Entwicklung und Etablierung einer Methode für die zerstörungsfreie Bestimmung des Alkaloidgehaltes im Samen der Blauen Lupine (lat.: Lupinus angustifolius L.)

Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmittelwissenschaften Studiengang Agrarwirtschaft

Entwicklung und Etablierung einer Methode für die zerstörungsfreie

Bestimmung des Alkaloidgehaltes im Samen der Blauen Lupine

(lat.: Lupinus angustifolius L.)

Zur Erlangung des akademischen Grades

- Bachelor of Science (B. Sc.) -

vorgelegt von: Natalie Götz

1. Prüfer: Prof. Dr. sc. agr. Gerhard Flick Hochschule Neubrandenburg

2. Prüfer: Frau Dipl. agr. Ing. Sabine Schulze Saatzucht Steinach GmbH & Co. KG

-I

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei den Mitarbeitern der Saatzucht Steinach bedanken für die Möglichkeit das Thema zu bearbeiten, die Bereitstellung des Samenmaterials sowie für die fachliche Unterstützung von Frau Schulze und Frau Dieterich.

Des Weiteren möchte ich Herrn Prof. Dr. Flick danken für die Möglichkeit die Untersuchun-gen in den Laborräumen der Hochschule Neubrandenburg durchführen zu dürfen.

Mein besonderer Dank gilt vor allem Frau Schultze für die Betreuung während der Laborver-suche und der Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit.

Zudem möchte ich mich bei meiner „Laborpartnerin“ Heike Kunz für ihr „offenes Ohr“ und ihre fachlichen Hinweise bedanken.

Darüber hinaus möchte ich mich auch bei meinen Eltern, Großeltern und meinem Freund Christian Maschke bedanken. Sie alle haben mich während der Anfertigung dieser Arbeit und der gesamten Studienzeit immer motiviert und unterstützt.

II

Inhaltsverzeichnis

2.1 Die Lupine (lat.: Lupinus L.)... 3

2.1.1 Beschreibung und Herkunft der Gattung ... 3

2.1.2 Botanik & Herkunft der Blauen Lupine ... 4

2.1.3 Züchtung ... 6

2.1.4 Verwertung und Nutzen ... 8

2.1.4.1 Verwertung in der Tierernährung ... 8

2.1.4.2 Verwendung in der Humanernährung ... 9

2.1.4.3 Weitere Nutzungsmöglichkeiten ... 10 2.1.5 Besonderheiten ... 11 2.2 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe ... 12 2.3 Alkaloide ... 13 2.4 Alkaloidbestimmungs-Methoden ... 15 2.4.1 Chromatographische Verfahren ... 15 2.4.2 Immunologische Verfahren ... 15 2.4.3 Schnelltests ... 16

3 Materialen und Methoden ... 21

3.1 Geräte, Hilfsmittel und Chemikalien ... 21

3.2 Herkunft des Ausgangsmaterials ... 23

3.3 Kalibrierung ... 23

3.3.1 Herstellung der Stammlösung ... 23

III 3.4 Spektralphotometrische Alkaloidbestimmung unter Zugabe verschiedener

Reagenzien ... 24

3.4.1 Zugabe des Reagenz ... 24

3.4.2 Ermittlung der Messwellenlänge (Spektrum) ... 24

3.4.3 Extinktionswerte der Kalibrierlösungen im Zeitverlauf ... 25

3.5 Probenvorbereitungen ... 25

3.5.1 Quellverhalten der Samen ... 25

3.5.2 Bestimmung der Quellzeit ... 26

3.6 Vergleichende Untersuchungen mit gemahlenem Samenmaterial ... 26

3.6.1 Herstellen und Einquellen der gemahlenen Samen ... 26

3.6.2 Filtrieren/Zentrifugieren ... 26

3.6.3 Bestimmung der Standdauer/-zeit ... 27

3.7 Berechnung des Alkaloidgehaltes ... 27

4 Ergebnisse ... 29

4.1 Kalibrierung ... 29

4.1.1 Dragendorff-Munier-Sprüh-Lösung ... 29

4.1.2 Jod Kaliumjodid nach Lugol ... 31

4.2 Quellverhalten der Samen ... 32

4.3 Quellzeiten ... 34

4.4 Vergleich der Alkaloidgehalte ... 35

4.5 Vergleichende Untersuchungen mit gemahlenem Samenmaterial ... 36

4.6 Arbeitsanweisung ... 37

5 Diskussion ... 37

6 Fazit ... 39

Literaturverzeichnis ... 41 Anhang ... VIII Eidesstattliche Erklärung ... XIII

IV

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Genzentren der Lupinenarten auf der Weltkarte (grau schraffiert)

(Hackbarth, et al., 1959) ... 3 Abbildung 2: Lupinus angustifolius L.: a Habitus, b Zweig mit reifen Hülsen, c Samen (Hegi, 1975) ... 5 Abbildung 3: Natürliches Verbreitungsgebiet von Lupinus angustifolius L. im

Mittelmeerraum (schwarz markiert) (Hondelmann, 1996) ... 6 Abbildung 4: Fluoreszenz am Samen zweier Sorten der Weißen Lupine (lat.: Lupinus albus) unter UV-Licht. links: Alban (alkaloidarm) rechts: Weibit (alkaloidreich) ... 17 Abbildung 5: Abrissmethode-Untersuchungsergebnisse von links nach rechts:

Lupinus luteus: 1. alkaloidreich, 2. alkaloidarm; Lupinus angustifolius: 3. alkaloidreich 4. Alkaloidarm (Hackbarth, et al., 1959)... 19 Abbildung 6: Indikatorpapiermethode: Aufdrücken eines Lupinenblattstiels auf

Indikatorpapier, die drei dunklen Flecken stammen von alkaloidreichen Pflanzen, der blasse Fleck von einer alkaloidarmen Pflanze (Plarre, 1999) ... 20 Abbildung 7: Strukturformel von Lupanin (Wink, 1994) ... 23 Abbildung 8: Lupinensamen zum Quellen in verschiedenen Behältnissen (links: Reagenzgläser, rechts: Schnappdeckelgläser in zwei Varianten mit Wasser befüllt: D1-2 ml und D4-3 ml) ... 25 Abbildung 9: aufbereitetes Samenmaterial links: grob zerkleinert, rechts: fein

gemahlen ... 27 Abbildung 10: Kalibrierstandardreihe oben: mit DM; unten: mit JKJ ... 29 Abbildung 11: Absorptionsspektrum von DM in einem Messwellenbereich von 300-850 nm mit RW (BW und 25 mg/l-Kalibrierstandard) ... 29 Abbildung 12: Kalibriergerade von DM mit DW in einem Messwellenbereich von 525 nm ... 30 Abbildung 13: Absorptionsspektrum von JKJ in einem Messwelllenbereich von 300-850 nm mit RW (BW und 25 mg/l-Kalibrierstandard) ... 31 Abbildung 14: Kalibriergerade von JKJ mit RW und BW (s) in einem

Messwellenbereich von 525 nm ... 32 Abbildung 15: Stabilitätsuntersuchung der Kalibrierlösungen nach Zugabe des

V Abbildung 16: Gewichtszunahme der Lupinensamen ( drei verschiedene Sorten) beim Quellvorgang innerhalb 24 h; TKG-Angaben in g ... 33 Abbildung 17: Rotilabo®-Probenröhrchen befüllt mit einem Lupinenamen und 2 ml Wasser ... 34 Abbildung 18: Grafische Darstellung der Quellzeiten in Bezug auf den Alkaloidgehalt in μg/g Samen in Boxplots (8 und 10 h: n=4; 14 und 18 h: n=19) ... 34 Abbildung 19: Vergleich des feinzermahlenem Samenmaterials links: vor; rechts: nach dem Zentrifugieren mit Mini Spin ... 36

VI

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Rohnährstoffgehalte einheimischer Körnerleguminosen im Vergleich mit

Sojabohne und Sojaextraktionsschrot in g/1000 g Frischmasse (DLG, 2005) ... 8

Tabelle 2: Aminosäuregehalte einheimischer Körnerleguminosen im Vergleich mit Sojaextraktionsschrot in g/100 g Rohprotein (Römer, 2007) ... 9

Tabelle 3: Verwendete Geräte in alphabetischer Reihenfolge ... 21

Tabelle 4: Verwendete Hilfsmittel in alphabetischer Reihenfolge ... 22

Tabelle 5: Verwendete Chemikalien in alphabetischer Reihenfolge ... 22

Tabelle 6: Verdünnung der Stammlösung zur Herstellung der Kalibrierstandards ... 24

Tabelle 7: Extinktions-Messwerte der Kalibrierstandards mit DM und verschiedenen Lösungsmitteln ... 30

Tabelle 8: Extinktions-Messwerte der Kalibrierstandards mit JKJ und verschiedenen Lösungsmitteln ... 31

Tabelle 9: Alkaloidgehalte der Samen von verschiedenen Lupinensorten in % der TM (aus den GC-Untersuchungen von M. Wink; Anhang 1) und FM (errechnet mit Formel (7)) ... 35

VII

Abkürzungsverzeichnis

BW Probenblindwert

BW (s) Probenblindwert mit 125 μl HCl (c= 0,1 mol/l) angesäuert

DC Dünnschichtchromatographie

DM Dragendorff-Munier-Sprühlösung

DW destilliertes Wasser

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

GA Gesamtalkaloide

GC Gaschromatographie

GVO gentechnisch veränderter Organismus

HCl Salzsäure

HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie (engl.: High Performance Liquid Chromatography)

H2O Wasser

JKJ Jod Kaliumjodid-Lösung nach Lugol

MS Massenspektroskopie n Anzahl RIA Radioimmunoassay RW Reinstwasser TKG Tausendkorngewicht NIRS Nahinfrarotspektroskopie

SPA Scintillation proximity assay

1

1 Einleitung

In der Human- und Tierernährung sind Leguminosen seither bedeutende Kulturpflanzen. Bereits in den Anfängen der Menschheit wurden Körnerleguminosen als Quelle für Eiweiß, Kohlenhydrate und andere Nährstoffe sehr geschätzt und daher kultiviert. In Deutschland spielt der Körnerleguminosen-Anbau für die Futter- und Lebensmittelindustrie eine unterge-ordnete Rolle. Die weitgehende Deckung des Futterproteinbedarfs mit importierten Sojapro-dukten, die vergleichsweise niedrigen Preise für Mineralstickstoff sowie die Bevorzugung von Kulturarten mit höheren direktkostenfreien Leistungen sind die ausschlaggebenden Gründe dafür. Um den Bedarf an Kraftfutterprodukten zu decken, wurde im Jahr 2012 3,26 Millionen Tonnen Soja und 3,54 Millionen Tonnen Sojaschrot vorrangig aus Brasilien, den USA und Argentinien nach Deutschland importiert (Baumann, et al., 2013). Im Laufe der vergangenen Jahre verdrängte dieser massive Import den inländischen Anbau proteinreicher heimischen Leguminosen. Doch auf Grund der gesellschaftlichen Ablehnung von GVO Pflanzen in Euro-pa steigt die Nachfrage nach regional ökologisch bzw. konventionell erzeugten gentechnik-freien Eiweißpflanzen an. Einheimische Körnerleguminosen wie Erbsen, Bohnen, Lupinen, Klee und Luzerne bieten zu den Sojaprodukten eine Alternative. Insbesondere die Lupine besitzt ein hohes Potential. Sie zählt wie bereits erwähnt zu den heimischen Körnerlegumi-nosen, ist gerade auf leichten Böden sehr ertragreich und besitzt eine ähnliche Inhaltsstoff-zusammensetzung wie Soja, woraufhin sie auch als „Soja des Nordens“ bezeichnet wird. Auf Grund dieser Eigenschaften ist es auch möglich (ohne Berücksichtigung der betriebswirt-schaftlichen Gesichtspunkte) die Lupine für Soja-Importe zu ersetzen und eine gentechnik-freie Futtermittelversorgung zu erzielen. Zudem besitzt das Lupinenprotein das Vermögen die Lebensmittelindustrie neu zu gestalten und gewinnt deswegen immer weiter an Bedeu-tung.

1.1 Problemstellung

Die vielfältige Nutzungsweise der Lupinen ist basierend auf der Eigenschaft, dass sie Alkalo-ide beinhalten, gehemmt. AlkaloAlkalo-ide besitzen einen leicht bitteren Geschmack, können to-xisch wirken und müssen vor der Eignung als Lebens- bzw. Futtermittel vor der weiteren Verwertung aufwendig extrahiert und separiert werden. Nachdem es bereits gelungen ist alkaloidarme Lupinensorten zu züchten, ist das Interesse an einer alkaloidfreien Sorte welt-weit gestiegen und rückt derzeit immer welt-weiter in den Fokus der Züchtung und Forschung. Die züchterische Bearbeitung von alkaloidarmen Lupinensorte wird weltweit nur von wenigen Zuchtunternehmen verfolgt. Insbesondere das deutsche Unternehmen Saatzucht Steinach GmbH und Co. KG in Steinach nahm sich der Herausforderung an und züchtet seit Jahren

2 erfolgreich alkaloidarme Sorten der Blauen Lupine, mit denen sie sich auf dem Markt etablie-ren konnten. Die Quantifizierung der Alkaloide in der Lupine ist dementsprechend für die Evaluierung von Neuzüchtungen essentiell. Um den Gehalt qualitativ sowie quantitativ zu bestimmen existieren viele Möglichkeiten. Bislang lässt das Unternehmen die Gehalte quali-tativ von externen Laboren bestimmen, welche mit aufwendigen chromatographischen Ver-fahren arbeiten. Eine chromatographische Methode als Routineanalytik in diesem Zuchtun-ternehmen zu integrieren, gestaltet sich als schwierig, da sie zum einen aufwendig und zum anderen kostenintensiv sind. Zudem werden die Lupinensamen hierfür zermahlen und scheiden somit für die weitere Züchtung aus. Außerdem sind das Auswählen und Einschi-cken der zu untersuchenden Samen, sowie die Untersuchungen selbst mit einem hohen Zeitaufwand verbunden. Gegenüber den aufwendig analytischen Verfahren existieren aller-dings auch weitere Möglichkeiten die Alkaloide quantitativ. Die sogenannten Schnelltests werden auf Grund ihrer relativ einfachen Handhabung und der schnellen Bestimmung über-wiegend von Praktikern der Pflanzenzucht bevorzugt. Doch in den meisten Fällen ist nur eine grobe Unterscheidung von hohem, mittlerem und niedrigem Gehalt möglich, so dass die Prü-fung auf signifikante Unterschiede bei geringen Konzentrationsbereichen nicht gewährleistet ist.

1.2 Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit ist es, im Interesse des Saatzuchtunternehmens Steinach GmbH & Co. KG eine geeignete Methode zu entwickeln und zu etablieren, die eine Quantifizierung des Alka-loidgehaltes im Samen der Blauen Lupine erlaubt. Ferner muss auch sichergestellt werden, dass diese Methode dem Anspruch der zerstörungsfreien Untersuchung am Samen gerecht wird und somit eine weitere züchterische Bearbeitung gewährt. Um Aussagen über die Alka-loidgehalte der einzelnen Lupinensamen treffen zu können, wird eine photometrische Me-thode angewandt. Diese wird im Rahmen der Versuche unter verschiedenen Gesichtspunk-ten entwickelt und etabliert. In diesem Zusammenhang könnte mit Hilfe dieser erarbeiteGesichtspunk-ten Methode die Selektion des Zuchtmaterials einfacher und effektiver gestaltet werden, sodass die Züchtung alkaloidarmer bzw. -freier Sorten unterstützt werden kann. Um die Bedeutung der Arbeit und die damit verbundenen Untersuchungen verständlich zu machen, wird zu-nächst in der Literaturübersicht grundlegendes über die Lupine und auf den heutigen Stand des Wissens auf dem Gebiet der Alkaloide sowie die Bestimmungs-Methoden am Lupinen-material eingegangen.

3

2 Literaturübersicht

2.1 Die Lupine (lat.: Lupinus L.)

2.1.1 Beschreibung und Herkunft der Gattung

Die Gattung Lupine (lat.: Lupinus L.) gehört zur Familie der Hülsenfrüchtler (lat.: Fabaceae). Die Namensgebung geht Vermutungen zufolge bereits in das römisch-griechische Altertum zurück, denn das griechische Wort „λύπη“ (ausgesprochen: „ly´pe“) heißt übersetzt so viel wie „Gram“ oder „Kummer“. Höchstwahrscheinlich basiert die Namensgebung auf den, durch die Bitterstoffe hervorgerufenen, Beschwerden. In der deutschen Sprache existiert für Lupi-nen auch der Begriff „Wolfsbohne“, was darin begründet ist, dass das Wort Lupinus Ähnlich-keit mit dem lateinischen Begriff für Wolf „lupus“ besitzt (Krausch, 2002). Je nach Klassifika-tion existieren weltweit ca. 450 Lupinenarten. Ungefähr 200-300 Arten stammen aus Süd-amerika und schätzungsweise weitere 150 Arten sind in den Vereinigten Staaten von Ameri-ka verbreitet, wobei diese überwiegend aus dem westlichen Teil der Rocky Mountains stammen. Nur zwölf Arten haben ihren Ursprung in Europa und Afrika (Barceloux, 2008). In der Literatur ist die genaue Herkunft sowie die Verbreitung der Gattung Lupine sehr umstrit-ten. Renommierte Wissenschaftler haben hierfür zahlreiche Theorien aufgestellt. Prinzipiell existieren zwei geografisch weit voneinander entfernte Genzentren, welche für die Herkunft der Lupine in Frage kommen (Abbildung 1: Genzentren der Lupinenarten auf der Weltkarte (grau schraffiert) Abbildung 1). Es handelt sich dabei zum einen um den amerikanischen Kontinent und zum anderen um den Mittelmeerraum. Da bereits vor der Entdeckung Ameri-kas auf beiden Seiten des Atlantischen Ozeans die Lupine beheimatet war, erfolgt eine Un-terteilung in die Alte Welt, womit der Mittelmeerraum gemeint ist, und die Neue Welt, dem amerikanischen Kontinent (Hondelmann, 1996).

4 Nach GROSS´ Theorie liegt das Entstehungsgebiet im Nordosten Brasiliens. Diese Region

weist nämlich noch bis heute einfachblättrige Lupinenformen auf, welche als ursprünglich angesehen werden. Seiner Ansicht nach war das Gebiet Teil des sogenannten Südkonti-nents Godwanaland, welches vor 100 Millionen Jahren eine ökogeografische Verbindung zwischen Südamerika und Afrika war (Gross, 1986). Eine vergleichbare Theorie nimmt auch KURLOVICH an. Jedoch geht er von einem nördlichen Urkontinent Laurasia aus. Es existieren hierfür noch einige weitere Hypothesen, doch insgesamt betrachtet unterliegt ein Großteil der Entstehungstheorien den plattentektonischen Vorgängen in den Erdzeitaltern. Durch das Auseinanderdriften der Kontinente und der damit verbundenen unterschiedlichen Umweltbe-dingungen kam es zu separaten Entwicklungen und jede Evolutionslinie bildete somit unab-hängig voneinander spezifische Merkmale aus, sodass sich die Lupinen der Alten und Neu-en Welt im morphologischNeu-en Charakter, in dNeu-en EntwicklungszyklNeu-en und in der Anzahl der Chromosomen, welche genetische Barrieren bei der Kreuzung setzt, unterscheiden (Kurlovich, 2002). Zudem haben sich in der Alten Welt nur annuelle Arten entwickelt, wobei die Arten der Neuen Welt überwiegend perennierend sind. Die Weiße Lupine (lat.: Lupinus albus), die Gelbe Lupine (lat.: Lupinus luteus) und die Blaue Lupine (lat.: Lupinus angustifoli-us) zählen zu den landwirtschaftlich intensiv genutzten Arten. Diese stammen aus der Alten Welt. Aus der Neuen Welt werden lediglich die Andenlupine (lat.: Lupinus mutabilis) und die Staudenlupine (lat.: Lupinus polyhyllus) kultiviert. Alle Lupinenarten unterscheiden sich in ihren Ansprüchen an den Boden und Klima, aber auch hinsichtlich ihrer Inhaltsstoffe und Verwertungsmöglichkeiten. Darüber hinaus sind die Pflanzen von ihrer Evolution her alkalo-idhaltig (Plarre, 1999). Sie enthalten im Samen als auch im grünen Gewebe von Natur aus Bitterstoffe, welche auch als Alkaloide bekannt sind. Besonders die Lupinenkörner der Wild-formen besitzen hohe Alkaloidgehalte von 1-4% der Trockenmasse, die teilweise sogar auch höhere Akkumulationen zulassen. Im Vergleich dazu enthalten die neuen Züchtungen weni-ger als 0,05%. Es gibt sogar bereits Sorten, die eine äußerst weni-geringe Konzentration von 0,02% aufweisen (Römer, 2007). Erst ab einem Alkaloidgehalt im Samen von unter 0,05% zählen Lupinen zu den „Süßlupinen“ (Dierauer, et al., 2004). Diese Bezeichnung kann miss-verständlich sein, da sie nicht vollkommen süß und damit verbunden bitterstofffrei, sondern lediglich bitterstoffarm sind.

2.1.2 Botanik & Herkunft der Blauen Lupine

Die Blaue Lupine (lat.: Lupinus angustifolius L.), welche auch als Schmalblättrige Lupine be-zeichnet wird, ist ein dicotyles, einjähriges Kraut mit einer Wuchshöhe von 20-100 cm. Ihre Pfahlwurzeln können eine Länge von 2,20 m erreichen. Die grünen Stängel sind rund,

5 schwach behaart und mit vielen Blättern bestückt. Die Abbildung 2 zeigt eine botanische Zeichnung der Blauen Lupine. Daraus geht hervor, dass die Blätter wechselseitig angeordnet sind. Sie können 5-9-mal gefiedert sein und besitzen eine schmale lanzetten-artige Form. Die Blüten der Blauen Lupine entsprechen der typischen Schmetterlingsblüte, sind in ge-drängten Trauben angeordnet und stehen auf kurzen Stielen. Sie können hell- oder dunkel-blau mit violettem Farbton und - entgegen der Namensgebung - auch selten rosa, purpur oder weiß sein (Hondelmann, 1996). Die Hülsen sind behaart, werden 5-7 cm lang, 1-1,25 cm breit und beinhalten in der Regel 5-6 Samen (Hegi, 1975). Ausgereifte Samen sind rund-oval bis nierenförmig und die Samenschale ist glatt und unterschiedlich gefärbt. Die Grund-farben reichen von cremeGrund-farben über grau und schwarz bis hin zu braun. Zu einem Großteil weisen sie auch Flecken und Muster auf. Das Tausendkorngewicht liegt zwischen 140 und 200 g (Cowling, et al., 1998).

Abbildung 2: Lupinus angustifolius L.: a Habitus, b Zweig mit reifen Hülsen, c Samen (Hegi, 1975)

Die Wildform der Blauen Lupine ist im Mittelmeerraum bis nach Vorderasien beheimatet. Die Abbildung 3 verbildlicht das natürliche Verbreitungsgebiet der Blauen Lupine. Trotz der wei-ten Verbreitung im Mittelmeerraum scheint die Blaue Lupine im Altertum nicht angebaut wor-den zu sein. Erstmals in Aufzeichnungen aus dem 17. Jahrhundert ging hervor, dass sie als Gründüngungs- und Futterpflanze kultiviert wurde (Hegi, 1975). Innerhalb der vergangenen

6 Jahre wurden in Südafrika, Polen, Chile, Deutschland und in Süd- und Westaustralien ver-mehrt Sorten der Blauen Lupine kultiviert (Cowling, et al., 1998).

Abbildung 3: Natürliches Verbreitungsgebiet von Lupinus angustifolius L. im Mittelmeerraum (schwarz markiert) (Hondelmann, 1996)

2.1.3

Züchtung

Eine züchterische Bearbeitung ist notwendig, um aus der ursprünglichen Lupinen-Wildform eine Kulturform entstehen zu lassen, die als voll nutzbarere Kulturpflanze in Deutschland angebaut werden kann. Die Wildformen der Lupine besaßen früher negative Eigenschaften wie Spätreife, Hülsenplatzen, hohen Wuchs und den bereits angesprochenen hohen Alkalo-idgehalt. Diese galt es mit Hilfe gezielter Züchtung zu domestizieren. Bereits Karl Friedrich der Große befasste sich im späten 18. Jahrhundert mit der Lupinen-Züchtung. Er verwende-te Saatgut der Weißen Lupine aus Italien und war bestrebt die „neue“ Pflanze in Preußen einzuführen um sie in der bestehenden Landwirtschaft zu etablieren. Doch darin bestand auch das Problem. Die vorherrschenden Umweltverhältnisse entsprachen nicht den Ansprü-chen der Pflanze aus dem Mittelmeerraum, sodass nur unzureiAnsprü-chende Ergebnisse erzielt wurden und mit dem Tod Friedrichs das Interesse an der Züchtung fast zum Erliegen kam (Hondelmann, 1996). In den folgenden Jahrzehnten behielten die Lupinen lediglich den Wert als Gründüngungspflanze bei. Eine großflächige Verbreitung des Lupinenanbaus war basie-rend auf dem geringen Nutzungswertes gehemmt. Der Lupine fehlte im Gegensatz zu ande-ren Kultuande-ren die Stabilität im Anbau um die Produktion abzusichern. Erst zu Beginn des 20. Jahrhunderts traten vermehrt Diskussionen über bitterstoffarme Lupinen auf. Neben dem Kellnerschen Entbitterungsverfahren gab es um 1900 viele weitere teilweise sogar patentier-te Methoden die Alkaloide zu extrahieren. Trotz der Entwicklung gingen die Meinungen weit auseinander als es um die Fragestellung ging, ob das Entbittern im großtechnischen

Verfah-7 ren oder über den züchterischen Weg mittels Selektion bitterstoffarmer oder sogar -freier Pflanzen zu lösen sei. Es stellte sich im weiteren Verlauf auch heraus, dass die Entbitte-rungsschritte zu aufwendig und kostenintensiv waren. Zudem gingen nach den damaligen Entbitterungsprozessen 20-30% der Inhaltsstoffe verloren (Winterstein, et al., 1931). Entge-gen dem scheiterten viele verschiedene Pflanzenzüchter bei dem Versuch bitterstoffarme Lupinen zu züchten. So beklagte T. Roemer in seinen Arbeiten, dass nichts über die Rolle der Alkaloide in der Lupinenpflanze bekannt sei. Ein weiteres Problem der Pflanzenzüchtung bestand darin, dass zum damaligen Zeitpunkt keine geeignete Alkaloidbestimmungs-Methode existierte, die auch Massenanalysen erlaubte (Hondelmann, 1996). Die Züchtung der alkaloidarmen Lupine forderte sogar ein Opfer, den Direktor des Kaiser- Wilhelm- Insti-tuts für Chemie in Berlin, Professor Beckmann. Dieser verwendete anstelle einer chemi-schen eine sensorische Methode um den Bitterstoffgehalt zu bestimmen. Sein eigener Ge-schmack sollte ihm Aufschluss geben und so erprobe er regelmäßig die Gehalte. Eine einfa-che Probe mit der Zungenspitze war Professor Beckmann nicht ausreieinfa-chend, so dass er ei-nen großen Schluck des Auslaugewassers nach dem Entbittern trank und anhand der Inten-sivität des Kratzens im hinteren Gaumenbereich den Alkaloidgehalt abschätzte. Diese Ei-genart war wahrscheinlich sein Verhängnis. Vermutungen zur Folge ist er an der Vergif-tungskrankheit Lupinose erkrankt und verstarb 1923 in einem Alter von 70 Jahren (Hondelmann, 1996) (Lockemann, 1953). Erst durch die Pionierarbeiten des deutschen Züchters R. v. Sengbusch kam der Durchbruch. Ihm gelang es eine geeignete Alkaloidbe-stimmungs-Methode zu entwickeln, welche auch dem Anspruch der Massenanalysen ge-recht wurde. Er legte damit die Grundsteine der Lupinenzüchtung und schaffte die Voraus-setzungen für die Selektion alkaloidarmer Lupinen. Mit Hilfe der Methoden entdeckte er kurz darauf die ersten alkaloidarmen Lupinenkörner der Blauen, Gelben und Weißen Lupine in der Mutationszüchtung (Sengbusch, 1942). Um die Dimension dieser Arbeiten zu verdeutli-chen, schätzte R. v. Sengbusch die von ihm und seinen Mitarbeitern untersuchten Pflanzen in dem Zeitraum von 1927- 1939 auf eine Anzahl von 6-7 Millionen (Hondelmann, 1996). Aus dem heutigen Standpunkt moderner biochemischer Analytik gesehen, waren Sengbuschs entwickelte Schnelltests sehr grobe Verfahren, jedoch erfüllten sie den damaligen Zweck. Die alten bitteren Lupinensorten sowie die Wildformen haben ihre Bedeutung in der Züch-tung aber nicht verloren. Sie dienen weiterhin als wertvolle Quelle zur Erweiterung des Gen-materials für die Ausprägung bestimmter Eigenschaften und werden somit auch für die heu-tige Züchtung verwendet.

8 2.1.4 Verwertung und Nutzen

Zunächst galt die Lupine als eine Pflanze, die in äußersten Notlagen wie bei Hungersnöten und Missernten als Substitut für Getreide Verwertung fand. Doch nach dem Auffinden alkalo-idarmer Lupinensorten ergaben sich viele neue Nutzungsmöglichkeiten (Römer, 2007). Lupi-nen haben eine hervorragende Inhaltsstoffzusammensetzung. Aus Tabelle 1 geht hervor, dass ihr Rohproteingehalt dem der Sojabohne sehr nahe kommt. Die Gelbe Lupine übertrifft die Sojabohne dabei sogar. Das Lupinenprotein besitzt außerdem sehr viele essentielle Aminosäuren (Tabelle 2), weswegen der Lupine ein hoher ernährungsphysiologischer Wert zugeteilt wird. Darüber hinaus enthalten sie im Vergleich zu den anderen heimischen Körner-leguminosen die höchsten Rohfaser- und Rohfettanteile. Das Lupinenöl ist zudem auch sehr reich an ungesättigten Fettsäuren.

Tabelle 1: Rohnährstoffgehalte einheimischer Körnerleguminosen im Vergleich mit Sojabohne und So-jaextraktionsschrot in g/1000 g Frischmasse (DLG, 2005)

Futtermittel Trockenmasse Rohprotein Rohfett Rohfaser Stärke

Ackerbohne 880 262 14 78 371 Erbsen 880 221 13 59 421 Blaue Lupine 880 293 50 143 89 Gelbe Lupine 880 385 50 148 43 Weiße Lupine 880 328 77 114 65 Sojabohne 880 350 179 55 50 Sojaextraktionsschrot 890 488 12 35 61

2.1.4.1 Verwertung in der Tierernährung

Um die Samen in der Tierernährung verwerten zu können, ist es nötig sie zu Schroten oder zu Mahlen, da sonst keine vollkommene Verwertung gewährleistet werden kann. Durch das zusätzliche Schälen der Samen kann auch der Rohfasergehalt reduziert werden. Wegen ihres hohen Proteingehaltes (

Tabelle 1) eignen sich die Lupinensamen besonders gut zur Eiweißergänzung in

Mischfut-termitteln für Monogastrier und Wiederkäuer. Die Samen finden aber auch in der Kaninchen-, Forellen- und Lachsfütterung ein Einsatzgebiet. Neben der Inhaltsstoffzusammensetzung ist die Proteinqualität der Futtermittel ein weiteres wichtiges Kriterium bei der Proteinergänzung. In Tabelle 2 sind die Aminosäuregehalte der Futtermittel genau aufgeschlüsselt. Zwar er-scheinen die Gehalte der Lupinen und den anderen Körnerleguminosen gegenüber dem Sojaextraktionsschrot zunächst geringwertig, aber das Protein der Lupinen ist aus

ernäh-9 rungsphysiologischer Sicht das beste Nahrungsprotein, weil das Aminosäurenverhältnis dem „idealen Protein“ am nächsten kommt. Da lediglich die Aminosäure Methionin in einem Man-gel vorzufinden ist, muss entsprechend darauf geachtet und (vor allem in der GeflüMan-gelfütte- Geflügelfütte-rung) als Zusatz ergänzt werden. Des Weiteren ist zu berücksichtigen, dass in der Schwei-neernährung der Alkaloidgehalt der gesamten Ration unter 0,02% liegen sollte, da Schweine besonders empfindlich auf den, durch Alkaloide verursachten, bitteren Geschmack reagieren (Römer, 2007). Neben den Samen kann auch die gesamte Pflanze als Heu, Grün- oder Gär-futter genutzt werden, da die Grünmasse auch hohe Eiweißgehalte besitzt. Lupinen werden aber auch als Wildfutter für Rehe in Waldschlägen angesät. Das Lupinenstroh eignet sich sehr gut als Einstreu (Hegi, 1975).

Tabelle 2: Aminosäuregehalte einheimischer Körnerleguminosen im Vergleich mit Sojaextraktionsschrot in g/100 g Rohprotein (Römer, 2007)

Futtermittel Cystin Lysin Methionin Threonin Tryptophan

Ackerbohne 1,26 6,42 0,80 3,56 0,88 Erbsen 1,47 7,17 1,00 3,75 0,90 Blaue Lupine 1,33 4,49 0,55 3,31 0,91 Gelbe Lupine 1,54 4,60 0,60 3,34 0,73 Weiße Lupine 1,42 4,66 0,65 3,49 0.90 Sojaextraktionsschrot 1,51 6,26 1,45 3,99 1,31

2.1.4.2 Verwendung in der Humanernährung

In der menschlichen Ernährung werden überwiegend die Lupinensamen verarbeitet. Die Verwertung der Lupinensamen ist sehr weit gefächert: Angefangen vom ganzen Korn, über die Herstellung von Lupinenmehl, Lupinenmilch, Lupinenöl, Lupinenquark, Lupinenjoghurt, Lupinenmayonnaise, Lupinenmiso bis hin zu Lupinentofu u.v.m.. Aufgrund der sehr guten technologischen Eigenschaften wie Wasserbindungsvermögen, Farbe und Geschmacksge-bung, kann die Lupine in vielen Herstellungsprozessen von Lebensmitteln verwendet werden (Goldscheider, 2014). In der Vergangenheit wurde das Lupinenmehl ohne geschmackliche Beeinträchtigungen anderen Mehlen beigefügt .In Russland war es in einer Höhe von bis zu 25% erlaubt. Teilweise wurden die Samen aufgrund des bitteren Geschmacks auch als wür-ziger Zusatz bei der Bierbereitung verwendet. In der Nachkriegszeit nahm man geröstete Samen der Blauen Lupine als Kaffeeersatz, was zuvor bereits in Russland üblich war (Hanelt, 1960). In der modernen Ernährung wird das Lupinenmehl in Teig- und Brotwaren beigemischt. Die geschmacklich neutralen Lupinenproteine können aber auch in Fleisch- und Wurstwaren Verwendung finden, da sie eine hervorragende, natürliche Emulgierfähigkeit und

10 -stabilität aufweisen. Wie bereits mit Soja erfolgreich umgesetzt, können aus Lupinen auch vegetarische bzw. vegane Hack- sowie Wurstwaren hergestellt werden. Auch die Verwen-dung des Lupinenmehls für die Zubereitung von Waffeln oder Pfannkuchen hat sich als er-folgreich erwiesen, da sie nicht nur ein lockeres Produkt sondern ebenso eine natürliche Gelbfärbung erzeugen (Goldscheider, 2014). Auf dem deutschen Lebensmittelmarkt existiert seit 2011 das Lupinesse-Eis, welches von dem Unternehmen Prolupin aus Lupinenproteinen hergestellt wird und somit ein rein pflanzliches Speiseeis darstellt. Durch das Hinzufügen von Lupinenprodukten werden die Struktur, die Verarbeitungseigenschaft und der Nährwert des Produkts verbessert. Neben den hochwertigen Lupinenproteinen, haben auch andere Lupi-nenrohstoffe an Bedeutung gewonnen. Lupinenfasern werden als Ballaststoffanreicherung und als Fettersatzstoff in verschiedenen Lebensmitteln verwendet. Die industriell gemahle-nen Lupigemahle-nenschalen köngemahle-nen beispielsweise die Frischhaltung von Backwaren verbessern (Prolupin, 2013). Neben dem ernährungsphysiologischen Wert ist bekannt, dass Lupinen auch weitere positive Eigenschaften haben, die dem Menschen zu Gute kommen. Zum Bei-spiel besitzen Lupinen gegenüber anderen Hülsenfrüchten einen äußerst geringen Puringe-halt und sind damit auch für Gicht- und Rheumaerkrankte sehr gut geeignet (Schneider, 2013). Lupinen kommen auch für die Ernährung von Diabetikern infrage, da die darin enthal-tenen Kohlenhydrate nur sehr langsam verfügbar sind und somit eine zu starke Erhöhung des Zuckerspiegels vermieden werden kann. Wie alle Hülsenfrüchte sind Lupinen glutenfrei. Besonders Milch-, Soja- und Weizeneiweißallergiker können ferner von Lupinen-Produkten profitieren. Aber auch Menschen mit Laktose-Intoleranz können ohne Bedenken Lupinen in ihre tägliche Ernährung integrieren (Goldscheider, 2014). Der Lupine wird auch eine ge-sundheitsfördernde Eigenschaft der Cholesterinspiegelsenkung zugeschrieben. Aus dem Schlussbericht „Lebensmittelzutaten mit cholesterinsenkender Wirkung aus Lupine“ unter der Leitung von Prof. Dr. Gabriele Stangl geht hervor, dass das bioaktive Potential der Lupine sehr vielversprechend ist und die Herstellung cholesterinspiegelsenkender Proteinisolate grundsätzlich möglich ist. Jedoch bedarf es noch an weiterer Forschung, um diese besonde-re Eigenschaft auch im wirtschaftlichen Sinn nutzen zu können (Stangl, 2009).

2.1.4.3 Weitere Nutzungsmöglichkeiten

Bereits nach dem 1. Weltkrieg wurden die aus dem Lupinenstroh gewonnenen Fasern zu-sammen mit Hanf- oder Flachsfasern zu Säcken und Seilen verarbeitet. Das Lupinenstroh besitzt zwar einen relativ geringen Fasergehalt von 5%, aber trotz der Erkenntnis konnten sie in ihrer Qualität überzeugen, weil sie mit den Eigenschaften der Jutefasern vergleichbar sind (Wilde, 1916). In der ägyptischen Medizin wurde die Lupine auch als Heilpflanze genutzt.

11 Hauptsächlich handelte es sich dabei um die Weiße Lupine (lat.: Lupinus albus), die zu Mehl verarbeitet als ein gutes Mittel gegen aufgerissene Hämorriden oder Warzen galt. Zudem sollte ein Breiumschlag bei Hauterkrankungen helfen (Germer, 2008). Schon in der Römi-schen Landwirtschaft wurde die Lupine als Gründüngerpflanze geschätzt. Da zu der damali-gen Zeit die Viehhaltung eine unbedeutende Rolle spielte, fiel dementsprechend auch wenig Stallmist an, so dass eine Alternative zur Düngung benötigt wurde. Der Lupinenanbau war somit die perfekte Lösung. Sie wurde im Acker-, Wein- und Olivenanbau entsprechend als düngende Pflanze genutzt (Hanelt, 1960). Weiterhin erfolgt auch eine Nutzung als Gründün-gerpflanze und Zierpflanze. Hauptsächlich werden hierbei die aus der Neuen Welt stammen-de Staustammen-denlupine (lat.: Lupinus polyphyllus) und die Ausdauernstammen-de Lupine (lat.: Lupinus pe-rennis) benutzt. Da die beiden Arten mehrjährig sind, werden sie zumeist auch an Bahn- o-der Straßenböschungen, sowie bei Aufforstungen angesät (Krausch, 2002).

2.1.5 Besonderheiten

Neben den im Abschnitt 2.1.4 Verwertung und Nutzenerwähnten Nutzungsmöglichkeiten, existieren noch weitere Vorteile, die für den Anbau von Lupinen sprechen. Aufgrund des Charakteristikums, dass Lupinen eine tiefe Pfahlwurzel und ein verzweigtes Seitenwurzel-system ausbilden, sind sie in der Lage starke Bodenverdichtungen aufzubrechen wodurch sie zur Strukturverbesserung und Durchlüftung des Bodens beitragen. Des Weiteren zählen Lupinen zu den Stickstoffsammlern. Sie leben mit den sogenannten Knöllchenbakterien, in Symbiose und binden den Stickstoff aus der Luft an der Wurzel (Simon, 2003). Während des Wachstums steht dieser Stickstoff der Lupinenpflanze zur Verfügung. Nach dem Drusch ver-bleibt dieser auf dem Feld und kann von der Nachfrucht als Nährstoff aufgenommen werden. Zudem können Lupinen Phosphorvorräte erschließe in der Lage starke Bodenverdichtungen aufzubrechen wodurch sie zur Strukturverbesserung und Durchlüftung n, welche für andere Kulturpflanzen nicht oder nur kaum verfügbar sind, und stellen somit auch Phosphor der Nachfrucht zur Verfügung. Durch diese besonderen Eigenschaften ist es möglich zusätzliche Stickstoff-Düngungen und die damit verbundenen Kosten einzusparen (Römer, 1994). Der Lupine wird daher ein hoher Vorfruchtwert zugeschrieben und nimmt vor allem auf Grund ihres enormen Stickstofffixierungsvermögens und der guten Bodendurchwurzelung einen wichtigen Platz als wertvolles Fruchtfolgeglied im Anbauplan ökologisch wirtschaftender Be-triebe ein, da diese keine mineralische Dünger verwenden dürfen. Weitere Vorteile liegen in ihrer Robustheit und Standfestigkeit. Lupinen können auch auf sandigen Böden angebaut werden, da ihre tiefen Pfahlwurzeln ein gutes Wasseraufnahmevermögen besitzen. Basie-rend auf der Frühreife und einer Vegetationsdauer von 120-150 Tagen kann die Blaue

Lupi-12 ne sehr gut in Gebieten mit kurzer Vegetationszeit wie Küstenregionen und Vorgebirgslagen angebaut werden (Saatzucht Steinach, Flyer 2013). Der Anbau von Lupinen gestaltet sich problemlos. Der Aufwand ist gegenüber anderen Kulturpflanzen gering, da keine Spezial-technik benötigt wird. Bei der Ernte können die erntereifen Pflanzen mit den allgegenwärti-gen Mähdreschern gedroschen werden. Des Weiteren werden soallgegenwärti-genannte Arbeitsspitzen vermieden. Die Blaue Lupine kann Mitte März ausgesät und Anfang August gedroschen werden. Damit steht sie gegenüber anderen Kulturpflanzen nicht in Konkurrenz.

2.2 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe

Der pflanzliche Stoffwechsel lässt sich in den Primär- und Sekundärstoffwechsel einteilen. Der Primärstoffwechsel wird auch Grundstoffwechsel genannt und umfasst alle biochemi-schen Vorgänge in einem Organismus, die für sein Leben essentiell sind. Entgegen dem besitzt der Sekundärstoffwechsel eher eine funktionelle Rolle. Dieser ist für das Leben (pflanzliche Wachstum und Entwicklung) der Pflanze zwar verzichtbar, allerdings nicht für ihr Überleben selbst. Die Sekundärstoffe übernehmen wichtige ökologische Funktionen. Da zu-nächst nichts über die Bedeutung der Sekundärstoffe bekannt war, wurde erst angenommen, dass es sich dabei um „Abfallstoffe“ des pflanzlichen Stoffwechsels handelt. Doch heute ist bekannt, dass sie eine wichtige Rolle für den Organismus spielen (Wink, 1999). Die stand-ortgebundenen Pflanzen sind ungünstigen oder auch bedrohlichen Umweltbedingungen wie Hitze, Kälte, Sonnenstrahlen, Trockenheit u.v.m. ausgesetzt. Entgegen den Tieren und Men-schen können Pflanzen weder vor Feinden oder vor Phytopathogenen fliehen. Ferner besit-zen sie auch kein Immunsystem, welches sie davor schütbesit-zen könnte. Im Laufe der Evolution haben Pflanzen dahingehend andere Strategien zum Schutz entwickelt (Weiler, et al., 2008). Experimentell konnte nachgewiesen werden, dass die Substanzen aus dem Sekundärstoff-wechsel dabei von Bedeutung sind. Ein Großteil dient der Abwehr von Feinden. Dabei besit-zen sie unterschiedliche Wirkungen auf die Fremdorganismen. Bei Bakterien, Viren und Pil-zen kommt es zu starken Wachstumshemmungen. Herbivoren werden durch einen unange-nehmen Geschmack abgeschreckt oder sogar vergiftet. Sie können aber auch dem Schutz vor anderen Pflanzen, die in diesem Sinn Licht-, Wasser- und Nährstoffkonkurrenten darstel-len, dienen. Die Wirkung der gegen pflanzliche Konkurrenten gerichteten Sekundärstoffe wird als Allelopathie bezeichnet und äußert sich darin, dass das Auskeimen der Samen un-terdrückt wird. Neben der Verteidigung tragen Sekundärstoffe auch einen wertvollen Beitrag zur Erhaltung und Vermehrung der eigenen Art bei. Einigen Pflanzen möglich ist es damit möglich Tiere anzulocken, die sie bestäuben oder deren Samen und Früchten verbreiten. Bestimmte Sekundärstoffe besitzen sogar eine Funktion als UV-Schutz (Wink, 1999). Bislang

13 konnten ca. 80.000 Substanzen als sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe nachgewiesen werden und Vermutungen zufolge ist die reelle Anzahl jedoch um ein Vielfaches höher. Die sekundä-ren Pflanzeninhaltsstoffe sind chemisch gesehen in sehr unterschiedlichen Klassen vertre-ten, wie z.B. den Alkaloiden, Alkamiden, Aminen, Flavonoiden, Phenole, Glucosinolaten und Polyketiden (Wink, 2002). Da sie häufig in bestimmten Pflanzenarten und -gruppen auftreten, wird ihnen sogar ein chemotaxonomischer Wert zu geschrieben (Weiler, et al., 2008). In der Pflanzenfamilie der Leguminosen zählen zu den typische Sekundärstoffen unter anderem die Alkaloide, die Amine, die Flavonoide, die nicht proteinogene Aminosäuren, die Glycoside oder auch die Proteaseninhibitoren.

2.3 Alkaloide

Der Begriff „Alkaloide“ steht für „alkaliähnlich“, da sie häufig basisch wirken, dennoch reagie-ren nicht alle Alkaloide dem entsprechend. Ein Großteil besitzt ein heterozyclisch gebunde-nes Stickstoffatom im Molekül (Breitmaier, 2008). Die meisten Alkaloide bilden mit Säuren wasserlösliche Salze, die als freie Basen nicht wasserlöslich sind. In der Pflanze liegen sie meistens als wasserlösliche Salze organischer Pflanzensäuren vor. Manche sind aber auch an Gerbstoffe gebunden. Überwiegend liegen die Alkaloide aber isoliert in kristalliner Form vor. Lediglich ein Bruchteil davon gibt es in flüssiger Form. Alkaloide besitzen zudem die Fähigkeit Komplexsalze mit Schwermetallen wie Quecksilber, Wismut oder Platin zu bilden (Bühring, 2011). Bislang zählen annähernd 20.000 Stoffe natürlichen Ursprungs zu den Alka-loiden. Doch hinsichtlich ihrer Struktur und Biosynthese existieren in dieser Stoffgruppe viele verschiedene Vertreter. Dahingehend ist es auch schwierig Alkaloide klar zu definieren und zu klassifizieren (Breitmaier, 2008). Grundsätzlich unterteilt man Alkaloide folgendermaßen: Echte Alkaloide, Protoalkaloide und Pseudoalkaloide. Stammen die Alkaloide von einer oder mehreren Aminosäuren ab und ist der Stickstoff heterozyclisch gebunden, so ergibt sich die Klassifizierungsgruppe Echte Alkaloide. Geht das Alkaloid aus einer Aminosäure hervor und besitzt keinen heterozyclisch gebundenen Stickstoff, wird es den Protoalkaloiden zugeteilt. Als Pseudoalkaloid liegt der Stickstoff heterozyclisch gebunden vor, jedoch stammt dieser nicht aus einer Aminosäure (Bühring, 2011) (Weiler, et al., 2008). Anfänglich wurde ange-nommen, dass Alkaloide nur pflanzlicher Herkunft sind, jedoch wurden sie inzwischen auch im Tierreich entdeckt, wie etwa Bufotenin, welches sich im Hautdrüsensekret der Aga-Kröte (lat.: Bufo marinus) befindet. Weiterhin sind auch tropische Frösche, Stinktiere, Tausendfüß-ler und Feuersalamander in der Lage Alkaloide zu synthetisieren. Nicht unerwähnt sollte bleiben, dass auch Pilze Alkaloide produzieren können. Als bekanntestes Beispiel ist das Mutterkornalkaloid Ergotamin anzuführen, welches im Mittelalter zum Einleiten der Wehen

14 verwendet wurde und zum epidemieartigen Ausbrechen der Antoniusfeuer-Krankheit führte (Weiler, et al., 2008). Weitere bekannte Vertreter der Alkaloide sind Heroin, Nicotin, Codein, Solanin u.v.m.. Überwiegend besitzen sie einen bitteren oder brennenden Geschmack und haben bereits in geringen Mengen (im mg-Bereich) pharmakologische oder sogar toxikologi-sche Wirkungen auf den tieritoxikologi-schen und menschlichen Organismus. Sie können eine Vielzahl an Wirkungen auf die Wahrnehmung und das Bewusstsein hervorrufen. Beim Menschen können auch Halluzinationen oder schwere psychische Störungen hervorgerufen werden. Daher unterliegen viele Alkaloide dem Betäubungsmittelgesetz und sind rezeptpflichtig (Bühring, 2011) (Breitmaier, 2008). Die Alkaloide der Lupinen sind für das Überleben der Pflanzen sehr wichtig, weil sie sich durch den bitteren Geschmack vor Hebivoren schützen. Auf Grund dieser Eigenschaft kam zu dem Begriff „Bitterlupinen“ (Tei, et al., 1998). Die Lupi-nen produzieren Alkaloide des Chinolizidin-, Piperidin- und seltener des Indoltypes. Die Chi-nolizidinalkaloide werden überwiegend in den oberirdischen Pflanzenteilen in den Chloro-plasten gebildet. Der Transport in andere Pflanzenteile findet über das Phloem statt. Da Stickstoff zum Aufbau von Proteinen benötigt wird, folgt bei der Keimung ein Abbau der im Samen enthaltenen Alkaloide (Wink, 2002). Der Alkaloidgehalt der Lupinen unterliegt be-stimmten Schwankungen und kann durch Umwelteinflüsse und Pflanzenernährung beein-flusst werden. Es liegt immer ein Alkaloidgemisch vor, welches aus bis zu 30 Einzelkompo-nenten bestehen kann. Davon bilden 2-6 Alkaloide die Hauptgruppe, die bei der Züchtung Beachtung finden. Die restlichen Nebenalkaloide machen zusammen lediglich 1% des Ge-samtanteils aus und sind insbesondere bei chemotaxonomischen Untersuchungen von Inte-resse. Folgende Hauptalkaloide befinden sich im Samen landwirtschaftlich genutzter Lupi-nenarten (Wink, 2002):

Weiße Lupine : 50-80% Lupanin

3-10% Multiflorin

5-15% 13- Hydroxylupanin

5-15% Albin

Gelbe Lupine : 40-70% Lupanin 30-50% Spartein

Blaue Lupine : 50-80% Lupanin 5-20% Angustifolin 10-29% 13-Hydroxylupanin Andenlupine : 40-70% Lupanin 10-20% 13-Hydroxylupanin 5-20% 3-Hydroxylupanin 4% Tetrahydrorhombifolin 5-20% Spartein

15

2.4 Alkaloidbestimmungs-Methoden

Von grundlegender Bedeutung für die Lupinenzüchtung sind die Methoden zur Bestimmung des Alkaloidgehalts im Lupinenmaterial. Dahingehend sind bereits viele verschiedene veröf-fentlicht worden. Die einzelnen Methoden können sowohl Samen als auch grüne Pflanzentei-le der Lupinen auf ihre Alkaloidgehalte untersuchen und untergliedern sich in qualitative und quantitative Verfahren. Zu den qualitativen Methoden gehören die chromatographischen so-wie die aufwendigeren immunologischen Verfahren. Die Schnelltest hingegen zählen zu den quantitativen Methoden. Für die Verarbeitung, Vermarktung sowie Sortenzulassung von Lu-pinensamen ist eine exakte Bestimmung des Alkaloidgehalts unerlässlich. Daher wird hierbei auf chromatographische Verfahren zurückgegriffen, da diese eine genaue Aufschlüsselung des komplexen Alkaloidgemischs ermöglichen. Für die Lupinenzüchter sind Alkaloidbestim-mungs-Methoden an Einzelpflanzen, die möglichst praktikabel und zuverlässig sind, von be-sonderem Interesse. Entweder der Gesamtalkaloid-Gehalt oder das Hauptalkaloid steht da-bei im Fokus. Die explizite Aufschlüsselung des Alkaloidkomplexes ist dementsprechend unwesentlich. Als Reagenzien zum Fällen der Alkaloide haben sich Jodjodkalium, Jodqueck-silberjodkalium, Kaliumquecksilberjodid, Kieselwolframsäure und Dragendorff´s Reagenz bewährt.

2.4.1 Chromatographische Verfahren

Die Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Verfahren, bei dem Substanzen bzw. Stoffgemische, auch Analyten genannt, über verschiedene Wechselwirkungen zwischen ei-ner mobilen und eiei-ner stationären Phase aufgetrennt werden. Sie ermöglichen eine qualitati-ve sowie quantitatiqualitati-ve Bestimmung der Lupinen-Alkaloide. Dabei haben sich vor allem die Gaschromatographie (GC), die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und die Dünnschichtchromatografie (DC) bewährt (Wink, 1992). Die einzelnen Verfahren unterschei-den sich hinsichtlich ihrer Trennkapazitäten und ihrer Empfindlichkeiten, aber für alle ist es erforderlich das zu untersuchende Pflanzenmaterial vor der Analyse aufzubereiten. Die Lupi-nensamen müssen dementsprechend zerstört werden. Des Weiteren sind sie mit Ausnahme der DC mit einem hohen apparativen Aufwand verbunden, so dass die Geräte dementspre-chend auch sehr kostenintensiv sind. Gegenwärtig werden die Alkaloiduntersuchungen an der Universität Heidelberg mittels GC durchgeführt.

2.4.2 Immunologische Verfahren

Um geringe Mengen einer Substanz oder eines Metaboliten in ungereinigten Proben zu er-mitteln, haben sich in der analytischen und klinischen Chemie die immunologischen

Nach-16 weisverfahren bewährt. Dazu zählen Radioimmunoassay (RIA), Scintillation proximity assay (SPA) und Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Diese Verfahren wurden auch speziell zur Bestimmung von QA vom Lupanintyp entwickelt, so dass Lupanin-Mengen im pg/ng-Bereich damit erfasst werden können. Spartein oder Lupinin werden nicht quantifiziert. Jedoch bedarf es, um diese Verfahren durchführen zu können, eines hochspezifischen körpers, der die Alkaloide “erkennt“. Dieser ist Voraussetzung. Für die Herstellung des Anti-körpers wird reines 13-Hydroxylupanin zu einem Antigen aufbereitet. Das Antigen wird an-schließend in die Unterhaut von Kaninchen injiziert. In den darauf folgenden Monaten wird Blut aus den Ohren entnommen. Lediglich die Hälfte der Kaninchen bilden Antikörper aus (Wink, 1992). Zusätzlich zum Antikörper wird beim RIA-Verfahren ein radioaktives Traceral-kaloid benötigt. Dafür ist eine Erlaubnis zum Umgang mit radioaktiven Stoffen notwendig. Das Verfahren besitzt eine hohe Empfindlichkeit und erlaubt viele Proben gleichzeitig zu un-tersuchen. Eine Variante des RIA´s ist das SPA. Im Vergleich zu RIA sind mit dem SPA-Verfahren weniger Arbeitsschritte notwendig, jedoch ist die Lupanin-Detektion weniger emp-findlich und wesentlich teurer. Die dritte immunologische Methode ELISA ist sehr empemp-findlich und kommt ohne die Verwendung von radioaktiven Stoffen aus.

2.4.3 Schnelltests Geschmackstest

Bei dem Geschmackstest wird die Bitterkeit, welche in Verbindung mit den Alkaloiden steht, untersucht. Je bitterer eine Lupinenpflanze ist, desto höher ist ihr Alkaloidgehalt.

Samenfarbe

Es wurde beobachtet, dass helle Samen tendenziell „süßer“ sind als dunkle Samen, so dass dies zur Beurteilung herangezogen werden kann. Diese optische Möglichkeit den Bitterstoff-gehalt zu bestimmen ist vor allem bei der Weißen Lupine nicht sehr zuverlässig, da die Sa-men bereits sehr hell sind. Die Wahrscheinlichkeit ist bei der Blauen und Gelben Lupine zwar höher, jedoch ist die Methode nicht sicher und birgt immer ein bestimmtes Risiko (Aniszewski, 2007).

UV-Test

Bei der Selektion alkaloidarmer Samen von der Weißen Lupine wurde bzw. wird in Chile, Deutschland und Frankreich eine Bestimmung mittels UV-Lampe vorgenommen (Hackbarth, et al., 1959) (von Baer, et al., 1990). Wie in Abbildung 4 erkenntlich ist, weisen einige Samen der Weißen Lupine unter UV-Licht keine oder eine blaue Fluoreszenz auf. Mit Hilfe

analyti-17 scher Verfahren stellt sich heraus, dass die fluoreszierenden Samen alkaloidreicher sind. Jedoch fluoreszieren die Lupinenalkaloide selbst nicht. Es existiert eher eine Korrelation zwi-schen Alkaloidgehalt und dem Gehalt der fluoreszierenden Substanz in der Samenschale (Wink, 1992). Abgesehen von der Weißen Lupine und der Andenlupine weisen andere Arten keine Fluoreszenz unter UV-Licht auf, so dass dieser UV-Test nicht auf andere Lupinenarten anwendbar ist. Zudem eignet sich diese Methode lediglich für eine quantitative Unterschei-dung zwischen alkaloidarmen und alkaloidreichen Samen und wird daher eine Qualitätskon-trolle nicht ersetzen können. Hervorzuheben ist, dass die Methode in der Praxis sehr einfach anwendbar, kostengünstig und schnell ist.

Abbildung 4: Fluoreszenz am Samen zweier Sorten der Weißen Lupine (lat.: Lupinus albus) unter UV-Licht. links: Alban (alkaloidarm) rechts: Weibit (alkaloidreich)

Wasser-Koch-Methode

Die Wasser-Koch-Methode ist ein sehr einfaches Verfahren bei dem 1 g unbehandelten Sa-men für 2 Stunden in 10 cm3 _{Wasser gekocht werden. Sie ist auch für}

Einzelkornuntersu-chungen geeignet. Dabei wird ein Korn mit einem Gewicht von etwa 0,12 g in 2,5 cm3

Was-ser gekocht. Danach wird in die noch heiße Lösung einige Tropfen1 _{Jodquecksilberjodkalium}

hinzu gegeben und nach dem Erkalten tritt ein starker weißer Niederschlag ein. Unter der Verwendung von Jodkaliumjodid als Reagenz erfolgt die Zugabe erst, wenn die Lösung ab-gekühlt ist. Um auszuschließen, dass dieser Niederschlag eventuell durch andere stickstoff-haltige Verbindungen im Samen hervorgerufen wird, führte Sengbusch eine Kontrolle mit alkaloidfreien Sojabohnensamen durch. Nach gleicher Behandlung trat kein Niederschlag auf. Daher kann die weiße Fällung als „Alkaloidfällung“ bezeichnet werden (Sengbusch, 1942).

18 Kaltwasserquell-Methode

In einer Eisenplatte mit 100 eingestanzten Vertiefungen werden 100 Lupinenkörner verteilt und für 6-16 Stunden in je 2 cm3 _{Wasser ein gequollen. Die herausdiffundierten Alkaloide}

können anschließend mit Jodjodkalium nachgewiesen werden. Für jeden zu untersuchenden Samen reicht ein Tropen1 _{der Lösung aus. Bei Anwesenheit von Alkaloiden tritt ein brauner}

Niederschlag ein. Nach kurzem Abspülen mit Wasser und anschließender Rücktrocknung sind die Samen wieder lagerfähig und können zur Aussaat genutzt werden. Die Gelbe Lupi-ne lässt sich nach dieser Methode nicht untersuchen (Sengbusch, 1942).

Schnittmethode und Kornfräsmethode

Bei der Schnittmethode werden trockene Lupinensamen mit Hilfe einer Schere oder Zange aufgeschnitten. Bei der Kornfräsmethode werden mit einer Fräsmaschine 2 mm dicke Schei-ben aus dem Lupinensamen abgefräst. Die so entstandenen Hälften bzw. ScheiSchei-ben werden daraufhin in eine Jod Jodkaliumlösung gelegt. Nach ungefähr 10 Sekunden in diesem Bad werden die Hälften für 5 Sekunden mit destilliertem Wasser abgespült. Alkaloidreiche Samen weisen danach an der Schnittfläche eine dunkelbraune Verfärbung auf, wobei hingegen alka-loidarme Samen gelb bleiben. Der große Vorteil bei dieser Methode besteht darin, dass die nicht untersuchten Körnerhälften mit den Keimlingen danach wieder zur Aussaat verwendet werden können, jedoch besitzen diese nicht die gewohnte Leistungsfähigkeit (Hackbarth, et al., 1959) (Wuttke, 1942).

Beutelkochmethode

In einem 7 x 10 cm großen Tüllbeutel wird eine Probe von 100 Körnern für 1,5 h gekocht. Über die Diffusion werden Alkaloide in der eigentlich alkaloidfreien Samenschale abgelagert. Nach kurzem Abkühlen wird der Beutel in eine 1:20 verdünnte Stammlösung Jodjodkalium getaucht und kurz mit klarem Wasser abgespült. Die alkaloidreichen Samen besitzen dann eine braune Färbung und die alkaloidarmen besitzen noch ihre Ausgangszeichnung. Im Üb-rigen eignen sich hellkörnige Samen für diese Methode besonders gut (Wuttke, 1942).

NIRS - Nahinfrarotspektroskopie

Die Nahinfrarotspektroskopie-Methode basiert auf der Spektroskopie im Bereich des kurz-welligen Infrarotlichtes. Sie wird bei den Lupinen angewendet um den Protein- und Ölgehalt im Samen zu bestimmen. Zwischen den ermittelten NIRS-Werten und den gaschromatogra-phisch bestimmten Alkaloidgehalten konnte im weiteren Verlauf eine Korrelation festgestellt werden. Die ersten Versuche dahingehend führte Clark et al. durch. Basierend auf der

Korre-19 lation kann die Methode zur Bestimmung des Gesamtalkaloid-Gehaltes herangezogen wer-den (Clark, et al., 1987). Besonders vorteilhaft ist dabei, dass die Methode eine Analyse von umfangreichem Probemengen erlaubt und es nicht notwendig ist die Samen aufzubereiten. Sie belieben somit zerstörungsfrei und können zur Aussaat verwendet werden. Jedoch be-sitzt die NIRS-Methode nur eine unzureichende Aussagekraft bei der Bestimmung von ge-ringen Alkaloidgehalten, da die Quantifizierung mit einer großen Streuung versehen ist (Wink, 1992).

Abrissmethode

Bei der Abrissmethode wird ein nicht zu junges Blatt vorsichtig vom Stängel abgezogen. Da-bei sollte die Handbewegung von oben nach unten gehen, so dass im besten Fall ein durch-sichtiges Stück Epidermis mit abgetrennt wird. Im weiteren Arbeitsschritt wird der untere Teil des Stängels mit dem Stück Epidermis in eine 0,2%ige Jodjodkalium-Lösung getaucht und anschließend in einem Gefäß mit Wasser abgespült. Bildet sich in der Epidermis ein nicht auswaschbarer Niederschlag, kann man von einer alkaloidhaltigen Pflanze ausgehen. Die alkaloidarmen Pflanzen sind nach dem Abspülen wieder durchsichtig (Schwarze, 1941) (Hackbarth, et al., 1959). Diese Methode ist schnell und einfach durchführbar, jedoch kann nur eine grobe Einschätzung des Alkaloidgehaltes erfolgen.

Abbildung 5: Abrissmethode-Untersuchungsergebnisse von links nach rechts: Lupinus luteus: 1. alkaloidreich, 2. alkaloidarm; Lupinus angustifolius: 3. alkaloidreich 4. Alkaloidarm (Hackbarth, et al.,

1959)

Spektralphotometrie

Für die Photometrische Bestimmungsmethode wird das Alkaloid Spartein als Vergleichssub-stanz verwendet. (Zu der damaligen Zeit stand nur Spartein zur Verfügung.) In einem Kon-zentrationsbereich von 1-10 μg Spartein/ml lässt sich die Kalibriergerade aufstellen. Von den Kalibrierstandards wird je 1 ml mit 50 μl Reifer´s Reagenz versehen. Die Extinktion der ent-standenen Farbreaktion wird anschließen in einem Spektralbereich von 830 nm gemessen.

20 Das zu untersuchenden Pflanzenmaterial wird zunächst aufbereitet und zentrifugiert. Nach einer anschließenden Trichloressigsäure-Fällung der Proteine und der Reagenzzugabe kann eine photometrische Untersuchung durchgeführt werden (Wink, 1980).

Indikatorpapier

Bei der Indikatorpapiermethode wird zunächst das Filterpapier aufbereitet. Nach Schwarze 1942 wird es für zwei Sekunden in eine 0,2%ige Jodjodkaliumlösung gegeben und gemäß der Tüpfelmethode nach Kraft 1953 wird es in Kaliumwismutnitrat getränkt. Laut Wink 1992 kann auch eine vorherige Imprägnierung mit Dragendorff´s Reagenz erfolgen. Als weiteren Schritt muss ein Lupinenstiel bzw. -stängel abgeschnitten werden. Der heraustretende Pflan-zensaft wird auf das Papier getupft (Abbildung 6). Sofern viele Alkaloide vorhanden sind, kommt es zu einer braunen bis dunkelbraunen Verfärbung. Unter der Verwendung von Dragendorff´s Reagenz erscheint die Verfärbung eher orange-rot. Je mehr Alkaloide im Pflanzensaft sind, desto intensiver die Färbung, so dass sogar bestimmte Abstufungen op-tisch erkennbar sind (Schwarze, 1941) (Wuttke, 1942) (Wink, 1992).

Abbildung 6: Indikatorpapiermethode: Aufdrücken eines Lupinenblattstiels auf Indikatorpapier, die drei dunklen Flecken stammen von alkaloidreichen Pflanzen, der blasse Fleck von einer alkaloidarmen Pflanze

(Plarre, 1999)

Reagenzglasmethode nach Sengbusch

Hierfür wird ein grünes Blatt in ein Reagenzglas gesteckt, 2,5 cm3 _{Wasser hinzugefügt und}

für 20 Minuten gekocht. Anschließend wird Jodquecksilberjodkalium hinein getropft1_{. Dies}

Reak-21 tion zu sehen wobei hingegen bei alkaloidreichen Blättern eine Trübung entsteht. Die Blätter der Blauen Lupine sind für diese Analyse ungeeignet (Sengbusch, 1942).

Salzsäuremethode nach Sengbusch

Nach der Salzsäuremethode wird ein grünes Lupinenblatt in ein Reagenzrohr gegeben und mit 3-6 cm3 _{5%iger Salzsäure aufgefüllt. Der Aufschluss dauert ungefähr 3-6 Stunden und}

als Alkaloid-Reagenz kann entweder Jodquecksilberjodkalium oder das wesentlich empfind-lichere Jodjodkalium verwendet werden, welches nach der besagten Zeit in das Reagenz-glas getropft1 _{wird. Unmittelbar danach zeigt sich bei alkaloidreichen Blättern eine starke}

Trübung (Sengbusch, 1942). Die Salzsäuremethode eignet sich besonders für Untersuchun-gen im Freiland, da das ReaUntersuchun-genzglas neben die entsprechende Pflanze in den Boden ge-steckt werden kann. Nach der genauen Bestimmung kann somit direkt vor Ort selektiert wer-den (Hackbarth, et al., 1959).

1 _{R. v. Sengbusch geht in seinen Methoden davon aus, dass ein Tropfen etwa 0,07 cm}3 _beträgt

3 Materialen und Methoden

3.1 Geräte, Hilfsmittel und Chemikalien

Tabelle 5 sind die verwendeten Geräte, Hilfsmittel und Chemikalien für die Methodenentwick-lung und -beschreibung in alphabethischer Reihenfolge aufgelistet. Die dazu gehörigen Ein-stellungen können aus dem Methoden- bzw. Ergebnisteil entnommen werden.

Tabelle 3: Verwendete Geräte in alphabetischer Reihenfolge

Gerätebezeichnung Typ/ Modell Hersteller

Analysenwaage (Genauigkeit: 0,000 g)

Extend ED124S Sartorius AG, Göttingen Probemühle Pulverisette 14 Fritsch GmbH, Idar-Oberstein

Mikro-Zentrifuge Mini Spin Eppendorf AG, Hamburg

Spektralphotometer Libra S 50 UV Vis Biochrom Ltd, Cambridge Vortex-Schüttler Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc.,

Portland (USA)

Zentrifuge Concentrator plus Eppendorf AG, Hamburg

Zerkleinerer 708 A Krups GmbH,

22 Tabelle 4: Verwendete Hilfsmittel in alphabetischer Reihenfolge

Hilfsmittel Typ Hersteller

Halb-Mikroküvetten (Einmalküvetten)

1,5 ml, Abmessungen: 12,5 x 12,5 x 45 mm

Brand GmbH & CO. KG, Wertheim

Reaktionsgefäße 2 ml Roth GmbH & Co. KG,

Karlsruhe Rotilabo®_{-Probenröhrchen}

+ Deckel

Borosilikatglas, amber, 4 ml, Ø 15 mm

Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Schnappdeckelgläser + Deckel

transparent, Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Spritzenfilter 25 mm, 45 μm Celluose-acetat Membran

VWR International, North America

Tabelle 5: Verwendete Chemikalien in alphabetischer Reihenfolge

Stoff/Lösung Chemische Formel bzw.

Zusammensetzung Hersteller Charge

Destilliertes Wasser (DW) H2O Hochschule Neubrandenburg -- Dragendorff-Munier-Sprühlösung (DM) 1% basisches Wismutnitrat 16,5% Weinsäure

20% Kaliumjodid gelöst in Wasser

Roth GmbH & Co., KG, Karlsruhe

0233201070

Jod Kaliumjodid-Lösung nach Lugol (JKJ)

1 %ige wässrige Jodlösung ent-hält 3,3 g/l Jod und 6,7 g/l Kalium-jodid

Roth GmbH & Co., KG Karlsruhe 463207361 Lupanin (Reinheit: 99,0%) C14H25N2O Prof. Dr. Michael Wink, Heidelberg -- Reinstwasser2 (RW) H2O Hochschule Neubrandenburg -- Salzsäure c = 0,1 mol/l

HCl Roth GmbH & Co.,

KG, Karlsruhe

06260612

2 _{Behandlung mit SG Reinstwasser System Clear, Typ Clear UV Plus (Wasseraufbereitung und Regenerierstation}

23

3.2 Herkunft des Ausgangsmaterials

Die in den Untersuchungen verwendeten Samen der Blauen Lupine wurden von Saatzucht Steinach zur Verfügung gestellt. Eine tabellarische Auflistung ist im Anhang 1 zu finden. Die dazugehörigen Alkaloid-Untersuchungen wurden von Prof. Dr. Michael Wink mittels GC durchgeführt. Für die photometrischen Untersuchungen wurde Lupanin (Abbildung 7), das Hauptalkaloid der Blauen Lupine, als Standard verwendet und von Prof. Dr. Michael Wink erworben. Sämtliche Versuche wurden in den Laborräumen von Saatzucht Steinach in Bocksee und der Hochschule Neubrandenburg durchgeführt.

Abbildung 7: Strukturformel von Lupanin (Wink, 1994)

3.3 Kalibrierung

3.3.1 Herstellung der Stammlösung

Um die Stammlösung herstellen zu können, muss zunächst das feste Lupanin in einem Mör-ser mit einem Stößel zerkleinert werden, so dass ein feines Pulver entsteht. Daraufhin erfolgt das Einwiegen von 25 mg Lupanin in einem Wiegeschiffchen mit Hilfe der Analysewaage. Die abgewogene Menge wird anschließend in einem 25 ml Messkolben gegeben und bis zur Markierung mit 0,1 mol/l HCl gefüllt und behutsam geschüttelt, so dass das Lupanin sich vollständig löst und eine homogene Stammlösung entsteht. Die Stammlösung besitzt somit eine Konzentration von 1 mg/ml. Im Anschluss wird die entstandene Lösung in Reaktionsge-fäße pipettiert, mit Parafilm versiegelt und bei -20°C eingefroren.

3.3.2 Herstellung der Kalibrierstandards

Für die Herstellung der Kalibrierlösungen muss zunächst ein mit der Stammlösung gefülltes Reaktionsgefäß vollständig aufgetaut werden. Es ist darauf zu achten, dass die Stammlö-sung für das weitere Verfahren gut geschüttelt wird, damit die LöStammlö-sung auch homogen ist. Im weiteren Arbeitsschritt werden die gewünschten Konzentrationen der Kalibrierstandards be-stimmt. Eine Kalibrierreihe mit den Zielkonzentrationen von 2,5- 25 mg/l wird aufgestellt. Die dazu entsprechenden Mengen der Lupanin-Stammlösung können aus der Tabelle 6 ent-nommen werden. Die Lupanin-Mengen werden daraufhin in einem 5 bzw. 10 ml-Messkolben

24 pipettiert und bis zur Markierung mit destilliertem Wasser (DW) aufgefüllt. Bei der Konzentra-tion von 2,5 mg/l wird ein 10 ml-Messkolben verwendet, um bei dieser geringen Lupanin-Menge der Stammlösung mögliche Pipettier-Fehler zu unterbinden.

Tabelle 6: Verdünnung der Stammlösung zur Herstellung der Kalibrierstandards

Zielkonzentration c Lupanin in mg/l 2,5 5 10 15 20 25

Lupanin-Menge in μl 25 25 50 75 100 125

Messkolbengröße in ml 10 5 5 5 5 5

3.4 Spektralphotometrische Alkaloidbestimmung unter Zugabe

verschie-dener Reagenzien

3.4.1 Zugabe des Reagenz

Von den bereits an gemischten Kalibrierlösungen werden pro Konzentration 1 ml in ein Re-aktionsgefäß pipettiert und mit dem Reagenz versetzt. Zum Fällen der Alkaloide werden fol-gende Reagenzien verwendet: 10 μl Dragendorff-Munier-Sprüh-Lösung (DM) oder 60 μl Jod Kaliumjodid-Lösung (JKJ). Danach werden die Gefäße verschlossen. Um sicher zu stellen, dass das Reagenz vollständig durchmischt ist, muss das Reaktionsgemisch homogenisiert werden. Hierfür wird der Vortex-Schüttler verwendet. Direkt im Anschluss werden die Lösun-gen in Halb-Mikroküvetten überführt. Die verschiedenen Konzentrationen können anschlie-ßend spektralphotometrisch gemessen werden und mit den so erhaltenen Extinktionen kann eine lineare Kalibrierfunktion (siehe Formel (1)) errechnet werden.

ߛ ൌ ܽݔ ൅ ܾ (1)

ݕ ؙ Extinktion

ݔ ؙ Alkaloidgehalt in mg/l

3.4.2 Ermittlung der Messwellenlänge (Spektrum)

Um eine möglichst hohe Empfindlichkeit bei der spektralphotometrischen Methode sicherzu-stellen ist ein Absorptionsspektrum über den Messwellenlängenbereich von 300–850 nm von dem Probenblindwert (BW) und dem Kalibrierstandard mit der Konzentration von 25 mg/l aufzunehmen. Das Absorptionsmaximum wird für die weiteren Untersuchungen als Messwel-lenlänge eingesetzt.

25 3.4.3 Extinktionswerte der Kalibrierlösungen im Zeitverlauf

Nachdem mit Hilfe des Vortex-Schüttler das Reagenz in der Kalibrierlösung vollständig ho-mogenisiert ist, wird die Zeitmessung gestartet. Nach den ersten 5 Minuten wird die gesamte Kalibrierreihe spektralphotometrisch gemessen. Weiterhin erfolgen in Abständen von 5 Minu-ten erneute Messungen der gesamMinu-ten Standardreihe, um die Stabilität der Reaktion analy-sieren zu können.

3.5 Probenvorbereitungen

Das Quellen des Samenmaterials führt zu einer Aufweitung der Zellkapillaren. Dadurch be-dingt kommt es zu einer Erhöhung der Permeabilität der Zellwände, wodurch die Diffusion beschleunigt wird und die Alkaloide aus dem Samen in das Quellwasser abgegeben werden. Um zu sehen, ob die in den Schnelltests von R .v. Sengbusch verwendete Wassermenge von 2 ml zum Quellen ausreicht, werden in den anfänglichen Untersuchungen zum Quellver-halten 3 Lupinensorten ausgewählt. Davon werden je 20 Samen zum Quellen angesetzt und während des Vorgangs stündlich gewogen. Bei der Auswahl wird besonders auf das Kriteri-um Tausendkorngewicht (TKG) geachtet. Neben der Sorte Haags Blaue werden unter ande-rem auch Samen von Boruta und Boregine verwendet, so dass jeweils ein Vertreter mit nied-rigen, mittleren und hohen TKG untersucht wird. Die zu untersuchenden Lupinensamen wer-den beginnend einzeln gewogen und in geeignete Gefäße gegeben (Abbildung 8). Zum Quellen werden 2 ml DW oder RW in jedes Gefäß pipettiert und bei einer Zimmertemperatur von 22°C stehen gelassen. Um die Verdunstung als mögliche Fehlerquelle zu vermeiden, werden die Gläser mit den passenden Deckeln verschlossen.

Abbildung 8: Lupinensamen zum Quellen in verschiedenen Behältnissen (links: Reagenzgläser, rechts: Schnappdeckelgläser in zwei Varianten mit Wasser befüllt: D1-2 ml und D4-3 ml)

26 Unmittelbar nach Ablauf der definierten Quellzeit wird 1 ml Quellwasser aus dem Glas ent-nommen und in ein Reaktionsgefäß gegeben. Der gequollene Samen wird im Anschluss aus dem Schnappdeckelglas herausgenommen und sorgfältig mit einem Tuch abgetupft, so dass die Wasserreste entfernt werden und das Gewicht erneut bestimmt werden kann. Die Alkalo-ide im Quellwasser werden zuletzt mit dem Reagenz gefällt und photometrisch untersucht. Anmerkung: Während die Samen im gequollenen Zustand gewogen werden, ist es ratsam die Reaktionsgefäße mit dem Quellwasser zu verschließen, so dass die Verdunstung ausge-schlossen werden kann.

3.5.2 Bestimmung der Quellzeit

Die Lupinensamen werden wie beschrieben zum Quellen angesetzt. Es werden Quellzeiten von 4-24 h festgelegt. Nach Ablauf der entsprechenden Zeit wird 1 ml Quellwasser aus dem Glas in ein Reaktionsgefäß pipettiert, mit dem entsprechenden Reagenz gefällt und am Pho-tometer untersucht.

3.6 Vergleichende Untersuchungen mit gemahlenem Samenmaterial

Dieser Versuch soll zeigen, wie hoch der Gesamtalkaloid(GA)-anteil aus den gequollenen Samen im Vergleich zu dem GA-gehalt aus zerkleinerten Samen ist. Die Samen werden da-zu in zwei Zerkleinerungsgraden aufbereitet: da-zum einen fein zermahlen und des Weiteren grob zerkleinert. Es muss unbedingt darauf geachtet werden, dass die Maschinen vor dem Benutzen wirklich sauber sind, so dass es zu keiner Vermischung der einzelnen Lupinensor-ten sowie -samen kommt. Für die Herstellung des feinen Samenpulvers werden 5 Samen in eine Probenmühle auf eine Korngröße von 0,5 mm zermahlen. Mit dem Krups-Zerkleinerer werden die Samen grob zerkleinert. Hierfür wird das Gerät mit 5 Samen bestückt und für 10 Sekunden angestellt, so dass der Zerkleinerungsgrad entsprechend der Abbildung 9 ist. Nach dem Aufbereiten wird das entstandene Material gewogen und in Schnappdeckelgläser gegeben. Im Anschluss werden 10 ml RW zum Quellen hinzugegeben.

3.6.2 Filtrieren/Zentrifugieren

Jede Proben wird in 2 Varianten aufgearbeitet. Die eine Probe wird filtriert und die andere zentrifugiert. Zum Filtrieren wird eine Spritze mit dem Quellwasser bestückt und über einem Spitzenfilter in ein anderes Gefäß filtriert. Von dieser filtrierten Probe wird 1 ml in ein Reakti-onsgefäß pipettiert, mit dem Reagenz gefällt und anschließend photometrisch untersucht. Die andere Aufbereitung gestaltete sich so, dass ein Reaktionsgefäß vollständig mit dem

27 Ausgangsquellwasser befüllt wird und daraufhin zentrifugiert wird. Zu Beginn werden die Proben für 10 min mit dem Concentrator plus von Eppendorf bei 1.400 U/min zentrifugiert. Anschließend erfolgt die Benutzung der Zentrifuge Mini Spin für 2 min bei 13.000 U/min. Der so entstandene Überstand wird ab pipettiert und 1 ml davon in ein weiteres Reaktionsgefäß gegeben, so dass dieses auch für die photometrischen Untersuchungen verwendet werden kann.

Abbildung 9: aufbereitetes Samenmaterial links: grob zerkleinert, rechts: fein gemahlen

3.6.3 Bestimmung der Standdauer/-zeit

Um die optimale Quellzeit der gemahlenen Samen zu ermitteln, wurden Quellzeiten von 6, 12, und 16 Stunden festgelegt. Sofern die Quellzeit abgelaufen ist, wird das Quellwasser ab pipettiert. Jeweils 1 ml davon wird in Reaktionsgefäße gegeben, mit dem Reagenz werden die Alkaloide gefällt und photometrisch untersucht.

3.7 Berechnung des Alkaloidgehaltes

Mit Hilfe der linearen Funktion aus der Kalibriergerade und den spektralphotometrischen gemessenen Extinktionswerten können Rückschlüsse auf die Konzentration der Alkaloide im Quellwasser gezogen werden. Da die Samen sehr unterschiedliche Ausgangsgewichte be-sitzen, bedarf es eines anderen Wertes, dem Alkaloidgehalt pro Gramm Samen (’”‘‰ƒ‡ǡሻǡ

um qualitative und aussagekräftige Vergleiche der einzelnen Samen aufstellen zu können. An Hand der Alkaloid-Konzentration im Quellwasser und den dazugehörigen Samengewich-ten im trockenen sowie gequollenen Zustand kann dieser gemäß der folgenden Gleichungen ermittelt werden: