3. Methoden
3.2. Großtiermodell: Schwein
3.2.1. Entnahme des Herzens bei einem neonatalen Schwein
Um Kardiomyozyten zu gewinnen, wurde hierzu das Herz eines neonatalen Schweins (Alter: 1-3 Tage) entnommen. Die hierfür notwendigen Eingriffe am Schwein wurden in einem Tierschutzantrag genehmigt. Die Schweine wurden aus der Landwirtschaftlichen Forschungsanstalt FAL Mariensee bezogen.
Das Schwein wurde am Morgen des Operationstags aus der FAL Mariensee geholt und in die Medizinische Hochschule in das Zentrale Tierlabor gebracht. Hier wurde die Operation in einem Tier-OP durchgeführt. Das Tier wurde von Pflegekräften des Tierlabors in Narkose gelegt und für die Operation vorbereitet, indem ein venöser Zugang am Ohr des Tiers gelegt wurde, um hierüber die Euthanasie durchzuführen.
Das Schwein wurde auf dem Operationstisch an den Extremitäten mit Bändern leicht fixiert, die Operationsfläche mit Braunol-Iodlösung desinfiziert und die unsterilen Bereiche um das Operationfeld herum mit Tüchern steril abgedeckt.
Nachdem die Euthanasie am Schwein durch eine Gabe von 20 mL Propofol durchgeführt wurde, konnte mit der Eröffnung des Thorax begonnen werden. Hierzu wurde mit einem Skalpell ein Hautschnitt vom Manubrium sterni bis knapp einen halben Zentimeter unterhalb des Proc. xyphoideus durchgeführt. Mit dem Finger wurde unterhalb des Proc. xyphoideus das Gewebe stumpf erweitert und im nächsten Schritt mit einer Schere eine mediane Sternotomie durchgeführt. Die Spitze
der Schere ist abgerundet, um keine Verletzungen der Thoraxorgane zu verursachen. Nach Eröffnung des Thorax wurde dieser durch einen Thorax-Spreizer offen gehalten und das Herz dargestellt, indem das Perikard und die Pleurablätter durchtrennt wurden. Bei der Eröffnung des Thorax schlug das Herz nicht mehr.
Als nächstes wurde die Aorta aufgesucht, die unterhalb der A. pulmonalis verläuft.
Aorta und A. pulmonalis wurden stumpf durch vorsichtiges Spreizen der Schere voneinander getrennt. Mit einem Overhold wurde ein Mersilene 2/0 Faden zwischen Aorta und A. pulmonalis geführt und um die Aorta gelegt und ein Knoten vorgelegt.
Nun wurde eine Stichinzision mit einem spitzen Skalpell zwischen Aortenwurzel und Aortenbogen in die Aorta ascendens gesetzt und die Knopfkanüle in die Inzision geführt. Der Knoten des Mersilene 2/0 Fadens wurde zugezogen und zusätzlich mit zwei Knoten fixiert, damit die Kanüle nicht aus der Aorta herausgleiten konnte, und um einen retrograden Fluß der Perfusionslösung zu verhindern.
Zunächst wurde Custodiol, eine ca. 4 °C kalte kardioplege Lösung, infundiert, und man sah, das die Koronargefäße von Blut reingespült wurden und das Myokard innerhalb von Sekunden abblasste. Custodiol wurde hier zur Kardioprotektion eingesetzt, um elektrischen Reizleitungsaktionen zu unterdrücken. Es wurden ca.
200 mL innerhalb von 4-6 Minuten infundiert. Um einen guten Abfluß der Perfusionslösung zu gewährleisten, wurden beide Vorhöfe des Herzens am Herzohr eingeschnitten.
Abb.5: Neonatales Herz im Thorax des Ferkels. Das Herz ist freigelegt und die Koronargefäße werden über die Aorta mit kardiopleger Lösung perfundiert (Pfeil).
In der Zwischenzeit entfernte der Operateur den linken und rechten Lungenflügel und legte das Herz soweit frei, das es nur noch an der Aorta fixiert war.
Nachdem die 200 mL Custodiol infundiert waren, wurde der Infusionsbeutel gewechselt. Jetzt wurden die Koronargefäße mit KHB-Lösung, einem 4°C kalten, kalziumfreien Puffer perfundiert. Auch hierzu wurden 200 mL in 4-6 Minuten infundiert. War dies geschehen, wurde das Herz an den großen Gefäßen abgesetzt und aus dem Thorax entnommen. Es wurde in eine sterile Glasflasche mit 100 mL KHB-Puffer gelegt und in einer Kühlbox auf Eis bei ca. 4°C transportiert.
Das tote Tier wurde artgerecht entsorgt.
3.2.2. Verdau des neonatalen Herzens zur Gewinnung von porcinen neonatalen Kardiomyozyten
Ansetzen von kalziumfreiem KHB- (Krebs-Henseleit-Bicarbonat) Puffer:
- 110 mM NaCl: 6,4 g
- 2,6 mM KCl: 0,19 g
- 1,2 mM KH2PO4: 0,16 g
- 1,2 mM MgSO4: 0,30 g
- 11 mM Glukose: 0,19 g
- 10 mM HEPES: 2,38 g
Anschließend Hinzugabe von 1000 mL H2O, Einstellung des pH-Wertes auf 7,4 und Sterilfiltrieren der Lösung.
1.Schritt:
Nach der Entnahme des Herzens wurde dieses zur Weiterverarbeitung schnellstmöglich in das Labor befördert.
Der erste Schritt beinhaltete die Perfusion der Herzkranzgefäße mit einer 0,1%igen Kollagenase II – Lösung in einer modifizierten Langendorff Apparatur, welche die Kollagenaselösung über einen Wärmetauscher-Kreislauf auf 37°C aufheizte (siehe Abb.6). Hierbei wurde das gesamte Herzgewebe über die Koronargefäße angedaut, bis das Herz begann, leicht an Konsistenz zu verlieren und eine honiggelbe Farbe entwickelte.
Um eine gleichmäßige Verdauung des Herzens zu gewährleisten, konnten die Koronargefäße selektiv penetriert und perfundiert werden. Hierbei mußte darauf geachtet werden, dass nicht zu viel Luft in die Koronargefäße gelangte. Dies würde zu deren Okklusion führen und es würde keine Kollagenaselösung in die Peripherie gelangen.
Modifizierte Langendorff Apparatur:
Abb.6: Modifizierte Langendorff Apparatur zur Perfusion der Koronararterien des Herzens
Wasserheizgerät mit Pumpe
Pumpe O2
Aorta
Herz
Legende:
: Fluß der Kollagenaselösung
: Fluß des Wassers im Wärmetauscher Zellfilter
Der nächste Schritt beinhaltete die grobe mechanische Zerkleinerung des Herzens.
Hierfür wurden die Anteile, vorwiegend des linken und rechten Ventrikels, reseziert und von Strukturen, wie Koronargefäßen und Herzklappen getrennt.
In einer Petrischale wurden die Myokardanteile mit einer Schere über mehrere Minuten soweit zerkleinert, bis die einzelnen Gewebestücke ca. 1-2 mm3 groß waren.
Das zerkleinerte Gewebe wurde nun mit 5-10 mL KHB suspendiert und in einer 25 mL Pipette aufgenommen. In der Petrischale zurückgebliebene Gewebestücke wurden erneut mit KHB suspendiert und aufgenommen. Die Suspension wurde in ein 50 mL Falcon-Röhrchen gefüllt und zum Sedimentieren der Gewebestücke auf Eis gesetzt.
Nach wenigen Minuten konnte der Überstand mit einer 25 mL Pipette abgenommen und verworfen werden.
Es empfahl sich, für die weitere Verarbeitung des Gewebes das Volumen des zerkleinerten Materials auf 10 mL zu beschränken, da sonst das Verhältnis von Gewebe und Verdau-Lösung ungünstig wurde und sich die Gesamt-Zellausbeute später verschlechterte.
2. Schritt (Kollagenase-Verdau):
Der zweite Schritt war folgendermaßen aufgebaut:
Menge an
Kollagenase-Lösung Dauer
Verdau 1 10 mL 10 min.
Verdau 2 10 mL 10 min.
Verdau 3 10 mL 10 min.
Tabelle 2: Verdauprotokoll zur Isolation von neonatalen porcinen Kardiomyozyten
Das zerkleinerte Herzmuskelgewebe wurde in einem 50 mL Falcon-Röhrchen gefüllt und jeweils mit 10 mL Kollagenase-Verdaulösung versetzt. Das Gemisch wurde in einem Schüttelbad bei 37°C für 10 min. verdaut. Anschließend wurde der Überstand entnommen und in ein neues 50 mL Falcon – Röhrchen gefüllt, mit KHB auf 40 mL aufgefüllt und bei 4°C auf einem Schüttler gelagert. Das Verfahren wurde insgesamt
3x durchgeführt. Danach erfolgte die Zellfilterpassage der Zellsuspensionen. Es folgte anschließend die Zellzählung jedes Verdaus mittels einer Neubauer-Zählkammer.
3.Schritt:
Der nächste Schritt beinhaltete die Anhebung der Calcium-Konzentration auf physiologische Werte, da vorher ein kalziumfreier Puffer (KHB) verwendet wurde.
Dies geschah in 3 Schritten.
Kalzium-Konzentration Menge Vorgang
auf 2,5 µmol/l 100µL, 1mmol/l CaCl2 5 min. inkubieren auf 75 µmol/l 28 µL, 100 mmol/l CaCl2 5 min. inkubieren auf 175 µmol/l 40 µL, 100 mmol/l CaCl2 5 min. inkubieren
Tabelle 3: Protokoll zur Erhöhung der Kalziumkonzentration der Kardiomyozytensuspension
Nach diesem Arbeitsgang wurden die Zellen in Lösung bei 600 U/min. bei 4°C für 15 min. zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen mit einer 25 mL Pipette und jeweils 5 mL EGM-2 Medium gepoolt und mit Medium auf die gewünschte Konzentration gebracht. Nach dem Befüllen der Zellsuspension mit Medium hatten die Zellen die gewünschte Kalziumkonzentration erreicht. Bis zum weiteren Gebrauch der Zellen wurden diese im 50 mL Falcon – Röhrchen bei 4°C auf einem Schüttler gelagert.
Vorbereitung des Nährmediums:
EGM-2 Medium:
- 1 Flasche EBM-2 Medium (500mL)
- Supplement Kit (ausser: Cortisol, Amphotericin B/Gentamycin) - 10 mL FCS
- 5,6 mL P/S
3.2.3. Isolation der Endothelzellen
Für die Isolation von porcinen neonatalen aortalen Endothelzellen wurde die Aorta descendens des neonatalen Schweins vom Aortenbogen bis zum Zwerchfell steril entnommen und in 4°C kaltem PBS zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
Die neonatale Aorta wurde in einer Petrischale mit sterilem PBS von Blutkoagel freigespült und anschließend an beiden Seiten mit einer Ligatur verschlossen. An einer Seite wurde zur Befüllung des Lumens in die Ligatur eine Knopfkanüle eingebunden. Nun wurde über die Knopfkanüle das Lumen mit 10 mL Kollagenase A befüllt (0,01 g Kollagenase A auf 10 mL PBS) und für 30 Minuten in PBS bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Ligatur geöffnet und die Kollagenase-Zell-Suspension in Stoppmedium (M199 + 100 mL FCS + 5 mL P/S) überführt. Die Zellen wurden bei 1200 rpm für 10 Minuten abzentrifugiert und zunächst in EGM-2 Medium resuspendiert.
Die Zellsuspension wurde in Kulturflaschen (175 cm3) überführt, welche vorher mit 10mL Gelatine + Fibronectin (1mL:1µL) für 30 Minuten vorbehandelt wurden. Die Zellen wurden kultiviert und expandiert. Die Zellpassage und Mediumwechsel erfolgte jeden 3. Tag.
Nachdem die erwünschte Zellmenge erreicht war, wurden die Zellen mit 10 mL Trypsin-EDTA pro Kulturflasche und mehrfaches Abklopfen abgelöst und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C konserviert.
3.2.4. Passagierung der Endothelzellen
Nachdem das Medium aus den Kulturflaschen abgesaugt wurde, mußten die Zellen noch zweimal mit PBS gespült werden, um Serumbestandteile zu entfernen, welche das Trypsin blockieren könnten.
Anschließend wurden 5 mL Trypsin-EDTA in die Kulturflasche gegeben, um die adhaerenten Zellen vom Boden abzulösen. Dies geschah im Inkubator für 5 Minuten bei 37°C.
Nach 5 Minuten wurde in die Kulturflasche 10 mL Medium hinzugefügt, um das Trypsin zu blockieren und damit die Ablösung der Zellen zu stoppen. Die erfolgreiche
Ablösung der Zellen wurde unter dem Mikroskop kontrolliert, gegebenenfalls mußte durch Klopfen der Kulturflasche nachgeholfen werden.
Die Zellsuspension wurde aus der Kulturflasche entnommen und in einem 15 mL Falcon-Röhrchen bei 1200 rpm für 5 Minuten abzentrifugiert.
Anschließend wurden die Zellen in EGM-2 Medium resuspendiert und je nach Zellzahl auf verschiedene Kulturflaschen aufgeteilt. Die neuen Kulturflaschen wurden zuvor mit 10 mL Gelatine + Fibronectin (1000:1) für 30 Minuten vorbehandelt.
3.2.5. Präparation der A. carotis interna aus dem neonatalen Schwein
Nachdem die Entnahme des Herzens aus dem neugeborenen Ferkel abgeschlossen war, wurde der Hautschnitt von der vorderen Thoraxapertur nach kranial bis zum Kinn erweitert und die Strukturen im Hals des Ferkels dargestellt. Zum Offenhalten des operativen Zugangs wurde ein Wundsperrer benutzt. Es wurde der Kehlkopf samt Trachea mit einer Schere und einer chirurgischen Pinzette freipräpariert und der Gefäßstrang beidseits lateral der Trachea sichtbar gemacht. Die A. carotis interna wurde der Länge nach vom Sinus carotis bis zum Eintritt in den Schädel dargestellt und von umliegendem Gewebe und Gefäßen getrennt. Dann wurde die Arterie an den jeweiligen Enden abgesetzt und in eine sterile Flasche mit gekühltem KHB-Puffer zum Transport gelegt. Derselbe Vorgang passierte mit der gegenüberliegenden A. carotis interna.
3.2.6. Konstruktion des Bioreaktors
Die Herstellung des Gewebekonstrukts im Bioreaktor gestaltete sich analog zu der oben erwähnten Konstruktion im Kleintiermodell. Modifiziert wurde lediglich die Martixkomposition. Zusätzlich wurde das externe Schlauchsystem leicht verändert, indem eine Drainage über die Applikationsvorrichtung jeder Kammer plaziert wurde, um der Entwicklung eines Überdrucks in der Kammer zu vermeiden. Der entstehende Überdruck wurde über einen Schlauch in die Medium-Reservoirflasche drainiert. Darüberhinaus wurden sterile Medium-Entnahme-Vorrichtungen in jedes
Schlauchsystem eingearbeitet. Sie dienten der Entnahme von Medium zur Diagnostik von Glukose- und Laktatspiegeln sowie der Gase im Medium.
Die Pumpleistung der Rollpumpe wurde im Großtiermodell von 15% auf 5%
gedrosselt, da ansonsten der Perfusionsdruck zu hoch war und das Gewebekonstrukt zu sehr in Mitleidenschaft gezogen wurde.
3.2.7. Vorversuch zur Ermittlung der geeigneten Matrixkomposition
Veränderungen der Matrixkomposition sollten zum Ziel haben, den Zellen eine geeignetere Umgebung zur Proliferation zu bieten. Hierfür wurde in einer Versuchsreihe eine Anzahl von Matrixkompositionen ausgetestet (siehe Abb. 7). Es wurde die Matrix aus den Versuchen des Kleintiermodells verglichen mit der Matrix aus der Publikation von Zimmermann WH [36]. Weiterhin wurde die Kombination beider Matrices auf die Zellproliferation untersucht.
In einem Chamber-Slide mit 8 Kammern in einer Kulturschale wurden jeweils in 2 Kammern folgende Matrices gegeben:
1a 1b Matrigel™ (ECM) + 5 x 105 Zellen
2a 2b Fibrin + 5 x 105 Zellen
3a 3b Fibrin + Matrigel™ (ECM) + 5 x 105 Zellen
4a 4b Gelatine/Fibronectin + 5 x 105 Zellen
Abb. 7: Einteilung der verschiedenen Kulturansätze im Chamber-Slide
Kammer 1a und 1b wurden jeweils mit 5 x 105 Zellen und Matrigel™ (ECM) bestückt.
Kammer 2a und 2b ebenfalls mit 5 x 105 Zellen und Fibrin, Kammer 3a und 3b wurden neben 5 x 105 Zellen eine Mischung von Matrigel™ (ECM) und Fibrin im
Verhältnis 1:1 hinzugegeben. Kammer 4a und 4b wurden zuvor mit Gelatine/Fibronectin (1000:1) beschichtet und jeweils mit 5 x 105 Zellen bestückt.
1:
- 1 x 106 Kardiomyozyten in Kammer vorgelegt: 100µL - 88µL Kollagen Typ I
- 86µL Medium laut Zimmermann-Protokoll - 33 µL Matrigel™ (ECM) - 43µL Medium laut Zimmermann-Protokoll
- 44µL Kollagen I
Aufteilung in Kammer (a) und (b) durch mehrmaliges durchmischen mit der Pipette à 160µL in jeder Kammer
Ansatz des Mediums laut Eschenhagen-Protokoll: 10mL
- 2-fach konzentriertes DMEM: (DMEM: 13,38 g/L) à 133,8 mg/10 mL abgewogen, in 10 mL DMEM gegeben.
- Horse serum: 20% à 2 mL
- Chick embryo extract: 4% à 400µL - P/S: 2 mL
In jede der 8 Kammern wurde zusätzlich 100 µL EGM-2 Medium gegeben. Der Versuch wurde über 7 Tage im Inkubator bei 37°C kultiviert. Mediumwechsel wurde am 3. und 5. Kulturtag durchgeführt.
Am 3., 5. und 7. Tag der Kultivierung wurden die Zell-Matrix-Kulturen unter einem Lichtmikroskop beobachtet und jeweils Fotographien angefertigt.
3.2.8. Untersuchung zur Festlegung der Matrixkomposition im Großtiermodell
Im Großtiermodell wurde die Zusammensetzung der Matrix im Hinblick auf den Matrix-Vorversuch modifiziert.
Gesamtvolumen von 3,15 mL pro Kammer des Bioreaktors - 1mL Cardiomyozyten-Suspension zu 2 x 107 / mL - 432µL Medium-Ansatz laut Eschenhagen-Protokoll - 440µL Kollagen I
- 500µL EGM-2 Medium - 160µL Matrigel™ (ECM) - 550µL Fibrin
- 68µL NaOH (0,1 mol/l) à 3,15mL Gesamtvolumen
3.2.9. Erstellung des Gewebekonstrukts im Bioreaktor
Alle Komponenten der Matrix wurden erst in der Kammer des Bioreaktors zusammengeführt.
Nachdem die A. carotis in die Kammer eingespannt war, wurden mit einer Pipette 1 mL der Kardiomyozytensuspension ( 2 x 107 Zellen ) in die Kammer des Bioreaktors, um die Arterie herum, gegeben. Zusätzlich wurden 500 µL EGM-2 Medium und 432 µL Medium-Ansatz hinzugegeben und mit der Pipette wiederholt mehrfach resuspendiert.
Im nächsten Schritt wurden 440 µL Kollagen I und 68 µL NaOH (0,1 mol/l) gleichzeitig hinzugegeben und vermischt.
Zuletzt wurde noch 550 µL Fibrinogen (Tissucol™ ) und 160 µL ECM (Matrigel™ ) untergemischt und alles sorgfältig resuspendiert. Es mußte darauf geachtet werden, daß das Matrix-Gemisch die Arterie komplett umgab.
Anschließend wurde das Gemisch zur Konsolidierung für 35-45 Minuten unter der sterilen Werkbank belassen.
Im Versuchsaufbau der Kokultivierung wurden in das Gewebekonstrukt Kardiomyozyten und Endothelzellen im Verhältnis 3:1 eingebracht (7,5 x 106 : 2,5 x 106 Zellen). Insgesamt wurden hier, wie auch im Kardiomyozytenkonstrukt, 1 x 107 Zellen verwendet.
3.2.10. Inbetriebnahme der Kammern
Nach dem Konsolidierungsprozeß wurden der Zu- und Abflußschlauch des Perfusionssystems an die Kammer angeschlossen. Durch Anheben der Medium-Vorratsflasche gelangte zunächst passiv Medium durch den Schlauch, durchströmte das Lumen der Arterie und floß dann am anderen Ende wieder heraus. Somit wurden die Endothelzellen der Tunica intima der Arterie mit frischem Medium versorgt und die Arterie auf ihre Durchgängigkeit überprüft.
Nachdem das geschehen war, konnte der Pumpenschlauch in die Einspannvorrichtung eingesetzt, und die Kammer an die Pumpe im Inkubator angeschlossen werden. Die Pumpleistung wurde auf konstant 5% eingestellt. Nach
Inbetriebnahme der Kammer beobachtete man den pulsatilen Rückfluß von Medium in die Vorratsflasche.
3.2.11. Ermittlung der Druckverhältnisse im Perfusionssystem während der Kultivierung
Um sich die Druckverhältnisse im Perfusionssystem zu veranschaulichen, wurden an den Ein- und Ausgängen der Kammern des Bioreaktors Druckabnehmer in Form von senkrecht aufsteigenden Silikonschläuchen über jeweils einen 3-Wege-Hahn installiert. Somit konnten die Perfusionsdrücke ermittelt werden, welche vor und nach der Passage durch das zentrale Gefäß des Konstrukts herrschten.
Um den jeweiligen Druck zu ermitteln, wurde der 3-Wege-Hahn zusätzlich in Richtung des senkrechten Silikonschlauches geöffnet. Nach ca. 1 Minute hatte sich das gemäß dem Druck nun senkrecht aufsteigende Medium in einer bestimmten Höhe eingependelt. Da es sich um eine pulsatile Perfusion handelte, konnten jeweils 2 Werte, ein maximaler und ein minimaler Ausschlag des Mediums ermittelt werden.
Analog zum menschlichen Blutdrucksystem wurde der maximale Wert als systolischer Druck und der Minimalwert als diastolischer Druck bezeichnet.
Gemessen wurde der jeweilige senkrechte Ausschlag des Mediums mittels eines Lineals in Zentimeter-Wassersäule.
Nach Beendigung der Messung wurde die Perfusion kurz gestoppt, so dass das Medium wieder zurück in die Perfusion fließen konnte, der 3-Wege-Hahn wurde wieder in eine Richtung umgestellt und die Perfusion erneut gestartet. Die Ablesung der Druckwerte erfolgte zweimal täglich im Abstand von ca. 10-12 Stunden.
3.2.12. Messung von Stoffwechsel- und Gasparametern während der Kultivierung
Zur Ermittlung von Glukose- und Laktatwerten sowie der Gasverhältnisse im Medium wurde aus den jeweiligen Perfusionskreisläufen der verschiedenen Konstrukte Medium abgenommen. Dies geschah an den jeweiligen sterilen Abnahmeports bestehend aus einem 3-Wege-Hahn und einem Sterilfliter. Hierfür wurde zuvor ca. 1
mL Medium abgenommen und verworfen, um den Sterilfilter zu spülen. Anschließend wurde mit einer Spritze bei laufender Perfusion ca. 1 mL Medium abgenommen und in ein Eppendorff-Röhrchen gegeben und beschriftet. Zur weiteren Untersuchung wurden die Röhrchen mit dem Medium in die Abteilung für Klinische Chemie der Medizinischen Hochschule Hannover gebracht. Bestimmt wurden die Glukose- und Laktatwerte sowie die Partialdrücke von Sauerstoff und Kohlendioxid, pH-Wert, Standard-Bikarbonat und der Basen-Exzess (BE).
3.2.13. Verarbeitung der Konstrukte nach der Kultivierung
Nach der Kultivierungszeit wurde die Perfusion gestoppt und die zu- und abführenden Schläuche vom Bioreaktor entfernt. Der Bioreaktor wurde aus dem Inkubator entnommen, die Deckplatte entfernt und die Braunülen herausgezogen.
Nun wurde jedes Konstrukt mit einem sterilen Skalpell in der Kammer gelockert und mit einer anatomischen Pinzette und dem Skalpell vorsichtig herausgenommen. Das Konstrukt wurde in einer Petrischale mit einer Rasierklinge und mit Hilfe einer Pinzette in 6x ca. 0,3 cm dicke Scheiben, immer quer zum zentralen Blutgefäß, geschnitten. Jede Scheibe des Konstrukts wurde in eine Kammer einer 6-Well-Platte gelegt und mit KHB-Puffer befüllt, so daß es komplett bedeckt war. Wichtig war die korrekte Zuordnung gemäß der Flußrichtung des Mediums im zentralen Blutgefäß bei der Kultivierung.
Das geschnittene Konstrukt wurde nun mit TissueTek im Kryostaten eingedeckt und bis zur weiteren Verarbeitung in einer 6-well-Platte bei -20 Grad gelagert.
3.2.14. Immunhistologie
Um die kultivierten Zellen zu identifizieren, wurde das Gewebekonstrukt in einem Kryotom in 10 µm dicke Präparate geschnitten. Es wurden verschiedene Antikörper gegen spezifische Epitope der Zellen in einem Immunhistologischen Färbeverfahren aufgetragen.
Vor den einzelnen Färbeschritten wurden die Präparate zunächst bei -20 Grad in Aceton fixiert. Anschließend wurde das Präparat auf dem Objektträger mit einem
Fettstift umkreist, um das spätere Verlaufen der Färbeflüssigkeiten zu verhindern.
Die einzelnen Objektträger wurden nun in Schiffchen eingereiht und für 2-5 Minuten in Waschpuffer gelegt, um das überflüssige Aceton zu entfernen. Im zweiten Schritt wurden die Präparate zur Blockierung der endogenen Peroxidasen in Dunkelheit für 30 Minuten in 0,3%ige H2O2 Lösung getaucht. Anschließend wurden sie in Waschpuffer gespült. Der nächste Schritt beinhaltete die Blockierung von unspezifischen Epitopen mittels Serum, welches vorher 1:10 mit Färbepuffer verdünnt wurde. Dieser Schritt verhinderte die unspezifische Bindung der Antikörper an andere Oberflächenantigene.
Die Präparate wurden für 1 Stunde mit dem Primärantikörper und anschließend für 30 Minuten mit dem Sekundärantikörper in einer feuchten Kammer inkubiert. Um den Antikörperkomplex sichtbar zu machen, wurde für 30 Minuten ein Avidin-Peroxidase-Komplex aufgetragen, welcher eine Bindung mit dem Sekundärantikörper einging.
Der Avidin-Peroxidase-Komplex wurde zusätzlich mit einem Chromogen versehen.
Dementsprechend kommt es an den Stellen, an denen die Zellen die antikörper-spezifischen Epitope exprimiert hatten, zu einer bräunlichen Färbung durch Spaltung des Chromogens durch die Peroxidase.
Zur Fixierung der Zellfärbung wurden die Präparate in eine aufsteigende Ethanolreihe und zuletzt in Xylol getaucht. Um die Präparate zu schützen, wurden sie mit Corbit-Balsam betropft und mit einem Deckglas versehen.
Nach der Lufttrocknung der Präparate über Nacht konnten diese dann anschließend unter dem Mikroskop betrachtet werden.
Verdünnung der Primärantikörper:
- MF20 1:70 - CD 31 1:100 - Troponin T 1:200
3.2.15 Pentachromfärbung nach Movat
Die Pentachromfärbung ist eine Übersichtsfärbung, welche aus fünf Farbstoffen besteht. Sie ist von Vorteil, weil sie die Bestandteile der Matrix, insbesondere
Die Pentachromfärbung ist eine Übersichtsfärbung, welche aus fünf Farbstoffen besteht. Sie ist von Vorteil, weil sie die Bestandteile der Matrix, insbesondere