Etablierung einer 3D-Darmgewebekultur zur
in-vitro-Untersuchung der Resorption potentieller Wirkstoffe auf Basis einer natürlichen Kollagenmatrix
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
an der Universität Konstanz
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie
vorgelegt von
Jacqueline Pusch (geb. Michaelis) Konstanz, Juli 2009
Tag der mündlichen Prüfung: 21.09.2009
Referent: Prof. Dr. Dr. Thomas Hartung Referentin: Prof. Dr. Heike Walles
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-87123
URL: http://kops.ub.uni-konstanz.de/volltexte/2009/8712/
Für Fynn
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Dünndarm ist das zentrale Resorptionsorgan des menschlichen Organismus. Lebensnot- wendige Nährstoffe werden über die Darmschleimhaut in das Blut- oder Lymphsystem resor- biert und auf diese Weise dem Körper zugänglich gemacht. Gleichzeitig stellt die darmaus- kleidende Epithelschicht unter physiologischen Bedingungen eine effektive Barriere gegen das Eindringen von Fremdstoffen dar und hat somit einen entscheidenden Einfluss auf die Bioverfügbarkeit oral applizierter Arzneistoffe.
Viele Arzneimittelkandidaten bestehen die Phasen II und III der klinischen Studien nicht, da sie neben einer zu geringen Löslichkeit, eine unzureichende Permeabilität sowie einen hohen First-Pass Metabolismus in Darm und Leber aufweisen.
Stand der Technik für die Bestimmung der Bioverfügbarkeit in präklinischen Studien ist vor- wiegend die Analyse des Plasmaspiegels nach der oralen Verabreichung einer Substanz im Tiermodell. In welchem Maße und über welchen Transportweg die gemessene Substanz das intestinale Epithel tatsächlich passiert, ist allerdings mithilfe dieser In-vivo-Messungen nicht eindeutig zu ermitteln. Zudem ist die Durchführung von Tierversuchen in der Arzneimittel- entwicklung sehr kosten- und zeitintensiv und lässt aufgrund speziesspezifischer Unterschiede zwischen Versuchstier und Mensch keine vollständige Korrelation der Versuchsdaten zu.
Nicht zuletzt unter ethischen Gesichtspunkten ist daher eine Reduktion und letztendlich der vollständige Ersatz von Tierversuchen durch alternative, zellbasierte In-vitro-Methoden anzu- streben.
Aus diesem Grund werden In-vitro-Gewebemodelle benötigt, die bereits in frühen Stadien der Arzneimittelentwicklung eine Beurteilung über das Maß der Absorption und des Metabolis- mus potentieller Wirksubstanzen an der intestinalen Barriere zulassen. Die Etablierung sol- cher Modelle setzt neben einem einfachen Versuchsaufbau, eine hohe Reproduzierbarkeit und eine vom Experimentator unabhängige Versuchsdurchführung sowie die Vergleichbarkeit der generierten Daten mit dem humanen Organismus voraus.
Diese Anforderungen können durch bisherige Modellsysteme nicht vollständig erfüllt werden.
Während Monolayerkulturen aufgrund ihres einfachen Aufbaus die physiologischen Umge- bungsbedingungen des Dünndarmes nur unzureichend widerspiegeln, sind explantierte Darm- segmente nicht lange genug vital und funktionell zu kultivieren, um mehrere Substanztestun- gen zeitgleich zu realisieren.
Eine weitere Möglichkeit zur Bestimmung der intestinalen Permeabilität bietet der Einsatz von dreidimensionalen, organoiden Zell-Testsystemen. Basierend auf natürlichen Trägerstruk- turen, simulieren diese Modelle die physiologischen Umgebungsbedingungen der Zellen und tragen, analog der Extrazellulären Matrix in vivo, zum Erhalt funktioneller Zellcharakteristika bei.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein In-vitro-Darmtestsystem etabliert werden, welches die
Zusammenfassung
zeitig stand der einfache und standardisierbare Aufbau des Systems für eine zukünftige Nut- zung für Mehrfachtestungen im Vordergrund.
Die Entwicklung des dreidimensionalen Darmtestsystems orientierte sich dabei an dem etab- lierten zweidimensionalen Caco-2 Insertmodell. Dieses Modell wird zurzeit zur Klassifizie- rung von Substanzen hinsichtlich ihrer Permeabilität an der intestinalen Barriere eingesetzt.
Für den Aufbau des 2D-Modells erfolgt die Aussaat der Zelllinie Caco-2 auf eine poröse Kunststoffmembran und deren statische Kultivierung über einen Zeitraum von 21 Tagen.
Als Weiterentwicklung des Modells wurden in dieser Arbeit die artifiziellen Kulturbedingun- gen des 2D-Modells zum Aufbau eines funktionellen 3D-Testsystems durch die Integration physiologischer Parameter schrittweise an die Umgebungsbedingungen des nativen Dünn- darms angepasst. Zunächst erfolgte der Austausch der Kunststoffmembran gegen eine azellu- larisierte Kollagenmatrix aus Jejunumsegmenten. Diese stellte die natürliche Mikroumgebung für die Epithelzellen dar. Die vorgegebene Zottenstruktur wies zusätzlich eine protektive Wirkung der rebesiedelten Zellen gegenüber viskösen und partikulären Substanzen während der Durchführung von Transportversuchen auf. Somit konnte die Barrierefunktion über die gesamte Versuchszeit aufrechterhalten werden. Es ließ sich jedoch unter statischer Kultivie- rung keine Optimierung des Systems hinsichtlich der Zellmorphologie nachweisen.
Erst die Entwicklung eines 2-Kammer-Bioreaktorsystems, der eine dynamische Kultivierung der Epithelzellen bei zeitgleicher Durchführung gerichteter Transportstudien realisieren sollte, führte zu einer Verbesserung. Bei der Auswertung der Experimente konnte der, über die Per- fusion, in das System integrierte mechanische Stimulus als ausschlaggebender Parameter zur Veränderung der Zellmorphologie detektiert werden. Aufgrund der Dynamik, der verbesser- ten Nährstoffzufuhr und des Abtransports toxischer Metabolite erzielte die Reaktorkultivie- rung ein, für Enterozyten charakteristisches, hochprismatisches Wachstum der Caco-2 Zellen.
Die Co-Kultivierung von Epithelzellen mit primären mikrovaskulären Endothelzellen, ermög- lichte darüber hinaus die Repräsentation der vollständigen Darm-Blut-Schranke und damit die Simulation des Stofftransports aus dem Darmlumen in den Körperkreislauf.
Über eine immuhistologische Charakterisierung (Villin) der Caco-2 Zellen, sowie über die Untersuchung der Transporteraktivität (P-Glycoprotein) konnte dabei eine Reduktion der, bis zur Durchführbarkeit von Transportversuchen, notwendigen Kultivierungszeit von 21 Tage auf 14 Tage nachgewiesen werden.
Innerhalb des 3D- Modells ließen sich gerichtete Transportstudien auf Basis des Efflux- substrats Rhodamine 123 erfolgreich durchführen. Des Weiteren ergab der Vergleich des Transportes von Fluorescein und Desmopressin, als niederpermeable Substanzen, eine höhere Durchlässigkeit für das dynamische 3D- Modell als für das 2D- Modell. Diese erhöhte para- zelluläre Permeabilität der Caco-2 Zellen entspricht eher der Barriereeigenschaft des Dünn- darmepithels in vivo als die, für das 2D- Modell, gemessenen Werte.
Da jedoch generell die Verwendung der Caco-2 Zelllinie aufgrund ihres kanzerogenen und kolorektalen Ursprungs infrage zu stellen ist, war alternativ die Isolation und Kultur von pri- mären Dünndarmepithelzellen aufzubauen.
Zusammenfassung
Die Etablierung eines neuen Zellkulturmediums sowie die Modifizierung bisher veröffentlich- ter Isolationsprotokolle ermöglichte dabei erstmals eine 5-tägige Kultivierung primärer porci- ner Epithelzellen innerhalb des 3D- Modells. Es konnte eine Zellpopulation aus Enterozyten und Becherzellen des Dünndarms nachgewiesen werden, die anhand des einschichtigen, hochprismatischen Wachstums der Epithelzellen in Verbindung mit der Mucusschicht die Physiologie und Morphologie des Dünndarms realistisch widerspiegelte.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte damit sowohl ein dreidimensionales Darmtestsystem auf Basis einer natürlichen Kollagenmatrix als auch ein Bioreaktorsystem für dessen dynamische Kultivierung entwickelt werden. Im Vergleich zum standardisierten, zweidimensionalen Ca- co-2 Modell ließ sich damit zum einen ein charakteristischeres Zellwachstum erzielen sowie in einigen der durchgeführten Transportversuchen eine verbesserte In-vitro-In-vivo- Korrelation der Daten.
In weiterführenden Forschungsarbeiten sind die Validierbarkeit des Systems sowie eine Er- weiterung um primäre Darmepithelzellen zu untersuchen.
Danksagung
Danksagung
Prof. Dr. Dr. Thomas Hartung danke ich herzlich für die Betreuung meiner Arbeit und für die Möglichkeit an der Universität Konstanz zu promovieren.
Prof. Dr. Herwig Brunner und Prof. Dr. Thomas Hirth danke ich für die Möglichkeit mei- ner Promotion am Fraunhofer IGB in Stuttgart. Herrn Prof. Dr. Hirth möchte ich auch herz- lich für die anregende Diskussionsbereitschaft und die Unterstützung meiner Arbeit danken.
Prof. Dr. Heike Mertsching danke ich für die motivierenden Gespräche, die Vergabe der Fragestellung meiner Arbeit und die hervorragende Unterstützung während der gesamten Zeit in ihrer Abteilung.
„Meinen Mädels“ Andrea Seibert, Beate Sawodny, Jasmin Engl und Miriam Votteler danke ich für die klasse Mitarbeit und ständige Hilfestellung während der gesamten Zeit mei- ner Promotion.
Auch Felix Luther und Marius Schaut danke ich für die gute Zusammenarbeit während ih- rer Zeit am IGB.
Dr. Martina Hampel, Dr. Petra Kluger, Dr. Johanna Schanz und Jan Hansmann danke ich für alle Gespräche und Diskussionen die mir für eine gute Arbeitsatmosphäre wirklich wichtig waren und es weiterhin sind. Außerdem danke ich für die Korrekturen an der ge- schriebenen Arbeit. Dr. Iz Anadere, Sibylle Thude, Brigitte Höhl und Anke Hoppensack danke ich für sämtliche Arbeitserleichterung im und außerhalb des Labors. Danke an das gan- ze Team Zellsysteme.
Dr. Rosario Lizio, Dr. Norbert Windhab, Dr. Benedikt Hartwig und Michael Damm von EVONIK Industries danke ich für die gute Zusammenarbeit und die konkreten Vorstellungen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Prof. Dr. Karl-Herbert Schäfer, Dr. Ulrich Rauch, Tanja Schwab, Patrick Kolbe und Michael Bischof danke ich für die freundliche Aufnahme und Hilfestellung während meiner Zeit an der Hochschule Zweibrücken sowie für die Möglichkeit die richtige Präparationstech- nik zu erlernen.
Meinen Eltern Branka und Wolfgang Michaelis, meinem Bruder Kevin und meinen Schwiegereltern Inge und Axel Pusch danke ich dafür, dass wir alle Hürden gemeinsam ü- berwinden konnten und ich mich ständig an sie lehnen durfte.
Meinem Partner Kai Pusch und meinem Sonnenschein Fynn danke ich für grenzenlosen Rückhalt und das süßeste Lächeln der Welt.
Abschließend möchte ich mich bei meiner gesamten Familie und meinen Freunden, insbeson- dere bei Sanja Cicko, Claus Stahl und Thomas Kretschi bedanken.
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Vollständige Beschreibung
ab Transportrichtung apikal nach basolateral
ADMET Absorption, Distribution, Metabolism, Elimination, Toxicity ATCC American Type Culture Collection
ba Transportrichtung basolateral nach apikal
BBMV Brush border membrane vesicles, apikale Membranvesikel
BioVaSc Biological vascularized scaffold (Biologisch vaskularisierte Trägerstruktur) BLMV Basolateral membrane vesicles, basolaterale Membranvesikel
BSA Bovine Serum Albumin, Rinder Serum Albumin
Caco-2 Colon Carcinom-2, Zelllinie aus kolorektalem Adenokarzinom
DDAVP Desmopressin
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinacid, Desoxyribonukleinsäure DNS
DSMZ Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
ECM Extrazelluläre Matrix
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGF Epidermal growth factor
FCS Fötales Kälberserum
FGF Fibroblast growth factor
FSC Forward Scatter
HBSS Hank´s buffered salt saline, Pufferlösung HPLC Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie
Hu Human, vom Menschen (ab)stammend
INT 2-[4-iodophenyl]-5-phenyltetrazolium Chlorid ISC Intestinal stem cells, Stammzellen
KGF Keratinocyte growth factor
KRB Krebs Ringer buffer solution
LDH Laktat-Dehydrogenase
LogPow Dekadischer Logarithmus des n-Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten Pow
mEC Mikrovaskuläre Endothelzellen
Ms Mouse, Maus
NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat
PAS Periodic-acid-stain (Perjod-Schiff-Färbung)
PET Polyethylenterephthalat
PBS Phosphate buffered saline, Pufferlösung pIEC Porcine, intestinale Epithelzellen
Po Porcin, vom Schwein (ab)stammend
PP Polypropylen
PTFE Polytetrafluorethylen
Rb Rabbit, vom Kaninchen (ab)stammend
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion
SD Standardabweichung
SSC Side Scatter
t0 Retentionszeit des Totzeitmarkers, Totzeit der Säule
TA Transit amplifying cells (proliferierende, undifferenzierte Zellen)
UF Ultrafiltration
UV Ultraviolett
vWF von Willebrand Faktor
WF Wachstumsfaktoren
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung... I Danksagung...IV Abkürzungsverzeichnis... V Inhaltsverzeichnis ...VI
1. EINLEITUNG... 1
1.1. Der Dünndarm...1
1.1.1. Anatomie und Physiologie des Dünndarms ...1
1.1.1.1 Organisation und Regeneration des Darmepithels...4
1.1.2. Resorption an der intestinalen Barriere ...6
1.2. Resorptionsmechanismen ...6
1.2.1. Parazellulärer Transport ...7
1.2.2. Transzellulärer Transport ...8
1.2.2.1 Transzellulärer erleichterter Transport...9
1.2.2.2 Transzellulärer aktiver Transport...9
1.2.2.3 Der Effluxtransporter P-Glycoprotein (ABCB1)...10
1.2.2.4 Sekundär und tertiär transzellulärer Transport...11
1.2.2.5 Endozytose ...12
1.2.3. Beeinflussung intestinaler Resorptionsmechanismen ...12
1.2.4. Untersuchung der intestinalen Permeabilität...14
1.3. Notwendigkeit alternativer Testverfahren – Reduktion von Tierversuchen ...16
1.4. Tissue Engineering ...18
1.4.1. Zellquellen für Tissue Engineering ...18
1.4.2. Matrices für Tissue Engineering ...20
1.4.3. Bioreaktorsysteme ...21
2. ZIELSETZUNG DER ARBEIT ... 23
3. MATERIAL ... 24
3.1 Chemikalien ...24
3.2. Biologisches Material ...26
3.2.1. Humanes Material ...26
3.2.1.1 Vorhautgewebe ...26
3.2.1.2 Zelllinien ...26
3.2.2. Porcines Material...27
3.3. Material für die Zellkultur ...28
3.3.1. Zellkulturmedien ...28
3.3.2. Puffer und Lösungen für die Zellkultur...30
3.4. Puffer und Lösungen für Transportversuche ...31
Inhaltsverzeichnis
3.5. Materialien und Lösungen für 3D- Kulturen ...32
3.6. Immunhistologie ...33
3.6.1. Antikörper für Immunhistologie...33
3.6.2. Lösungen und weitere Materialien für Immunhistologie ...33
3.6.3. Lösungen und weitere Materialien für Histologie...34
3.7. Durchflusszytometrie (FACS) ...35
3.7.1. Antikörper und Isotypkontrollen für FACS ...35
3.7.2. Lösungen und weitere Materialien für FACS ...35
3.8. Verwendete Kits...35
3.9. Verbrauchsmaterial ...36
3.10. Laborgeräte...37
4. METHODEN... 39
4.1. Zellkulturtechnik...39
4.1.1. Steriles Arbeiten ...39
4.1.2. Beschichtung von Zellkulturgefäßen und Insertmembranen...39
4.1.3. Optische Bewertung von Zellen ...40
4.1.4. Zellzählung ...40
4.1.5. Vitalitätsbestimmung...40
4.2. Transportstudien auf Caco-2 Monolayerkulturen (2D) ...41
4.2.1. Caco-2 Zellkultur...41
4.2.2. Kultivierung von Caco-2 Zellen auf Insertmembranen...42
4.2.3. Induktion des P-Glycoprotein-Transporter (MDR-1) ...42
4.2.4. Bestimmung des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER-Wert)...43
4.2.5. Durchführung der 2D-Transportstudien ...44
4.2.6. Auswertung der Transportversuche...46
4.2.6.1 Fluoreszenzmessung ...46
4.2.6.2 High-Performance-Liquid-Chromatographie (HPLC)...47
4.2.6.3 Statistik ...48
4.3. 3D- Kulturen ...49
4.3.1. Herstellung der natürlichen Kollagenmatrix ...49
4.3.2. Primärzellisolation...50
4.3.2.1 Isolation und Kultivierung humaner mikrovaskulärer Endothelzellen ...50
4.3.2.2 Isolation und Kultivierung porciner intestinaler Epithelzellen (pIEC)...51
4.3.3. Rebesiedelung der Kollagenmatrix ...54
4.3.3.1 Statische Kultivierung im Brutschrank ...54
4.3.3.2 Dynamische Kultivierung im Bioreaktorsystem (BRS) ...54
4.3.4. Transportstudien innerhalb des 3D- Modellsystems ...56
4.4. Charakterisierung der Zellen ...58
4.4.1. Lebend-Tod-Färbung...58
Inhaltsverzeichnis
4.4.4. Immunhistochemie ...60
4.4.4.1 Cytospots...60
4.4.4.2 Fixierung von Gewebe ...60
4.4.4.3 Einbetten von Gewebe ...60
4.4.4.4 Paraffinschnitte ...61
4.4.4.5 Entparaffinierung ...62
4.4.4.6 Antigendemaskierung ...62
4.4.4.7 Antikörperfärbung...63
4.4.5. Hämatoxilin-Eosin-Färbung (HE) ...64
4.4.6. Perjod-Schiff-Färbung (PAS) ...65
4.4.7. Alzianblaufärbung pH = 2,5 ...66
4.4.8. Durchflusszytometrie (FACS)...67
5. ERGEBNISSE... 71
5.1. Aufbau und Untersuchung des statischen 2D-Caco-2 Insertmodells ...71
5.1.1. Vergleichende Charakterisierung von Caco-2 Zelllinien der Anbieter ATCC und DSMZ ...71
5.1.2. Zellzahlbestimmung auf PET-Insertmembranen...77
5.1.3. Transportversuche auf 2D- PET-Insertmembranen...78
5.1.3.1 Einfluss der Probenpuffer und Probensubstanzen auf die Monolayerintegrität...78
5.1.3.2 Vergleichende Transportstudien von Caco-2 Zellen der Anbieter ATCC und DSMZ auf 2D- PET-Insertmembranen ...82
5.2. Etablierung eines dynamischen 3D- intestinalen Co-Kulturmodells...91
5.2.1. 3D- Kultur auf natürlicher Kollagenmatrix ...91
5.2.2. Dynamisches Bioreaktorsystem (BRS) ...94
5.2.2.1 Entwicklung und Aufbau des BRS ...94
5.2.2.2 Dynamische 3D- Kultivierung ...97
5.2.3. Co-Kultursystem mit primären, mikrovaskulären Endothelzellen (mEC) ...101
5.2.4. Glukosebestimmung ...103
5.2.5. Transportstudien auf dem erweiterten Co-Kulturmodell ...104
5.2.6. Erstellung von Korrelationen - Vergleich 2D-PET-Insertmodell mit erweitertem 3D- Co-Kulturmodell ...108
5.3. Etablierung einer primären porcinen, intestinalen Epithelzellkultur für ein physiologisches 3D- Modell...116
5.3.1. Untersuchung von Zellkulturmedien und Langzeitkultivierung in vitro...116
5.3.2. Charakterisierung der isolierten pIEC ...120
5.3.3. Kultivierung der pIEC auf der natürlichen Kollagenmembran BioVaSc...124
5.3.3.1 Statische Kultivierung auf BioVaSc ...125
5.3.3.2 Dynamische Kultivierung auf BioVaSc...128
Inhaltsverzeichnis
6. DISKUSSION DER ERGEBNISSE... 132
6.1. Aufbau und Untersuchung des statischen 2D-Caco-2 Insertmodells ...133
6.2. Vergleichende Charakterisierung von Caco-2 Zellen der Anbieter DSMZ und ATCC...133
6.3. Transportversuche auf 2D- PET-Insertmembranen...135
6.3.1. Einfluss der Probenpuffer und Probensubstanzen auf die Monolayerintegrität ...135
6.3.2. Vergleichende Transportstudien von Caco-2 Zellen der Anbieter ATCC und DSMZ auf 2D- PET-Insertmembranen...137
6.4. Etablierung eines dynamischen 3D- intestinalen Co-Kulturmodells...142
6.4.1. Natürliche Kollagenmatrix als Trägerstruktur...142
6.4.2. Dynamisches Bioreaktorsystem (BRS) ...143
6.4.3. Co-Kultursystem mit primären, mikrovaskulären Endothelzellen (mEC) ...146
6.4.4. Transportstudien auf dem erweiterten Co-Kulturmodell ...148
6.5. Erstellung von Korrelationen - Vergleich zwischen 2D- PET-Insertmodell und 3D- Co-Kulturmodell ...149
6.6. Etablierung einer porcinen, intestinalen Epithelzellkultur für ein physiologisches 3D- Modell ...155
6.6.1. Charakterisierung der primären, porcinen Epithelzellkultur ...155
6.6.2. Kultivierung der primären, porcinen Epithelzellen auf der natürlichen Kollagenmatrix ...157
6.7. Ausblick ...158
7. LITERATURVERZEICHNIS... 160
8. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 170
9. TABELLENVERZEICHNIS... 173
PRÄSENTATIONEN UND VERÖFFENTLICHUNGEN... 174
Einleitung
1. Einleitung 1.1. Der Dünndarm
Der Dünndarm ist das Hauptresorptionsorgan des Gastrointestinaltraktes (GIT).
Die Aufgabe des Dünndarms besteht vorwiegend darin, den im Mund und Magen vorverdau- ten Speisebrei vollständig zu verdauen und lebensnotwendige Nährstoffe durch Absorption dem Körper zugänglich zu machen.
Fette, Kohlenhydrate und Eiweiße werden dabei gemeinsam mit Vitaminen, Spuren- und Mengenelementen, sowie mit oral zugeführten Arzneistoffen über die Darmschleimhaut in das Blut- oder Lymphgefäßsystem resorbiert [SCHMIDT ET AL.2007].
1.1.1. Anatomie und Physiologie des Dünndarms
Im Anschluss an den Pförtner des Magens (Pylorus) folgt der in 3 Abschnitte eingeteilte Dünndarm: Zwölffingerdarm (Duodenum), Leerdarm (Jejunum) und Krummdarm (Ileum).
Beim erwachsenen Menschen geht das etwa 20 – 30 cm lange Duodenum am sog. Treitz- Band in das ca. 1,5 m lange Jejunum über. Ohne definierte Grenze folgt daraufhin das 2 m lange Ileum [SCHMIDT ET AL.2007].
Die Darmabschnitte weisen jeweils eine leicht unterschiedliche Funktionalität auf. Da sich der Mageninhalt in das Duodenum entleert und die Bauchspeicheldrüse ihre Verdauungssekrete in das Dünndarmlumen abgibt, findet in diesem Darmabschnitt hauptsächlich eine enzymati- sche Aufspaltung der Nahrung statt. Zusätzlich befinden sich im Duodenum die Brunner- Drüsen, die ein alkalisches Sekret produzieren und so den sauren Mageninhalt abpuffern. Das Sekret neutralisiert die Magensäure und gewährleistet damit den richtigen pH-Wert für die Aktivität der Enzyme. Die nachfolgenden Darmabschnitte Jejunum und Ileum gehen fließend ineinander über. In diesen Bereichen findet die Bildung von weiteren Verdauungsenzymen (z.B. Disaccharidasen und Dünndarmlipasen), vor allem aber die weitere Aufspaltung und Resorption der Nahrungsbestandteile statt. Das Ileum lässt sich histologisch vom Jejunum durch seine niedrigeren Schleimhautfalten sowie das Vorhandensein von Lymphfollikeln ab- grenzen und stellt den Übergang zum Kolon dar [SPORNITZ ET AL.2007].
Um eine effiziente Resorption von Molekülen entlang des Darmlumens zu gewährleisten, ist der Dünndarm durch die Ausstülpung von sog. Kerckring-Falten (Pilcae circularis) geprägt.
Zusammen mit den finger- oder blattförmigen Zotten (Villi intestinalis) und dem Bürsten- saum (Mikrovilli) der Epithelzellen wird die Oberfläche des gesamten Dünndarmes ca. 600- fach vergrößert und beträgt schließlich bis zu 200 m2 [SCHMIDT ET AL.2007].
Einleitung
Abbildung 1: Oberflächenvergrößerung des Darmepithels [SCHMIDT ET AL.2007].
Innerhalb des Gastrointestinaltraktes ähneln sich der Aufbau und die funktionellen Einheiten der Gewebeschichten. Die Wandschichten des Dünndarms lassen sich dabei von der äußeren Abgrenzung des Organs bis zur inneren, luminalen Seite wie folgt einteilen:
- Tunica serosa oder advenita - Tunica muscularis
- Tela submucosa - Tunica mucosa
Einleitung
Die Tunica serosa bildet die äußere Schicht der Darmwand und ist mit einem Plattenepithel (Mesothel) überzogen. Dieses sondert Flüssigkeiten ab, die es ermöglichen, den Darm an an- deren Organen entlanggleiten zu lassen. Die Tunica serosa kommt ausschließlich in den intra- peritoneal gelegenen Darmabschnitten des Jejunums und Ileums vor, während die äußere Schicht des Duodenums lediglich mit einer dünnen Bindegewebsschicht, der sog. Tunica ad- venita, überzogen ist [LÜLLMANN-RAUCH 2006,SCHIEBLER ET AL.2007].
An die Tunica serosa schließt sich das Bindegewebe der Tela subserosa an. Die Tela subsero- sa verbindet die Tunica serosa mit der äußeren Längsmuskelschicht (Stratum longitudinale), der Tunica muscularis.
Die Kontraktion der Längsmuskulatur führt zu einer Verkürzung und Erweiterung des Darm- rohres, während die Kontraktion der angrenzenden Ringmuskulatur (Stratum circulare) zu einer Verengung des Darmlumens führt. Die Kombination aus Pendelbewegungen und Peris- taltik dient der Durchmischung und dem Weitertransport des Darminhaltes in aboraler Rich- tung. Innerhalb des Dünndarmes wird dabei eine durchschnittliche Passagegeschwindigkeit von 1 – 4 cm/min erreicht [HICK ET AL.2006].
Verantwortlich für die Steuerung der Darmbewegungen ist unter anderem der zwischen den beiden Muskelschichten gelegene Auerbach-Plexus (Plexus myentericus). Gemeinsam mit dem in der Tela submucosa gelegenen Meißner-Plexus (Plexus submucosus) bilden diese Nervengeflechte das enterische Nervensystem.
Innerhalb der bestehenden Tela Submucosa befinden sich zudem zahlreiche Blut- und Lymphgefäße, die für den Abtransport und die Verteilung der resorbierten Nahrungsbestand- teile aus dem Darmlumen in den Körperkreislauf zuständig sind. Im Gegensatz zu den ande- ren Abschnitten des Dünndarmes, befinden sich innerhalb der Tela submucosa des Duode- nums zusätzlich Brunner-Drüsen, welche bis in die Darmzotten reichen können. Durch die Sekretion von Muzinen, schützen diese das Darmepithel vor Proteasen und vor dem aus dem Magen kommenden sauren Speisebrei.
Die aus Bindegewebe bestehende Tela submucosa grenzt an die dünne Muskelschicht der Tunica mucosa, welche eine Anpassung an den jeweiligen Kontraktionszustand des Darms ermöglicht.
Die Tunica mucosa (Schleimhaut) kleidet das Darmlumen mit einem einschichtigen Epithel aus und ist vorwiegend für die enzymatische Zerkleinerung und Resorption von Nahrungsbe- standteilen verantwortlich.
Die Zellpopulation der Darmschleimhaut besteht aus Enterozyten, Becherzellen, Paneth- Zellen, Enteroendokrinen Zellen und M-Zellen. M-Zellen kommen lediglich in Angrenzung an Lymphozytenansammlungen (z.B. Peyer-Plaques) der Lamina propria mucosae vor und sind Bestandteil des Schleimhautassoziierten Lymphatischen Systems (MALT), welches der Immunabwehr dient [SCHIEBLER ET AL.2007].
Das Eptihel des Dünndarms gehört zu den regenerativsten Geweben des ganzen Körpers und obwohl jeder Zellart unterschiedliche Aufgaben zugewiesen sind, regenerieren sie sich aus der gleichen Stammzelle [POTTEN ET AL.1997,SCHMIDT ET AL.2007].
Einleitung
1.1.1.1 Organisation und Regeneration des Darmepithels
Den vier Zelltypen der Tunica mucosa liegen jeweils absorptive und sekretorische Funktionen zugrunde (Abbildung 3).
Abbildung 3: Organisation der Zellen des Darmepithels. A) Zotte mit einer Krypte, die mit dem Stammzell- kompartiment maßgeblich für die Zellerneuerung verantwortlich ist. B) Darstellung der vier ausdifferenzierten Zelltypen des Darmepithels [CROSNIER ET AL.2006].
Die Enterozyten machen den größten Teil der Schleimhautzellen aus. Mithilfe der zum Darm- lumen (apikal) zugewandten Mikrovilli und der spezifischen Ausprägung von Enzymen und Transportsystemen sind diese absorptiven Epithelzellen vorwiegend für die Aufnahme von Nahrungsbestandteilen zuständig.
Die Becherzellen (Goblet Zellen) sind zwischen den Enterozyten lokalisiert und sezernieren Muzine, die das Darmepithel vor Enzymen schützen sowie eine ausreichende Gleitfähigkeit des Darminhaltes gewährleisten.
Paneth-Zellen sitzen in den tiefen Kryptenregionen und sezernieren u. a. Lysozym, TNF-α und verschiedene alpha-Defensine. Diese dienen der Abwehr von Mikroorganismen und so- mit dem Schutz des regenerativen Stammzellkompartiments [BURKEY ET AL.2009,POTTEN ET AL.1997].
Enteroendokrine Zellen sind eine Population aus unterschiedlichen, hormonbildenden Zellen, die ihre Sekrete vorwiegend in die inneren Schichten der Darmwand abgeben. Die Sekretion
Einleitung
Seit über 30 Jahren ist bekannt, dass sich das gesamte Darmepithel aus gewebespezifischen Stammzellen innerhalb von 2 bis 7 Tagen vollständig regeneriert. [MONTGOMERY ET AL. 2008, BRITTAN ET AL. 2002]. Die intestinalen Stammzellen (ISC) sind in den tiefen Einstül- pungen zwischen den Zotten, den sog. Lieberkühn-Krypten (Glandulae intestinales), lokali- siert. Derzeit wird davon ausgegangen, dass die Zellerneuerung auf Basis der asymmetrischen Zellteilung erfolgt. Dabei bleibt eine Stammzelle erhalten, während gleichzeitig neue undiffe- renzierte Zellen aus ihr hervorgehen. Es wird zudem davon ausgegangen, dass es neben den ruhenden Stammzellen (ISC) eine Population von proliferativen, noch undifferenzierten Zel- len (transit amplifying cells, TA) gibt, die oberhalb der Stammzellen und Paneth-Zellen gele- gen sind. Die noch undifferenzierten Zellen wandern aus den Krypten heraus und differenzie- ren entlang der Zotte, bis sie schließlich an der Zottenspitze in das Darmlumen abgestoßen werden.
Wie die so genannte Stammzellnische aber tatsächlich organisiert ist und an welcher Stelle in der Krypte die Stammzellen wirklich lokalisiert sind, ist bis heute nicht eindeutig belegt.
In verschiedenen genetischen Studien konnte gezeigt werden, dass ausgehend von mesen- chymalen und epithelialen Zellen die wnt/β-catenin Signalkaskade einen signifikanten Ein- fluss auf den Erhalt der Stammzellnische hat. Ferner spielen weitere Faktoren, die unter ande- rem von myofibroblastären Zellen und enterischen Neuronen sezerniert werden, eine wichtige Rolle bei der Organisation des Stammzellkompartiments [MONTGOMERY ET AL.2008].
Da noch immer keine eindeutigen Stammzellmarker identifiziert werden konnten, versuchen verschiedene Arbeitsgruppen über indirekte Methoden diese nachzuweisen. Mit der Annah- me, dass intestinale Stammzellen (ISC) im Vergleich zu TA-Zellen einen langsameren Zell- zyklus aufweisen, definierte die Arbeitsgruppe um C. S. Potten die Zellen der Position 4-9 in der Kryptenregion von Mäusen als ISC-Population. Barker et al. zeigten 2007, dass die Stammzellen des Darms zwischen den Paneth-Zellen lokalisiert sind. Mithilfe von Knock-in Mäusen, deren Darmregeneration anhand von Biopsien über ein Zeitraum von insgesamt 60 Tagen untersucht wurde, wiesen sie Lgr5 (leucine-rich-repeat-containing G-Protein-coupled receptor 5) als einen potentiellen Stammzellmarker nach [BARKER ET AL.2007].
Als weitere Marker der ISC-Population zählen zudem verschiedene Integrine, die entlang der Krypte in unterschiedlichem Maße exprimiert werden. Auch die individuelle Expression von Telomerasen lässt sich zur Beurteilung der Lokalisation von ISC einsetzen.
Dennoch kann insgesamt festgestellt werden, dass bisher keiner der identifizierten Marker für die eindeutige Identifikation der ISC-Population ausreichend ist. Hierfür müssen zukünftig Modellsysteme entwickelt werden, die es ermöglichen Stammzellen und Progenitorzellen in ausreichendem Maße anzureichern und diese hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften und Marker zu validieren [MONTGOMERY ET AL.2008].
Einleitung
1.1.2. Resorption an der intestinalen Barriere
Die Resorptionsbarriere für Nahrungs- und oral zugeführte Arzeimittelbestandteile stellen die Enterozyten der Dünndarmschleimhaut dar.
Diese absorptiven Epithelzellen sind lateral durch verschiedene Zell-Zell-Kontakte unterein- ander (z.B. über Tight Junctions und Desmosmen) und basolateral mit der Balsallamina (über Hemidesmosomen) verbunden [ALBERTS ET AL.2001].
Abbildung 4: Zelluläre Kontakte [ALBERTS ET AL.2001].
Während die anderen Zellverbindungen vorwiegend der Stabilität und Adhäsion, sowie dem gegenseitigen Austausch von Wassermolekülen dienen, verhindern die apikal gelegenen Tight Junctions die Diffusion von Membranproteinen und erhalten die Unterschiede der apikalen gegenüber der basolateralen Seite und somit die Polarität der gesamten Zelle aufrecht. Ferner führt die Versiegelung der Zellschicht durch die Tight Junctions zu einem selektiven Trans- port von wasserlöslichen Molekülen an den Enterozyten vorbei und stellt damit die Basis für die gerichteten Transport- und Aufnahmemöglichkeiten des Darmepithels dar [ALBERTS ET AL.2001,BURKEY ET AL.2009].
1.2. Resorptionsmechanismen
Der polarisierte Aufbau des Darmepithels ermöglicht es Molekülen generell zwei Transport- wege in Anspruch zu nehmen. Entweder sie werden transzellulär durch eine Zelle hindurch transportiert, oder passieren die Epithelschicht parazellulär, indem sie über die Zell-Zell- Kontakte durch den Interzellularraum geschleust werden [ULLRICH ET AL.1979].
Über welchen Transportweg eine Substanz schließlich in das Blutgefäßsystem gelangt, hängt
Einleitung
Abbildung 5: Transportmechanismen an der intestinalen Epithelzellbarriere. 1) parazellulärer Transport;
2a) transzellulärer passiver Transport; 2b) durch Transporter vermittelter Transport:
b1) erleichterter Transport, b2) primär aktiver Transport b3) sekundär aktiver Transport mit symport (s) oder antiport (a); 2c) Endozytose und Pinozytose, 3) Efflux [TUKKER 2002].
1.2.1. Parazellulärer Transport
Substanzen, die das Darmepithel parazellulär durchdringen, werden durch passive Diffusion transportiert. Dabei ist dieser Transportweg für hydrophile Moleküle durch die Porengröße des Interzellularspaltes limitiert [TUKKER 2002].
Innerhalb des Darms nimmt die Durchlässigkeit der Tight Junctions von distal nach proximal ab. Während das Jejunum theoretisch noch für Moleküle mit einer Größe von 0,8 nm durch- lässig ist, ist das Kolon mit einer Porengröße von 0,2 nm weitaus undurchlässiger [SCHMIDT ET AL. 2007]. Lediglich Substanzen, die aufgrund ihrer Hydrophilie die Zellmembran nicht durchdringen können und ein Molekulargewicht unter 300 Da haben, können die parazelluläre Route in Anspruch nehmen [TUKKER 2002]. In-vitro- Studien zeigten zudem, dass eine Präfe- renz für den Transport kationischer Moleküle gegenüber ungeladener oder anionischer Mole- küle vorliegt [KARLSSON ET AL.1999].
Typische Ionen, die auf parazellulärem Wege das Epithel durchdringen können, sind z.B. Na+, K+, Cl- undMg2+. Diese werden entweder direkt über ein Konzentrationsgefälle transportiert oder über solvent drag durch den Wassereinstrom mitgeführt [SCHMIDT ET AL.2007]. Koffein wird beispielsweise aufgrund seiner geringen Größe und seines hydrophilen Charakters zur Untersuchung der parazellulären Permeabilität epithelialer Zellen verwendet. Umgekehrt die- nen Substanzen, die nicht transzellulär aufgenommen werden können und lediglich eine ge- ringe Durchlässigkeit auf parazellulärem Wege erzielen, als Integritätsmarker der Tight Junc- tions bei in vitro Transport Experimenten. Beispiele für schlecht resorbierbare Stoffe der pa- razellulären Route stellen unter anderem Atenolol, Mannitol und Fluorescein dar [TUKKER
2002].
Einleitung
1.2.2. Transzellulärer Transport
Der passive transzelluläre Transport führt Substanzen über die apikale Membran in die Zelle hinein. Die Substanz verteilt sich voraussichtlich innerhalb der Zelle schnell durch Konvekti- on und überquert anschließend die basolaterale Membran, bevor sie schließlich in das Blutge- fäßsystem gelangen kann [TUKKER 2002].
Da die Substanzen entlang eines Konzentrationsgefälles permeieren, erfordert die passive Diffusion keine Energie. Nahrungs- und Arzneistoffe bewegen sich somit aus einer Lösung mit höherer Konzentration (Darmlumen) in einen Raum mit niedrigerer Konzentration (Blut oder Lymphe) ohne zusätzlichen Energieaufwand [DERENDORF ET AL.2002].
Die Diffusionsgeschwindigkeit ist abhängig vom Konzentrationsgefälle, von der Größe und der Dicke der Membran, sowie von einem stoffspezifischen Diffusionskoeffizienten und kann dabei quantitativ durch das Fick´sche Gesetz beschrieben werden (Formel 1):
) (Ca Ci L
D A
q= ∗ ∗ − (Formel 1)
q = Diffusionsgeschwindigkeit [mg/s]
Ca = Konzentration auf der Membranaußenseite [mg/ml]
Ci = Konzentration auf der Membraninnenseite [mg/ml]
D = Diffusionskoeffizient [cm2/s]
A = Membranfläche [cm2] L = Membrandicke [cm].
Der Diffusionskoeffizient D ist eine Stoffkonstante und abhängig von Molekülgröße und Struktur, sowie der Lipophilie und Ladung des Stoffes.
Eine Charakterisierung oral verabreichter Arzneistoffe, die Zellmembranen durch passive Diffusion gut überqueren können, ist mithilfe der von Lipinski im Jahre 1997 erstellten ´Rule of 5´ möglich [LIPINSKI 1997]. Die auf experimentellen Untersuchungen und auf Modellie- rungen basierende Regel besagt, dass Substanzen mit nicht mehr als 15 H-Bindungen, einem Molekulargewicht von ca. 500 Da und einem Oktanol-Wasser-Koeffizienten (Lipophilie) von logPow ≈ 5 transzellulär aufgenommen werden. Lipophilere Substanzen (>logPow) können in die Membran eingelagert werden, was somit zu einer geringen Bioverfügbarkeit führt [AR- TURSSON ET AL.2001].
Beispiele für Substanzen, die die Zellbarriere auf passivem, transzellulärem Weg überqueren, sind unter anderem die Betablocker Metoprolol und Propranolol. Diese Arzneimittel dienen vorwiegend der Behandlung von Bluthochdruck und werden unter anderem bei in-vitro- Stu- dien als Markersubstanzen für den hochpermeablen transzellulären Transport eingesetzt [MARKOWSKA ET AL. 2001]. Zudem gelangen über Nahrungsmittel zugeführte, fettlösliche Vitamine, wie z.B. Vitamin A (als Retinol), Vitamin D, E und K über passive transzelluläre
Einleitung
1.2.2.1 Transzellulärer erleichterter Transport
Unter erleichterten Transporten versteht man Transporte, bei denen sich Substanzen mithilfe von Trägermolekülen, den sog. Carriern, durch Zellmembranen schleusen lassen. Durch die Kopplung an den Carrier entsteht ein Komplex, der lipophilere Eigenschaften als die Aus- gangssubstanz hat. Deshalb erleichtert dieses Prinzip insbesondere hydrophilen Substanzen das Durchdringen von Zellmembranen. Bei den Carriern handelt es sich um Trans- membranproteine mit mehreren membrandurchspannenden Domänen. Wie diese Carrier tat- sächlich funktionieren, ist noch nicht vollständig geklärt [TUKKER 2002]. Es wird allerdings vermutet, dass sie die Substanzen über flip-flop Mechanismen in die Zelle einschleusen [TUKKER 2002].
Für die erleichterten Transporte ist kein Energieaufwand notwendig. Analog der passiven Diffusion gelangen die Substanzen entlang eines Konzentrationsgefälles über den Carrier in die Zelle. Inwieweit erleichterte Transporte für die Resorption von Arzneimittel eine Rolle spielen ist derzeit noch unklar [DERENDORF ET AL.2002,TUKKER 2002].
Ein Beispiel für den erleichterten Transport entlang des Dünndarmepithels stellt der Transport eines Glukosemoleküls über den apikal gelegenen GLUT5 Transporter und den basolateral gelegenen GLUT2 Transporter dar (Uniport) [SCHMIDT ET AL.2007].
1.2.2.2 Transzellulärer aktiver Transport
Als aktiver Transport werden Resorptionsprozesse bezeichnet, die unter Verbrauch von Ener- gie aus dem Zellstoffwechsel ablaufen. Die Hydrolyse von Adenonsintriphosphat (ATP) zu Adenonsindiphosphat (ADP) ermöglicht einen Stofftransport entgegen eines Konzentrations- gefälles [DERENDORF ET AL.2002].
Der primär aktive Transport wird mithilfe von Pumpen (ATPasen) realisiert und ist aufgrund seiner begrenzten Kapazität sättigbar und kann mit folgender Gleichung beschrieben werden (Formel 2):
C K J C J
m∗
∗
= max (Formel 2)
J = aktuelle Transportrate [mol * m-2*s-1] Jmax = maximale Transportrate [mol * m-2*s-1]
C = aktuelle Konzentration des zu transportierenden Stoffes [mol*m-3] Km = Michaelis-Menten-Konstante
Die Michaelis-Menten-Konstante stellt die (Halbsättigungs-)Konzentration dar, bei der die Transportgeschwindigkeit ihren halbmaximalen Wert erreicht hat (0,5*Jmax). Dabei ist zu be- achten, dass viele Stoffe nicht ausschließlich aktiv transportiert werden, sondern durch einen möglichen lipophilen Anteil auch teilweise passiv die epitheliale Barriere überqueren. Für solche Substanzen ist dies bei der Berechnung zu berücksichtigen [TUKKER 2002].
Einleitung
Ein im Darm vorkommendes aktives Transportersystem stellt die Na+/K+-ATPase dar, die drei positive Natriumionen aus der Zelle hinaus pumpt und im selben Zyklus unter der Hydro- lyse eines ATP zwei positiv geladene Kaliumionen in die Zelle einschleust. Über diesen Pro- zess hält die Na+/K+-Pumpe das Potential der Zelle im Gleichgewicht [SCHMIDT ET AL.2007].
1.2.2.3 Der Effluxtransporter P-Glycoprotein (ABCB1) Entlang des Darmepithels befinden sich aktive
Transportersysteme, die oral auf- genommene Substanzen in das Darmlumen
zurückbefördern.
Diese sekretive Ausschleusung von Molekülen wird als Efflux bezeichnet. Während der Pro- zess einerseits dazu dient, den Körper vor toxischen Substanzen zu schützen, ist er andererseits für die Resorption von Wirkstoffen nachteilig, da er die orale Bioverfügbarkeit dieser Substanzen erheblich herabsetzen kann.
Abbildung 6: P-Glycoprotein [SORRENTINO 2007].
Den wohl am besten untersuchten Effluxtransporter stellt das MDR-1 (Multiple Drug Re- sistance) Genprodukt P-Glycoprotein dar (Abbildung 6).
P-Glycoprotein wird in allen Geweben mit Barrierefunktion exprimiert und ist somit auf dem Epithel oder Endothel der Blut-Hirn-Schranke, der Leber, der Niere, der Hoden, der Plazenta und des Darms lokalisiert [TUKKER 2002,DEAN ET AL. 2001].
Das 170 kDa große Transporterprotein gehört der Superfamilie der ABC-Transporter (ATP- binding-cassette-transporter) an und wurde im Jahre 1976 in mutierten Eizellen des chinesi- schen Hamsters entdeckt [JULIANO ET AL. 1976]. Die Expression von P-Glycoprotein in Krebszellen führt dazu, dass Chemotherapeutika (z.B. Vinblastin) als Substrate des Trans- portproteins aktiv aus der Zelle ausgeschleust werden und somit eine Resistenz der pathogen veränderten Zellen gegenüber des eingesetzten Wirkstoffes hervorrufen [HUNTER ET AL. 1993].
In gesunden Geweben mit Barrierefunktion stellt das P-Glycoprotein zusätzlich eine limitie- rende Barriere für viele Wirkstoffe dar. Zu den Substraten des Effluxtransporters gehören unter anderem verschiedene Betablocker und Antibiotika, sowie das Herzglykosid Digoxin [HASLAM ET AL.2008]. Gemeinsam mit Studien, die zeigen, dass die hydrophoben Substrate des P-Glycoproteins mit metabolisierenden Enzymen (Cytochrom P450) interagieren können, stellen diese Beobachtungen eine wichtige Grundlage für die Indikation und Entwicklung von
Einleitung
Verschiedene Arbeiten zeigten zudem, dass die gleichzeitige Einnahme von mehreren Wirk- stoffen zu unerwünschten Arzneimittelinteraktionen bzw. Nebenwirkungen führen kann. Ein ähnlicher Zusammenhang konnte bei der gleichzeitigen Einnahme eines Wirkstoffes mit Nah- rungsmitteln gezeigt werden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass Transportmechanismen inhibiert oder induziert werden und Wirkstoffe daraufhin toxische Wirkspiegel erreichen kön- nen oder eine Wirkung vollständig ausbleibt [NISHI ET AL.2004,WANDEL ET AL.1999].
Zur Steigerung der Resorption und damit zu einer Erhöhung der oralen Bioverfügbarkeit von Substraten des P-Glycoprotein gibt es verschiedene Strategien deren Ziel die Inhibition des Transportproteins ist. Häufig werden hierfür sog. „MDR-Modulatoren“ eingesetzt, die selbst keine pharmakologische Wirksamkeit aufweisen, aber als Substrat des Transporters dessen Aktivität blockieren.
1.2.2.4 Sekundär und tertiär transzellulärer Transport
Innerhalb der apikalen Membran des Darmepithels sind sekundär aktive Transportmechanis- men in hohem Maße vertreten. Sekundär aktive Transportmechanismen befördern Ionen ent- lang eines Konzentrationsgefälles, welches aus einem primär aktiven Transport entstandenen ist. Sie nutzen diese potentielle Energie aus, um ein zweites Molekül gegen dessen Konzentra- tionsgradienten in gleicher Richtung (Symport) oder in entgegen gesetzter Richtung (Anti- port) zu transportieren. Durch diesen Mechanismus verbraucht der sekundär aktive Transport selbst kein ATP [SCHMIDT ET AL.2007].
Ein Beispiel für ein solches sekundär aktives System innerhalb des Dünndarms stellt der Nat- rium-abhängige Glukose und Galaktose Symporter SGLT-1 dar. SGLT-1 transportiert nur dann Substanzen in das Zellinnere, wenn er zwei Natriumionen und ein Glukosemolekül auf- genommen hat. Der zelleinwärts gerichtete, elektrochemische Gradient für Natrium liefert die notwendige Energie für den Glukosetransport aus dem Darmlumen in die Zelle. Durch die Aufkonzentration der Glukose innerhalb der Zelle kann diese die basolaterale Membran durch erleichterte Diffusion wieder verlassen.
Andere Transportsysteme des Dünndarmepithels wie z.B. EAAT, RBAT und NaSi-1 sind für die Aufnahme von Aminosäuren und Sulfat über sekundär aktive Transportmechanismen zu- ständig [SCHMIDT ET AL.2007].
Tertiär aktive Transporte sind entlang des Dünndarms ebenfalls vertreten. Diese Transport- mechanismen nutzen den Konzentrationsgradienten aus, der durch einen sekundär aktiven Transport auf Basis eines primär aktiven Transports aufgebaut wurde. Der Transporter PepT1 repräsentiert diese Form des tertiär aktiven Transports. Das aus 710 Aminosäuren und mit 12 Membran-durchdringenden Schleifen aufgebaute Protein ist auf der apikalen Zellmembran lokalisiert und übermittelt die Aufnahme von Di- und Tripeptiden in Form eines Protonen- abhängigen Symports [SCHMIDT ET AL.2007,TUKKER 2002].
Einleitung
Therapeutisch wirksame Substanzen, die über sekundär und tertiär aktive Transporter aufge- nommen werden, sind den natürlich vorkommenden Molekülen, die z.B. mit der Nahrung aufgenommen werden, strukturell ähnlich. Daher werden L-Dopa und L-α-Methyldopa über Aminosäuretransporter aufgenommen und verschiedene Cephalosporine und Aminopenicilli- ne über Di- und Tripeptid-Transporter [TUKKER 2002].
1.2.2.5 Endozytose
Die Aufnahme von Flüssigkeitströpfchen (Pinozytose) und ungelösten Feststoffpartikeln (Phagozytose) erfolgt über die vesikuläre Einstülpung der Zellmembran. Feststoffpartikel werden über die Interaktion mit Rezeptoren in die Zelle aufgenommen und können, in Vesikel eingebunden, die Zelle durchqueren. Ein Beispiel für die rezeptorvermittelte Endozytose stellt die Aufnahme von Vitamin B12 dar. Dieses bildet im Darm einen Komplex mit dem von der Magenschleimhaut produzierten Intrinsic Factor und wird ausschließlich in dessen Gegenwart resorbiert [SCHMIDT ET AL.2007].
Die Aufnahme von Arzneistoffen in den Körperkreislauf ist über diesen Resorptionsmecha- nismus limitiert, dennoch besteht die Möglichkeit, dass Wirkstoffe verpackt in Nanopartikel und Viren zukünftig über Endozytose dem Körper zugänglich gemacht werden können.
1.2.3. Beeinflussung intestinaler Resorptionsmechanismen
Die Resorption von Nahrungs- und Arzneistoffbestandteilen an der intestinalen Barriere ist von einer Vielzahl physiologischer Parameter abhängig. Alter, Größe und Gewicht des Orga- nismus haben bereits einen Einfluss darauf, wie viel der zugeführten Substanzen tatsächlich im Blutkreislauf ankommt. Die pH-Verhältnisse im Magen-Darm-Trakt, sowie die Verweil- zeit innerhalb des Dünndarmes können ebenfalls einen Einfluss auf die orale Bioverfügbarkeit ausüben.
Ferner führt die Nahrungsaufnahme zu einer grundsätzlichen Änderung des Motilitätsmusters von Magen und Darm. Gemeinsam mit weiteren Parametern, wie z.B. der Zusammensetzung, der Konsistenz und Temperatur der Nahrungsmittel, kann das entscheidend für die Resorption von gleichzeitig oral applizierten Arzneistoffen sein. Beispielsweise werden schwer lösliche Arzneimittel wie das Fungizid Grisefulvin durch fettreiche Nahrung emulgiert und lassen sich somit besser in den Blutkreislauf resorbieren.
Die Grenze zwischen Darmepithel und Blutkreislauf ist die erste und entscheidende Barriere für die Aufnahme von Nahrungs- und Arzneistoffbestandteilen. Die resorbierten (Wirk-) Be- standteile können bereits am intestinalen Epithel metabolisiert werden (intestinaler First- Pass-Effekt) und gelangen anschließend in die Leber. Dort angekommen erfolgt eine weitere Metabolisierung und teilweise bereits eine Eliminierung der resorbierten Substanzen (hepati- scher First-Pass-Effekt) bevor diese am jeweiligen Rezeptor (Wirkort) im Körper ankommen.
Einleitung
Aus diesem Grund werden Wirkstoffkandidaten so konzipiert, dass sie die Darm- Blutschranke mit einer hohen Konzentration überqueren können, damit sie in hohem Maße an ihrem tatsächlichen Wirkort ankommen.
Die Wahl der geeigneten Darreichungsform kann bereits aufgrund der damit verbundenen galenischen Eigenschaften einen Einfluss auf die Resorption des jeweiligen Wirkstoffs erzie- len. Des Weiteren lassen sich Stoffeigenschaften verändert, um die Löslichkeit von Wirkstof- fen zu verbessern. Beispielsweise kann die Zerkleinerung oder eine Veränderung der Stoff- modifikation zu einer erhöhten Resorption der Wirksubstanz führen [DERENDORF ET AL. 2002].
Wenn sich die Stoffeigenschaften der potentiellen Wirksubstanz selbst nicht beeinflussen las- sen, gibt es die Möglichkeit verschiedene Hilfstoffe einzusetzen, die die Permeabilität des jeweiligen Wirkstoffes steigern können. In Verbindung mit verschiedenen Tensiden und na- nopartikulären Carriern wie z.B. Micellen und Hexosomen konnte bereits in verschiedenen Studien eine verbesserte Aufnahme über die epitheliale Barriere gezeigt werden [KOGAN ET AL.2008, SWARNAKAR ET AL.2007,TAKAHASHI ET AL.2002].
Andere Hilfstoffe bewirken über eine Umverteilung des Zytoskellets (F-actin) die Öffnung der Tight Junctions und führen somit zur Erhöhung des parazellulären Transports von vor- wiegend hydrophilen Wirkstoffen [SALAMA ET AL.2006, MERWE ET AL.2004,THANOU ET AL. 2001]. Für verschiedene mucoadhesive Polymere, Fettsäuren und Ca2+-Chelatoren konnte dadurch ein permeationssteigernder Effekt nachgewiesen werden. Dennoch ist bei der Ver- wendung sogenannter Permeationsförderer (permeation enhancer) darauf zu achten, dass sie keine Zelltoxizität aufweisen und Zellkontakte lediglich für einen kurzen Zeitraum öffnen.
Studien zeigten, dass Derivate des natürlich vorkommenden Polymers Chitosan zukünftig Entwicklungspotential für die Steigerung des parazellulären Transportes bieten könnten. Es handelt sich dabei um biokompatible Stoffe, deren Moleküle so groß sind, dass sie selbst nicht in den systemischen Kreislauf gelangen [CANO-CEBRIÁN 2005,MERWE ET AL.2004,THANOU ET AL.2001].
Um Nebenwirkungen weitestgehend zu vermeiden, stellt die Ausscheidung der Hilfsstoffe, sowie die Vermeidung einer Schädigung der Mucosa die Voraussetzung für die Anwendung von Permeationsförderern dar.
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1.2.4. Untersuchung der intestinalen Permeabilität
Die frühzeitige Analyse und Klassifikation von neuen Wirkstoffkandidaten hinsichtlich ihrer Resorption an der intestinalen Barriere ist für die Beurteilung der oralen Bioverfügbarkeit ausschlaggebend.
Viele Arzneimittelkandidaten bestehen die Phasen II und Phasen III der klinischen Studien nicht, da sie neben einer zu geringen Löslichkeit, eine unzureichende Permeabilität sowie einen hohen First-Pass Metabolismus in Darm und Leber aufweisen [UNGELL 2002].
Aus diesem Grund ist die Entwicklung von Modellen notwendig, die bereits in präklinischen Studien eine Abschätzung der Unbedenklichkeit und der pharmakokinetischen Eigenschaften der eingesetzten Substanzen erlauben. An die angewandten Modelle werden dabei mehrere Anforderungen gestellt.
Neben einem einfachen Versuchsaufbau, sollten sie reproduzierbar, vom jeweiligen Experi- mentator unabhängig und mit dem humanen Organismus vergleichbar sein. Dabei steht eine Vielzahl von Modellen zur Verfügung, die sich hinsichtlich ihrer Komplexität und Aussage- kraft zur Beurteilung der intestinalen Permeabilität unterscheiden. Je nach Fragestellung muss entschieden werden, welches Modell geeignet ist und ob nicht ggf. eine Kombination aus ver- schiedenen Modellen notwendig ist [UNGELL 2002,STEWARD ET AL.1997].
Die Untersuchung der Löslichkeit und Stabilität des Wirkstoffes in einem bekannten Volu- men mit Lösungsmittel stellt eine einfache und wichtige Methode dar, die in frühen Stadien der Arzneimittelentwicklung eingesetzt wird. Zusätzlich zu physikalischen Modellen können zudem computerbasierte in silico-Modelle für die Beurteilung von Molekülstruktur und Li- pophilie des potentiellen Wirkstoffes hinsichtlich seiner Membrandurchlässigkeit und einer möglichen Arzneimittelinteraktion herangezogen werden. Die Anwendung von in silico- Modellen sowie die Korrelation der daraus gewonnenen Daten mit dem humanen Organismus setzt allerdings wesentliche Kenntnisse über die einzelnen Transportmechanismen und den Einfluss metabolisierender Enzyme des Darmepithels voraus [GARMIRE ET AL. 2007, STE- WARD ET AL.1997].
Um die Resorption von Substanzen an der intestinalen Barriere, sowie den Einfluss der in- testinalen Barriere auf die zu analysierende Substanz untersuchen zu können, ist der Aufbau und die Verwendung von biologisch basierten Modellen unumgänglich. Einfache Modelle, wie die Fraktionierung von apikalen (BBMV) und basolateralen (BLMV) Membransvesikeln werden für den Nachweis des Einflusses von Transportproteinen auf die Resorption der zu analysierenden Substanzen eingesetzt. Der Vorteil dieser Modelle liegt darin, dass neben tieri- schen Zellen auch die Aufnahme in humane Enterozyten untersucht werden kann. Limitiert sind sie durch die reine Betrachtung einzelner Darmpartien und den Ausschluss einer mögli- chen parazellulären Substanzaufnahme [UNGELL 2002].
Der Aufbau von in-vitro- Zellkulturmodellen, die auf die Kultivierung von Zellen auf porösen Membranen basieren, stellt eine Möglichkeit zur Durchführung von Transportstudien über ein
Einleitung
zeitig absterben und somit nicht über einen langen Zeitraum zu kultivieren sind, werden Zell- kulturmodelle vorwiegend auf Basis von Zelllinien aufgebaut, deren kanzerogener Ursprung häufig zu einer Veränderung der physiologischen Eigenschaften führt [SIMON-ASSMANN ET AL.2007, LE FERREC ET AL.2001]. Neben den Zelllinien HT29 und T84 werden Caco-2 Zel- len am häufigsten zur Untersuchung von Transportmechanismen an der intestinalen Barriere eingesetzt. Aus einem humanen Adenokarzinom isoliert, weisen diese Zellen in Kultur trotz ihres kolorektalen Ursprungs eine Vielzahl charakteristischer Eigenschaften von differenzier- ten Epithelzellen des Dünndarms auf [ARTURSSON ET AL. 1991, STEWARD ET AL. 1997, LE
FERREC ET AL. 2001]. Studien von Artursson et al. zeigten, dass vorwiegend die Resorption von hochpermeablen Substanzen, die passiv über die transzelluläre Route transportiert wer- den, innerhalb des in-vitro- Caco-2 Zellkulturmodells mit einer Aufnahme der gleichen Sub- stanzen im humanen Organismus in vivo korreliert [ARTURSSON ET AL.1991,ARTURSSON ET AL.2001]. In anderen Laboratorien führten diese Studien unter ähnlichen Bedingungen aller- dings nicht zu den gleichen Ergebnissen. Dies lässt auf eine Abhängigkeit der Versuchsdurch- führung vom jeweiligen Experimentator schließen und zeigt, dass sich das Caco-2 Zellkul- turmodell für eine Klassifizierung der Substanzen, nicht jedoch für eine vollständig quantita- tive Vorhersage der Absorption im humanen Organismus in vivo eignet [LENNERNÄS 2007, LE
FERREC ET AL.2001]. Ferner stellt u. a. die, verglichen mit Enterozyten, höhere Aktivität von P-Glycoprotein, die geringere Expression metabolisierender Enzyme (Cytochrom P450) so- wie die geringere parazelluläre Durchlässigkeit zusätzlich limitierende Faktoren für den Ein- satz des Caco-2 Zellkulturmodells zur Beurteilung der intestinalen Permeabilität in präklini- schen Studien dar.
Die Präparation von vollständigen Gewebesegmenten besitzt den Vorteil, dass Transportstu- dien über die vollständige Zellschicht mit allen, im Darmepithel vorkommenden Zelltypen sowie über die Schleimschicht vollzogen werden. Bei der Anwendung von organotypischen Modellen wird kontrolliert, in welchem Maße die Wirksubstanzen in das Gewebe und in Puf- ferlösungen diffundieren (z.B. intestinal rings, everted sac). Anwendung finden diese Model- le u. a. bei der Quantifizierung des parazellulären Transports von hydrophilen Substanzen und zur Bestimmung des Effekts potentieller Permeationsbeschleuniger. Zudem eignen sie sich zur Analyse einer möglichen Toxizität neuer Wirksubstanzen über die Ausscheidung intrazel- lulärer Enzyme und die Beurteilung histologischer Schnitte [LE FERREC ET AL.2001]. Obwohl die Vitalität der Gewebeproben durch die Sauerstoffanreicherung von Medien und Puffern über einen längeren Zeitraum erhalten bleibt, ist die Anwendung dieser Modelle limitiert. Da die Muskelschicht und Serosa der Gewebeproben nicht in allen Studien vollständig entfernt werden, findet ein Transport statt, der nicht die Gegebenheiten an der intestinalen Barriere reflektiert. Die Substanzen werden nicht ausschließlich in das Blut- und Lymphgefäßsystem der Lamina propria aufgenommen, sondern können in gleichem Maße von den Zellen der darunter liegenden Gewebeschichten gebunden werden. Daher ist eine Konzentrationsernied-
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rigung der Substanz nicht mit einer Resorption gleichzustellen was die Interpretation der er- haltenen Daten erheblich erschwert.
Intestinale Perfusionsmodelle stellen eine Möglichkeit dar, die Resorption von Substanzen an der intestinalen Barriere unter nahezu physiologischen Bedingungen im Tiermodell zu analy- sieren. Durch die zusätzliche Anbindung an das Blutgefäßsystem kann der Anteil der zu transportierenden Substanz an der intestinalen Barriere und deren systemische Verteilung im gesamten Organismus nachgewiesen werden. Dennoch ist darauf zu achten, dass diese Model- le eine hohe Variabilität aufweisen. Die Anästhesie, sowie die Wahl der Pufferlösung können bereits einen Einfluss auf die Resorption haben. Die Einstellung der Parameter wie Sauer- stoffgehalt, Verhältnis von Laktat zu Pyruvat, pH-Wert des Perfusats und der richtige Perfusi- onsdruck stellen lediglich einige Beispiele der benötigten Faktoren dar, damit solche komple- xen Modelle der richtigen Handhabung unterliegen und mit oralen in-vivo- Absorptionsstu- dien vergleichbar sind. Für Hochdurchsatztestungen können diese Modelle nicht angewandt werden und sind aus ethischen Aspekten daher lediglich in begrenztem Maße einsetzbar [STE- WARD ET AL.1997,LE FERREC ET AL.2001].
Im menschlichen Körper kann die Passage von Wirkstoffen durch die Anwendung einer spe- ziellen Ballontechnik überprüft werden (Loc-1-Gut) [LENNERNÄS 2007]. Bei dieser Technik wird der Proband lokal anästhesiert und die Substanz über einen Katheter in den Darm einge- geben. Die quantitative Bestimmung erfolgt durch Blutproben, sowie durch die Abnahme der initialen Konzentration der Substanzen über die definierte Länge eines Darmsegments.
Mithilfe dieses in-situ-Modells lassen sich gute Korrelationen zu pharmakokinetischen Stu- dien aufstellen. Das Loc-1-Gut-Modell stellt jedoch eine aufwendige und teure Methode dar, die aufgrund möglicher toxischer Nebenwirkungen nicht routinemäßig während frühen Pha- sen der Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden kann [LE FERREC ET AL.2001].
Die beschriebenen in-vitro-, in-situ- und ex-vivo-Modelle stellen eine Alternative zu in-vivo- (Tier-)Studien für die Analyse der Resorption oral zugeführter Substanzen dar.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass jedoch keines dieser Modelle allein für die Ent- wicklung und Beurteilung neuer Wirkstoffe ausreichend ist. Vielmehr ist in vorklinischen Studien eine exakte Planung und Kombination dieser Modelle notwendig, damit die Anzahl an Tierversuchen reduziert wird und bereits in diesem Stadium ein hoher Kenntnisstand über die zu testenden Substanzen für nachfolgende klinische Studien vorliegt.
1.3. Notwendigkeit alternativer Testverfahren – Reduktion von Tierversuchen Die Notwendigkeit, alternative Testsysteme zur Reduktion von Tierversuchen zu etablieren, ist nicht ausschließlich auf den Nachweis von Qualität, Unbedenklichkeit und Wirksamkeit neuer Wirkstoffe begrenzt. Die Bewertung eines potentiellen gesundheitlichen Nutzens funk- tioneller Lebensmittel (sog. „Functional Food“) kann ebenfalls auf der Anwendung tierexpe-
Einleitung
Auch die Risikoabschätzung im Umgang mit Chemikalien wird wissenschaftlich durch eine Vielzahl von Tierversuchen belegt und spätestens die Einführung der REACH-Verordnung (Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals) zeigt, dass weiterhin sinnvolle Er- satz- und Alternativmethoden für eine rückläufige Tendenz bei der Durchführung von Tier- versuchen benötigt werden. Die Testung von neuen Chemikalien aber auch von Altchemika- lien hinsichtlich ihrer Sicherheit ist die Grundlage von REACH und basiert auf dem Grund- satz der Eigenverantwortung des jeweiligen Herstellers [ALLANOU ET AL.2003]. Zwar unter- liegen die Untersuchung und Zulassung neuer Arzneimittel dem Arzneimittelgesetz und den aktuellen Arzneimittelprüfrichtlinien und folglich nicht direkt der Registrierung von REACH.
Dennoch müssen alle Substanzen, die für die Herstellung eines Wirk- und Hilfstoffes not- wendig sind, nach REACH getestet werden. Als Beispiel seien hier Prozesshilfsmittel wie Methanol zur Granulierung von Tabletten oder auch Desinfektionsmittel für die Prozessreini- gung genannt.
Die Untersuchung all dieser derzeit auf dem Markt befindlichen Substanzen erfordert somit zahlreiche in-vivo- Studien, denen ohne die Etablierung geeigneter Ersatz- und Ergänzungs- methoden weitere Millionen Versuchstiere zum Opfer fallen werden.
Obwohl in der Vergangenheit mehrfach gesichert und reproduzierbar am Tiermodell generier- te Daten auf den Menschen übertragen werden konnten und als Argument für Tierversuche häufig auf die mögliche Untersuchung von Langzeitwirkungen in einem vollständigen und komplexen biologischen System hingewiesen wird, ist die Verwendbarkeit von Tieren für die Analyse von Substanzen begrenzt [STREHLE ET AL.2008].
So lassen sich innerhalb des Tiermodells, aufgrund von speziesspezifischen Unterschieden zwischen Versuchstier und Mensch, nicht alle Nebenwirkungen der Testsubstanzen in präkli- nischen Studien analysieren. Auch die Größe der Tiere, die zumindest bei Nagern nicht mit der des Menschen übereinstimmt, hat einen erheblichen Einfluss auf die pharmako- und toxi- kokinetischen Eigenschaften der untersuchten Substanzen. Weitere unterschiedliche Parame- ter wie der pH-Wert des Darms, die Metablisierungsrate, das Alter der Tiere und die Wahl des Geschlechts sind lediglich einige Beispiele, die zeigen inwieweit die Übertragbarkeit von Tierstudien auf den Menschen beeinflusst werden kann. Außerdem wird eine Adaption von Versuchstieren an die Substanzdosis und die damit zusammenhängende (Fehl-)Interpretation der Daten häufig unterschätzt [HARTUNG 2008]. Auch wenn diese Versuche in Zukunft nicht vollständig wegzudenken sind, so ist nicht zuletzt aus ethischen und ökonomischen Gründen eine Einschränkung im Sinne des 3 R Prinzips notwendig und wünschenswert.
Das durch Russel und Burch definierte Prinzip geht grundsätzlich davon aus, dass Tierversu- che notwendig sind. Dennoch ist innerhalb jeder Versuchreihe zu überprüfen, ob sich die An- zahl der eingesetzten Tiere sinnvoll einschränken lässt (reduce) und ob über die Optimierung der Versuchsbedingungen eine geringere Belastung für das Versuchstier ermöglicht werden kann (refine). Durch die Anwendung geeigneter Alternativmethoden ist darüberhinaus zu- künftig ein vollständiger Ersatz der Tierversuche zu erzielen (replace) [LAHL 2005].
