Herstellung eines 3-dimensionalen myokardialen Gewebeäquivalents in einem perfundierten Bioreaktor-System

der Medizinischen Hochschule Hannover

Leiter: Prof. Dr. med. Axel Haverich

Herstellung eines 3-dimensionalen myokardialen

Gewebeäquivalents in einem perfundierten Bioreaktor-System

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin (Dr. med.)

in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von ANDRE LENZ aus Wolfsburg

Hannover 2007

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 23.07.2007

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer der Arbeit: Priv. Doz. Dr. med. Theodoros Kofidis Referent: Prof. Dr. med. Kai Wollert

Koreferent: Priv. Doz. Dr. med. Joachim Laas

Tag der mündlichen Prüfung: 23.07.2007

Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. med. Alexander Kapp Prof. Dr. med. Wippermann Prof. Dr. med. Stefan Kubicka

Meinen Eltern Renate und Friedrich-Wilhelm Lenz und meinem Bruder Thomas Lenz gewidmet

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis … … … … . 4

1. Einleitung… … … … ... 7

1.1. Klinische Problematik… … … .7

1.2. Experimentelle Ansätze der Transplantation von Herzmuskelzellen… … … 9

1.2.1. Verfahren der zellulären Kardiomyoplastie… … … . 9

1.2.2. Konstruktion von Gewebeersatz zur Implantation (Tissue Engineering)… … .10

1.2.3. Problematik und Grenzen des Tissue Engineering… … … 11

1.3. Problemstellung… … … ... 12

2. Material… … … … 14

2.1. Geräte… … … ... 14

2.2. Chemikalien und Biochemikalien… … … .. 15

2.3. Enzyme… … … . 15

2.4. Kulturmedien, Matrixkomponenten und Puffer… … … ... 16

2.5. Primär-Antikörper… … … 16

2.6. Sekundär-Antikörper… … … ... 16

2.7. Histologische und Immunhistochemische Reagenzien… … … . 17

2.8. Allgemeine Laborutensilien… … … 17

2.9. Materialien des Bioreaktors… … … ... 18

2.10. Versuchstiere… … … . 18

3. Methoden… … … … 19

3.1. Kleintiermodell: Ratte… … … . 19

3.1.1. Explantation von neonatalen Rattenherzen… … … 19

3.1.2. Isolation der Kardiomyozyten aus neonatalen Rattenherzen… … … ... 19

3.1.3. Explantation der Aorta aus der adulten Ratte… … … . 22

3.1.4. Der Bioreaktor… … … .. 22

3.1.5. Konstruktion des Bioreaktors im Kleintiermodell… … … 27

3.1.6. Bestücken des Bioreaktors mit Matrix und Zellen… … … .. 28 3.1.7. Fluor–18–Fluordesoxyglukose–Positronen–Emissions–Tomographie

( F–FDG–PET)… … … .. 29

3.1.8. LIVE/DEAD – Färbung… … … 30

3.2. Großtiermodell: Schwein… … … 31

3.2.1. Entnahme des Herzens bei einem neonatalen Schwein… … … ... 31

3.2.2. Verdau des neonatalen Herzens zur Gewinnung von porzinen neonatalen Kardiomyozyten… … … ... 34

3.2.3. Isolation der Endothelzellen… … … ... 38

3.2.4. Passagierung der Endothelzellen… … … . 38

3.2.5. Präparation der A. carotis interna aus dem neonatalen Schwein… … … 39

3.2.6. Konstruktion des Bioreaktors… … … . 39

3.2.7. Vorversuch zur Ermittlung der geeigneten Matrixkomposition… … … . 40

3.2.8. Untersuchung zur Festlegung der Matrixkomposition im Großtiermodell… .. 42

3.2.9. Erstellung des Gewebekonstrukts im Bioreaktor… … … 43

3.2.10. Inbetriebnahme der Kammer… … … ... 43

3.2.11. Ermittlung der Druckverhältnisse im Perfusionssystem während der Kultivierung… … … . 44

3.2.12. Messung von Stoffwechsel- und Gasparametern während der Kultivierung… … … . 44

3.2.13. Verarbeitung des Konstrukts nach der Kultivierung… … … . 45

3.2.14. Immunhistologie… … … . 45

3.2.15. Pentachromfärbung nach Movat… … … . 47

3.2.16. Hämalaun & Eosin- Färbung… … … 47

3.2.17. Computerunterstützte Dokumentation und statistische Auswertung… .… … 47

4. Ergebnisse … … … … .. 49

4.1. Ergebnisse der Zellisolation porziner Kardiomyozyten… … … ... 49

4.2. Matrix-Vorversuch zur Ermittlung der geeigneten Matrixkomposition… … … … 52

4.3. Aufbau und Funktion des Bioreaktors… … … . 52

4.4. Flußeigenschaften innerhalb des zentralen Gefäßes… … … 55

4.5. Aufbau des Gewebekonstrukts… .… … … 57

4.6. Histologische Aufarbeitung… … … .. 58

4.7. Zellinteraktionen mit der Matrix… … … . 60

4.8. Nachweis vitaler Zellen innerhalb des Kardiomyozyten–Konstrukts mittels ¹⁸F – FDG – PET… … … 60

4.9. Vitalitätsnachweis mittels LIVE/DEAD Färbung… … … 63

4.10. Nachweis eines aktiven zellulären Stoffwechsels im Konstrukt… … … 64

4.11. Konstruktion der Ko-Kultur… … … .. 66

4.12. Nachweis von Vitalität in der Ko-Kultur… … … . 67

5. Diskussion… … … … ... 70

5.1. Stellenwert von Bioreaktoren im Bereich des Tissue Engineerings… … … … ... 70

5.2. Auswahl der Zellart zur Konstruktion des künstlichen Herzgewebes… … … … . 72

5.3. Rolle der Matrix im Bereich der Gewebekonstruktion… … … ... 74

5.4. Versorgung des Konstrukts mit Nährstoffen… … … ... 76

5.5. Induktion von Prozessen der Neoangiogenese… … … . 77

6. Zusammenfassung … … … … 80

7. Literaturverzeichnis… … … … 81

8. Anhang… … … … 88

Veröffentlichung von Teilergebnissen… … … . 88

Lebenslauf… … … 90

Danksagung… … … . 92

Erklärung… … … ...93

1. Einleitung

1.1. Klinische Problematik

Unter dem Begriff der Herzinsuffizienz versteht man die Unfähigkeit des Herzens, die verschiedenen Organe im Körper ausreichend mit Blut zu versorgen, was in einem Sauerstoffdefizit resultiert. Klinisch äußert sich dies z.B. in Form von Dyspnoe oder mangelnder körperlicher Belastbarkeit [1]. Sowohl kardiale als auch extrakardiale Ursachen kommen hierfür in Frage. Die häufigsten Ursachen sind die koronare Herzkrankheit (KHK) und die arterielle Hypertonie, wobei die jährliche Inzidenz mit dem Alter stetig zunimmt. Die Prävalenz ist ebenfalls altersabhängig und liegt bei Pat. über 65 Jahre bei ca. 2-5% [1].

Die momentanen Behandlungsmöglichkeiten der chronischen Herzinsuffizienz bestehen in der medikamentösen Regulierung der Hämodynamik. Zur Anwendung kommen Nachlastsenker, wie die ACE-Hemmer [2] und die AT1-Blocker, welche den peripheren Gefäßwiderstand senken und somit dem Herz das Auswerfen des Blutes in die Peripherie erleichtern, darüber hinaus β-Blocker [3] und Diuretika [4, 5]. Um die Pumpleistung des Herzens zu verbessern und Symptome zu lindern, ist in besonderen Fällen die Gabe von positiv inotropen Substanzen, in Form von Herzglykosiden, indiziert [5]. Dies führt zu einer Erhöhung der Auswurfleistung des Herzens durch intrazelluläre Calciumanreicherung und zu einer Senkung des enddiastolischen Volumens und des ventrikulären Füllungsdrucks. Jedoch wird die Mortalität durch die Herzglykoside im Gegensatz zu den vorher genannten Medikamenten nicht gesenkt.

Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz können neben der medikamentösen Therapie die Prognose durch zusätzliche körperliche Schonung, Reduktion von Übergewicht, Flüssigkeitsrestriktion, Kochsalzbeschränkung und das Ausschalten von Risikofaktoren (Aufgabe des Rauchens!) günstig beeinflussen [6].

Derzeitige chirurgische Ersatzverfahren bei terminaler Herzinsuffizienz sind spezielle herzunterstützende Systeme (ventricular assist devices) [7] und die Herztransplantation. Die Systeme reichen von intraaortalen Ballonpumpen über biventrikuläre extrakorporale Blutpumpen bis zu voll implantierbaren Pumpen. Sie

eignen sich sowohl zur Erholung des Herzens infolge akuter oder chronischer Herzinsuffizienz als auch zur Zeitüberbrückung bis zur Herztransplantation [8].

Dieses „Bridging“ bis zur Transplantation bei Patienten, dessen Kreislauf nicht bis dahin aufrechterhalten werden kann und bei denen ein ischämisches Multiorganversagen droht, erweist sich als vorteilhaft im Bezug auf das spätere Überleben [9]. Kunstherzen sind synthetisch hergestellte Pumpen, welche mechanisch das Blut durch den Körper pumpen. Die Nachteile dieser Systeme sind die hohen Raten von Blutungs- und Infektionskomplikationen sowie Thrombembolien [10].

Trotz der modernen therapeutischen Möglichkeiten kann jedoch der Umbau des Herzens, das Remodeling, nicht verhindert werden, da der Verlust von funktionalem Herzmuskel nach wie vor vorliegt. Die Herzmuskelzellen des Erwachsenen befinden sich in einem Stadium, in dem sie nicht proliferieren können [11, 12]. Eine „Restitutio ad Integrum“ des Herzmuskels findet nicht statt. Eine kausale Therapie, die die Wiederherstellung des insuffizienten Myokards gewährleistet, ist zurzeit leider noch nicht möglich.

Das effizientere Konzept stellt die Herztransplantation dar. Die Hauptindikation zur Herztransplantation stellt heutzutage die terminale Herzinsuffizienz auf dem Boden einer dilatativen Kardiomyopathie dar, gefolgt von der ischämischen Kardiomyopathie durch die koronare Herzkrankheit.

Heutzutage wird die orthotope Herztransplantation durchgeführt [13]. Hierbei wird das kranke Herz unter Einsatz der extrakorporalen Zirkulation entfernt und das Spenderherz an derselben Stelle implantiert [14]. Zur Vorbeugung der Transplantatabstoßung ist die Einnahme von Immunsuppressiva unerlässlich [15].

Das Auftreten einer Transplantatvaskulopathie stellt mit einer Inzidenz von 50%

innerhalb der ersten 5 Jahre nach Transplantation heutzutage immer noch die häufigste Todesursache transplantierter Patienten dar [16]. Die perioperative Mortalität dieses Verfahrens liegt bei < 10%. Die 1-Jahr-Überlebensrate beträgt ca.

80%, die 5-Jahres-Überlebensrate immerhin noch 60-70% [17]. 90% der Patienten gelangen nach der Transplantation in die NYHA – Klasse I zurück [18].

1.2. Experimentelle Ansätze der Transplantation von Herzmuskelzellen

1.2.1. Verfahren der zellulären Kardiomyoplastie

Neben den bereits in der Klinik angewandten Verfahren zur Therapie der terminalen Herzinsuffizienz existieren experimentelle Ansätze der Myokardrestauration. Der Hauptansatz besteht darin, kultivierte Zellen in das durch Infarkt geschädigte Herzgewebe zu bringen und damit die kontraktile Funktion zu verbessern bzw.

wiederherzustellen [19, 20]. Das Einbringen von Stammzellen oder muskulärer Vorläuferzellen in das geschädigte Myokard gelingt über einen Koronarkatheter oder durch direkte Injektion in den Herzmuskel. Im Tiermodell wurden bereits autologe [21] sowie allogene Herzmuskelzellen [22], skeletale Myoblasten [23] und glatte Muskelzellen [24], embryonale und mesenchymale Stammzellen transplantiert. Eine Reihe von Tierversuchsstudien haben nach Zelltransplantation eine signifikante Verbesserung der Herzfunktion nachweisen können.

Im Tierexperiment unternahmen Li RK et al Versuche, Knochenmarkstammzellen in ein infarziertes Schweineherz zu injizieren [25]. Die zuvor radioaktiv markierten Stammzellen ließen sich nach 4 Wochen vermehrt innerhalb des infarzierten Areals des Herzens nachweisen. Die Zellen beinhalteten kontraktile Elemente und es fanden sich herzspezifische Oberflächenmarker, was auf Herzmuskelzellen schließen lässt. Darüber hinaus bildeten sie untereinander gap junctions aus, die der Signalübertragung zwischen den Zellen dienen. Innerhalb des infarzierten Bereichs ließ sich eine vermehrte Vaskularisierung darstellen. Insgesamt wurde eine leicht verbesserte Herzfunktion nachgewiesen, was sich in einer besseren Wandbeweglichkeit des infarzierten Ventrikels und einer geringgradig höheren Auswurffraktion darstellte. Der linke Ventrikel erschien darüber hinaus weniger dilatiert in Gegensatz zur Kontrollgruppe. Atkins et al unternahmen den Versuch, Skelettmuskel-Myoblasten in das Infarktgebiet einzubringen und dessen Auswirkungen auf die links-ventrikuläre Funktion zu untersuchen [26]. Die Versuche ergaben nur teilweise eine Verbesserung der ventrikulären Funktion, vor allem in der Diastole.

Scorsin et al [27] erstellten eine Studie im Tierexperiment, in welcher die Implantation von fetalen Kardiomyozyten und skeletalen Myoblasten unternommen wurde. Beide Zellarten bewirkten eine Verbesserung der links-ventrikulären Auswurffraktion nach

einem Zeitraum von einem Monat, wohingegen sie sich in der Kontrollgruppe über die Zeit hin verschlechterte. Das links-ventrikuläre end-diastolische Volumen nahm parallel zu der verbesserten Auswurffraktion ab, verglichen mit der Kontrollgruppe.

Klug MG et al differenzierten Kardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen und transferierten sie in den linken Ventrikel von Mäusen [28]. Die transferierten Zellen konnten auch hier anhand von immunhistochemischen Färbemethoden und dem Nachweis von Myofibrillen im Phasen-Kontrast-Mikroskop dargestellt werden.

1.2.2. Konstruktion von Gewebe zur intramyokardialen Implantation (Tissue Engineering)

Neben den oben genannten Verfahren beschreibt ein chirurgischer Ansatz die Herstellung und Implantation von künstlichem Herzmuskelgewebe in Form von Zellen und einem geeigneten Trägermaterial in einem Kultursystem. Das gezüchtete Gewebe soll dann anstelle von infarziertem Myokard implantiert werden und somit seine Funktion aufnehmen. Diverse Modelle wurden bereits im Tierexperiment generiert. Eschenhagen et al stellten ein künstliches Herzmuskelgewebe her, welches aus Herzmuskelzellen aus der Ratte, eingebettet in eine Trägersubstanz aus Matrigel™ und Kollagen Typ 1, bestand [29]. Nach ca. 2 Tagen begann das Gewebe, spontan zu kontrahieren, was über 18 Tage anhielt. Histologisch wies das Konstrukt eine longitudinale Anordnung der Herzmuskelzellen, ähnlich dem nativen Myokard, auf. Kofidis et al stellten ebenfalls ein künstliches Herzmuskelgewebe her, welches im Rattenmodell in vitro nach 3 Tagen zu kontrahieren begann und eine homogene Distribution von Zellen aufwies. Dieses sogenannte AMT (Artificial Myocardial Tissue) besteht aus einer Trägersubstanz aus bovinem Kollagen Typ 1 in Form eines Schwammes (Fleece), welches in der Klinik bereits zur chirurgischen Blutstillung eingesetzt wird. Dieses Fleece wurde mit neonatalen Herzmuskelzellen aus der Ratte besiedelt. Spontane Kontraktionen der Konstrukte wurden über einen Zeitraum von 12 Wochen beschrieben. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die Kontraktionskraft mit der Erhöhung der Vordehnung (Vorlast), gemäß dem Frank-Starling-Mechanismus, zunimmt. Des Weiteren wurde das Gewebe wie eine Art Flicken in einer Größe von 20 x 15 x 2,5 mm konstruiert und im Rahmen einer Pilotstudie im Großtiermodell (rechts-ventrikuläre Wand) implantiert [30].

Bei beiden o.g. Gewebekonstrukten ließ sich in-vitro die Kontraktilität durch eine Erhöhung der Calcium-Konzentration oder durch die Zugabe von Katecholaminen in Form einer β-adrenergen Stimulation verstärken. Die Entwicklung dieser beiden künstlich hergestellten Gewebe könnte in Zukunft dazu beitragen, die Ventrikelfunktion bei Herzinsuffizienz zu verbessern. Li RK et al haben ein 10 x 10 x 4 mm großes Gewebe aus fetalen Herzmuskelzellen aus der Ratte und einer Gelatine-Trägersubstanz generiert. Auch hier gelang die Kultivierung der Zellen auf der Trägersubstanz über einen längeren Zeitraum. Eine Implantation des Gewebekonstrukts an das Herz einer adulten Ratte zeigte eine leichte, jedoch nicht signifikante Verbesserung der Herzfunktion [31].

1.2.3. Problematik und Grenzen des Tissue Engineering

Ein grundlegendes Problem der Gewebekonstruktion ist, dass die Zellen nur jeweils die oberen Schichten der Matrix von ca. 300 bis 500 µm besiedeln [32]. Zellen, welche über diese Strecke hinaus, im Inneren des Konstrukts angesiedelt werden, sterben nach wenigen Tagen bis Wochen ab. Histologisch werden nur noch Reste von degenerierten Zellen beobachtet. Der Grund hierfür liegt in der hohen Empfindlichkeit der Kardiomyozyten gegenüber Hypoxie. An der Oberfläche besteht bei statischen Kulturbedingungen die beste Versorgung der Zellen mit Sauerstoff und Nährstoffen. Eine Versorgung von Zellen, die weiter in der Tiefe liegen, ist ungenügend und die Zellen sterben ab. Man erhält somit ein Gewebekonstrukt, welches eine bestimmte Dicke nicht überschreiten kann, da der Transport von Nährstoffen und Sauerstoff in die Tiefe durch passive Diffusion nicht möglich ist [33].

Ebenso würde ein Übereinanderlegen von mehreren Konstrukten das Absterben der tiefer gelegenen Schichten zur Folge haben. Die Diffusionsstrecke für die essentiellen Nährstoffe und Gase ist zu lang, bzw. deren Konzentration/O₂- Partialdruck in der Tiefe so schwach, dass die Zellen unzureichend versorgt werden.

Darüber hinaus kumulieren Stoffwechselendprodukte, welche nicht abtransportiert werden können, und welche sich für die Zellen toxisch auswirken.

Was jedoch benötigt wird, ist ein Herzmuskelersatz, der die komplette Dicke des ventrikulären Myokards ausfüllt, da bei der Herzinsuffizienz die gesamte Wand des Herzens betroffen ist. Eine funktionell relevante Kontraktion ließe sich mit einer

dünnen Schicht Herzmuskelgewebe, wie es die vorher genannten Konstrukte aufweisen, im menschlichen Herz nicht aufbauen.

Um dieses Defizit zu umgehen, ist eine Versorgung der Zellen über Blutgefäße notwendig. Somit könnten auch die in tieferen Schichten liegenden Zellen ausreichend mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt werden, wie in nativen Geweben. Hiermit ließe sich ein Konstrukt entwickeln, welches in seiner gesamten Dicke Herzmuskelzellen beinhalten würde, und im Falle einer Implantation eine für die Verbesserung der Herzfunktion ausreichende Kontraktilität aufweisen könnte.

Um ein 3-dimensionales Gewebe mit Zellen ausreichend mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgen zu können, müßte es gelingen, Gefäßneubildung zu induzieren oder zumindest die Diffusionsstrecke zu vermindern. So könnten die langen Diffusionswege überbrückt werden und langfristig ein vitales und funktionelles Gewebe hergestellt werden.

1.3. Problemstellung

In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurde der Versuch unternommen, ein kardiales Gewebekonstrukt zu entwickeln, welches für den Implantationsversuch anstelle eines infarzierten Herzmuskelgewebes vorerst im Tiermodell gedacht ist.

Dieses Konstrukt sollte ein zentrales natives Blutgefäß beinhalten, welches über End-zu-End-Anastomose an das koronare Gefäßsystem angeschlossen werden kann und somit eine Verbesserung der Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff resultiert. Darüber hinaus sollte eine 3-dimensionale Besiedlung erreicht werden, in einer Größenordnung, die ungefähr der Stärke der Herzmuskelwand des linken Ventrikels entspricht. Hierfür musste eigens ein Bioreaktor entwickelt werden, welcher das Gewebe aufnehmen und mittels pulsatiler Perfusion versorgen kann.

Zunächst sollten die Herstellung und die Kulturbedingungen des Gewebekonstrukts optimiert, anschließend der Übergang vom Kleintier- in das Großtiermodell umgesetzt werden. Der Hauptteil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Konstruktion des kardialen Ersatzgewebes im porzinen Großtiermodell, dem Nachweis von vitalen Zellen über einen gewissen Zeitraum sowie die Ko-Kultivierung verschiedener Zellen im Konstrukt.

Die hierfür verwendeten Zellen mussten in ausreichender Menge gewonnen werden, um eine 3-dimensionale Besiedlung in vollem Umfang zu gewährleisten.

Da das Gewebekonstrukt im Falle einer späteren Implantation funktionsfähig sein soll und sich am Kontraktionsvorgang des Herzens beteiligen muss, war der Nachweis von vitalen Zellen notwendig. Für den Nachweis von Vitalität wurden verschiedene Methoden verwendet, erstmals auch ein Verfahren, welches in der Klinik u.a. zur nuklearmedizinischen Untersuchung von Durchblutungsstörungen des Herzens dient, die Methode des ¹⁸F-FDG-PET (Fluor-18-Fluor-Desoxy-Glukose-Positronen- Emissions-Tomographie) [34]. Hierbei wird radioaktiv markierte Glukose verwendet, welche über die Perfusionslösung von den Zellen aufgenommen wird und anschließend im PET durch Positronenemission detektiert werden kann.

Entsprechend würden sich minderdurchblutete Areale durch eine Signalabschwächung bemerkbar machen [35]. Um die Vitalität der Zellen im Konstrukt zu verifizieren, musste darüber hinaus laborchemisch Stoffwechselaktivität nachgewiesen werden.

Das langfristige Ziel ist es, das Herzmuskelgewebe anstelle eines Narbengewebes, z.B. entstanden durch Myokardinfarkt, in den linken Ventrikel zu implantieren und das Konstrukt an das koronare Gefäßsystem anzuschließen. Das Gewebekonstrukt soll dann die verminderte Kontraktionsfähigkeit des Herzens kompensieren und die zu erwartenden Komplikationen einer progredienten Herzinsuffizienz abwenden.

2. Materialien

2.1. Geräte

Autoklaviergerät Fritz Gössner

Cryotom Microm HM 500 OM

Cytospot-Zentrifuge Shandon Cytospin 2

Digitalfotoapparat Olympus

Elektrokoagulation Dräger

Feinwaage Sartorius

Gefrierschrank (-20 Grad) Liebherr

Gefrierschrank (-80 Grad) GFL

Grobwaage Sartorius

Heraeus BBD 6220

Inkubator Sanyo

Kendro Multifuge 3 S-R

Kühlschrank Liebherr

Kulturmikroskop Zeiss

Magnetrührgerät IKA Labortechnik

Neubauer-Zählkammer Marienfeld

pH-Meter WTW

Pipett-Boy Hirschmann Laborgeräte

Pipetten Eppendorf

Positronen Emissions Tomograph Siemens ECAT Exact

Rollpumpe Ismatec

Schüttler IKA Labortechnik

Sterile Werkbank Heraeus

Wasserbad GFL

Wasserschüttelbad GFL

Zellmikroskop Zeiss

Zentrifuge Heraeus Megafuge 2.0 R

2.2. Chemikalien und Biochemikalien

Aceton J.T. Baker

Bovines Serumalbumin (BSA) Sigma

BRDU Sigma

Calciumchlorid (CaCl2) Merck

Dextrose Merck

Ethanol J.T. Baker

Ether J.T. Baker

Fibronectin Sigma

HEPES Sigma

Kaliumchlorid (KCl) Sigma

Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄) Merck Magnesiumsulfat (MgSO4 x 7 H2O) Merck

Natriumchlorid (NaCl) Roth

Natriumdihydrogenphosphat (Na₂HPO₄ x 7 H₂O) Merck

Natriumhydroxid (NaOH) Merck

Propofol Sigma

Tris Base Merck

(Tris-hydroxymethyl-amino-methan)

Tris HCl Merck

(Tris-hydroxymethyl-amino-methan-hydrochlorid)

Trypan-Blau PAA

Wasserstoffperoxid (H₂O₂) Sigma

Xylol J.T. Baker

2.3. Enzyme

Desoxyribonuklease (DNase) II Sigma

Kollagenase A Roche

Kollagenase Typ II Worthington

Trypsin EDTA PAA

Trypsin Life Technologies

2.4. Kulturmedien, Matrixkomponenten und Puffer

Braunol – Lösung Braun

BRDU Sigma

Chick-Embryo-Extrakt Life Technologies

Custodiol Dr. Franz Köhler Chemie

DMEM Medium Life Technologies

EGM-2 Medium Cambrex

Extrazelluläre Matrix (Matrigel™ ) Tebu

FCS Life Technologies

Fibrinogen Baxter

Gelatine Sigma

Histoacryl-Kleber Braun

Horse Serum Life Technologies

Kollagen Typ I Upstate Biotechnology

M199 Medium Life Technologies

MEM Medium Life Technologies

PBS (Phosphate Buffered Saline) Sigma

Penicillin / Streptomycin (P/S) Biochrom AG

2.5. Primär-Antikörper

Anti-mouse IgG1-Antikörper Dako

Anti-mouse IgG2-Antikörper Dako

CD 31 Dako

MF-20 Überstand

Troponin T Sigma

2.6. Sekundär-Antikörper

Horse-anti-mouse-Antikörper Dianova

2.7. Histologische und Immunhistochemische Reagenzien

Avidin-POD-Komplex Vector Industries

Corbit-Balsam Hecht

DAB Dako

Eosin Merck

Fettstift Dako

Harris Hämatoxyllin Merck

Live/Dead Assay Molecular Probes

Mayer´s Hämalaun Merck

MitoTracker Dye Molecular Probes

Pentachromreagenzien

- Alcianblau Sigma

- Ammoniumhydroxyd Sigma

- Brilliant Crocein Chroma

- Phosphowolframsäure Merck

- Saffron du Gatinnais Chroma

- Säurefuchsin Chroma

TissuTek Sakura Finetek

2.8. Allgemeine Laborutensilien

Chamber-Slides Sigma

Falcon-Röhrchen Greiner

Kulturflaschen Greine

Latex Handschuhe Kimberly Clark

Petrischalen Greiner

Spritzen Braun

Sterile Handschuhe Regent Biogel

Steriles Abdecktuch Klinidrape

Zellfilter (groß) Sartorius

Zellfilter (klein) Sartorius

2.9. Materialien des Bioreaktors

3-Wege-Hähne Braun

Applikationskappe MHH-Forschungswerkstatt

Bioreaktor MHH-Forschungswerkstatt

Braunüle (20 G) Braun

Luer-Lock-Anschlüsse männlich/weiblich NeoLab

Luftfilter Sartorius

Medium-Reservoirflasche Schott Duran

Nahtmaterial Mersilene 2/0 Ethicon

Nahtmaterial Prolene 5/0 Ethicon

OP-Besteck Aesculap

- Nadelhalter - Pinzette spitz - Pinzette stumpf - Schere groß - Schere klein

Pumpenschlauch Ismatec

Seldinger Nadeln (abgeschliffen) Braun

Silikonmembran MHH-Forschungswerkstatt

Silikonschlauch Landgraff

2.10. Versuchstiere

Deutsches Hausschwein FAL Mariensee

Wistar Ratten Tierlabor MHH

3. Methoden

3.1. Kleintiermodell: Ratte

3.1.1. Explantation von neonatalen Rattenherzen

Alle in dieser Dissertation beschriebenen Tierversuche wurden gemäß dem Antrag auf Genehmigung eines Tierversuchsvorhabens durchgeführt.

Präparation der Herzen aus neonatalen Ratten (1-3 Tage alt):

Materialien:

- 1 anatomische Pinzette - 1 Schere

- 200ml Flasche mit sterilem, 4°C kaltem PBS - ca. 60-90 neonatale Ratten

Die neonatalen Ratten wurden durch Dekapitation getötet und der Thorax mit der Schere vom Hals aus nach kaudal eröffnet. Durch leichten Druck mit der gespreizten Pinzette auf die Ränder der Thoraxöffnung trat das Herz hervor. Mit einem Schnitt an der Herzbasis wurde das Herz entnommen und in die Flasche mit 4°C kaltem PBS überführt. Die getöteten Tiere wurden ordnungsgemäß entsorgt.

3.1.2. Isolation der Kardiomyozyten aus neonatelen Rattenherzen

Herstellung der Verdaulösungen:

Trypsin – Verdaulösung: 150 mL - 1,5 mL P/S

- 4,5 mL Trypsin – Stammlsg.

- 1,5 mL DNase – Stammlsg.

ad 142,5 mL CBFHH – Lösung in eine sterile 200 mL Flasche

DNase – Verdaulösung: 100 mL - 1,0 mL P/S

- 3,4 mL FCS (hitze – inaktiviert) - 1,0 mL DNase – Stammlsg.

- ad 94,6 mL CBFHH – Lösung in eine sterile 200 mL Flasche

Sammelröhrchen: 7x

- 2,5 mL FCS (hitze – inaktiviert) in einem 50 mL Falconröhrchen vorlegen

Kardiomyozyten-Medium:

- 1 Flasche MEM Medium - 55 mL FCS (hitze-inaktiviert) - 5,6 mL Penicillin/Streptomycin - 5,6 mL BRDU

Ansetzen der gebrauchsfertigen CBFHH – Lösung (1 Liter) aus Stammlösungen:

- 810,0 mL H2O destilliert, steril (ELGA) - 40,0 mL NaCl – Stammlsg.

- 10,0 mL KCl – Stammlsg.

- 10,0 mL Magnesiumsulfat – Stammlsg.

- 10,0 mL Kalium – Dihydrogenphosphat – Stammlsg.

- 10,0 mL Di – Natriumhydrogenphosphat – Stammlsg - 10,0 mL Dextrose – Stammlsg.

- 100,0 mL HEPES – Stammlsg.

Zu Beginn wurden die neonatalen Herzen in der Flasche zweimal mit PBS gespült und in eine Petri-Schale überführt. Dort wurden die Herzen ein weiteres Mal mit PBS gespült. Hierbei wurde darauf geachtet, unbrauchbares Material (geronnenes Blut, Lungengewebe) mit zu entfernen. Das PBS wurde abgesaugt und es konnte mit der mechanischen Zerkleinerung der Herzen in der Petri-Schale mittels einer Schere begonnen werden. Die Zerkleinerung des Myokards erfolgte soweit, bis eine homogene Masse erreicht wurde mit einer Stückgröße von maximal 1-2 mm. Die zerkleinerte Masse wurde nun mit CBFHH in einer 25ml Pipette aufgenommen und in ein 50 ml Falcon-Röhrchen gefüllt. Die Petri-Schale wurde einmal mit CBFHH gespült, um alle Bestandteile aufzunehmen. Nach ein paar Minuten setzten sich die festen Bestandteile ab, und der Überstand konnte abgenommen und verworfen werden.

Zunächst wurde die Gewebemasse mit 15 ml Trypsin-Lösung vorverdaut. Dies geschah auf einem Schüttler bei 4°C für 20 min.

Die Gewebemasse in dem Falcon-Röhrchen wurde nun in 7 Schritten verdaut (Tabelle 1), begonnen mit der Trypsin-Lösung, die in das Falcon-Röhrchen mit der Gewebemasse gefüllt wurde. Das Ganze wurde bei 37°C in einem Schüttelbad für 7 min. verdaut. Anschließend nahm man das Röhrchen heraus und ließ es für kurze Zeit ruhen, damit die festen Bestandteile sich absetzen konnten. Daraufhin wurde der Überstand abgenommen und in das vorbereitete Falcon-Röhrchen mit FBS gefüllt.

Das FBS blockierte hierbei das Trypsin, und der Verdau-Vorgang wurde an dieser Stelle gestoppt.

Als zweiter Schritt wurde in das Röhrchen mit der Gewebemasse DNase-Lösung gefüllt und mit einer 25 ml Pipette ca. 30x gut durchmischen. Dann wurde wieder gewartet, bis sich die festen Bestandteile absetzen. Daraufhin wurde der Überstand entnommen und dem Röhrchen mit FBS und Trypsin-Überstand zugeführt. Dieses Röhrchen enthielt nun den Überstand mit den Zellen, die bei diesem ersten Verdau- Vorgang herausgelöst wurden. Hinzu wurde 5 ml Kardiomyozytenmedium gegeben und das Falcon-Röhrchen wurde bei 4°C auf einem Schüttler bis zur weiteren Verwendung gelagert. Der Verdau-Vorgang wurde nach gleichem Schema weitergeführt, jedoch mit Anpassung der Mengen an Verdau-Lösungen (Trypsin, DNase) an die jeweils vorhandene Gewebemenge (siehe Tabelle 1).

Verdau- Schritt

Trypsin

DNase

1. 15 ml 14 ml

2. 14,5 ml 13,5 ml

3. 14 ml 13 ml

4. 13,5 ml 12,5 ml

5. 13 ml 12 ml

6. 12,5 ml 11,5 ml

7. 12 ml 11 ml

Tabelle 1: Mengenanpassung der unterschiedlichen Verdauschritte

In jedem nachfolgenden Verdau-Schritt wurde die Menge an Enzymlösung jeweils um 0,5 ml reduziert, um die Verdau-Lösung ungefähr der Gewebe-Menge anzupassen.

3.1.3. Explantation der Aorta aus der adulten Ratte

Vor der Entnahme der Aorta wurde die Ratte in einer Glasglocke mit einer Überdosis Ether getötet. Nachdem die Atmung für länger als 5 Minuten ausgesetzt hatte, wurde die Ratte entnommen und mit einer Haarschneidemaschine an der Unterseite geschoren. Die tote Ratte wurde dann mit Klebeband und Nadeln auf einer Korkplatte an dessen Extremitäten befestigt. Thorax und Abdomen wurden mit Braunol abgewaschen. Anschließend erfolgte der Längsschnitt mit dem Skalpell median entlang des Sternums bis zur Mitte des Abdomens. Mit einer Schere wurde die Bauchdecke und der Thorax eröffnet und die Aorta mit Hilfe von Pinzetten stumpf freipräpariert und dargestellt. Die Interkostalarterien wurden mittels Elektrokoagulation verschlossen und anschließed abgetrennt. Die Aorta wurde vom distalen Aortenbogen bis kurz unter dem Zwerchfell mit einer Schere entnommen und mit PBS durchgespült. Abschließend wurde die Aorta in eine 4°C kalte PBS – Lösung in eine sterile Flasche gelegt und so ins Labor transportiert. Die tote Ratte wurde artgerecht entsorgt.

3.1.4. Der Bioreaktor

Der für diesen Versuch konstruierte Bioreaktor besteht aus 4 parallel zueinander angeordneten Kammern mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Tiefe von 1 cm.

Die Kammern bestehen aus durchsichtigem Plexiglas, welche durch eine Deckplatte, verschlossen werden kann. An den jeweils gegenüberliegenden Seiten der Kammern sitzen zwei Zugänge, welche der Zu- und Abführung von Medium dienen. Eingebettet ist das Kammersystem in einem Rahmen aus hitzebeständigem Kunststoff, welches die Deckplatte durch Zugschrauben auf die Kammerplatte presst.

Kammerplatte:

Abb.1: Grundplatte des Bioreaktors mit 4 parallel angeordneten Kammern

34 mm

10 mm 28 mm

135 mm

20 mm

Rahmen:

A:

Abb.2: Rahmen: (A): Untere und Obere Platte, (B): Seitenansicht Untere Platte

Der Rahmen dient der Befestigung der Deckplatte auf der Kammerplatte. Er ist aus hitzebeständigem Kunststoff gefertigt und hält mehrfachen Autoklavierprozessen stand.

49 mm 25 mm

12 mm 7 mm

124 mm 138 mm

6 mm Ø 5 mm

Schraube: 4,8 x 36

Untere Platte

Obere Platte

B:

Deckplatte:

A:

Abb.3: Deckplatte: (A): Draufsicht, (B): Seitenansicht

Die Deckplatte besteht aus Glas. Aufgesetzt sind insgesamt vier Applikationsvorrichtungen mit je einer Silikonmembran. Diese Vorrichtungen kommen bei der Montage des Bioreaktors direkt über den Kammern zum Liegen. Sie dienen der jeweiligen Kammer zur direkten Injektion oder Entnahme von Stoffen.

Für die Montage des Bioreaktors wird die Kammerplatte in die untere Platte zwischen die Schrauben eingelegt und die Kammern mit der Deckplatte verschlossen. Auf die Deckplatte wird die obere Platte durch die Schrauben der unteren Platte geführt und mit den Muttern fest verschraubt.

135 mm

28 mm

B:

Bioreaktor:

A:

B:

Abb.4: Bioreaktor: (A): Seitenansicht, (B): Draufsicht

138 mm

49 mm 138 mm

39 mm

29 mm

3.1.5. Konstruktion des Bioreaktors im Kleintiermodell

Materialien für 4 Kammern eines Bioreaktors:

- 1 Bioreaktor (autoklaviert), - steriles Tuch

- sterile OP-Handschuhe - 8 Braunülen 20 G (rosa)

- 4 abgeschliffene Seldinger-Nadeln - 1 Prolene 5/0 Nahtmaterial (steril)

- steriles Besteck: Nadelhalter, Pinzette, Schere - 5ml Spritze

- Histoacryl-Kleber - 4 Aorten aus der Ratte

Zum sterilen Arbeiten unter der Flow wurden zunächst die sterilen OP-Handschuhe angezogen. Das weitere Material wurde von einer zweiten Person steril angereicht.

Zunächst wurde das sterile Tuch ausgebreitet, um den sterilen Arbeitsplatz abzugrenzen. Auf diesem Tuch wurden die oben genannten Arbeitsmaterialien steril abgelegt.

In die schwarzen Verschlußkappen wurden die Silikon-Membranen eingelegt und diese dann zusammen auf die Schraubvorrichtung der Deckplatte des Bioreaktors geschraubt. Sie dienen als Applikationsvorrichtung.

Zunächst wurden die Braunülen in die beiden, sich gegenüberliegenden, Öffnungen der Bioreaktorkammer eingeführt. Hierzu mußte der im Bioreakor verbleibende Kunststoffmandrain der Braunüle auf 1 cm verkürzt werden. Die Braunülen dienten zum Befestigen der Aorta an den jeweiligen Enden, um einen Zu- und Abfluß zu gewährleisten. Nun wurde die Aorta an beiden Enden auf die jeweiligen Braunülen aufgeschoben. Anschließend wurde eine abgeschliffene Seldinger-Nadel über eine Braunüle durch das Aortenlumen retrograd in die gegenüberliegende Braunüle vorgeschoben, um eine „innere Schienung“ zu erreichen. Somit konnte die Aorta nun nicht mehr herunterrutschen. Zuletzt wurde jeweils das Ende der Aorta, aufliegend auf den Braunülen, mit Prolene 5/0 Nahtmaterial vernäht, mit einem Doppelknoten und 3 weiteren Knoten befestigt und mit einem Tropfen Histoacryl-Kleber fixiert. Die

Durchgängigkeit des Braunülen-Aorten-Konstrukts wurde mit einer 5ml Spritze mit sterilem PBS überprüft. Um die Austrocknung der Aorta zu verhindern, wurde die Kammer des Bioreaktors mit sterilem PBS befüllt.

3.1.6. Bestücken des Bioreaktors mit Matrix und Zellen

Es wurden hierfür folgende Materialien pro Kammer verwendet:

- Fibrin-Kleber (Tissucol, Baxter): 1mL - Kardiomyozyten-Suspension in Medium:

Konzentration: 1 x 10⁷ Zellen/mL; Menge: 2mL

- Injektionsbesteck bestehend aus einer Spritzenhalterung, zwei 2ml Spritzen, und einer Weiche.

Zur Verwendung der Kammer mit der eingespannten Aorta mußte zunächst das PBS wieder aus der Kammer abgenommen werden.

Die zwei 2mL Spritzen wurden jeweils mit 1mL Kardiomyozyten-Suspension gefüllt, so dass man eine Gesamtmenge von 2 x 10⁷ Zellen in die Kammer erhält. Die beiden Spritzen wurden in die Spritzenhalterung eingesetzt. Auf deren Öffnungen wurde die Weiche aufgesetzt, welche beide Öffnungen der Spritzen zusammenführt. Der Fibrin- Kleber wurde schon in derselben Vorrichtung geliefert und konnte mit einer weiteren Weiche mit dem Injektionsbesteck der Kardiomyozyten-Suspension verbunden werden. Nun konnten beide Komponenten in die Kammer, um die Aorta herum, gegossen werden.

Der Übergang vom flüssigen in den festen Zustand benötigte eine Zeit von i.d.R. 35 min. Hierbei wurde der Verschluß-Deckel des Bioreaktors auf die Kammer gelegt und das gesamte System unter der Flow belassen. Nach 35 min. wurde die Kammer verschlossen, der Deckel verschraubt und das Schlauchsystem an die Kanülen der Aorta befestigt. Jede Kammer war mit einer Mediumreservoirflasche, befüllt mit jeweils 100mL Medium, über ein Schlauchsystem verbunden. Über eine Rollpumpe wurde Medium durch die Rattenaorta befördert und das Konstrukt so mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt.

Nun konnte die Perfusion begonnen werden und der Bioreaktor mitsamt den Vorratsflaschen mit Medium in den Inkubator gestellt werden, wo 37°C Temperatur, 5% CO2, und 85% Luftfeuchtigkeit herrschten.

Eine Rollpumpe im Inkubator sorgte für einen pulsatilen Fluß im System. Die Pumpe lief auf 15% Leistung.

3.1.7. Fluor–18–Fluordesoxyglukose–Positronen–Emissions–Tomographie (¹⁸F – FDG – PET)

Zur Ermittlung der Vitalität der Zellen im Konstrukt wurde der Bioreaktor nach 7 Tagen Kulturzeit mit ¹⁸F – FDG versetzt und im Positronen – Emissions – Tomograph (PET) gemessen.

Zur Vorbereitung mußte der Bioreaktor aus dem Inkubator entnommen werden und in eine Isolierbox aus Styropor eingebaut werden. Die Perfusion wurde für den Transport gestoppt. In der Abteilung für Nuklearmedizin wurde die Box mit dem Bioreaktor in das PET positioniert. Die Mediumreservoirflaschen wurden in eine „hot chamber“ gelegt, ein Behälter, welcher das Medium erwärmte. Die Temperatur in dem Behälter wurde auf konstant 56°C eingestellt, so daß das Medium bei Austritt aus der hot chamber bis zum Erreichen des Bioreaktors eine Temperatur von ca.

37°C betrug. Die Reservoirflaschen wurden 20 cm höher positioniert im Vergleich zum Bioreaktor, um einen höheren Perfusionsdruck zu erzielen. Die Pumpenleistung wurde auf 30% erhöht. Ein Thermometer wurde auf die Oberfläche des Bioreaktors, direkt über der Kammer, plaziert. Die Perfusion wurde bis zur Betriebstemperatur von 37°C in der Box beibehalten. Zunächst wurden durch das PET die Dichteverhältnisse des Bioreaktors ermittelt, um einen Nullwert gegenüber der folgenden Messung zu erhalten. Der Bioreaktor durfte nun nicht mehr in seiner Position im PET verändert werden.

Anschließend wurde das ¹⁸F – FDG (Tracer) in die jeweiligen Kammern über die Perfusion injiziert und die PET-Messung gestartet. Diese „wash-in“– Phase wurde über 90 Minuten gemessen. Die Aktivität der Tracers betrug bei Injektion 4,37 +/- 1,27 MBq (Mega Bequerel).

Nach Ablauf der Wash-in-Zeit wurde das Kulturmedium durch 150 mL frisches Medium ausgetauscht und für weitere 90 Minuten perfundiert. In dieser wash-out-

Phase wurde das ¹⁸F – FDG, welches nicht von vitalen Zellen aufgenommen wurde, herausgewaschen.

Im Anschluß an die Messung wurden die gemessenen Signale mittels Rechner in einem 3-dimensionalen Bild rekonstruiert.

Das aus den Daten errechnete Bild enthält Informationen über die ¹⁸F-FDG- Aufnahme, nachdem der Tracer aus der Perfusion des Bioreaktors ausgewaschen wurde (wash-out-Phase).

3.1.8. LIVE/DEAD – Färbung

Mit Hilfe der LIVE/DEAD – Färbung konnte indirekt die Vitalität durch Fluoreszenzfarbstoffe an den Präparaten nachgewiesen werden. Hierzu mußte das Färbesubstrat jedoch aufgetragen werden, während die Zellen noch vital waren. Dies geschah nach Beendigung der Kulturzeit, direkt nachdem das Konstrukt aus dem Bioreaktor entnommen wurde.

Das Calcein AM ist ein Farbstoff, welcher nur von vitalen Zellen in den grün fluoreszierenden Stoff gespalten werden kann, folglich leuchten vitale Zellen grün.

Ethidium Homodimer kann bei toten Zellen die Zellmembran überwinden und mit der DNA einen rot fluoreszierenden Farbstoff bilden. Tote Zellen erscheinen im Präparat somit rot.

Zuvor wurden die Arbeitslösungen angesetzt. Calcein AM – Lösung und Ethidium Homodimer wurden aufgetaut und mit PBS (37°C) verdünnt (Calcein AM 1:1000, Ethidium Homodimer 1:8000). Beides mußte bis zur Verwendung lichtgeschützt aufbewahrt werden. Zur Färbung des Gewebekonstrukts wurde dieses nach Entnahme aus dem Bioreaktor in 6 dünne Scheiben geschnitten, jeweils immer senkrecht zum zentralen Gefäß des Konstrukts. Diese dünnen Scheiben wurden in eine 6-well-Platte gelegt und mit der Arbeitslösung versetzt, so dass sie gerade bedeckt waren. Es folgte die Inkubation bei 37 Grad Celsius in Dunkelheit für 30 Minuten. Anschließend wurde das Gewebekonstrukt dreifach mit PBS gewaschen, um das Substrat, welches nicht von den Zellen aufgenommen wurde, aus dem Konstrukt herauszuspülen.

Nun konnte das gefärbte Gewebekonstrukt zur Kryokonservierung mit TissuTek eingedeckt werden und anschließend im Kryostat in 10 µm dicke Präparate geschnitten werden.

Der Zeitfaktor war hierbei für die Qualität der Fluoreszenz entscheidend, so dass eine zügige Mikroskopierung sich anschließen sollte.

Arbeitslösung:

- 8 mL PBS

- 8 µL Calcein AM (1:1000)

- 1 µL Ethidium Homodimer (1:8000)

3.2. Großtiermodell: Schwein

3.2.1. Entnahme des Herzens bei einem neonatalen Schwein

Um Kardiomyozyten zu gewinnen, wurde hierzu das Herz eines neonatalen Schweins (Alter: 1-3 Tage) entnommen. Die hierfür notwendigen Eingriffe am Schwein wurden in einem Tierschutzantrag genehmigt. Die Schweine wurden aus der Landwirtschaftlichen Forschungsanstalt FAL Mariensee bezogen.

Das Schwein wurde am Morgen des Operationstags aus der FAL Mariensee geholt und in die Medizinische Hochschule in das Zentrale Tierlabor gebracht. Hier wurde die Operation in einem Tier-OP durchgeführt. Das Tier wurde von Pflegekräften des Tierlabors in Narkose gelegt und für die Operation vorbereitet, indem ein venöser Zugang am Ohr des Tiers gelegt wurde, um hierüber die Euthanasie durchzuführen.

Das Schwein wurde auf dem Operationstisch an den Extremitäten mit Bändern leicht fixiert, die Operationsfläche mit Braunol-Iodlösung desinfiziert und die unsterilen Bereiche um das Operationfeld herum mit Tüchern steril abgedeckt.

Nachdem die Euthanasie am Schwein durch eine Gabe von 20 mL Propofol durchgeführt wurde, konnte mit der Eröffnung des Thorax begonnen werden. Hierzu wurde mit einem Skalpell ein Hautschnitt vom Manubrium sterni bis knapp einen halben Zentimeter unterhalb des Proc. xyphoideus durchgeführt. Mit dem Finger wurde unterhalb des Proc. xyphoideus das Gewebe stumpf erweitert und im nächsten Schritt mit einer Schere eine mediane Sternotomie durchgeführt. Die Spitze

der Schere ist abgerundet, um keine Verletzungen der Thoraxorgane zu verursachen. Nach Eröffnung des Thorax wurde dieser durch einen Thorax-Spreizer offen gehalten und das Herz dargestellt, indem das Perikard und die Pleurablätter durchtrennt wurden. Bei der Eröffnung des Thorax schlug das Herz nicht mehr.

Als nächstes wurde die Aorta aufgesucht, die unterhalb der A. pulmonalis verläuft.

Aorta und A. pulmonalis wurden stumpf durch vorsichtiges Spreizen der Schere voneinander getrennt. Mit einem Overhold wurde ein Mersilene 2/0 Faden zwischen Aorta und A. pulmonalis geführt und um die Aorta gelegt und ein Knoten vorgelegt.

Nun wurde eine Stichinzision mit einem spitzen Skalpell zwischen Aortenwurzel und Aortenbogen in die Aorta ascendens gesetzt und die Knopfkanüle in die Inzision geführt. Der Knoten des Mersilene 2/0 Fadens wurde zugezogen und zusätzlich mit zwei Knoten fixiert, damit die Kanüle nicht aus der Aorta herausgleiten konnte, und um einen retrograden Fluß der Perfusionslösung zu verhindern.

Zunächst wurde Custodiol, eine ca. 4 °C kalte kardioplege Lösung, infundiert, und man sah, das die Koronargefäße von Blut reingespült wurden und das Myokard innerhalb von Sekunden abblasste. Custodiol wurde hier zur Kardioprotektion eingesetzt, um elektrischen Reizleitungsaktionen zu unterdrücken. Es wurden ca.

200 mL innerhalb von 4-6 Minuten infundiert. Um einen guten Abfluß der Perfusionslösung zu gewährleisten, wurden beide Vorhöfe des Herzens am Herzohr eingeschnitten.

Abb.5: Neonatales Herz im Thorax des Ferkels. Das Herz ist freigelegt und die Koronargefäße werden über die Aorta mit kardiopleger Lösung perfundiert (Pfeil).

In der Zwischenzeit entfernte der Operateur den linken und rechten Lungenflügel und legte das Herz soweit frei, das es nur noch an der Aorta fixiert war.

Nachdem die 200 mL Custodiol infundiert waren, wurde der Infusionsbeutel gewechselt. Jetzt wurden die Koronargefäße mit KHB-Lösung, einem 4°C kalten, kalziumfreien Puffer perfundiert. Auch hierzu wurden 200 mL in 4-6 Minuten infundiert. War dies geschehen, wurde das Herz an den großen Gefäßen abgesetzt und aus dem Thorax entnommen. Es wurde in eine sterile Glasflasche mit 100 mL KHB-Puffer gelegt und in einer Kühlbox auf Eis bei ca. 4°C transportiert.

Das tote Tier wurde artgerecht entsorgt.

3.2.2. Verdau des neonatalen Herzens zur Gewinnung von porcinen neonatalen Kardiomyozyten

Ansetzen von kalziumfreiem KHB- (Krebs-Henseleit-Bicarbonat) Puffer:

- 110 mM NaCl: 6,4 g

- 2,6 mM KCl: 0,19 g

- 1,2 mM KH2PO4: 0,16 g

- 1,2 mM MgSO4: 0,30 g

- 11 mM Glukose: 0,19 g

- 10 mM HEPES: 2,38 g

Anschließend Hinzugabe von 1000 mL H₂O, Einstellung des pH-Wertes auf 7,4 und Sterilfiltrieren der Lösung.

1.Schritt:

Nach der Entnahme des Herzens wurde dieses zur Weiterverarbeitung schnellstmöglich in das Labor befördert.

Der erste Schritt beinhaltete die Perfusion der Herzkranzgefäße mit einer 0,1%igen Kollagenase II – Lösung in einer modifizierten Langendorff Apparatur, welche die Kollagenaselösung über einen Wärmetauscher-Kreislauf auf 37°C aufheizte (siehe Abb.6). Hierbei wurde das gesamte Herzgewebe über die Koronargefäße angedaut, bis das Herz begann, leicht an Konsistenz zu verlieren und eine honiggelbe Farbe entwickelte.

Um eine gleichmäßige Verdauung des Herzens zu gewährleisten, konnten die Koronargefäße selektiv penetriert und perfundiert werden. Hierbei mußte darauf geachtet werden, dass nicht zu viel Luft in die Koronargefäße gelangte. Dies würde zu deren Okklusion führen und es würde keine Kollagenaselösung in die Peripherie gelangen.

Modifizierte Langendorff Apparatur:

Abb.6: Modifizierte Langendorff Apparatur zur Perfusion der Koronararterien des Herzens

Wasserheizgerät mit Pumpe

Pumpe O2

Aorta

Herz

Legende:

: Fluß der Kollagenaselösung

: Fluß des Wassers im Wärmetauscher Zellfilter

Der nächste Schritt beinhaltete die grobe mechanische Zerkleinerung des Herzens.

Hierfür wurden die Anteile, vorwiegend des linken und rechten Ventrikels, reseziert und von Strukturen, wie Koronargefäßen und Herzklappen getrennt.

In einer Petrischale wurden die Myokardanteile mit einer Schere über mehrere Minuten soweit zerkleinert, bis die einzelnen Gewebestücke ca. 1-2 mm³ groß waren.

Das zerkleinerte Gewebe wurde nun mit 5-10 mL KHB suspendiert und in einer 25 mL Pipette aufgenommen. In der Petrischale zurückgebliebene Gewebestücke wurden erneut mit KHB suspendiert und aufgenommen. Die Suspension wurde in ein 50 mL Falcon-Röhrchen gefüllt und zum Sedimentieren der Gewebestücke auf Eis gesetzt.

Nach wenigen Minuten konnte der Überstand mit einer 25 mL Pipette abgenommen und verworfen werden.

Es empfahl sich, für die weitere Verarbeitung des Gewebes das Volumen des zerkleinerten Materials auf 10 mL zu beschränken, da sonst das Verhältnis von Gewebe und Verdau-Lösung ungünstig wurde und sich die Gesamt-Zellausbeute später verschlechterte.

2. Schritt (Kollagenase-Verdau):

Der zweite Schritt war folgendermaßen aufgebaut:

Menge an

Kollagenase-Lösung Dauer

Verdau 1 10 mL 10 min.

Verdau 2 10 mL 10 min.

Verdau 3 10 mL 10 min.

Tabelle 2: Verdauprotokoll zur Isolation von neonatalen porcinen Kardiomyozyten

Das zerkleinerte Herzmuskelgewebe wurde in einem 50 mL Falcon-Röhrchen gefüllt und jeweils mit 10 mL Kollagenase-Verdaulösung versetzt. Das Gemisch wurde in einem Schüttelbad bei 37°C für 10 min. verdaut. Anschließend wurde der Überstand entnommen und in ein neues 50 mL Falcon – Röhrchen gefüllt, mit KHB auf 40 mL aufgefüllt und bei 4°C auf einem Schüttler gelagert. Das Verfahren wurde insgesamt

3x durchgeführt. Danach erfolgte die Zellfilterpassage der Zellsuspensionen. Es folgte anschließend die Zellzählung jedes Verdaus mittels einer Neubauer- Zählkammer.

3.Schritt:

Der nächste Schritt beinhaltete die Anhebung der Calcium-Konzentration auf physiologische Werte, da vorher ein kalziumfreier Puffer (KHB) verwendet wurde.

Dies geschah in 3 Schritten.

Kalzium-Konzentration Menge Vorgang

auf 2,5 µmol/l 100µL, 1mmol/l CaCl₂ 5 min. inkubieren auf 75 µmol/l 28 µL, 100 mmol/l CaCl2 5 min. inkubieren auf 175 µmol/l 40 µL, 100 mmol/l CaCl2 5 min. inkubieren

Tabelle 3: Protokoll zur Erhöhung der Kalziumkonzentration der Kardiomyozytensuspension

Nach diesem Arbeitsgang wurden die Zellen in Lösung bei 600 U/min. bei 4°C für 15 min. zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen mit einer 25 mL Pipette und jeweils 5 mL EGM-2 Medium gepoolt und mit Medium auf die gewünschte Konzentration gebracht. Nach dem Befüllen der Zellsuspension mit Medium hatten die Zellen die gewünschte Kalziumkonzentration erreicht. Bis zum weiteren Gebrauch der Zellen wurden diese im 50 mL Falcon – Röhrchen bei 4°C auf einem Schüttler gelagert.

Vorbereitung des Nährmediums:

EGM-2 Medium:

- 1 Flasche EBM-2 Medium (500mL)

- Supplement Kit (ausser: Cortisol, Amphotericin B/Gentamycin) - 10 mL FCS

- 5,6 mL P/S

3.2.3. Isolation der Endothelzellen

Für die Isolation von porcinen neonatalen aortalen Endothelzellen wurde die Aorta descendens des neonatalen Schweins vom Aortenbogen bis zum Zwerchfell steril entnommen und in 4°C kaltem PBS zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

Die neonatale Aorta wurde in einer Petrischale mit sterilem PBS von Blutkoagel freigespült und anschließend an beiden Seiten mit einer Ligatur verschlossen. An einer Seite wurde zur Befüllung des Lumens in die Ligatur eine Knopfkanüle eingebunden. Nun wurde über die Knopfkanüle das Lumen mit 10 mL Kollagenase A befüllt (0,01 g Kollagenase A auf 10 mL PBS) und für 30 Minuten in PBS bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Ligatur geöffnet und die Kollagenase-Zell- Suspension in Stoppmedium (M199 + 100 mL FCS + 5 mL P/S) überführt. Die Zellen wurden bei 1200 rpm für 10 Minuten abzentrifugiert und zunächst in EGM-2 Medium resuspendiert.

Die Zellsuspension wurde in Kulturflaschen (175 cm³) überführt, welche vorher mit 10mL Gelatine + Fibronectin (1mL:1µL) für 30 Minuten vorbehandelt wurden. Die Zellen wurden kultiviert und expandiert. Die Zellpassage und Mediumwechsel erfolgte jeden 3. Tag.

Nachdem die erwünschte Zellmenge erreicht war, wurden die Zellen mit 10 mL Trypsin-EDTA pro Kulturflasche und mehrfaches Abklopfen abgelöst und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C konserviert.

3.2.4. Passagierung der Endothelzellen

Nachdem das Medium aus den Kulturflaschen abgesaugt wurde, mußten die Zellen noch zweimal mit PBS gespült werden, um Serumbestandteile zu entfernen, welche das Trypsin blockieren könnten.

Anschließend wurden 5 mL Trypsin-EDTA in die Kulturflasche gegeben, um die adhaerenten Zellen vom Boden abzulösen. Dies geschah im Inkubator für 5 Minuten bei 37°C.

Nach 5 Minuten wurde in die Kulturflasche 10 mL Medium hinzugefügt, um das Trypsin zu blockieren und damit die Ablösung der Zellen zu stoppen. Die erfolgreiche

Ablösung der Zellen wurde unter dem Mikroskop kontrolliert, gegebenenfalls mußte durch Klopfen der Kulturflasche nachgeholfen werden.

Die Zellsuspension wurde aus der Kulturflasche entnommen und in einem 15 mL Falcon-Röhrchen bei 1200 rpm für 5 Minuten abzentrifugiert.

Anschließend wurden die Zellen in EGM-2 Medium resuspendiert und je nach Zellzahl auf verschiedene Kulturflaschen aufgeteilt. Die neuen Kulturflaschen wurden zuvor mit 10 mL Gelatine + Fibronectin (1000:1) für 30 Minuten vorbehandelt.

3.2.5. Präparation der A. carotis interna aus dem neonatalen Schwein

Nachdem die Entnahme des Herzens aus dem neugeborenen Ferkel abgeschlossen war, wurde der Hautschnitt von der vorderen Thoraxapertur nach kranial bis zum Kinn erweitert und die Strukturen im Hals des Ferkels dargestellt. Zum Offenhalten des operativen Zugangs wurde ein Wundsperrer benutzt. Es wurde der Kehlkopf samt Trachea mit einer Schere und einer chirurgischen Pinzette freipräpariert und der Gefäßstrang beidseits lateral der Trachea sichtbar gemacht. Die A. carotis interna wurde der Länge nach vom Sinus carotis bis zum Eintritt in den Schädel dargestellt und von umliegendem Gewebe und Gefäßen getrennt. Dann wurde die Arterie an den jeweiligen Enden abgesetzt und in eine sterile Flasche mit gekühltem KHB-Puffer zum Transport gelegt. Derselbe Vorgang passierte mit der gegenüberliegenden A. carotis interna.

3.2.6. Konstruktion des Bioreaktors

Die Herstellung des Gewebekonstrukts im Bioreaktor gestaltete sich analog zu der oben erwähnten Konstruktion im Kleintiermodell. Modifiziert wurde lediglich die Martixkomposition. Zusätzlich wurde das externe Schlauchsystem leicht verändert, indem eine Drainage über die Applikationsvorrichtung jeder Kammer plaziert wurde, um der Entwicklung eines Überdrucks in der Kammer zu vermeiden. Der entstehende Überdruck wurde über einen Schlauch in die Medium-Reservoirflasche drainiert. Darüberhinaus wurden sterile Medium-Entnahme-Vorrichtungen in jedes

Schlauchsystem eingearbeitet. Sie dienten der Entnahme von Medium zur Diagnostik von Glukose- und Laktatspiegeln sowie der Gase im Medium.

Die Pumpleistung der Rollpumpe wurde im Großtiermodell von 15% auf 5%

gedrosselt, da ansonsten der Perfusionsdruck zu hoch war und das Gewebekonstrukt zu sehr in Mitleidenschaft gezogen wurde.

3.2.7. Vorversuch zur Ermittlung der geeigneten Matrixkomposition

Veränderungen der Matrixkomposition sollten zum Ziel haben, den Zellen eine geeignetere Umgebung zur Proliferation zu bieten. Hierfür wurde in einer Versuchsreihe eine Anzahl von Matrixkompositionen ausgetestet (siehe Abb. 7). Es wurde die Matrix aus den Versuchen des Kleintiermodells verglichen mit der Matrix aus der Publikation von Zimmermann WH [36]. Weiterhin wurde die Kombination beider Matrices auf die Zellproliferation untersucht.

In einem Chamber-Slide mit 8 Kammern in einer Kulturschale wurden jeweils in 2 Kammern folgende Matrices gegeben:

1a 1b Matrigel™ (ECM) + 5 x 10⁵ Zellen

2a 2b Fibrin + 5 x 10⁵ Zellen

3a 3b Fibrin + Matrigel™ (ECM) + 5 x 10⁵ Zellen

4a 4b Gelatine/Fibronectin + 5 x 10⁵ Zellen

Abb. 7: Einteilung der verschiedenen Kulturansätze im Chamber-Slide

Kammer 1a und 1b wurden jeweils mit 5 x 10⁵ Zellen und Matrigel™ (ECM) bestückt.

Kammer 2a und 2b ebenfalls mit 5 x 10⁵ Zellen und Fibrin, Kammer 3a und 3b wurden neben 5 x 10⁵ Zellen eine Mischung von Matrigel™ (ECM) und Fibrin im

Verhältnis 1:1 hinzugegeben. Kammer 4a und 4b wurden zuvor mit Gelatine/Fibronectin (1000:1) beschichtet und jeweils mit 5 x 10⁵ Zellen bestückt.

1:

- 1 x 10⁶ Kardiomyozyten in Kammer vorgelegt: 100µL - 88µL Kollagen Typ I

- 86µL Medium laut Zimmermann-Protokoll - 33 µL Matrigel™ (ECM)

- 14µL NaOH (0,1 mol/l) à ca. 320µL

2:

- 1 x 10⁶ Kardiomyozyten in Kammer vorgelegt: 100µL - 110µL Fibrin

- 110µL EGM-2 Medium à 320µL

3:

- 1 x 10⁶ Kardiomyozyten in Kammer vorgelegt: 100µL - 43µL Medium laut Zimmermann-Protokoll

- 44µL Kollagen I - 50µL EGM-2 Medium - 16µL Matrigel™ (ECM) - 55µL Fibrin

- 7µL NaOH (0,1 mol/l) à ca. 320 µL

4:

- 1 x 10⁶ Kardiomyozyten in Kammer vorgelegt: 100µL - 220µL EGM-2 Medium

à ca. 320 µL

Aufteilung in Kammer (a) und (b) durch mehrmaliges durchmischen mit der Pipette à 160µL in jeder Kammer

Ansatz des Mediums laut Eschenhagen-Protokoll: 10mL

- 2-fach konzentriertes DMEM: (DMEM: 13,38 g/L) à 133,8 mg/10 mL abgewogen, in 10 mL DMEM gegeben.

- Horse serum: 20% à 2 mL

- Chick embryo extract: 4% à 400µL - P/S: 2 mL

In jede der 8 Kammern wurde zusätzlich 100 µL EGM-2 Medium gegeben. Der Versuch wurde über 7 Tage im Inkubator bei 37°C kultiviert. Mediumwechsel wurde am 3. und 5. Kulturtag durchgeführt.

Am 3., 5. und 7. Tag der Kultivierung wurden die Zell-Matrix-Kulturen unter einem Lichtmikroskop beobachtet und jeweils Fotographien angefertigt.

3.2.8. Untersuchung zur Festlegung der Matrixkomposition im Großtiermodell

Im Großtiermodell wurde die Zusammensetzung der Matrix im Hinblick auf den Matrix-Vorversuch modifiziert.

Gesamtvolumen von 3,15 mL pro Kammer des Bioreaktors - 1mL Cardiomyozyten-Suspension zu 2 x 10⁷ / mL - 432µL Medium-Ansatz laut Eschenhagen-Protokoll - 440µL Kollagen I

- 500µL EGM-2 Medium - 160µL Matrigel™ (ECM) - 550µL Fibrin

- 68µL NaOH (0,1 mol/l) à 3,15mL Gesamtvolumen

3.2.9. Erstellung des Gewebekonstrukts im Bioreaktor

Alle Komponenten der Matrix wurden erst in der Kammer des Bioreaktors zusammengeführt.

Nachdem die A. carotis in die Kammer eingespannt war, wurden mit einer Pipette 1 mL der Kardiomyozytensuspension ( 2 x 10⁷ Zellen ) in die Kammer des Bioreaktors, um die Arterie herum, gegeben. Zusätzlich wurden 500 µL EGM-2 Medium und 432 µL Medium-Ansatz hinzugegeben und mit der Pipette wiederholt mehrfach resuspendiert.

Im nächsten Schritt wurden 440 µL Kollagen I und 68 µL NaOH (0,1 mol/l) gleichzeitig hinzugegeben und vermischt.

Zuletzt wurde noch 550 µL Fibrinogen (Tissucol™ ) und 160 µL ECM (Matrigel™ ) untergemischt und alles sorgfältig resuspendiert. Es mußte darauf geachtet werden, daß das Matrix-Gemisch die Arterie komplett umgab.

Anschließend wurde das Gemisch zur Konsolidierung für 35-45 Minuten unter der sterilen Werkbank belassen.

Im Versuchsaufbau der Kokultivierung wurden in das Gewebekonstrukt Kardiomyozyten und Endothelzellen im Verhältnis 3:1 eingebracht (7,5 x 10⁶ : 2,5 x 10⁶ Zellen). Insgesamt wurden hier, wie auch im Kardiomyozytenkonstrukt, 1 x 10⁷ Zellen verwendet.

3.2.10. Inbetriebnahme der Kammern

Nach dem Konsolidierungsprozeß wurden der Zu- und Abflußschlauch des Perfusionssystems an die Kammer angeschlossen. Durch Anheben der Medium- Vorratsflasche gelangte zunächst passiv Medium durch den Schlauch, durchströmte das Lumen der Arterie und floß dann am anderen Ende wieder heraus. Somit wurden die Endothelzellen der Tunica intima der Arterie mit frischem Medium versorgt und die Arterie auf ihre Durchgängigkeit überprüft.

Nachdem das geschehen war, konnte der Pumpenschlauch in die Einspannvorrichtung eingesetzt, und die Kammer an die Pumpe im Inkubator angeschlossen werden. Die Pumpleistung wurde auf konstant 5% eingestellt. Nach

Inbetriebnahme der Kammer beobachtete man den pulsatilen Rückfluß von Medium in die Vorratsflasche.

3.2.11. Ermittlung der Druckverhältnisse im Perfusionssystem während der Kultivierung

Um sich die Druckverhältnisse im Perfusionssystem zu veranschaulichen, wurden an den Ein- und Ausgängen der Kammern des Bioreaktors Druckabnehmer in Form von senkrecht aufsteigenden Silikonschläuchen über jeweils einen 3-Wege-Hahn installiert. Somit konnten die Perfusionsdrücke ermittelt werden, welche vor und nach der Passage durch das zentrale Gefäß des Konstrukts herrschten.

Um den jeweiligen Druck zu ermitteln, wurde der 3-Wege-Hahn zusätzlich in Richtung des senkrechten Silikonschlauches geöffnet. Nach ca. 1 Minute hatte sich das gemäß dem Druck nun senkrecht aufsteigende Medium in einer bestimmten Höhe eingependelt. Da es sich um eine pulsatile Perfusion handelte, konnten jeweils 2 Werte, ein maximaler und ein minimaler Ausschlag des Mediums ermittelt werden.

Analog zum menschlichen Blutdrucksystem wurde der maximale Wert als systolischer Druck und der Minimalwert als diastolischer Druck bezeichnet.

Gemessen wurde der jeweilige senkrechte Ausschlag des Mediums mittels eines Lineals in Zentimeter-Wassersäule.

Nach Beendigung der Messung wurde die Perfusion kurz gestoppt, so dass das Medium wieder zurück in die Perfusion fließen konnte, der 3-Wege-Hahn wurde wieder in eine Richtung umgestellt und die Perfusion erneut gestartet. Die Ablesung der Druckwerte erfolgte zweimal täglich im Abstand von ca. 10-12 Stunden.

3.2.12. Messung von Stoffwechsel- und Gasparametern während der Kultivierung

Zur Ermittlung von Glukose- und Laktatwerten sowie der Gasverhältnisse im Medium wurde aus den jeweiligen Perfusionskreisläufen der verschiedenen Konstrukte Medium abgenommen. Dies geschah an den jeweiligen sterilen Abnahmeports bestehend aus einem 3-Wege-Hahn und einem Sterilfliter. Hierfür wurde zuvor ca. 1

mL Medium abgenommen und verworfen, um den Sterilfilter zu spülen. Anschließend wurde mit einer Spritze bei laufender Perfusion ca. 1 mL Medium abgenommen und in ein Eppendorff-Röhrchen gegeben und beschriftet. Zur weiteren Untersuchung wurden die Röhrchen mit dem Medium in die Abteilung für Klinische Chemie der Medizinischen Hochschule Hannover gebracht. Bestimmt wurden die Glukose- und Laktatwerte sowie die Partialdrücke von Sauerstoff und Kohlendioxid, pH-Wert, Standard-Bikarbonat und der Basen-Exzess (BE).

3.2.13. Verarbeitung der Konstrukte nach der Kultivierung

Nach der Kultivierungszeit wurde die Perfusion gestoppt und die zu- und abführenden Schläuche vom Bioreaktor entfernt. Der Bioreaktor wurde aus dem Inkubator entnommen, die Deckplatte entfernt und die Braunülen herausgezogen.

Nun wurde jedes Konstrukt mit einem sterilen Skalpell in der Kammer gelockert und mit einer anatomischen Pinzette und dem Skalpell vorsichtig herausgenommen. Das Konstrukt wurde in einer Petrischale mit einer Rasierklinge und mit Hilfe einer Pinzette in 6x ca. 0,3 cm dicke Scheiben, immer quer zum zentralen Blutgefäß, geschnitten. Jede Scheibe des Konstrukts wurde in eine Kammer einer 6-Well-Platte gelegt und mit KHB-Puffer befüllt, so daß es komplett bedeckt war. Wichtig war die korrekte Zuordnung gemäß der Flußrichtung des Mediums im zentralen Blutgefäß bei der Kultivierung.

Das geschnittene Konstrukt wurde nun mit TissueTek im Kryostaten eingedeckt und bis zur weiteren Verarbeitung in einer 6-well-Platte bei -20 Grad gelagert.

3.2.14. Immunhistologie

Um die kultivierten Zellen zu identifizieren, wurde das Gewebekonstrukt in einem Kryotom in 10 µm dicke Präparate geschnitten. Es wurden verschiedene Antikörper gegen spezifische Epitope der Zellen in einem Immunhistologischen Färbeverfahren aufgetragen.

Vor den einzelnen Färbeschritten wurden die Präparate zunächst bei -20 Grad in Aceton fixiert. Anschließend wurde das Präparat auf dem Objektträger mit einem

Fettstift umkreist, um das spätere Verlaufen der Färbeflüssigkeiten zu verhindern.

Die einzelnen Objektträger wurden nun in Schiffchen eingereiht und für 2-5 Minuten in Waschpuffer gelegt, um das überflüssige Aceton zu entfernen. Im zweiten Schritt wurden die Präparate zur Blockierung der endogenen Peroxidasen in Dunkelheit für 30 Minuten in 0,3%ige H2O2 Lösung getaucht. Anschließend wurden sie in Waschpuffer gespült. Der nächste Schritt beinhaltete die Blockierung von unspezifischen Epitopen mittels Serum, welches vorher 1:10 mit Färbepuffer verdünnt wurde. Dieser Schritt verhinderte die unspezifische Bindung der Antikörper an andere Oberflächenantigene.

Die Präparate wurden für 1 Stunde mit dem Primärantikörper und anschließend für 30 Minuten mit dem Sekundärantikörper in einer feuchten Kammer inkubiert. Um den Antikörperkomplex sichtbar zu machen, wurde für 30 Minuten ein Avidin-Peroxidase- Komplex aufgetragen, welcher eine Bindung mit dem Sekundärantikörper einging.

Der Avidin-Peroxidase-Komplex wurde zusätzlich mit einem Chromogen versehen.

Dementsprechend kommt es an den Stellen, an denen die Zellen die antikörper- spezifischen Epitope exprimiert hatten, zu einer bräunlichen Färbung durch Spaltung des Chromogens durch die Peroxidase.

Zur Fixierung der Zellfärbung wurden die Präparate in eine aufsteigende Ethanolreihe und zuletzt in Xylol getaucht. Um die Präparate zu schützen, wurden sie mit Corbit-Balsam betropft und mit einem Deckglas versehen.

Nach der Lufttrocknung der Präparate über Nacht konnten diese dann anschließend unter dem Mikroskop betrachtet werden.

Verdünnung der Primärantikörper:

- MF20 1:70 - CD 31 1:100 - Troponin T 1:200