до 20 ч. роста) они имеют слабый ж ёлто-коричневы й цвет и почти прозрачны . К 24 часам роста, иногда позже, колонии окраш иваю тся с поверхности в м олочно­

матовый цвет. В дальн ей ш ем поверхность приобретает беловатую морщ инистость, гоф рированную ломаной линией, ради альн о т я н у ­ щ ей ся к вы пучиваю щ ем уся центру. Края, по-преж нему остаются ж ёлто-коричневы е.

12

Диаметр колонии достигает 2 ,5 —3 мм, высота 1 мм. При густом посеве она образует сплош ную беловатую плёнку с узор ч ато­

м орщ инистой поверхностью.

После 50 часов роста колония темнеет и приобретает кори чн е­

в ы й цвет. В этот момент она состоит из споровых форм культуры . Вообще, колония состоит из единичны х палочек, плотно при ле­

гаю щ их д руг к д р угу и располож енны х, в больш инстве случаев, радиальны м и нитям и. Эти нити, в момент приобретения беловатой окраски, приобретают ветвистость и образуют зи гза ги , что, веро­

ятно, и определяет радиальную узорчатую морщ инистость колоний.

Это соответствует III типу р азви ти я культуры в ж идкости. В ж и д ­ ком субстрате они очень сходны с сущ ествую щ им ш тамом ацетоно-

«бутиловых бактерий и отличаю тся л и ш ь больш ей подвижностью . К укурузны й затор, после сбраж и вания со ш тамом „А “, приобретает мутно-серый цвет. Спора образуется в конце палочки.

Ш там „К “ отличается от ш там а „А “ и сущ ествую щ его ш там а -Cl. acetobutylicum больш ей подвижностью палочек, особенно в первы й период р азвития, и вели чи н ой . До III типа они очень м ел к и е и быстро двигаю тся в ж идкой среде, в заторе из к укурузн о й муки, приобретая полную д лину в моменты, когда кислотность затора п ри ­ ближ ается к максимуму.

В этот период п алочки располагаю тся попарно, образуя углы , ка к и сущ ествую щ ие производственны е ацетоно-бутиловые бактерии.

Реж е образуются цепочки, состоящ ие из 3—4 п алочек. В этот период наблю дается их неравном ерность по длине и подвиж ности — от слабой до хорош ей. В IV типе встречаю тся единичны е цепочки из 3— 5 палочек. Споры образую тся и ли в центре клетки и л и ближ е к одному из концов палочек. В этот момент п ал очка сама п р и н и ­ мает иную ф орм у: если спора образуется точно в середине, то п ал о ч ка приним ает форму эллипса, если ближ е к одному концу, то палочка приним ает форму, похожую на заострённое эллип сообраз­

ное ручное зеркало. Под микроскопом споры обладают тёмно-жёлтым цветом со слегка зеленоватым оттенком, а тело бактерии (палочки) светлож елтоватой кайм ой охваты вает спору.

Спора имеет сл егк а угловатую эллипсовидно-вы тянутую форму.

Разм ер средний. К огда спора достигает полной величины , она осво­

бождается от окруж аю щ ей её тело м атеринской бактерии, которая разлагается к тому врем ени автолизом. При вы севе культуры ш там а ,,К “ на сусловы й агар-агар она образует мелкие круглы е и выпуклые колонии диаметром не больш е 1— 11/2 мм, похожие н а восковые

булавочны е головки. Они имеют сл егк а матово-жёлтый цвет и состоят из отдельных палочек. После 48 часов роста эти колонии начинаю т приобретать м утно-коричневы й оттенок. Это изм ен ен и е цвета совпадает со спорообразованием . Затор после сбраж и вания ш тамом „К“ приобретает яркож ёлты й цвет со слегка зеленоватым,, к ак бы ф луоресцирую щ им оттенком.

Из всего этого ясно, что нам уд алось вы делить два разли чн ы х ш там а ацетоно-бутиловых бактерий.

3. Сравнительное испытание штамов „А“ и „К“.

С огласно Stiles с сотр. (1929), с увели чен и ем концентрации затора от 3 ,2 6 % до 7 ,3 8 % общее количество растворителей оста­

ётся практически постоянным — так же, как количество ацетона и бутилового спирта, но увел и ч и вается выход этилового спирта. По

Т а б л и ц а №3 .

Результаты предварительного испы танвя штамов и В ы х о д а ц е т о н а в г р / л и т б р а ж к и Наименование на 6% концентрат. на 9 % концентрат.

штамов

1-я 2-я 5-ая 7-ая объёмный %

генерация генерация генерация генерация сольвентов

„ А “ 4,09 4,49 5,92 5,41 не определ.

»К“ 4,49 5,26 7,52 7,12 2,55

Существующий

штам — — 6,56 6,95 2,2

наш им наблю дениям, это соответствует увеличению конц ен трац и и затора до 9 % . И сходя из этого, для испы тания устойчивости новой культуры была принята наи вы сш ая концентрация.

При предварительном испы тании ш там а „А “ и ш там а „К “ на 6 % -м заторе из кукурузн ой м уки крупного помола (в склянках) и 9 % -м таком ж е заторе (в АЧК) рассчитаны средние результаты , ко­

торые приводятся в т а б л и ц е .№ 3.

Из таблицы № 3 видно, что ш там „К “ даёт л у чш и е вы ходы ацетона, чем ш там „А “ и сущ ествую щ ий штам.

Ш там „К “ на 9 % ‘м заторе 5-ой генерации даёт выходы ац ето н а от 6,42 до 7,52 гр/лит.

14

Газовы деление в среднем 34 гр /ли т, кислотность м аксим альн ая к 14 час. брож ения с показателем 5,1— 5,6 мл N/10 NaOH н а 10 мл браж ки. Затор подним ается кверху м еж ду 16— 24 часам и брож ения.

К онечная кислотность норм альн ая (ненормальностью счи тается, если кислотность останавливается н а вы сш ей точке, — Robinson, G. 1922 г.

и др.) Б рож ение закан чи вало сь при 37° С к 48 часам , счи тая с момента зараж ения. Ш там „А “, к ак более слабая кул ьтура (сход­

н ая с сущ ествую щ им ш тамом), был заготовлен на II ген ерац и и в пробирки и оставлен в запас, а ш там „К “ подвергся д ал ь н ей ­ ш ем у испытанию, и и з него заго тавл и вал о сь несколько серий спор.

4. Испытание устойчивости штама „К “ .

Д л я испы тания ш там а „К “ п р и м ен ял и сь особо ж ёстки е услови я, которые могут встретиться при аварийны х и прочих анормальны х сл у ч аях вед ен и я процесса в производстве.

а) О б щ е е и с п ы т а н и е .

Первое испы тание заклю чалось в том, что спорам, заготовлен ­ ным и з ш там а „К “, не дали возм ож ности вы стояться (определённый период л ёж ки после заготовки).

Т а б л и ц а № 4.

Испытание штама „К“ на выход ацетона но генерациям (ацетон в гр/лит бражки).

х . Генерации

% затора

1-ая 2-ая 3-ья 4-ая 5-ая 6-ая 7-ая 8-ая 9-ая 10-ая

6 4,49 5,26 5,03 4,50 4,33 4,99 4,80 _ _

9 7,52 7,35 7,04 7,04 7,12 6,73 7,20 6,03 5,09 5,72

9 7,80 7,43 7,35 7,12 7,28 6,97 7,28 7,74 — —

ср. на 9% заторе 7,66 7,39 7,20 7,08 7,15 6,85 7,24 6,37 — —

Унтеркоф лер Л. и др. (1936) указы ваю т, что п астери зац и я спор после 6— 12 дней вы держ ки у вел и ч и вает е ы х о д ы на 1 0 % п ускоряет брожение на 5 0 % . И з спор, зако н ч и вш и х брожение, нем едленн о зараж ал ась 1-я ген ер ац и я без п редварительной пастеризации. Как

1-я, так и последую щ ие ген ерац и и испы ты вались на 6 °/0 и 9 % -х зато­

рах вплоть до 10-ой ген ерац и и вклю чительно. Результаты п ри во­

д я т с я в таблицах № 4, 5, 6.

Из таблицы № 4 видно, что выходы ацетона, как на 6 % , так и на 9 % заторе, до 7—8-ой ген ерац и и вклю чительно, вы ш е 6 гр /ли т., после чего падают.

Т а б л и ц а №5 .

Газовыделение по генерациям штама Генерации

Часы брожения

1-ая 2-ая 3-ья 4-ая 5-ая 6-ая 7-ая 8-ая

0 0 0 0 0 0 0 0 0

8 . 0,17 1,15 1,25 2,36 2,12 0,12 0,82 0,45

16 1,20 6,90 5,25 7,62 7,90 4,25 6,00 3,00

24 4,90 14,20 13,50 18,12 17,62 13,62 12,00 6,55

32 14,75 7,20 11,50 7,37 7,13 10,50 11,55 5,57

40 10,38 2,15 3,25 1,62 1,50 4,00 4,00 5,70

48 3,15 0,70 0,95 0,30 0 2,12 0,95 5,40

56 2,00 0,13 0,12 0,15 0 0,15 0,25 2,75

64 0 0,13 0 0,07 0 0 0,25 0,75

Всего з а 64 ч аса 36,55 32,50 35,57 37,61 36,25 34,38 36,32 с^ТСО

Из таблицы № 5 видно, что, до 8-ой ген ерац и и вклю чительно, общее количество вы деленного га за находится в нормальны х г р а ­ ницах (32—37 гр./лит.), затем наступает р езки й спад. Это я вл я ется характерным признаком норм ального ацетоно-бутилового брож ения.

На 8-ой генерации, согласно данным газовы делен и я, можно пред­

полагать ослабление культуры . На это указы вает медленны й подъём газовы деления до м аксим ум а и растянуты й спад, а такж е н и зки й уро вен ь максимума.

П рактически, н ачи н ая со 2-ой генерац и и и до 7-ой ген ерац и и вклю чительно, брожение закан чи вается к 48 часам , на 5-ой ген ер а­

ци и — к 40-му часу.

М аксимум газовы деления — м еж ду 24— 36 час. брож ения. Это объясняется медленностью первоначального разбраж й ван и я. Затем , со 2-ой до 7-ой генерац и и вклю чительно, максимум находится м еж ду 14— 16 часам и брож ения. При этом уровень м аксим ум а газовы де-

16

л е н и я возрастает до 4-ой ген ерац и и вклю чительно, а затем падает.

У читы вая то, что пересев по ген ер ац и ям п рои зводи лся на 24 ч асу

•брожения, и проанализировав данные газовы делен и я, можно заклю ­ чить, что, н ач и н ая с 5-ой ген ерац и и , ку л ьту р а слабеет, что о б ъяс­

н я е тс я и нокуляцией перезрелой культурой.

Т а б л и ц а № 6.

Анализ кислотности по генерациям при испытании штама „Ки на 9%-м заторе.

Генерации

\ Часы брожения

1-ая 2-ая 3-ья 4-ая 5-ая 6-ая 7-ая 8-ая 9-ая

0 0,5 0,6 0,4 0,5 0,4 0,4 0,5 0,6 0,5

10 1,0 3,4 3,6 5,2 3,6 2,3 2,6 1,3 4,3

12 1,3 4,3 4,9 5,7 4,2 3,6 4,2 2,1 4,3

14 1,7 ^— 4,8 5,4 3,9 4,7 4,6 3,7 4,8

16 2,7 3,0 3,8 4,3 3,1 4,8 3,& — 5,6

18 3,9 ■— ^{— — _ —} — 4,2 5,8

20 4,6 2,3 2,1 2,3 ^— 4,4 3,5 ^—

21 ^— — ^— — — — — 5,2 6,8

22 4,7 — — — — — — 4,9 6,6

24 ' 4,2 1,6 2,6 2,8 2,6 2,9 2,0 - 4,4

36 2Д 2,7 2,9 2,7 3,0 3,2 3,2 2,6 2,0

48 2,5 3>,1 3,6 3,8 3,3 3,7 3,6 2,9 2,5

60 3,0 3,8 3,8 3,7 3,9 3,9 3,7 4,6 3,3

64 3,2 5,8 4,0 3,7 3,8 3,9 3,7 — —

Из таблицы № 6 видно, что кислотность до 7-ой ген ерац и и вполне норм альная, что подтверж дает вывод, сделанны й при ан а­

л и зе данных таблицы № 5 об окончании брож ения со 2-ой по 7-ую генерацию уж е к 48 часам брож ения. М аксимум кислотности, с 1:ой до 7-ой генерации вклю чительно, наступает на 12— 16 ч асу брож ения. Затем происходит норм альны й „перелом ", спад до м и н и ­ м ум а и затем вновь н езначи тельн ы й подъём до 3,7—3,9, на этом уровне д остигается относительная стабильность. Н а 8-ой и 9-ой генерации, м аксим ум кислотности наступает после 20 часов, в дальнейш ем к 12— 16 часу. Это свойственно норм альном у ацетоно­

бутиловом у брожению. П отверж дается и законом ерность, подмече- н ая Унтеркофлером и др. (1936), что 8-ая и 9-ая ген ер ац и и у м ен ь­

ш аю т выход ацетона, увели чи ваю т вязкость и слизистость затора.

И з таблиц № 4 и 5 можно сделать вывод, что споры ш там а „К “ дают нормальное ацетоно-бутиловое брож ение с характерны м и д л я него показателям и кислотности, газовы делен и я и выходами ацетона от первой до 8-й генерации.

б) В ы н о с л и в о с т ь к у л ь т у р ы к н и з к о й т е м п е р а т у р е и к о т н о с и т е л ь н о й н е с т е р и л ь н о с т и .

В нестерильны х условиях зар аж ал и сь скл ян ки с 9 % -м затором»

которые затем бродили при комнатной температуре. И спы тание проводилось до 5-ой ген ерац и и вклю чительно. Пересевы по ген е­

рациям производились через 24 часа. На п ротяж ении всех 5 генераций ш там „К “ д авал норм альное ацетоно-бутиловое брож ение.

После окончания брож ения скл ян ки вы д ерж и вали сь в тех ж е условиях ещ ё четверо суток, чтобы дать врем я разбродиться, возможно, находящ им ся в бражке посторонним культурам , а затем ан али зи ровали сь н а содерж ание ацетона. Согласно данным Б ех те­

ревой, И ерусалимского и други х, в нестерильны х услови ях зар а­

ж ение затора м олочно-масленокислы м и бактериями н аруш ает н ор­

м альны й ход ацетоно-бутилового брожения.

В результате оказалось, что склян ки , несмотря на все эти н е ­ норм альности, содерж али от 6,65— 6,81 гр/ли т. ацетона.

Это доказало устойчивость культуры и к н изкой температуре брож ения, и к относительной нестерильности, которые могут и м еть место в заводской обстановке.

в) В ы н о с л и в о с т ь п р и з а р а ж е н и и у с т а р е л о й к у л ь т у р о й .

Подобный вариант возм ож ен в заводских условиях при авар и й ­ ных случаях, чтобы не останавливать работы при н еу д ач ах с иноку- ляторам и.

И з 4-ой ген ерац и и на 50-ом ч асу брож ения были зараж ены склянки новой 1-ой генерации, которые испы ты вались до 6-ой ген е­

рации вклю чительно. Пересев по генерац и ям п рои зводи лся череа 24 часа. Результаты приводятся в таблице № 7.

Из таблицы № 7 видно, что эти испы тания ш там „К “ вы держ ал, тем более, что н а 2-ой и 4-ой ген ерации, после зараж ен и я этих генераций, температура в термостате случай н о п однялась до 42° С, а эта вы сокая тем пература я вл я ется неблагоприятно действую щ им н а

18

Т а б л и ц а №7 .

Испытание штама при зараж ении почти отбродившей (устарелой) куль­

турой на 50-м часу брожения.

S3ы св >Я

со ft Св Е-1 U Нh-r Ч

Ф1 tr CQ ft

©3 н

Кислотность в мл N/10 NaOH на

10 мл бражки Время

поднятия

Время исчезно­

Он Й

® <

и ф f-l

о ^ к ft Я ^ 03 «

S м «

■® ^ ~~г- Й ° ft

J5 (ч началь­

ная

макси­

мальная

мини­

мальная

конеч­

ная

затора в ч асах

вения крахмала

1. 36,99 6,70 0,5 4,5

20

2,1

36 2,4 24 20

2. 37,77 6,85 0,5 ' 5,2

т г

2,4

~26~ 4,1 ^{26 20}

3. 36,77 6,85 0,3 4,2

12

2,2

24 4,4 24 24

4. 36,50 7,24 0,5 5,8

Т (Г

не ул о­

влен. 5,7 н. п. —

5. 35,00 7,37 0,4 5,5

21

2,3

~8(Г 3,7 26 36

6. 35,10 7,24 — 6,1

16

2,3

Ж 3,4 н. п. 36

П р и м е ч а н и я : 1) В таблице № 7 в графах миним. и макс. кислотности числитель дроби показы вает величину кислотности, а знаменатель — на каком часу брожения определена эта кислотность.

2) „н. п .“ в графе времени поднятия затора обозначает „не поднял затора*.

ацетдно-бутиловое брожение фактором. Возможно, этим и объясняется неподнятость затора на 4-ой ген ер ац и и и ненормально вы сокая ко н еч н ая кислотность. То, что затор не п од н ял ся на 6-ой г е н е ­ рации, можно объяснять такж е возможно не зам еченн ы м и н ар у ­ ш ениям и тем пературного реж им а.

Из этих данных можно за к л ю ч и т ь : 1) что ш там „К “ не сниж ает выходов ацетона и при н аруш ен и и тем пературного реж им а в сто­

рону повы ш ения температуры, но не поднимает при этом затор а;

2) что ш там „К “ способен вы нести и зараж ен ие отбраживаю щ ей культурой, по крайней мере, до 6-ой ген ерац и и , не сн и ж ая вы хода ацетона.

5. Качество бражки.

Необходимо отметить ещ ё одно полож ительное свойство „К“, — это малое пенообразование при сбраж и вании кукурузн ого затора.

Д л я характеристики состава сольвентов (получаемы х при сбраж и­

вании со гатамом ,,К“) была произведена разгон ка браж ки на лабо-

2* 19