Explantation von neonatalen Rattenherzen

Alle in dieser Dissertation beschriebenen Tierversuche wurden gemäß dem Antrag auf Genehmigung eines Tierversuchsvorhabens durchgeführt.

Präparation der Herzen aus neonatalen Ratten (1-3 Tage alt):

Materialien: Schere vom Hals aus nach kaudal eröffnet. Durch leichten Druck mit der gespreizten Pinzette auf die Ränder der Thoraxöffnung trat das Herz hervor. Mit einem Schnitt an der Herzbasis wurde das Herz entnommen und in die Flasche mit 4°C kaltem PBS überführt. Die getöteten Tiere wurden ordnungsgemäß entsorgt.

3.1.2. Isolation der Kardiomyozyten aus neonatelen Rattenherzen

Herstellung der Verdaulösungen:

Trypsin – Verdaulösung: 150 mL - 1,5 mL P/S

- 4,5 mL Trypsin – Stammlsg.

- 1,5 mL DNase – Stammlsg.

ad 142,5 mL CBFHH – Lösung in eine sterile 200 mL Flasche

DNase – Verdaulösung: 100 mL - 1,0 mL P/S

- 3,4 mL FCS (hitze – inaktiviert) - 1,0 mL DNase – Stammlsg.

- ad 94,6 mL CBFHH – Lösung in eine sterile 200 mL Flasche

Sammelröhrchen: 7x

- 2,5 mL FCS (hitze – inaktiviert) in einem 50 mL Falconröhrchen vorlegen

Kardiomyozyten-Medium:

- 1 Flasche MEM Medium - 55 mL FCS (hitze-inaktiviert) - 5,6 mL Penicillin/Streptomycin - 5,6 mL BRDU

Ansetzen der gebrauchsfertigen CBFHH – Lösung (1 Liter) aus Stammlösungen:

- 810,0 mL H2O destilliert, steril (ELGA) - 40,0 mL NaCl – Stammlsg.

- 10,0 mL KCl – Stammlsg.

- 10,0 mL Magnesiumsulfat – Stammlsg.

- 10,0 mL Kalium – Dihydrogenphosphat – Stammlsg.

- 10,0 mL Di – Natriumhydrogenphosphat – Stammlsg - 10,0 mL Dextrose – Stammlsg.

- 100,0 mL HEPES – Stammlsg.

Zu Beginn wurden die neonatalen Herzen in der Flasche zweimal mit PBS gespült und in eine Petri-Schale überführt. Dort wurden die Herzen ein weiteres Mal mit PBS gespült. Hierbei wurde darauf geachtet, unbrauchbares Material (geronnenes Blut, Lungengewebe) mit zu entfernen. Das PBS wurde abgesaugt und es konnte mit der mechanischen Zerkleinerung der Herzen in der Petri-Schale mittels einer Schere begonnen werden. Die Zerkleinerung des Myokards erfolgte soweit, bis eine homogene Masse erreicht wurde mit einer Stückgröße von maximal 1-2 mm. Die zerkleinerte Masse wurde nun mit CBFHH in einer 25ml Pipette aufgenommen und in ein 50 ml Falcon-Röhrchen gefüllt. Die Petri-Schale wurde einmal mit CBFHH gespült, um alle Bestandteile aufzunehmen. Nach ein paar Minuten setzten sich die festen Bestandteile ab, und der Überstand konnte abgenommen und verworfen werden.

Zunächst wurde die Gewebemasse mit 15 ml Trypsin-Lösung vorverdaut. Dies geschah auf einem Schüttler bei 4°C für 20 min.

Die Gewebemasse in dem Falcon-Röhrchen wurde nun in 7 Schritten verdaut (Tabelle 1), begonnen mit der Trypsin-Lösung, die in das Falcon-Röhrchen mit der Gewebemasse gefüllt wurde. Das Ganze wurde bei 37°C in einem Schüttelbad für 7 min. verdaut. Anschließend nahm man das Röhrchen heraus und ließ es für kurze Zeit ruhen, damit die festen Bestandteile sich absetzen konnten. Daraufhin wurde der Überstand abgenommen und in das vorbereitete Falcon-Röhrchen mit FBS gefüllt.

Das FBS blockierte hierbei das Trypsin, und der Verdau-Vorgang wurde an dieser Stelle gestoppt.

Als zweiter Schritt wurde in das Röhrchen mit der Gewebemasse DNase-Lösung gefüllt und mit einer 25 ml Pipette ca. 30x gut durchmischen. Dann wurde wieder gewartet, bis sich die festen Bestandteile absetzen. Daraufhin wurde der Überstand entnommen und dem Röhrchen mit FBS und Trypsin-Überstand zugeführt. Dieses Röhrchen enthielt nun den Überstand mit den Zellen, die bei diesem ersten Verdau-Vorgang herausgelöst wurden. Hinzu wurde 5 ml Kardiomyozytenmedium gegeben und das Falcon-Röhrchen wurde bei 4°C auf einem Schüttler bis zur weiteren Verwendung gelagert. Der Verdau-Vorgang wurde nach gleichem Schema weitergeführt, jedoch mit Anpassung der Mengen an Verdau-Lösungen (Trypsin, DNase) an die jeweils vorhandene Gewebemenge (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1: Mengenanpassung der unterschiedlichen Verdauschritte

In jedem nachfolgenden Verdau-Schritt wurde die Menge an Enzymlösung jeweils um 0,5 ml reduziert, um die Verdau-Lösung ungefähr der Gewebe-Menge anzupassen.

3.1.3. Explantation der Aorta aus der adulten Ratte

Vor der Entnahme der Aorta wurde die Ratte in einer Glasglocke mit einer Überdosis Ether getötet. Nachdem die Atmung für länger als 5 Minuten ausgesetzt hatte, wurde die Ratte entnommen und mit einer Haarschneidemaschine an der Unterseite geschoren. Die tote Ratte wurde dann mit Klebeband und Nadeln auf einer Korkplatte an dessen Extremitäten befestigt. Thorax und Abdomen wurden mit Braunol abgewaschen. Anschließend erfolgte der Längsschnitt mit dem Skalpell median entlang des Sternums bis zur Mitte des Abdomens. Mit einer Schere wurde die Bauchdecke und der Thorax eröffnet und die Aorta mit Hilfe von Pinzetten stumpf freipräpariert und dargestellt. Die Interkostalarterien wurden mittels Elektrokoagulation verschlossen und anschließed abgetrennt. Die Aorta wurde vom distalen Aortenbogen bis kurz unter dem Zwerchfell mit einer Schere entnommen und mit PBS durchgespült. Abschließend wurde die Aorta in eine 4°C kalte PBS – Lösung in eine sterile Flasche gelegt und so ins Labor transportiert. Die tote Ratte wurde artgerecht entsorgt.

3.1.4. Der Bioreaktor

Der für diesen Versuch konstruierte Bioreaktor besteht aus 4 parallel zueinander angeordneten Kammern mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Tiefe von 1 cm.

Die Kammern bestehen aus durchsichtigem Plexiglas, welche durch eine Deckplatte, verschlossen werden kann. An den jeweils gegenüberliegenden Seiten der Kammern sitzen zwei Zugänge, welche der Zu- und Abführung von Medium dienen. Eingebettet ist das Kammersystem in einem Rahmen aus hitzebeständigem Kunststoff, welches die Deckplatte durch Zugschrauben auf die Kammerplatte presst.

Kammerplatte:

Abb.1: Grundplatte des Bioreaktors mit 4 parallel angeordneten Kammern

34 mm

10 mm 28 mm

135 mm

20 mm

Rahmen:

A:

Abb.2: Rahmen: (A): Untere und Obere Platte, (B): Seitenansicht Untere Platte

Der Rahmen dient der Befestigung der Deckplatte auf der Kammerplatte. Er ist aus hitzebeständigem Kunststoff gefertigt und hält mehrfachen Autoklavierprozessen stand.

49 mm 25 mm

12 mm 7 mm

124 mm 138 mm

6 mm Ø 5 mm

Schraube: 4,8 x 36

Untere Platte

Obere Platte

B:

Deckplatte:

A:

Abb.3: Deckplatte: (A): Draufsicht, (B): Seitenansicht

Die Deckplatte besteht aus Glas. Aufgesetzt sind insgesamt vier Applikationsvorrichtungen mit je einer Silikonmembran. Diese Vorrichtungen kommen bei der Montage des Bioreaktors direkt über den Kammern zum Liegen. Sie dienen der jeweiligen Kammer zur direkten Injektion oder Entnahme von Stoffen.

Für die Montage des Bioreaktors wird die Kammerplatte in die untere Platte zwischen die Schrauben eingelegt und die Kammern mit der Deckplatte verschlossen. Auf die Deckplatte wird die obere Platte durch die Schrauben der unteren Platte geführt und mit den Muttern fest verschraubt.

135 mm

28 mm

B:

Bioreaktor:

A:

B:

Abb.4: Bioreaktor: (A): Seitenansicht, (B): Draufsicht

138 mm

49 mm 138 mm

39 mm

29 mm

3.1.5. Konstruktion des Bioreaktors im Kleintiermodell

Materialien für 4 Kammern eines Bioreaktors:

- 1 Bioreaktor (autoklaviert), - steriles Tuch

- sterile OP-Handschuhe - 8 Braunülen 20 G (rosa)

- 4 abgeschliffene Seldinger-Nadeln - 1 Prolene 5/0 Nahtmaterial (steril)

- steriles Besteck: Nadelhalter, Pinzette, Schere - 5ml Spritze

- Histoacryl-Kleber - 4 Aorten aus der Ratte

Zum sterilen Arbeiten unter der Flow wurden zunächst die sterilen OP-Handschuhe angezogen. Das weitere Material wurde von einer zweiten Person steril angereicht.

Zunächst wurde das sterile Tuch ausgebreitet, um den sterilen Arbeitsplatz abzugrenzen. Auf diesem Tuch wurden die oben genannten Arbeitsmaterialien steril abgelegt.

In die schwarzen Verschlußkappen wurden die Silikon-Membranen eingelegt und diese dann zusammen auf die Schraubvorrichtung der Deckplatte des Bioreaktors geschraubt. Sie dienen als Applikationsvorrichtung.

Zunächst wurden die Braunülen in die beiden, sich gegenüberliegenden, Öffnungen der Bioreaktorkammer eingeführt. Hierzu mußte der im Bioreakor verbleibende Kunststoffmandrain der Braunüle auf 1 cm verkürzt werden. Die Braunülen dienten zum Befestigen der Aorta an den jeweiligen Enden, um einen Zu- und Abfluß zu gewährleisten. Nun wurde die Aorta an beiden Enden auf die jeweiligen Braunülen aufgeschoben. Anschließend wurde eine abgeschliffene Seldinger-Nadel über eine Braunüle durch das Aortenlumen retrograd in die gegenüberliegende Braunüle vorgeschoben, um eine „innere Schienung“ zu erreichen. Somit konnte die Aorta nun nicht mehr herunterrutschen. Zuletzt wurde jeweils das Ende der Aorta, aufliegend auf den Braunülen, mit Prolene 5/0 Nahtmaterial vernäht, mit einem Doppelknoten und 3 weiteren Knoten befestigt und mit einem Tropfen Histoacryl-Kleber fixiert. Die

Durchgängigkeit des Braunülen-Aorten-Konstrukts wurde mit einer 5ml Spritze mit sterilem PBS überprüft. Um die Austrocknung der Aorta zu verhindern, wurde die Kammer des Bioreaktors mit sterilem PBS befüllt.

3.1.6. Bestücken des Bioreaktors mit Matrix und Zellen

Es wurden hierfür folgende Materialien pro Kammer verwendet:

- Fibrin-Kleber (Tissucol, Baxter): 1mL - Kardiomyozyten-Suspension in Medium:

Konzentration: 1 x 10⁷ Zellen/mL; Menge: 2mL

- Injektionsbesteck bestehend aus einer Spritzenhalterung, zwei 2ml Spritzen, und einer Weiche.

Zur Verwendung der Kammer mit der eingespannten Aorta mußte zunächst das PBS wieder aus der Kammer abgenommen werden.

Die zwei 2mL Spritzen wurden jeweils mit 1mL Kardiomyozyten-Suspension gefüllt, so dass man eine Gesamtmenge von 2 x 10⁷ Zellen in die Kammer erhält. Die beiden Spritzen wurden in die Spritzenhalterung eingesetzt. Auf deren Öffnungen wurde die Weiche aufgesetzt, welche beide Öffnungen der Spritzen zusammenführt. Der Fibrin-Kleber wurde schon in derselben Vorrichtung geliefert und konnte mit einer weiteren Weiche mit dem Injektionsbesteck der Kardiomyozyten-Suspension verbunden werden. Nun konnten beide Komponenten in die Kammer, um die Aorta herum, gegossen werden.

Der Übergang vom flüssigen in den festen Zustand benötigte eine Zeit von i.d.R. 35 min. Hierbei wurde der Verschluß-Deckel des Bioreaktors auf die Kammer gelegt und das gesamte System unter der Flow belassen. Nach 35 min. wurde die Kammer verschlossen, der Deckel verschraubt und das Schlauchsystem an die Kanülen der Aorta befestigt. Jede Kammer war mit einer Mediumreservoirflasche, befüllt mit jeweils 100mL Medium, über ein Schlauchsystem verbunden. Über eine Rollpumpe wurde Medium durch die Rattenaorta befördert und das Konstrukt so mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt.

Nun konnte die Perfusion begonnen werden und der Bioreaktor mitsamt den Vorratsflaschen mit Medium in den Inkubator gestellt werden, wo 37°C Temperatur, 5% CO2, und 85% Luftfeuchtigkeit herrschten.

Eine Rollpumpe im Inkubator sorgte für einen pulsatilen Fluß im System. Die Pumpe lief auf 15% Leistung.

3.1.7. Fluor–18–Fluordesoxyglukose–Positronen–Emissions–Tomographie (¹⁸F – FDG – PET)

Zur Ermittlung der Vitalität der Zellen im Konstrukt wurde der Bioreaktor nach 7 Tagen Kulturzeit mit ¹⁸F – FDG versetzt und im Positronen – Emissions – Tomograph (PET) gemessen.

Zur Vorbereitung mußte der Bioreaktor aus dem Inkubator entnommen werden und in eine Isolierbox aus Styropor eingebaut werden. Die Perfusion wurde für den Transport gestoppt. In der Abteilung für Nuklearmedizin wurde die Box mit dem Bioreaktor in das PET positioniert. Die Mediumreservoirflaschen wurden in eine „hot chamber“ gelegt, ein Behälter, welcher das Medium erwärmte. Die Temperatur in dem Behälter wurde auf konstant 56°C eingestellt, so daß das Medium bei Austritt aus der hot chamber bis zum Erreichen des Bioreaktors eine Temperatur von ca.

37°C betrug. Die Reservoirflaschen wurden 20 cm höher positioniert im Vergleich zum Bioreaktor, um einen höheren Perfusionsdruck zu erzielen. Die Pumpenleistung wurde auf 30% erhöht. Ein Thermometer wurde auf die Oberfläche des Bioreaktors, direkt über der Kammer, plaziert. Die Perfusion wurde bis zur Betriebstemperatur von 37°C in der Box beibehalten. Zunächst wurden durch das PET die Dichteverhältnisse des Bioreaktors ermittelt, um einen Nullwert gegenüber der folgenden Messung zu erhalten. Der Bioreaktor durfte nun nicht mehr in seiner Position im PET verändert Medium ausgetauscht und für weitere 90 Minuten perfundiert. In dieser

wash-out-Phase wurde das ¹⁸F – FDG, welches nicht von vitalen Zellen aufgenommen wurde, herausgewaschen.

Im Anschluß an die Messung wurden die gemessenen Signale mittels Rechner in einem 3-dimensionalen Bild rekonstruiert.

Das aus den Daten errechnete Bild enthält Informationen über die ¹⁸ F-FDG-Aufnahme, nachdem der Tracer aus der Perfusion des Bioreaktors ausgewaschen wurde (wash-out-Phase).

3.1.8. LIVE/DEAD – Färbung

Mit Hilfe der LIVE/DEAD – Färbung konnte indirekt die Vitalität durch Fluoreszenzfarbstoffe an den Präparaten nachgewiesen werden. Hierzu mußte das Färbesubstrat jedoch aufgetragen werden, während die Zellen noch vital waren. Dies geschah nach Beendigung der Kulturzeit, direkt nachdem das Konstrukt aus dem Bioreaktor entnommen wurde.

Das Calcein AM ist ein Farbstoff, welcher nur von vitalen Zellen in den grün fluoreszierenden Stoff gespalten werden kann, folglich leuchten vitale Zellen grün.

Ethidium Homodimer kann bei toten Zellen die Zellmembran überwinden und mit der DNA einen rot fluoreszierenden Farbstoff bilden. Tote Zellen erscheinen im Präparat somit rot.

Zuvor wurden die Arbeitslösungen angesetzt. Calcein AM – Lösung und Ethidium Homodimer wurden aufgetaut und mit PBS (37°C) verdünnt (Calcein AM 1:1000, Ethidium Homodimer 1:8000). Beides mußte bis zur Verwendung lichtgeschützt aufbewahrt werden. Zur Färbung des Gewebekonstrukts wurde dieses nach Entnahme aus dem Bioreaktor in 6 dünne Scheiben geschnitten, jeweils immer senkrecht zum zentralen Gefäß des Konstrukts. Diese dünnen Scheiben wurden in eine 6-well-Platte gelegt und mit der Arbeitslösung versetzt, so dass sie gerade bedeckt waren. Es folgte die Inkubation bei 37 Grad Celsius in Dunkelheit für 30 Minuten. Anschließend wurde das Gewebekonstrukt dreifach mit PBS gewaschen, um das Substrat, welches nicht von den Zellen aufgenommen wurde, aus dem Konstrukt herauszuspülen.

Nun konnte das gefärbte Gewebekonstrukt zur Kryokonservierung mit TissuTek eingedeckt werden und anschließend im Kryostat in 10 µm dicke Präparate geschnitten werden.

Der Zeitfaktor war hierbei für die Qualität der Fluoreszenz entscheidend, so dass eine zügige Mikroskopierung sich anschließen sollte.

Arbeitslösung:

- 8 mL PBS

- 8 µL Calcein AM (1:1000)

- 1 µL Ethidium Homodimer (1:8000)

3.2. Großtiermodell: Schwein

3.2.1. Entnahme des Herzens bei einem neonatalen Schwein

Um Kardiomyozyten zu gewinnen, wurde hierzu das Herz eines neonatalen Schweins (Alter: 1-3 Tage) entnommen. Die hierfür notwendigen Eingriffe am Schwein wurden in einem Tierschutzantrag genehmigt. Die Schweine wurden aus der Landwirtschaftlichen Forschungsanstalt FAL Mariensee bezogen.

Das Schwein wurde am Morgen des Operationstags aus der FAL Mariensee geholt und in die Medizinische Hochschule in das Zentrale Tierlabor gebracht. Hier wurde die Operation in einem Tier-OP durchgeführt. Das Tier wurde von Pflegekräften des Tierlabors in Narkose gelegt und für die Operation vorbereitet, indem ein venöser Zugang am Ohr des Tiers gelegt wurde, um hierüber die Euthanasie durchzuführen.

Das Schwein wurde auf dem Operationstisch an den Extremitäten mit Bändern leicht fixiert, die Operationsfläche mit Braunol-Iodlösung desinfiziert und die unsterilen Bereiche um das Operationfeld herum mit Tüchern steril abgedeckt.

Nachdem die Euthanasie am Schwein durch eine Gabe von 20 mL Propofol durchgeführt wurde, konnte mit der Eröffnung des Thorax begonnen werden. Hierzu wurde mit einem Skalpell ein Hautschnitt vom Manubrium sterni bis knapp einen halben Zentimeter unterhalb des Proc. xyphoideus durchgeführt. Mit dem Finger wurde unterhalb des Proc. xyphoideus das Gewebe stumpf erweitert und im nächsten Schritt mit einer Schere eine mediane Sternotomie durchgeführt. Die Spitze

der Schere ist abgerundet, um keine Verletzungen der Thoraxorgane zu verursachen. Nach Eröffnung des Thorax wurde dieser durch einen Thorax-Spreizer offen gehalten und das Herz dargestellt, indem das Perikard und die Pleurablätter durchtrennt wurden. Bei der Eröffnung des Thorax schlug das Herz nicht mehr.

Als nächstes wurde die Aorta aufgesucht, die unterhalb der A. pulmonalis verläuft.

Aorta und A. pulmonalis wurden stumpf durch vorsichtiges Spreizen der Schere voneinander getrennt. Mit einem Overhold wurde ein Mersilene 2/0 Faden zwischen Aorta und A. pulmonalis geführt und um die Aorta gelegt und ein Knoten vorgelegt.

Nun wurde eine Stichinzision mit einem spitzen Skalpell zwischen Aortenwurzel und Aortenbogen in die Aorta ascendens gesetzt und die Knopfkanüle in die Inzision geführt. Der Knoten des Mersilene 2/0 Fadens wurde zugezogen und zusätzlich mit zwei Knoten fixiert, damit die Kanüle nicht aus der Aorta herausgleiten konnte, und um einen retrograden Fluß der Perfusionslösung zu verhindern.

Zunächst wurde Custodiol, eine ca. 4 °C kalte kardioplege Lösung, infundiert, und man sah, das die Koronargefäße von Blut reingespült wurden und das Myokard innerhalb von Sekunden abblasste. Custodiol wurde hier zur Kardioprotektion eingesetzt, um elektrischen Reizleitungsaktionen zu unterdrücken. Es wurden ca.

200 mL innerhalb von 4-6 Minuten infundiert. Um einen guten Abfluß der Perfusionslösung zu gewährleisten, wurden beide Vorhöfe des Herzens am Herzohr eingeschnitten.

Abb.5: Neonatales Herz im Thorax des Ferkels. Das Herz ist freigelegt und die Koronargefäße werden über die Aorta mit kardiopleger Lösung perfundiert (Pfeil).

In der Zwischenzeit entfernte der Operateur den linken und rechten Lungenflügel und legte das Herz soweit frei, das es nur noch an der Aorta fixiert war.

Nachdem die 200 mL Custodiol infundiert waren, wurde der Infusionsbeutel gewechselt. Jetzt wurden die Koronargefäße mit KHB-Lösung, einem 4°C kalten, kalziumfreien Puffer perfundiert. Auch hierzu wurden 200 mL in 4-6 Minuten infundiert. War dies geschehen, wurde das Herz an den großen Gefäßen abgesetzt und aus dem Thorax entnommen. Es wurde in eine sterile Glasflasche mit 100 mL KHB-Puffer gelegt und in einer Kühlbox auf Eis bei ca. 4°C transportiert.

Das tote Tier wurde artgerecht entsorgt.

3.2.2. Verdau des neonatalen Herzens zur Gewinnung von porcinen neonatalen Kardiomyozyten

Ansetzen von kalziumfreiem KHB- (Krebs-Henseleit-Bicarbonat) Puffer:

- 110 mM NaCl: 6,4 g

- 2,6 mM KCl: 0,19 g

- 1,2 mM KH2PO4: 0,16 g

- 1,2 mM MgSO4: 0,30 g

- 11 mM Glukose: 0,19 g

- 10 mM HEPES: 2,38 g

Anschließend Hinzugabe von 1000 mL H₂O, Einstellung des pH-Wertes auf 7,4 und Sterilfiltrieren der Lösung.

1.Schritt:

Nach der Entnahme des Herzens wurde dieses zur Weiterverarbeitung schnellstmöglich in das Labor befördert.

Der erste Schritt beinhaltete die Perfusion der Herzkranzgefäße mit einer 0,1%igen Kollagenase II – Lösung in einer modifizierten Langendorff Apparatur, welche die Kollagenaselösung über einen Wärmetauscher-Kreislauf auf 37°C aufheizte (siehe Abb.6). Hierbei wurde das gesamte Herzgewebe über die Koronargefäße angedaut, bis das Herz begann, leicht an Konsistenz zu verlieren und eine honiggelbe Farbe entwickelte.

Um eine gleichmäßige Verdauung des Herzens zu gewährleisten, konnten die Koronargefäße selektiv penetriert und perfundiert werden. Hierbei mußte darauf geachtet werden, dass nicht zu viel Luft in die Koronargefäße gelangte. Dies würde zu deren Okklusion führen und es würde keine Kollagenaselösung in die Peripherie gelangen.

Modifizierte Langendorff Apparatur:

Abb.6: Modifizierte Langendorff Apparatur zur Perfusion der Koronararterien des Herzens

Wasserheizgerät mit Pumpe

Pumpe O2

Aorta

Herz

Legende:

: Fluß der Kollagenaselösung

: Fluß des Wassers im Wärmetauscher Zellfilter

Der nächste Schritt beinhaltete die grobe mechanische Zerkleinerung des Herzens.

Hierfür wurden die Anteile, vorwiegend des linken und rechten Ventrikels, reseziert und von Strukturen, wie Koronargefäßen und Herzklappen getrennt.

In einer Petrischale wurden die Myokardanteile mit einer Schere über mehrere Minuten soweit zerkleinert, bis die einzelnen Gewebestücke ca. 1-2 mm³ groß waren.

Das zerkleinerte Gewebe wurde nun mit 5-10 mL KHB suspendiert und in einer 25 mL Pipette aufgenommen. In der Petrischale zurückgebliebene Gewebestücke wurden erneut mit KHB suspendiert und aufgenommen. Die Suspension wurde in ein 50 mL Falcon-Röhrchen gefüllt und zum Sedimentieren der Gewebestücke auf Eis gesetzt.

Nach wenigen Minuten konnte der Überstand mit einer 25 mL Pipette abgenommen und verworfen werden.

Es empfahl sich, für die weitere Verarbeitung des Gewebes das Volumen des zerkleinerten Materials auf 10 mL zu beschränken, da sonst das Verhältnis von Gewebe und Verdau-Lösung ungünstig wurde und sich die Gesamt-Zellausbeute später verschlechterte.

2. Schritt (Kollagenase-Verdau):

Der zweite Schritt war folgendermaßen aufgebaut:

Menge an

Kollagenase-Lösung Dauer

Verdau 1 10 mL 10 min.

Verdau 2 10 mL 10 min.

Verdau 3 10 mL 10 min.

Tabelle 2: Verdauprotokoll zur Isolation von neonatalen porcinen Kardiomyozyten

Das zerkleinerte Herzmuskelgewebe wurde in einem 50 mL Falcon-Röhrchen gefüllt und jeweils mit 10 mL Kollagenase-Verdaulösung versetzt. Das Gemisch wurde in einem Schüttelbad bei 37°C für 10 min. verdaut. Anschließend wurde der Überstand entnommen und in ein neues 50 mL Falcon – Röhrchen gefüllt, mit KHB auf 40 mL aufgefüllt und bei 4°C auf einem Schüttler gelagert. Das Verfahren wurde insgesamt

3x durchgeführt. Danach erfolgte die Zellfilterpassage der Zellsuspensionen. Es folgte anschließend die Zellzählung jedes Verdaus mittels einer Neubauer-Zählkammer.

3.Schritt:

Der nächste Schritt beinhaltete die Anhebung der Calcium-Konzentration auf physiologische Werte, da vorher ein kalziumfreier Puffer (KHB) verwendet wurde.

Dies geschah in 3 Schritten.

Kalzium-Konzentration Menge Vorgang

Kalzium-Konzentration Menge Vorgang

Im Dokument Herstellung eines 3-dimensionalen myokardialen Gewebeäquivalents in einem perfundierten Bioreaktor-System (Seite 19-0)